Incubación

Guide PEC - Espagne
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Guía de
Interpretación
Petrifilm™
Placas para Recuento de E. coli y Coliformes
Esta guía sirve para familiarizarse con los resultados obtenidos en las placas 3M™ Petrifilm™ para Recuento de E. coli
y Coliformes (EC). Para más información, contactar con el distribuidor oficial de Productos 3M Microbiology.
Las placas Petrifilm EC contienen los nutrientes del VRB, un agente gelificante soluble en agua fría, un indicador
de la actividad glucuronidasa BCIG y un indicador de tetrazolio que facilita la enumeración de colonias. El film superior
atrapa el gas producido por la fermentación de la lactosa por los Coliformes y E.coli.
1
3
4
• El tiempo y temperatura de incubacion, así como
la interpretación de las placas Petrifilm EC puede variar
según el método seguido. Por lo tanto, se pueden obtener
resultados ligeramente diferentes. Las temperaturas
de incubación usadas normalmente en la mayoría de métodos
se mencionan en el folleto del producto, y se muestran
ejemplos en la sección técnica (Pág. 2 y 3) de esta Guía.
• No contar las colonias que aparecen sobre la zona
blanca, ya que no se hallan bajo la influencia selectiva
del medio.
• Incubar a la temperatura y tiempo normalmente seguido
en el laboratorio. Las temperaturas más usadas son:
35, 37, 42 ó 44ºC durante 24 a 48 horas.
E. coli :
E. coli es capaz de crecer en medios conteniendo
los nutrientes del Violeta Rojo Bilis (VRB). La mayoría
de E. coli (aprox. el 97%) producen beta-glucuronidasa,
que reacciona con un indicador (colorante) BCIG presente
en la placa Petrifilm EC y que hace que la colonia sea
de color azul a rojo-azul. Aproximadamente el 95%
1
de E. coli producen gas a partir de la lactosa, lo que viene
indicado como colonias asociadas (aproximadamente
el diámetro de una colonia) a gas atrapado. Ver Círculo 1. Las colonias de E.coli aparecen de color azul a rojo-azul
y producen gas; confirmar las colonias de color azul a rojo-azul sin gas. Ver Círculo 2. En algunos procesos de validación,
esta interpretación se ha modificado: las siguientes organizaciones AOAC, NMKL, EMMAS, han validado
o evaluado el uso de las Placas para Recuento de E. coli y Coliformes bajo condiciones específicas. Ver páginas
2 y 3 de esta Guía de Interpretación.
2
Observación :
La mayoría de cepas de E. coli O157:H7 son atípicas : no crecen a temperaturas ≥ 44.5ºC, son glucuronidasa negativas,
y por lo tanto, no producirán un precipitado azul. Aparecerán como Coliformes no-E. coli (rojas con gas).
Coliformes :
Las Placas para Recuento de E. coli y Coliformes pueden usarse también para la investigación de Coliformes.
• La ISO define los Coliformes por su capacidad de crecer en medios específicos y selectivos. El método ISO 4832,
que enumera los Coliformes por la técnica del recuento de colonias, define los Coliformes por el tamaño de las colonias
y la producción de ácido en el Agar VRB con lactosa (VRBL). En las placas Petrifilm EC, estos coliformes productores
de ácido se muestran como colonias rojas con o sin gas (dentro de aproximadamente el diámetro de una colonia).
Ver Círculo 3. El método ISO 4831, que enumera los Coliformes por el método del Número Más Probable (NMP),
define los Coliformes por su capacidad de crecer y producir gas a partir de la lactosa en un caldo selectivo. En las placas
Petrifilm EC, estos coliformes se muestran como colonias rojas asociadas a gas (dentro de aproximadamente el diámetro
de una colonia). Ver Círculo 4.
• La AOAC INTERNATIONAL y el U.S. FDA Bacteriological Analytical Manual (BAM) definen los Coliformes como
bacilos Gram negativos que producen ácido y gas a partir de la lactosa durante la fermentación metabólica. Las colonias
de Coliformes que crecen en las placas Petrifilm EC producen ácido que oscurece el color del gel. El gas atrapado
alrededor de las colonias de Coliformes (dentro de aproximadamente el diámetro de una colonia) indica Coliformes
confirmados. Ver Círculo 4.
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Interpretaciones de las Placas 3M Petrifilm EC
Método recomendado en Francia
Incubación :
24h +/- 2h a 42°C +/- 1°C.
Interpretación :
• E. coli : Contar todas las colonias azules con o sin gas.
1A
53 E. coli.
Lectura según la AOAC International, todos los
alimentos (método 991.14)
Incubación :
• Coliformes en todos los alimentos : incubar 24h +/- 2h
a 35ºC +/- 1ºC.
