secretaria de agricultura y recursos hidraulicos - Diario-o

SECRETARIA DE AGRICULTURA Y RECURSOS HIDRAULICOS
09-30-94 PROYECTO de Norma Oficial Mexicana NOM-017-ZOO-1994, Análisis de
mercurio en hígado, músculo y riñón de bovinos, equinos, porcinos y ovinos por
espectrometría de absorción atómica
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.Secretaría de Agricultura y Recursos Hidráulicos.- Comité Consultivo Nacional de
Normalización de Protección Zoosanitaria.
Héctor Campos López, Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de
Protección Zoosanitaria, con fundamento en los artículos 45, 46, fracción II y 47 de la
Ley Federal sobre Metrología y Normalización, me permito ordenar la publicación en el
Diario Oficial de la Federación del proyecto de Norma Oficial Mexicana por la que se
establece, con carácter obligatorio, el Análisis de mercurio en hígado, músculo y riñón
de bovinos, equinos, porcinos y ovinos por espectrometría de absorción atómica.
El presente proyecto se publica a efecto de que los interesados, dentro de los 90 días
naturales siguientes a la fecha de publicación del mismo, presenten sus comentarios ante
el Comité Consultivo Nacional de Normalización de Protección Zoosanitaria, sito en
Recreo número 14 piso 11, colonia Actipan, Delegación Benito Juárez código postal
03230 México, Distrito Federal.
Durante el plazo mencionado, los análisis que sirvieron de base para la elaboración del
proyecto de norma, estarán a disposición del público para su consulta en el domicilio
del Comité.
Dado en la Ciudad de México, Distrito Federal, a los veintinueve días del mes de agosto
de mil novecientos noventa y cuatro.
PROYECTO DE NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-017-ZOO-1994, ANALISIS
DE MERCURIO EN HIGADO, MUSCULO Y RIÑON DE BOVINOS, EQUINOS,
PORCINOS Y OVINOS POR ESPECTROMETRIA DE ABSORCION ATOMICA
PREFACIO
UNIDAD ADMINISTRATIVA RESPONSABLE DE LA ELABORACION DE ESTA
NORMA OFICIAL MEXICANA:
- DIRECCION GENERAL DE SALUD ANIMAL.
EN LA ELABORACION DE ESTA NORMA PARTICIPARON LOS ORGANISMOS
SIGUIENTES:
- INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES Y
AGROPECUARIAS. CENID-MICROBIOLOGIA.
- SMITHKLINE BEECHAM FARMACEUTICA
- LABORATORIO NACIONAL DE SALUD PUBLICA
SECRETARIA DE SALUD
- INVESTIGACION Y CONTROL DE CALIDAD BIOQUIMICA, S.A.
- INSTITUTO MEXICANO DE TECNOLOGIA DEL AGUA. IMTA.
INDICE
1. OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACION
2. REFERENCIAS
3. DEFINICIONES
4. SIMBOLOS Y ABREVIATURAS
5. FUNDAMENTO
6. EQUIPO
7. REACTIVOS, SOLUCIONES Y MATERIALES
8. ESTANDARES
9. PROCEDIMIENTO No. 1
10. PROCEDIMIENTO No. 2
11. RESULTADOS
12. SANCIONES
13. CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES
14. BIBLIOGRAFIA
15. DISPOSICIONES TRANSITORIAS
1. Objetivo y campo de aplicación
1.1. Objetivo
Esta norma es de observancia obligatoria en todo el territorio nacional y tiene por
objeto, establecer el método de prueba para la determinación de residuos de mercurio en
hígado, músculo y riñon de bovinos, equinos, porcinos y ovinos.
1.2. Campo de aplicación
Esta norma se aplica a todos los laboratorios de análisis de residuos tóxicos en tejidos
alimenticios primarios de origen animal, que hayan sido aprobados por la Secretaría de
Agricultura y Recursos Hidráulicos.
2. Referencias
Para la correcta aplicación de esta Norma deben consultarse las siguientes Normas
Oficiales Mexicanas:
NOM-003-ZOO-1994 Criterios para la Operación de Laboratorios de Pruebas
Aprobados en Materia Zoosanitaria.
NOM-004-ZOO-1993 Control de Residuos Tóxicos en Carne, Grasa, Hígado y Riñón
de Bovinos, Equinos, Porcinos y Ovinos.
NOM-008-SCFI-1993 Norma Oficial Mexicana. Sistema General de Unidades de
Medida.
3. Definiciones
Para efectos de esta norma, se entiende por:
3.1. Blanco de calibración del instrumento: Es la solución del ácido usado como
diluente para ajustar a cero el aparato.
3.2. Espectroscopía: Area de la física y la química, dedicada al estudio de la generación,
medición e interpretación de los espectros de energía que resultan de la emisión o
absorción de energía radiante.
3.3. Espectrometría: Es una rama de la espectroscopía relacionada con la medición de
espectros.
3.4. Espectrometría de absorción atómica: Es una rama del análisis instrumental, en el
que un elemento es atomizado en forma tal que pérmita la observación, selección y
medida de su espectro de absorción.
3.5. Espectrometría de absorción atómica por flama: Es el método por el cual el
elemento se determina mediante un espectrofotómetro de absorción atómica, usado en
conjunto con un sistema de nebulización, un atomizador y una fuente de energía
radiante o luminosa.
La fuente de atomización, es un quemador que utiliza diferentes mezclas de gases,
siendo las más frecuentes el aire-acetileno y el óxido nitroso-acetileno.
3.6. Espectrometría de absorción atómica por vapor frío: Es un método utilizado para
mejorar la sensibilidad de la absorción atómica, optimizando la eficiencia de muestreo
en el quemador de premezcla; en donde el mercurio se reduce químicamente al hidruro,
haciendo reaccionar la muestra con un reductor fuerte como cloruro estanoso o
borohidruro de sodio, en un recipiente de reacción cerrado.
El hidruro de mercurio volátil, se arrastra del matraz de reacción burbujeando argón o
nitrógeno a través de la solución. Los átomos de mercurio que se arrastran son
transportados a una celda de cuarzo que se coloca en el paso de luz del espectrómetro de
absorción atómica. A medida que los átomos de mercurio pasan por la celda de
muestreo, la absorbancia medida se incrementa indicando el aumento de concentración
en el paso de luz.
3.7. Límite de detección del método: Es la cantidad más baja de un residuo individual o
un componente de la muestra, que puede ser reproducido dentro de límites estadísticos
aceptables, cuando la muestra es sometida a un estudio interlaboratorio.
3.8. Muestra fortificada: Es un tejido blanco que ha sido adicionado de una
concentración conocida del analito.
3.9. Recuperación (R): Es el porcentaje del elemento o compuesto de interés (analito),
obtenido en la muestra fortificada (MF) calculado en función de la cantidad real
adicionada (CA).
R= MF x 100
CA
3.10. Tejido blanco: Es una muestra de tejido previamente analizada, que no contiene al
analito o que puede contenerlo en cantidades menores al límite máximo de residuos.
4. Símbolos y abreviaturas
g
gramo
G.R. grado reactivo
h
hora
Hg
mercurio
l
litro
mg
miligramo
µg
microgramo
min minuto
ml
mililitro
µl
microlitro
ppb partes por billón
ppm partes por millón
p/v
peso a volumen
v/v
volumen a volumen
%
porciento
5. Fundamento
Esta norma considera dos métodos de prueba, en los que se utilizan dos reductores
diferentes: el borohidruro de sodio y el cloruro estanoso.
El fundamento del primero en el que se usa el borohidruro es el siguiente: el tejido es
digerido con una solución de ácido nítrico a una presión alta. El ión mercurio es
reducido con borohidruro de sodio y la cuantificación de este elemento se lleva a cabo
por espectrometría de absorción atómica por vapor frío.
En el segundo, la muestra se digiere con una solución de permanganato de potasio-ácido
sulfúrico para liberar todo el mercurio orgánico como ión mercúrico. El exceso de
permanganato, es destruido con hidroxilamina y una reducción posterior con cloruro
estanoso al hidruro, facilita la medición del mercurio volátil en el aire. El límite de
detección es de 0.01 µg de mercurio.