• Enumeración de E. coli en todos los productos, excepto
los abajo mencionados : incubar 48h +/- 2h a 35°C +/- 1°C.
Lectura según la AOAC International, carnes,
aves y mariscos (método 998.08)
Incubación :
• Enumeración de E. coli en Carne, Volatería y Productos
del Mar, y Coliformes en todos los productos : incubar
24h +/- 2h a 35°C +/- 1°C.
Interpretación (Metodos 991.14 y 998.08)
1B
47 E. coli, método oficial AOAC.
87 Coliformes confirmados, método oficial AOAC.
• E. coli : colonias azules con gas.
• Coliformes confirmados : todas las colonias con gas
(azules y rojas).
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Lectura según la NMKL (método 147.1993)
Incubación :
37°C +/- 1°C.
Interpretación :
• E. coli : Contar todas las colonias azules, con y sin gas
tras 48h +/- 2h de incubación.
• Coliformes : Contar las colonias rojas con gas y todas las
colonias azules con o sin gas después de 24 h +/- 2h
de incubación.
1C
53 E. coli, método NMKL.
95 Coliformes totales, método NMKL.
Lectura según método evaluado por la EMMAS
Incubación :
48h +/- 2h a 37°C +/- 1°C.
Interpretación :
• E. coli : Contar todas las colonias azules con y sin gas.
Es aconsejable confirmar las colonias azules sin gas, en especial
cuando estén presentes en una alta proporción.
1D
53 E. coli, método evaluado EMMAS.
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Placas 3M Petrifilm para Recuento de E. coli y Coliformes
Observar el cambio de color del gel en las figuras 2 a 8. Al incrementar el recuento de E. coli y Coliformes,
el color del gel se vuelve rojo oscuro o azul-púrpura.
1
1
2
No crecimiento
Recuento de E. coli = 0
Las burbujas de fondo son una característica del gel
y no resultado del crecimiento de E. coli o Coliformes.
Las burbujas de fondo son pequeñas o puntiformes,
de forma regular y no tienen una colonia asociada.
Ver Recuadro 1.
Iluminación
de fondo
1
3
Recuento de E. coli = 13
Recuento de Coliformes productores de gas =28
Al igual que las placas de Agar VRB, el intervalo óptimo de
recuento (colonias totales) en las placas Petrifilm EC es 15-150.
No contar las colonias que aparecen sobre la zona blanca
ya que no están bajo la influencia selectiva del medio.
Ver Círculo 1.
Iluminación
frontal
2
4
Recuento E. coli = 3
Toda coloración azul presente en una colonia (azul a rojo-azul)
indica la presencia de E. coli. Utilizando una iluminación
frontal puede facilitar la visualización del precipitado azul
formado por una colonia.
• El Círculo 1 muestra una colonia rojo-azul usando una
iluminación de fondo
• El Círculo 2 muestra la misma colonia con iluminación
frontal. El precipitado azul en este caso se visualiza mejor.
5
Recuento E. coli = 20
Recuento total estimado = 150
El área de crecimiento circular de la placa Petrifilm EC
es de aproximadamente 20 cm2. Se pueden hacer estimaciones
en placas con más de 150 colonias contando el número de
colonias en uno o varios cuadrados representativos y obteniendo
el promedio. Multiplicar dicho número por 20 para obtener
el recuento total por placa.
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Placas TNTC (Demasiado Numeroso Para Contar)
Para obtener un recuento más preciso, diluir más la muestra.
6
Recuento real ~ 106
Las placas Petrifilm EC con colonias TNTC tienen
una o más de las características siguientes: muchas colonias
pequeñas, muchas burbujas de gas, y un oscurecimiento
del color del gel de rojo a azul-púrpura.
8
Recuento real ~ 108
Altas concentraciones de Coliformes (no E. coli) causarán
que el área de crecimiento se vuelva rojo oscuro.
Cuando ésto ocurra, realizar diluciones adicionales para
determinar la presencia de E. coli.
7
Recuento real ~ 108
Altas concentraciones de E. coli causarán que el área
de crecimiento se vuelva azul-púrpura.
9
Recuento real ~ 108
Cuando un alto número de microorganismos no-Coliformes,
tales como Pseudomonas, están presentes en las placas
Petrifilm EC, el gel puede virar a amarillo.
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Burbujas
1
1
10
Las partículas alimentícias tienen forma irregular y no están
asociadas a burbujas de gas. Ver Figura 10.
1
4
7
3
2
5
8
6
9
12
A continuación se muestran varios ejemplos de burbujas
asociadas a una colonia. Todos ellos se deben tener
en cuenta.
3
2
11
La Figura 11 muestra como la forma de las burbujas puede
variar.