6. Equipo
- Aparatos
- Celda espectrofotométrica de cuarzo de flujo continuo cilíndrica de 100-150 mm.
- Equipo de aereación que consiste en un tanque de aire con un filtro, conectado a un
medidor de flujo y éste a su vez a una llave de tres pasos o tres vías, la cual dá al matraz
de reacción de pera y a la trampa de agua y finalmente ésta conecta con la celda de flujo
continuo. Si la corrección del ruido basal es inadecuada, se sugiere poner ácido
sulfúrico concentrado en la trampa de agua, aproximadamente 5 mm en el final del tubo.
- Tubo de aereación
- Trampa de agua
- Llave de tres pasos o tres vías
- Medidor de flujo con un rango de 0-1.7 l/min
- Platina de calentamiento con agitador magnético
- Baño de vapor
- Picadora de alimentos
- Licuadora
- Autoclave
6.2. Instrumentos
- Espectrofotómetro de absorción atómica, equipado con corrector de fondo.
- Generador de hidruros para absorción atómica con reservorio para el reductante,
frascos de reacción y celda de cuarzo.
- Balanza granataria con sensibilidad de 0.01 g
7. Reactivos, soluciones y materiales
7.1. Reactivos
- Acido nítrico (HNO3) grado suprapuro
- Acido nítrico G.R.
- Hidróxido de sodio (NaOH) G.R.
- Borohidruro de sodio (NaBH4) G.R.
- Clorhidrato de hidroxilamina (NH2OH.HCl) G.R.
- Permanganato de potasio (KMnO4) G.R.
- Cloruro estanoso (SnCl2) G.R.
- Acido sulfúrico (H2SO4) concentrado G.R.
- Acido clorhídrico G.R.
- Agua destilada desionizada
7.2. Soluciones
- Acido nítrico al 25 % (v/v) .- Diluir 25 ml de HNO3 G.R. a 100 ml con agua destilada
desionizada.
- Acido nítrico al 50% (v/v).- Diluir 50 ml de HNO3 G.R. con 50 ml de agua destilada
desionizada.
- Acido nítrico al 2 % (v/v).- Diluir 2 ml de HNO3 grado suprapuro a 100 ml con agua
destilada desionizada.
- Solución de clorhidrato de hidroxilamina al 10% (p/v).- Disolver 25 g de NH2OH.HCl
en aproximadamente 200 ml de agua destilada desionizada, transferir a un matraz
volumétrico de 250 ml y diluir a volumen.
- Solución de hidróxido de sodio al 0.5% (p/v).- Pesar 0.5 g de NaOH y diluir a 100 ml
con agua destilada desionizada.
- Solución de borohidruro de sodio al 3 % (p/v).- Pesar 3g de NaBH4 y diluir a 100 ml
con la solución de NaOH al 0.5 % y filtrar a través de papel filtro Whatman número 2.
- Solución de permanganato de potasio al 6% (p/v).- En un vaso de precipitado de 1 litro
disolver 60 g de KMnO4 en aproximadamente 800 ml de agua destilada desionizada,
usando la platina con agitador magnético y calentando moderadamente. Transferir la
solución a un matraz volumétrico de 1 litro, enfriar y diluir a volumen con agua
destilada y mezclar bien.
- Solución de cloruro estanoso al 10 % .- Disolver 20 g de SnCl2.2H2O en 40 ml de
HCl concentrado caliente. Cuando todo el SnCl2 ha sido disuelto, agregar 160 ml de
agua destilada. Mezclar bien y guardar en frasco ámbar de reactivos de 250 ml.
7.3. Materiales
- Lámparas de cátodo hueco de Hg o lámparas de descarga sin electrodos de Hg.
- Cuchillo o escapelo con bisturí.
- Matraces Erlenmeyer de 125 ml con tapón esmerilado juntas 24/40.
- Matraces volumétricos de 1000, 250, 100, 50 y 10 ml.
- Pipetas volumétricas de 20, 5 y 1 ml.
- Pipetas graduadas de 1 ml.
- Matraces de pera de 100 ml.
- Probetas de 100 y 50 ml.
- Vasos de precipitado de 1000 y 10 ml.
- Frasco de reactivos ámbar.
- Microjeringas de 50 µl.
- Barras magnéticas.
- Papel filtro Whatman número 2.
- Masking tape.
El material de vidrio utilizado deberá someterse a lavado de acuerdo a las siguientes
instrucciones:
El detergente que se use deberá ser de preferencia neutro.
Enjuagar perfectamente con agua corriente.
Sumergir el material de vidrio, en un recipiente de preferencia plástico que contenga
una solución de ácido nítrico G.R. al 30 %.
Dejarlo tapado y reposando durante 24 h.
Quitar el exceso de ácido nítrico enjuagando 5 o 6 veces con agua destilada desionizada.
Dejar escurrir y secar.
Guardar en cuanto esté seco.
8. Estándares
8.1. Estándares patrón
Utilizar soluciones estándares de referencia o patrón certificadas para absorción
atómica, de mercurio inorgánico y orgánico de 1000 µg/ml.
9. Procedimiento No. 1
9.1. Preparación de estándares
9.1.1. Estándares intermedios
- Solución A (100 µg/ml).- Tomar 1 ml de la solución patrón y llevar a 10 ml con la
solución de HNO3 al 2 %.
- Solución B (10 µg/ml).- Diluir 1 ml de la solución A y llevar a 10 ml con agua
destilada desionizada.
- Solución C (1 µg/ml).- Diluir 1 ml de la solución B y llevar a 10 ml con agua destilada
desionizada.
9.1.2. Estándares de calibración.
A partir de la solución de 1 µg/ml preparar estándares de 0.02, 0.06 y 0.10 µg/ml,
colocando 0.2, 0.6 y 1.0 ml en matraces volumétricos de 10 ml y llevando al aforo con
agua destilada desionizada.
9.1.3. Estándar para fortificar.
Usar el estándar de 0.1 µg/ml y adicionar 1 ml a 0.5 g de tejido blanco homogeneizado.
9.2. Preparación de la muestra
9.2.1. Músculo.- Quitar tanto como sea posible la grasa del tejido, usando el cuchillo o
bisturí. Pasarlo rápidamente 3 veces a través de una picadora de alimentos, mezclar
completamente después de cada pasada.
9.2.2. Hígado o riñón.- Con el cuchillo o el bisturí, eliminar tanto como sea posible la
grasa y el tejido conectivo del hígado y el riñón, colocar los tejidos por separado en una
licuadora y licuar hasta que estén bien homogeneizados. Licuar un minuto y enfriar otro
minuto. Congelar las muestras si no van a ser analizadas inmediatamente.
9.3. Digestión
9.3.1. Pesar un matraz Erlenmeyer de 125 ml.
9.3.2. Dentro del matraz, colocar aproximadamente de 0.50 a 0.60 g del tejido
homogeneizado, teniendo cuidado que toda la muestra sea depositada en el fondo del
matraz y no quede nada en el cuello.
9.3.3. Pesar nuevamente el matraz y obtener por diferencia el peso de la muestra con
aproximación de 0.01 g.
9.3.4. Adicionar l0 ml de la solución de ácido nítrico al 25% y tapar el matraz con su
tapón esmerilado junta 24/40.
9.3.5. Sellar el tapón con masking tape y colocar el matraz en el autoclave a 125°C o 15
libras por 30 min.
9.3.6. Enfriar el matraz a temperatura ambiente y analizar el contenido de mercurio por
absorción atómica.
9.3.7. Los estándares de calibración deberán seguir el mismo procedimiento de
digestión para lo cual, se preparan 8 matraces Erlenmeyer de 125 ml y se adicionan en
cada uno 10 ml del HNO3 al 25 % y 1 ml de cada estándar de mercurio por duplicado
(0, 0.02, 0.06 y 0.1 µg/ml).
9.3.8. Correr un tejido blanco y una muestra fortificada por cada serie de digestión.
9.4. Resumen del método
El método anteriormente descrito se resume de la siguiente manera:
Pesar de 0.5. a 0.6 g de
muestra en un matraz
Erlenmeyer de 125 ml
De igual forma pesar tejido
blanco y muestra para
fortificar
Preparar 8 matraces
Erlenmeyer de 125 ml para
los estándares de
calibración
Adicionar a todos los
matraces 10 ml de HNO3 al
25%, tapar y sellar
Colocar en autoclave a 125°C
o 15 libras por 30 min
Enfriar y analizar por
absrción atómica
9.5. Cuantificación
9.5.1. Siguiendo las instrucciones del fabricante. Montar el generador de hidruros al
espectrofotómetro de absorción atómica; alinear la posición de la celda de cuarzo y
optimizar la intensidad de la señal ajustando la posición de la lámpara y la longitud de
onda.
9.5.2. Dejar calentar las lámparas de mercurio y deuterio por lo menos 15 min antes de
iniciar el análisis.
9.5.3. Llenar el reservorio del reductante con la solución de borohidruro de sodio al 3%.
9.5.4. Abrir la válvula del cilindro de argón y dejar estabilizar el flujo por lo menos
durante 1 min.
9.5.5. Llevar a 0 de absorbancia con la solución de HNO3 al 25 %.
9.5.6. Introducir los estándares de calibración de menor a mayor concentración.
Registrar su absorbancia o graficar los picos de cada uno.
9.5.7. Continuar con el tejido blanco, la muestra fortificada, así como las muestras a
analizar y registrar los valores de absorbancia o el área de los picos.
9.5.8. Elaborar una curva de calibración graficando la absorbancia o área del pico en
función de la concentración.
9.5.9. Se deben analizar al menos un tejido blanco y muestra fortificada por cada grupo
de muestras. Calcular la exactitud como el porcentaje de recuperación de acuerdo a:
R= MF - TB x 100
CA
Donde:
R = % de recuperación
MF = Concentración de la muestra fortificada
TB = Concentración del tejido blanco
CA = Concentración del analito añadido a la muestra
10. Procedimiento No. 2
10.1. Preparación de estándares.
10.1.1. Estándares intermedios.
Solución A) estándar de Hg inorgánico de 10 µg/ml.
Solución B) estándar de Hg orgánico de 10 µg/ml.
Identificar dos matraces volumétricos de 100 ml como A y B, colocar una alícuota de 1
ml de la solución patrón correspondiente en cada matraz y llevar a volumen con la
solución de HNO3 al 2%. Mezclar bien.
10.1.2. Estándares de calibración.- Preparar antes de usar.
ml solución A volumen final µg de Hg en 20 µl
con agua destilada
1.0
10 ml 0.02
3.0
10 ml 0.06
5.0
10 ml 0.10
Si se encuentran muestras con cantidades altas de Hg, la curva estándar puede ampliarse
usando soluciones estándares de 0.2, 0.6 y 1.0 µg de Hg en 20 µl.
10.1.3. Estándar para fortificar, solución C.
ml solución B volumen final µg/ml
con agua destilada
5.0
10 ml 5.0
Para la muestra de recuperación agregar 20 µl de la solución C (0.10 µg) a 0.750 g de
tejido homogeneizado.
10.2. Preparación de la muestra.
Proceder como se indica en los anteriores puntos 9.2.1. y 9.2.2.
10.3. Digestión.
10.3.1. Poner aproximadamente 0.600-0.750 g del tejido homogeneizado en un matraz
de pera de 100 ml, previamente tarado, teniendo cuidado de que toda la muestra sea
depositada en el fondo del matraz y no quede nada en el cuello.
10.3.2. Pesar nuevamente el matraz y obtener el peso de la muestra por diferencia, con
aproximación de 0.01 g. Tapar con un vaso de precipitado de 10 ml invertido sobre el
matraz. Este vaso se deja sobre el matraz durante todas las etapas de la digestión.
10.3.3. Colocar de 5.0 ml de H2SO4 concentrado dentro del matraz y colocarlo en un
baño de vapor para digerir la muestra, que generalmente se requieren de 20 a 45 min.
Agitar el matraz durante la digestión. La muestra completamente digerida forma una
solución altamente colorida, sin materia no disuelta, aunque puede estar ligeramente
turbia.
En este punto, debe tenerse mucho cuidado que toda la muestra esté en solución y no
haya partículas en los lados del matraz o suspendidas en la solución. Si ésto se presenta,
la digestión no será completa.
10.3.4. Colocar el matraz en un baño de hielo de 5 a 10 min. Agregar 15.0 ml de
solución de KMnO4 al 6% dentro del matraz, agitar suavemente al principio y después
vigorosamente, hasta que la muestra esté bien mezclada. Poner la muestra en un soporte
y continuar hasta que la solución de KMnO4 haya sido adicionada a todas las muestras.
10.3.5. Agitar y poner el matraz en baño de vapor y dejar digerir más la muestra. Agitar
el matraz ocasionalmente y continuar el calentamiento hasta que la espuma desaparezca
(de 15 a 20 min), no debiendo calentar más de lo necesario. Puede quedar un poco de
espuma presente después de que la reacción ha terminado.
10.3.6. Remover el matraz del baño de vapor y agregarle 5.0 ml de solución de KMnO4
al 6 %.
10.3.7. Regresar el matraz al baño por 15 min.
10.3.8. Enfriar el matraz a temperatura ambiente y analizar el contenido de mercurio por
absorción atómica.
10.3.9. Correr un blanco de reactivos, un tejido blanco y una muestra fortificada por
cada serie de digestión.
10.4. Preparación de la curva de calibración
10.4.1. Preparar 8 matraces de pera de 100 ml y adicionar dentro de cada uno 20 ml de
solución de KMnO4 al 6%. Tapar los matraces con vasos de precipitado de 10 ml
invertidos.
10.4.2. Enfriar los matraces en un baño de hielo por unos minutos; lenta y
cuidadosamente agregar 5.0 ml de H2SO4 concentrado en cada matraz. Agitar
suavemente y dejar enfriar.
10.4.3. Con una microjeringa adicionar por duplicado 20 µl de cada estándar inorgánico
(1, 3, y 5 µg/ml). En los dos matraces restantes no agregar nada. La cantidad total de Hg
será de 0, 0.02, 0.06 y 0.1 µg en los matraces correspondientes.
10.4.4. Enfriar los matraces a temperatura ambiente previamente a la aereación y al
análisis por absorción atómica.
10.5. Resumen del método.
El método anteriormente descrito se resume de la siguiente manera:
Homogenizar la muestra
Pesar 0.60-0.75 g en un
matraz de pera. Preparar
además, blanco de reactivos,
tejido blanco y
recuperación.
Agregar 5.0 de H2SO4 y
digerir en baño de vapor de
20 a 40 min, agitando
durante ese tiempo.
Poner el matraz en baño de
hielo de 5 a 10 min. Agregar
15.0 ml de KMnO4 al 6%.
Mezclar bien.
Agitar, colocar en baño de
vapor hasta que desaparezca
la espuma, de 15 a 20 min.
Remover el matraz del baño
del vapor y agregar 5.0 ml
más de KMnO4 al 6%.
Colocar nuevamente en el
baño de vapor por 15 min.
Preparar la curva estándar.
Enfriar a temperatura
ambiente y analizar el
contenido de Hg por
absorción atómica.
10.6. Cuantificación
10.6.1. Montar el aparato de aereación al equipo de absorción atómica de acuerdo al
diagrama de flujo del anexo 1. Fijar el flujo de aire para dar una buena sensibilidad y
poca espuma (0.7-1.0 l/min).
10.6.2. De acuerdo a las instrucciones del fabricante, alinear la posición de la celda,
optimizar la intensidad de la señal, ajustando la posición de la lámpara y la longitud de
onda. Dejar calentar durante 15 min.
10.6.3. Agregar 5.0 de ml de solución de NH2OH.HCl al 10% al matraz de digestión y
agitar para disolver los óxidos de manganeso. Adicionar aproximadamente 10 ml de
agua destilada para llevar a un volumen final de 40 ± 2 ml. Esta solución no deberá
tener ningún color o partículas suspendidas, pero puede estar ligeramente turbia.
10.6.4. Adicionar 2 ml de solución de SnCl2.2H2O al 10% e inmediatamente aerear la
solución.