Algunas veces el gas deforma la colonia y hace
que la colonia “perfile” la burbuja. Ver Círculos 1 y 2.
Pueden aparecer burbujas como artefactos debidas a una
inoculación inadecuada de la placa Petrifilm EC o de aire
atrapado en la muestra. En este caso, las burbujas tienen
forma irregular y no están asociadas a una colonia.
Ver Círculo 3.
No contar las colonias que aparecen en la zona blanca
ya que no están bajo la influencia selectiva del medio.
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3M™ Petrifilm™
Placas para Recuento de E. coli y Coliformes
Instrucciones
de uso
Para Advertencias, Precauciones, Responsabilidad del Usuario, Garantía Limitada,
Almacenamiento y Eliminación, e Instrucciones de Uso, ver el folleto del producto.
Almacenamiento
Petrifilm
Petrifilm
Petrifilm
1
Conservar las bolsas cerradas
a ≤8°C. Usar antes de la fecha
de caducidad impresa en la
bolsa.
2
Para cerrar las bolsas que
se están utilizando, doblar
los extremos y cerrarlos
con celo.
3
Mantener las bolsas una vez
cerradas a ≤25ºC, a HR <50%.
No refrigerar las bolsas
abiertas.
Usar las placas Petrifilm
en un mes desde su apertura.
5
Añadir una cantidad apropiada
de uno de los siguientes diluyentes
estériles: tampón fosfato
de Butterfield (tampón fosfato IDF,
KH2PO4 a 0.0425g/l , ajustar pH
a 7.2), agua peptonada al 0.1%,
peptona sal (método ISO 6887),
solución salina (0.85 - 0.90%)
o agua destilada.
6
Mezclar u homogeneizar
la muestra mediante los métodos
habituales.
9
Bajar el film superior
con cuidado evitando introducir
burbujas de aire. No dejarlo caer.
Preparación
4
Pesar o pipetear el producto
alimenticio en un contenedor
estéril adecuado, como una bolsa
Stomacher, frasco de dilución,
bolsa Whirl-Pak®, o cualquier otro
contenedor estéril.
No usar tampones que contengan
citrato, bisulfito o tiosulfato.
Ajustar el pH de la muestra diluida
entre 6.6 y 7.2:
• para productos ácidos, usar NaOH 1N,
• para productos alcalinos, usar HCl 1N.
Inoculación
7
Colocar la placa Petrifilm
en una superficie plana.
Levantar el film superior.
8
Con una pipeta colocada
de forma perpendicular
a la placa Petrifilm, colocar 1 ml.
de la muestra en el centro
del film inferior.
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Con la cara lisa hacia abajo,
colocar el aplicador en el film
superior sobre el inóculo.
11
Incubación
Con cuidado, ejercer una presión
sobre el aplicador para repartir
el inóculo sobre el área circular.
No girar ni deslizar el aplicador.
12
Levantar el aplicador. Esperar
un minuto a que solidifique el gel.
15
Las colonias pueden aislarse
para una posterior identificación.
Levantar el film superior
y seleccionar la colonia del gel.
Interpretación
<70°F
13
Incubar las placas cara arriba en pilas
de hasta 20 placas.
El tiempo e incubación varía según
el método*.
Métodos aprobados más usuales :
• Método Oficial AOAC 991.14 :
para coliformes, incubar 24h ± 2h
a 35°C ± 1°C ; para E.coli, incubar 48h
± 2h a 35°C ± 1°C
• Método Oficial AOAC 998.08: para
E. coli en carnes, aves y mariscos,
y Coliformes en todos los alimentos,
incubar 24 h +/- 2 h a 35ºC +/-1ºC.
• Método NMKL 147.1993 :
Para Coliformes, incubar 24h ± 2h
a 37°C ± 1°C ; para E.coli, incubar
48h ± 2h a 37°C ± 1°C.
14
Las placas Petrifilm pueden leerse
con un contador de colonias
standard u otra lente de aumento.
Para leer los resultados, consultar
la Guía de Interpretación.
* Ver el folleto del producto.
Comentarios adicionales
• Recordar inocular y repartir el inóculo en cada placa Petrifilm antes de pasar a la siguiente placa.
• El tiempo y temperatura de incubación puede variar según el método utilizado, ver el folleto del producto.
Fecha
Versión
Marzo 2002
1.0
FP 100111037 - Marzo 2002
Referencia de documento
Departamento de Microbiología
3M Espana, S.A.
Juan Ignacio Luca de Tena, 19-25
28027 Madrid
Tel : 91 321 6246
3M y Petrifilm son marcas registradas de 3M Company.
Whirl-Pak es una marca registrada de Nasco