10.6.5. Descontinuar la aereación después de que la pluma del registrador ha regresado
a unas 2 o 3 divisiones de la carta de la línea base original, generalmente de 1 a 1½ min
de lectura dependiendo de la proporción de la aereación.
10.6.6. Introducir el blanco de reactivos y los estándares de calibración de menor a
mayor concentración. Registrar la absorbancia o graficar los picos de cada uno.
10.6.7. Continuar con el tejido blanco, la muestra fortificada, así como las muestras a
analizar y registrar los valores de absorbancia o el área de los picos.
10.6.8. Elaborar una curva de calibración graficando la absorbancia o área del pico en
función de la concentración.
10.6.9. Se deben analizar al menos un tejido blanco y muestra fortificada por cada grupo
de muestras. Calcular la exactitud como el porcentaje de recuperación de acuerdo a:
R = MF - TB x 100
CA
Donde:
R = % de recuperación.
MF = Concentración de la muestra fortificada.
TB = Concentración del tejido blanco.
CA = Concentración del analito añadido a la muestra.
11. Resultados
11.1. Cálculos
11.1.1. Calcular el área de los picos de los estándares de calibración, multiplicando la
altura por la mitad de su ancho y ajustar la curva mediante la ecuación de regresión: y =
mx + b
El coeficiente de correlación obtenido deberá estar comprendido entre 0.998 - 1.000.
Donde:
y = área del pico.
x = concentración en µg/g.
m = pendiente.
b = intercepto y.
11.1.2. De la ecuación de regresión, despejar x para calcular la concentración de cada
muestra sustituyendo los valores de y, m y b y dividir entre el peso de la muestra en g
para obtener ppm analizadas.
Las ppm corregidas se calcularán mediante la siguiente fórmula:
ppm (µg/g) = ppm analizadas x 100
corregidos % de recuperación
11.2. Informe de resultados
Estos se reportarán en ppm o ppb del elemento encontrado.
12. Sanciones
El incumplimiento a las disposiciones contenidas en la presente norma, será sancionado
conforme a lo establecido en la Ley Federal de Sanidad Animal y la Ley Federal sobre
Metrología y Normalización.
13. Concordancia con normas internacionales
Esta Norma Oficial Mexicana no es equivalente con ninguna norma internacional.
14. Bibliografía
Analytical Methods for Atomic Absorption Spectrophotometry, 1982. Perkin-Elmer,
Corp. U.S.A.
Análisis de Mercurio en músculo, riñón e hígado por Espectrofotometría de Absorción
Atómica. Manual de Procedimientos del Laboratorio de Residuos Tóxicos y
Contaminantes. Revisión 1992. Centro Nacional de Servicios de Constatación en Salud
Animal SARH.
Determination of Mercury in Fish (Atomic Absorption Spectrometric Method) Method
CAS-AM-70.10, june 11, 1970, Dow Chemical Company, Midland, MI 48640.
Determination of Mercury in Liver, Muscle, Kidney or Hair by Atomic Absorption
Spectrophotometry., 1986. 5.007 Chemistry Laboratory Guidebook. Food Safety and
Inspection Service. Science, USDA.
Manning, D.C. Compensation for Broad-Band Absorption Interference in the Flameless
Atomic Absorption Determination of Mercury, Atomic Absorption Newsletter, Vol. 9,
No. 5 (Sept-Oct 1970), pg. 109.
MHS-10 Mercury/Hydride System, operators Manual, Perkin-Elmer, instrument
Division, Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, CT 06856, USA.
Norma-Z-013/02 1981. Guía para la redacción, estructuración y presentación de las
Normas Oficiales Mexicanas, Secretaría de Comercio y Fomento Industrial.
Kothandaraman, P., and Dallmeyer, J.F., Improved Desiccator for Mercury Cold Vapor
Technique, Atomic Absorption Newsletter, Vol. 15, No. 5 (Sep-Oct 1976), pg. 120-121.
15. Disposiciones transitorias
Esta Norma entrará en vigor al día siguiente de su publicación en el Diario Oficial de la
Federación.
09-30-94 PROYECTO de Norma Oficial Mexicana NOM-018-ZOO-1994, Análisis de
arsénico, en hígado, músculo y riñón de bovinos, equinos, porcinos y ovinos por
espectrometría de absorción atómica.
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.Secretaría de Agricultura y Recursos Hidráulicos.- Comité Consultivo Nacional de
Normalización de Protección Zoosanitaria.
Héctor Campos López, Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de
Protección Zoosanitaria, con fundamento en los artículos 45, 46, fracción II y 47 de la
Ley Federal sobre Metrología y Normalización, me permito ordenar la publicación en el
Diario Oficial de la Federación del proyecto de Norma Oficial Mexicana por la que se
establece, con carácter obligatorio, el Análisis de arsénico en hígado, músculo y riñón
de bovinos, equinos, porcinos y ovinos por espectrometría de absorción atómica.
El presente proyecto se publica a efecto de que los interesados, dentro de los 90 días
naturales siguientes a la fecha de publicación del mismo, presenten sus comentarios ante
el Comité Consultivo Nacional de Normalización de Protección Zoosanitaria, sito en
Recreo número 14 piso 11, colonia Actipan, Delegación Benito Juárez código postal
03230 México, Distrito Federal.
Durante el plazo mencionado, los análisis que sirvieron de base para la elaboración del
proyecto de norma, estarán a disposición del público para su consulta en el domicilio
del Comité.
Dado en la Ciudad de México, Distrito Federal, a los veintinueve días del mes de agosto
de mil novecientos noventa y cuatro.
PROYECTO DE NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-018-ZOO-1994, ANALISIS
DE ARSENICO, EN HIGADO, MUSCULO Y RIÑON DE BOVINOS, EQUINOS,
PORCINOS Y OVINOS POR ESPECTROMETRIA DE ABSORCION ATOMICA.
PREFACIO
UNIDAD ADMINISTRATIVA RESPONSABLE DE LA ELABORACION DE ESTA
NORMA OFICIAL MEXICANA:
- DIRECCION GENERAL DE SALUD ANIMAL.
EN LA ELABORACION DE ESTA NORMA PARTICIPARON LOS ORGANISMOS
SIGUIENTES:
- SMITHKLINE BEECHAM FARMACEUTICA
- LABORATORIO NACIONAL DE SALUD PUBLICA
SECRETARIA DE SALUD
- INVESTIGACION Y CONTROL DE CALIDAD BIOQUIMICA, S.A.
- INSTITUTO MEXICANO DE TECNOLOGIA DEL AGUA. IMTA.
INDICE
1. OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACION
2. REFERENCIAS
3. DEFINICIONES
4. SIMBOLOS Y ABREVIATURAS
5. FUNDAMENTO
6. EQUIPO
7. REACTIVOS, SOLUCIONES Y MATERIALES
8. ESTANDARES
9. PROCEDIMIENTO DE EXTRACCION
10. PROCEDIMIENTO DE CUANTIFICACION
11. RESULTADOS
12. SANCIONES
13. CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES
14. BIBLIOGRAFIA
15. DISPOSICIONES TRANSITORIAS
1. Objetivo y campo de aplicación
1.1. Objetivo
Esta Norma es de observancia obligatoria en todo el territorio nacional y tiene por
objeto establecer el método de prueba, para la determinación de residuos de arsénico en
hígado, músculo y riñón de bovinos, equinos, porcinos y ovinos.
1.2. Campo de aplicación
Esta Norma es aplicable para todos los laboratorios de análisis de residuos tóxicos en
tejidos alimenticios primarios de origen animal, que hayan sido aprobados por la
Secretaría de Agricultura y Recursos Hidráulicos.
2. Referencias
Para la correcta aplicación de esta Norma debe consultarse la siguiente Norma Oficial
Mexicana:
NOM-003-ZOO-1994 Criterios para la Operación de Laboratorios de Pruebas
Aprobados en Materia Zoosanitaria.
NOM-004-ZOO-1993 Control de Residuos Tóxicos en Carne, Grasa, Hígado y Riñón
de Bovinos, Equinos, Porcinos y Ovinos.
NOM-008-SCFI-1993 Norma Oficial Mexicana. Sistema General de Unidades de
Medida.
3. Definiciones
Para efectos de esta norma, se entiende por:
3.1. Blanco de calibración del instrumento.- Es la solución del ácido usado como
diluente para ajustar a cero el aparato.
3.2. Blanco de reactivos.- Es la solución que contienen todos los reactivos usados en los
mismos volúmenes y concentraciones, que en el procesamiento de la muestra. Este
blanco debe seguir todos los pasos indicados en la técnica; ayuda a detectar trazas de
contaminación provenientes del material o reactivos usados.
3.3. Espectroscopía.- Area de la física y la química dedicada al estudio de la generación,
medición e interpretación de los espectros de energía que resultan de la emisión o
absorción de energía radiante.
3.4. Espectrometría.- Es una rama de la espectroscopía relacionada con la medición de
espectros.
3.5. Espectrometría de absorción atómica.- Es una rama del análisis instrumental, en el
que un elemento es atomizado en forma tal que permita la observación, selección y
medida de su espectro de absorción.
3.6. Espectrometría de absorción atómica por flama.- Es el método por el cual el
elemento se determina mediante un espectrofotómetro de absorción atómica, usado en
conjunto con un sistema de nebulización, un atomizador y una fuente de energía
radiante o luminosa.
La fuente de atomización, es un quemador que utiliza diferentes mezclas de gases,
siendo las más frecuentes el aire-acetileno y el óxido nitroso-acetileno.
3.7. Espectrometría de absorción atómica por generación de hidruros.- Las muestras
reaccionan en un dispositivo externo con un agente reductor, generalmente borohidruro.
Los productos gaseosos de reacción, hidruros volátiles, son arrastrados a una celda de
muestreo que se encuentra en el paso óptico del espectrofotómetro de absorción
atómica. La celda se calienta para disociar el hidruro gaseoso en átomos libres; la
absorción atómica crece y cae a medida que se crean los átomos y escapan de la celda
de absorción. Se mide el máximo de absorción o altura del pico.
3.8. Muestra fortificada.- Es un tejido blanco que ha sido adicionado de una
concentración conocida del analito.
3.9. Recuperación (R).- Es el porcentaje del elemento o compuesto de interés (analito),
obtenido en la muestra fortificada (MF) calculado en función de la cantidad real
adicionada (CA).
R= MFx100
CA
3.10. Tejido blanco.- Es una muestra de tejido previamente analizada, que no contiene
al analito o que puede contenerlo en cantidades menores al límite máximo de residuos.
4. Símbolos y abreviaturas
As
arsénico
cm
centímetro
g
gramo
G.R. grado reactivo
h
hora
l
litro
mg
miligramo
µg
microgramo
ml
mililitro
mm milímetro
min minuto
N
normal
ppb partes por billón
ppm partes por millón
%
porciento
°
grado
°C
grados centígrados
5. Fundamento
El arsénico es extraído de los tejidos por calcinación a una temperatura elevada en una
mufla. La matriz de la muestra es primero incinerada en la mufla, usando nitrato de
magnesio como un ayuda cenizas. Un segundo tratamiento de calor es aplicado para
remover cualquier cantidad de materia orgánica residual. Las cenizas se disuelven en
solución ácida. El arsénico es convertido a su hidruro volátil con borohidruro de sodio.
El hidruro es purgado continuamente con argón dentro de un atomizador apropiado de
un espectrofotómetro de absorción atómica y convertido en átomos en su fase gaseosa.
6. Equipo
6.1. Aparatos
- Picadora de alimentos
- Licuadora
- Estufa con entrada de aire seco, capaz de mantener una temperatura de 95 ± 5°C.
- Platina de calentamiento capaz de mantener una temperatura de 120 ± 10°C
- Válvula de control que reemplaza al nebulizador, con tubo capilar de 6 mm. Anexo 1.
- Adaptador para conexión con ángulo de 90° con llave reductora estándar unión interna
reductora estándar. Anexo 2.
6.2. Instrumentos
- Espectrofotómetro de absorción atómica, equipado con corrector de fondo y quemador
con entrada de aire, acetileno y argón.
- Sistema de generación de hidruros con reservorio para el reductante, frascos de
reacción, celda de cuarzo o equivalente
- Balanza granataria con sensibilidad de 0.01g.
7. Reactivos, soluciones y materiales
7.1. Reactivos
- Nitrato de magnesio hexahidratado G.R.
- Acido nítrico G.R. al 65%
- Acido clorhídrico G.R. al 37%
- Ioduro de potasio G.R.
- Borato tetrahidruro de sodio en lentejas 98% de pureza.
- Hidróxido de sodio G.R.
- Agua destilada desionizada
- Acetileno grado absorción atómica
- Argón purificado
7.2. Soluciones
- Solución de nitrato de magnesio hexahidratado al 6.67% p/v. Disolver 133.4 g de
Mg(NO3)2.6H20 en agua destilada desionizada y diluir a 2000 ml.
- Solución de nitrato de magnesio hexahidratado al 50% p/v.- Disolver 500 g de
Mg(NO3)2.6H20 en agua destilada y diluir a 1000 ml.
- Acido nítrico al 50%.- Diluir 50 ml de HNO3 G.R. con 50 ml de agua destilada
desionizada.
- Acido clorhídrico 4.5 N.- Diluir 372 ml de HCl concentrado a 1000 ml con agua
destilada desionizada.
- Solución de ioduro de potasio al 15% p/v.- En un matraz aforado de bajo actinio de
100 ml colocar 15 g de KI disolver y aforar con agua destilada desionizada. Preparar
una hora antes de usar.
- Solución de hidróxido de sodio al 1.0% p/v.- Disolver 1.0g de NaOH en 100 ml de
agua destilada desionizada.
- Solución de borohidruro de sodio al 3% p/v.- Disolver 3.0g de NaBH4 en 100 ml de
solución de NaOH al 1.0% y filtrar en papel filtro wathman número 2.
7.3. Materiales
- Lámparas de cátodo hueco para arsénico.
- Crisoles de 50 ml Vycor brand, porcelana, cuarzo o platino.
- Cuchillo o escapelo con bisturí
- Matraces Erlenmeyer de 125 ml con tapón esmerilado, junta 24/40.
- Tubo de tygon de 3/8 x 1/4 de pulgada de diámetro interno, de longitud suficiente para
unir el matraz Erlenmeyer generador de hidruros con la válvula de control conectada al
quemador.
- Matraces volumétricos de bajo actinio de 100 ml.
- Matraces volumétricos de 2000, 1000, 100, 50 y 10 ml.
- Pipetas volumétricas de 20, 10, 5, 4, 3, 2 y 1 ml.
- Espátulas acanaladas de acero inoxidable.
- Varilla de teflón o polipropileno.
- Papel filtro wathman número 2
El material de vidrio, no deberá ser sujeto a un lavado rutinario con jabón o detergente,
los cuales son fácilmente fuente de contaminación con fósforo. Si se lavan, el material
debe enjuagarse con agua regia y después con agua destilada desionizada tres veces
antes de usar.
8. Estándares
8.1. Estándares patrón
Utilizar soluciones estándares de referencia o patrón certificadas para absorción atómica
de arsénico. La concentración de las soluciones estándares comerciales es típicamente
de 1000 µg/ml.
8.1.1. Solución estándar de arsénico inorgánico de 1000 µg/ml.
8.1.2. Solución estándar de arsénico orgánico como ácido arsenílico de 1000 µg/ml.
Disolver 0.2897g de ácido arsenílico al 100% de pureza con agua destilada desionizada
y diluir a 100 ml.
8.2. Estándares intermedios
8.2.1. Solución de arsénico de 100 µg/ml. Diluir 10 ml de la solución patrón de arsénico
inorgánico u orgánico a 100 ml con HCl 4.5 N.
Debido a que la forma de arsénico usada para el crecimiento de los animales y de las
aves es orgánico, se prefiere el uso de la solución estándar de arsénico orgánico.
8.3. Estándares de calibración
Diluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 10 ml de la solución de arsénico de 100 µg/ml a 100 ml con
HCl 4.5 N, para dar estándares de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 10 µg/ml, respectivamente.
8.4. Estándar para fortificar las muestras.
Usar 1.0 ml del estándar de 4 µg/ml y fortificar 5 g de tejido.
9. Procedimiento de extracción
9.1. Preparación de la muestra
9.1.1. Músculo.- Quitar tanto como sea posible la grasa con el cuchillo o el bisturí.
Pasar el tejido muscular rápidamente 3 veces a través de una picadora de alimentos.
Mezclar completamente después de cada picado.
9.1.2. Hígado o riñón.- Quitar tanto como sea posible el tejido conectivo con el cuchillo
o el bisturí. Colocarlo en una licuadora y licuar hasta que el tejido esté homogeneizado.
No moler por periodos mayores de un minuto, ya que puede sobrecalentarse el tejido.
Dejar enfriar entre cada molienda.
Congelar las muestras si no van a ser analizadas inmediatamente después de recibidas.
Es conveniente usar bolsas de plástico lisas para congelar las muestras en porciones de 2
cm de espesor.
9.2. Digestión por vía seca (calcinación)
9.2.1. Pesar 5.0 g de la muestra molida en un crisol de 50 ml. Adicionar 3 ml de
solución de nitrato de magnesio al 50% y mezclar completamente.
9.2.2. Extender la mezcla en una capa uniforme cerca de los lados del crisol. Secar en
una estufa ajustada a 90 - 95°C hasta que la muestra esté completamente seca,
aproximadamente 6 h o toda la noche.
9.2.3. Poner la muestra en una mufla fría a menos de 80°C y elevar lentamente la
temperatura hasta 150°C en una proporción de 2-4°C/min. Mantener a 150°C hasta que
cesen los humos.
9.2.4. Incrementar gradual y lentamente la temperatura a 500-550°C, para evitar que la
muestra se incinere bruscamente y haya pérdida del analito. Mantener esa temperatura
por 8 a 16 h o toda la noche.
9.2.5. Apagar la mufla, remover el crisol y dejar enfriar a temperatura ambiente.
Si se utilizan crisoles de porcelana, enfriar dentro de la mufla para evitar la fractura del
crisol.
9.2.6. Humedecer las cenizas con 2 ml de ácido nítrico al 50% para remover cualquier
residuo de carbón. Debido a la alta concentración de la solución de nitrato de magnesio
usada, el residuo es mínimo, por lo que es suficiente humedecer completamente con
HNO3 al 50% y remover el exceso de ácido en una platina que se calienta lentamente,
hasta llegar a 120°C para eliminar el carbón. En caso contrario, colocar la muestra en
una mufla fría y elevar la temperatura 500 - 550°C manteniéndola por una hora.
9.2.7. Transferir las cenizas del crisol a un matraz Erlenmeyer de 125 ml usando cuatro
porciones de 10 ml c/u de HCl 4.5 N.
9.2.8. Agregar 2 ml de solución de ioduro de potasio al 15% y mezclar bien. Dejar
reposar 20 min antes de leer en el espectrofotómetro de absorción atómica.
9.2.9. Correr simultáneamente un blanco de reactivos, tejido blanco y muestra
fortificada por cada serie de digestión.
9.3. Preparación de la curva estándar
9.3.1. Preparar 20 matraces Erlenmeyer de 125 ml y pipetear 40 ml de HCl 4.5 N en
cada uno.
9.3.2. Medir por duplicado en cada matraz, las siguientes concentraciones de arsénico 0,
1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 y 10.0 µg de los estándares de calibración.
9.3.3. Adicionar 2 ml de solución de KI al 15%, mezclar bien y dejar reposar por 20 min
antes de leer.
9.3.4. Continuar con el procedimiento de cuantificación indicado en el punto 10.1. de
esta norma.
Para el procedimiento de cuantificación utilizando el sistema de generación de hidruros
con reservorio para el reductante, frascos de reacción, celda de cuarzo o equivalente, el
procedimiento de extración es igual desde el punto 9.1. hasta el 9.2.6. de esta Norma y
después continuar de la siguiente manera:
9.3.4.1. Transferencia de la muestra
Transferir las cenizas del crisol a un frasco de reacción, usando una porción de 10 ml de
ácido clorhídrico 4.5 N. Enjuagar el crisol con 5 ml de agua destilada y transferirla al
frasco de reacción.
A esta solución adicionar 1 ml de solución de Ioduro de potasio al 15% y mezclar bien,
dejar reposar 15 min antes de su análisis.
9.3.4.2. Preparación de la curva de estándares
Dentro de cada frasco de reacción, pipetear 10 ml de ácido clorhídrico 4.5. N
Adicionar por duplicado: 0.0, 1.0, 3.0, 5.0, 7.0 y 10.0 µg de arsénico de los estándares
de calibración.
Agregar 2 ml de ioduro de potasio y mezclar bien. Dejar reposar 15 min antes de su
análisis.
9.3.4.3. Continuar con el procedimiento de cuantificación indicado en el punto 10.2. de
esta Norma.
9.4. Resumen del método
9.4.1. El método para cuantificar por espectrofotometría de absorción atómica por
generación de hidruros, usando la válvula de reemplazo del nebulizador, se resume de la
siguiente manera.
Homogeneizar muestra
Pesar 5.0 ± 0.1 g en un
crisol Vycor. Preparar además
tejido blanco, recuperación y
crisol para blanco de
reactivos
Agregar 3.0 ml de Mg(NOH3)2 al
50% mezclar completamente
Secar toda la noche a 90 95°C
Colocar la muestra en una
mufla. Calentar lentamente a
500 ± 50 °C. Mantener a ésta temperatura toda la noche
Enfriar la muestra. Agregar 2 ml
de HNO3 al 50%. Evaporar en
una platina caliente
Calentar la muestra en una
mufla a 500-550°C por 1 h
Enfriar, agregar 10 ml de HCl
4.5 N. Agitar a disolver las
cenizas
Transferir a un matraz
Erlenmeyer de 125 ml
Lavar al crisol con 10 ml de
HCl 4.5 N (3 veces) y
transferir al matraz
Erlenmeyer
Preparar la curva estándar
Adicionar 2 ml de KI al 15% a
las muestras estándares
Reposar 20 min
Analizar por absorción
atómica
9.4.2. El método para cuantificar por espectrofotometría de absorción atómica, usando
el sistema de generación de hidruros con reservorio para el reductante, frascos de
reacción y celda de cuarzo o equivalente, queda resumido de la siguiente manera:
Homogeneizar muestra
Pesar 5.0 ± 0.1 g en un
crisol Vycor. Preparar además
tejido blanco, recuperación y
crisol para blanco de
reactivos
Agregar 3.0 ml de Mg(NOH3)2 al
50% mezclar completamente
Secar toda la noche a 90 95°C
Colocar la muestra en una
mufla. Calentar lentamente a
500 ± 50 °C. Mantener a ésta temperatura toda la noche
Enfriar la muestra. Agregar 2
ml de HNO3 al 50%. Evaporar en
una platina caliente
Calentar la muestra en una
mufla a 500-550°C por 1 h
Enfriar y transferir las
cenizas a un frasco de
reacción con 10 ml de HCl
4.5 N
Lavar el crisol con 5 ml de
agua destilada y transferir
al frasco de reacción.
Preparar la curva estándar
Adicionar 1 ml a las muestras
y 2 ml a los estándares de KI
al 15%
Reposar 15 min
Analizar por absorción
atómica
10. Procedimiento de cuantificación
10.1. Espectrofotometría de absorción atómica por generación de hidruros, usando la
válvula de reemplazo del nebulizador y el adaptador para conexión.
Determinación. Es necesario comprobar que se tiene una calibración inicial y periódica
aceptable.
10.1.1. Encender el equipo de absorción atómica según el manual de operación. Insertar
la lámpara de cátodo hueco y dar un periodo de calentamiento de 20 min.
10.1.2. Optimizar la intensidad de la señal, ajustando la posición de la lámpara, la
longitud de onda, la altura del quemador, la aspiración y la posición de la cabeza del
quemador.
Fijar la longitud de onda para arsénico en 193.7 nm y ajustar el flujo de los gases argón
e hidrógeno a una proporción de 60 ml/min para argón y 24 ml/min para hidrógeno o
los mejores flujos determinados experimentalmente.
10.1.3. Encender la flama, ajustar el instrumento a 0 de absorbancia con el blanco de
calibración de HCl 4.5 N.
10.1.4. Optimizar con un estándar de arsénico la respuesta del equipo al analito, por lo
general 10 ml de una solución de 5µg/ml dá una observancia de 0.2.
10.1.5. Introducir los estándares de calibración del analito, empezando con la
concentración mayor y continuar en orden descendente. Adicionar en el adaptador 2
lentejas de borohidruro de sodio y dejarlo caer dentro de la muestra. Registrar la
absorbancia o graficar los picos de cada uno.
10.1.6. Elaborar una curva de calibración, graficando la absorbancia o altura del pico en
función de la concentración.
La curva deberá ser lineal arriba de 4 µg con un poco de curvatura a niveles altos.
10.1.7. Introducir el blanco de reactivo, el tejido blanco, la muestra fortificada, así como
las muestras a analizar y registrar los valores de absorbancia.
10.1.8. Se deben analizar al menos un blanco de reactivos y muestras fortificadas por
cada grupo de muestras. Los valores obtenidos para los blancos de reactivo ponen de
manifiesto la calidad de los reactivos usados. Calcular para la muestra fortificada el
porcentaje de recuperación de acuerdo a:
R= MF - TB x 100
CA
Donde:
R= % de recuperación
MF= Concentración de la muestra fortificada
TB= Concentración del tejido blanco
CA= Concentración del analito añadido a la muestra
10.2. Espectrofotometría de absorción atómica por generación de hidruros, usando el
sistema de hidruros MHS-10.
10.2.1. Siguiendo las instrucciones del fabricante, montar el generador de hidruros al
espectrofotómetro de absorción atómica; alinear la posición de la celda de cuarzo y
optimizar la intensidad de la señal, ajustando la posición de la lámpara y la longitud de
onda.
Antes de adicionar el ioduro de potasio al 15% a las muestras y estándares, encender la
flama y dejar calentar 20 min la celda de cuarzo.
10.2.2. Calentar las lámparas de arsénico y deuterio, por lo menos 15 min antes de
iniciar el análisis.
10.2.3. Llenar el reservorio del reductante del MHS-10 con la solución de borohidruro
de sodio al 3%.
10.2.4. Abrir la válvula del cilindro de argón y dejar estabilizar el flujo por lo menos
durante 1 min.
10.2.5. Llevar a 0 de absorbancia con el blanco de calibración.
10.2.6. Introducir los estándares de calibración de menor a mayor concentración.
Registrar la absorbancia o graficar los picos de cada uno.
10.2.7. Continuar con el blanco de reactivos, el tejido blanco, la muestra fortificada, así
como las muestras a analizar y registrar los valores de absorbancia o la altura de los
picos.
10.2.8. Elaborar una curva de calibración, graficando la absorbancia o altura del pico en
función de la concentración.
La curva deberá ser lineal arriba de 4 µg con un poco de curvatura a niveles altos.
10.2.9. Se deben analizar al menos un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada
grupo de muestras. Los valores obtenidos para los blancos de reactivo ponen de
manifiesto la calidad de los reactivos usados. Calcular para la muestra fortificada el
porcentaje de recuperación de acuerdo a:
R= MF - TB x 100
CA
Donde:
R= % de recuperación
MF= Concentración de la muestra fortificada
TB= Concentración del tejido blanco
CA= Concentración del analito añadido a la muestra
11. Resultados
11.1. Cálculos
11.1.1. Construir la curva de calibración, graficando absorbancia o altura del pico, en
función de la concentración. Ajustar la curva mediante la ecuación de la recta: Y= mx +
b
11.1.2. Interpolar los valores de absorbancia o altura del pico de la muestra analizada en
la curva de calibración y obtener la concentración del elemento en la muestra, utilizando
las siguientes fórmulas:
ppm(µ/g) = µg de la curva stándar
analizadas
peso de la muestra en g
ppm(µ/g) = ppm analizadas x 100
corregidos
% recuperación
11.2. Informe de resultados
Estos se reportarán en ppm o ppb del elemento encontrado.
12. Sanciones
El incumplimiento a las disposiciones contenidas en la presente Norma, será sancionado
conforme a lo establecido en la Ley Federal de Sanidad Animal y la Ley Federal sobre
Metrología y Normalización.
13. Concordancia con normas internacionales
Esta Norma Oficial Mexicana no es equivalente con ninguna norma internacional.
14. Bibliografía
Análisis de Arsénico en carne por Espectrofotometría de absorción atómica. Manual de
Procedimientos del laboratorio de residuos tóxicos y contaminantes. Revisión 1992.
Centro Nacional de Servicios de Constatación en Salud Animal SARH.
Analytical Methods for Atomic Absorption Spectrophotometry, 1982. Perkin-Elmer,
Corp. U.S.A.
Arsenic Analysis in Meat and Meat Products by Atomic Absorption Spectrophotometry.
5.009 Chemistry Laboratory Guidebook. June 1987- Revision. Food Safety and
Inspection Service Science. United States Departament of Agriculture.
Arsenic and Tin Chemistry Laboratory Guidebook July 1991- Revision Food Safety and
Inspection Service Science. United States Departament of Agriculture.
E.F. Dalton and A.J. Malanoski: 1971 Atomic Absorption Newsletter Vol. 10 No. 4
H.L. Kahn and J.E. Schallis 1968. Atomic Absorption Newsletter 7.5
15. Disposiciones transitorias
Esta Norma entrará en vigor al día siguiente de su publicación en el Diario Oficial de la
Federación.
09-30-94
PROYECTO de Norma Oficial Mexicana NOM-019-ZOO-1994,
Determinación de cloranfenicol en músculo de bovinos, equinos, porcinos y ovinos por
cromatografía de gases.
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.Secretaría de Agricultura y Recursos Hidráulicos.- Comité Consultivo Nacional de
Normalización de Protección Zoosanitaria.
Héctor Campos López, Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de
Protección Zoosanitaria, con fundamento en los artículos 45, 46, fracción II y 47 de la
Ley Federal sobre Metrología y Normalización, me permito ordenar la publicación en el
Diario Oficial de la Federación del proyecto de Norma Oficial Mexicana por la que se
establece, con carácter obligatorio, la Determinación de cloranfenicol en músculo de
bovinos, equinos, porcinos y ovinos por cromatografía de gases.
El presente proyecto se publica a efecto de que los interesados, dentro de los 90 días
naturales siguientes a la fecha de publicación del mismo, presenten sus comentarios ante
el Comité Consultivo Nacional de Normalización de Protección Zoosanitaria, sito en
Recreo número 14 piso 11, colonia Actipan, Delegación Benito Juárez código postal
03230 México, Distrito Federal.
Durante el plazo mencionado, los análisis que sirvieron de base para la elaboración del
proyecto de Norma, estarán a disposición del público para su consulta en el domicilio
del Comité.
Dado en la Ciudad de México, Distrito Federal, a los veintinueve días del mes de agosto
de mil novecientos noventa y cuatro.
PROYECTO DE NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-019-ZOO-1994,
DETERMINACION DE CLORANFENICOL EN MUSCULO DE BOVINOS,
EQUINOS, PORCINOS Y OVINOS POR CROMATOGRAFIA DE GASES
PREFACIO
UNIDAD ADMINISTRATIVA RESPONSABLE DE LA ELABORACION DE ESTA
NORMA OFICIAL MEXICANA
- DIRECCION GENERAL DE SALUD ANIMAL
EN LA ELABORACION DE ESTA NORMA PARTICIPARON LOS ORGANISMOS
SIGUIENTES:
- SMITHKLINE BEECHAM FARMACEUTICA
- LABORATORIO NACIONAL DE SALUD PUBLICA
SECRETARIA DE SALUD
- INSTITUTO MEXICANO DE TECNOLOGIA DEL AGUA. IMTA
INDICE
1. OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACION
2. REFERENCIAS
3. DEFINICIONES
4. SIMBOLOS Y ABREVIATURAS
5. FUNDAMENTO
6. EQUIPO
7. REACTIVOS, SOLUCIONES Y MATERIALES
8. ESTANDARES
9. PROCEDIMIENTO DE EXTRACCION
10. PROCEDIMIENTO DE CUANTIFICACION
11. INFORME DE RESULTADOS
12. SANCIONES
13. CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES
14. BIBLIOGRAFIA
15. DISPOSICIONES TRANSITORIAS
1. Objetivo y campo de aplicación
1.1. Objetivo
Esta Norma es de observancia obligatoria en todo el territorio nacional y tiene por
objeto, establecer los métodos de prueba para la cuantificacion de residuos de
cloranfenicol en músculo de bovinos, equinos, porcinos y ovinos.
1.2. Campo de aplicación
Esta Norma se aplica a los laboratorios de análisis de residuos tóxicos en tejidos
alimenticios primarios de origen animal, que hayan sido aprobados por la Secretaría de
Agricultura y Recursos Hidráulicos.
1.3. La vigilancia de esta Norma corresponde a la Secretaría de Agricultura y Recursos
Hidráulicos, así como a los gobiernos de los estados, en el ámbito de sus respectivas
atribuciones y circunscripciones territoriales, de conformidad con los acuerdos de
coordinación respectivos.
1.4. La aplicación de las disposiciones previstas en esta Norma, compete a la Dirección
General de Salud Animal, así como a las Delegaciones estatales de la Secretaría de
Agricultura y Recursos Hidráulicos, en el ámbito de sus respectivas atribuciones y
circunscripciones territoriales.
2. Referencias
Para la correcta aplicación de esta Norma deben consultarse las siguientes Normas
Oficiales Mexicanas:
NOM-003-ZOO-1994 Criterios para la Operación de Laboratorios de Pruebas
Aprobados en Materia Zoosanitaria.
NOM-004-ZOO-1993 Control de Residuos Tóxicos en Carne, Grasa, Hígado y Riñón
de Bovinos, Equinos, Porcinos y Ovinos.
NOM-008-SCFI-1993 Norma Oficial Mexicana. Sistema General de Unidades de
Medida.
3. Definiciones
Para efectos de esta norma, se entiende por:
3.1. Coeficiente de correlación: Es la relación nominal, teórica o de una unidad
evidente, entre una variable y otra que hace mínima a la suma de los cuadrados de las
desviaciones de la primera con respecto a su proporcionalidad con la segunda.
Con proporcionalidad exacta, el coeficiente es 1 si no existe ninguna relación es cero.
La proporcionalidad inversa completa proporciona un valor de -1.
3.2. Cromatografía de gases: Es una técnica analítica que permite la separación física de
dos o más compuestos, basada en la diferente distribución en dos fases, una de las
cuales es estacionaria sólida o líquida y la otra móvil, en fase gaseosa.
3.3. Espectrometría de masas: Es una técnica analítica que mediante alto vacío, permite
la fragmentación de una muestra en fase vapor, así como la separación y detección de
los iones formados de acuerdo con su masa y su carga.
3.4. Muestra fortificada: Es un tejido blanco que ha sido adicionado de una
concentración conocida del analito.
3.5. Recuperación (R): Es el porcentaje del elemento o compuesto de interés (analito)
obtenido en la muestra fortificada (MF), calculado en función de la cantidad real
adicionada (C.A.)
R=MF x 100
CA
3.6. Tejido blanco: Es una muestra de tejido, previamente analizada, que no contiene al
analito o puede contenerlo en cantidades menores al límite máximo de residuos.
4. Símbolos y abreviaturas
amu unidades de masa atómica (por sus siglas en inglés)
CE
captura de electrones
CG
cromatografía de gases
cm
centímetro
EM espectrometría de masas
eV
electrón volt
g
gramo
G.A.R grado análisis de residuos
G.R. grado reactivo
HPLC cromatografía de líquidos alta resolución (por sus siglas en inglés)
l
litro
M
molar
m
metro
mg
miligramo
µA
microampere
m/z relación masa-carga
min minuto
ml
mililitro
mm milímetro
ng
nanogramo
ppm partes por millón
ppb partes por billón
rpm revoluciones por minuto
s
segundo
sol.
solución
µg
microgramos
µl
microlitros
µm
micrómetros
%
porciento
5. Fundamento
La cuantificación de residuos de cloranfenicol, se realiza por cromatografía de gases
con detector de captura de electrones, el meta-cloranfenicol es usado como estándar
interno; después de adicionarlo, la muestra es incubada con beta-glucoronidasa para
convertir cualquier monoglucorónido de cloranfenicol a cloranfenicol libre. El
cloranfenicol es extraído del músculo con acetato de etilo, el cual se concentra a
aproximadamente un ml. Se adiciona entonces una solución de cloruro de sodio al 4 %
y el resto del acetato de etilo es evaporado con nitrógeno. La solución salina se aplica a
una columna C18 para limpieza en fase sólida y el cartucho se acondiciona con una
mezcla de metanol-agua 20:80; el cloranfenicol se eluye con acetonitrilo. El eluato es
evaporado a sequedad y silanizado. El cloranfenicol se cuantifica por cromatografía de
gases con detector de captura de electrones usando una columna capilar DB-1. La
confirmación se lleva a cabo por cromatografía de gases - espectrometría de masas,
usando una columna capilar OV-1 y una ionización química de ión negativo.
6. Equipo
6.1. Aparatos.
- Picadora de alimentos.
- Aparato múltiple de vacío.
- Evaporador de nitrógeno.
- Centrífuga de 5000 rpm.
- Agitador vórtex.
- Homogeneizador de tejidos eléctrico.
- Incubadora capaz de regular la temperatura a 37°C.
- Módulo con bloques de calentamiento en seco capaz de regular la temperatura entre
temperatura ambiente y 100 °C.
- Potenciómetro con precisión de ± 0.1 unidades de pH.
- Balanza granataria.
- Balanza analítica.
6.2. Instrumentos.
6.2.1. Cromatógrafo de gases con inyector capilar, operado en la modalidad sin división
de flujo, con detector de captura de electrones Ni-63 o equivalente.
6.2.2. Cromatógrafo de gases-espectrómetro de masas extranuclear, cuadrupolar, con
entrada capilar, inyección sin división de flujo, con ionización química de ión negativo.
7. Reactivos, soluciones y materiales
7.1. Reactivos.
- Metanol HPLC o G.A.R.
- Acetato de etilo HPLC o G.A.R.
- Hexano HPLC o G.A.R.
- Cloroformo HPLC o G.A.R.
- Acetonitrilo HPLC o G.A.R.
- Ciclohexano grado pesticida.
- Sylon HTP o equivalente.
- Hexametildisilazano G.R.
- Clorotrimetilsilano G.R.
- Piridina G.R.
- Fosfato monobásico de potasio G.R.
- Fosfato dibásico de sodio G.R.
- Cloruro de sodio G.R.
- Beta-glucoronidasa tipo A-1x
- Perfluorotributilamina (PFTBA)
- Agua de alta pureza, resistencia específica de 18 megaohm/cm.
- Agua destilada.
7.2. Soluciones.
- Fosfato monobásico de potasio 0.1 M.- Pesar 13.61 g de KH2PO4, disolver y diluir a
1000 ml con agua destilada.
- Fosfato dibásico de sodio 0.1 M.- Pesar 14.20 g de Na2HPO4, disolver y diluir a 1000
ml con agua destilada.
- Solución reguladora de fosfatos.- Mezclar las soluciones de los fosfatos 0.1 M hasta
alcanzar un pH de 6.8 ± 0.1.
- Solución de beta-glucoronidasa.- Diluir con solución reguladora de fosfatos de pH 6.8
± 0.1, una cantidad adecuada de beta-glucoronidasa, para alcanzar una concentración de
4000 unidades por mililitro.
- Solución equivalente del Sylon HTP.- Mezclar hexametildisilazano,
clorotrimetilsilano y piridina, en las siguientes proporciones 3:1:9.
- Solución de cloruro de sodio al 4 %.- Pesar 4.0 g de NaCl disolver y diluir a 100 ml
con agua destilada.
7.3. Materiales.
- Helio alta pureza.
- Argón/metano 95/5 alta pureza.
- Isobutano o metano.
- Cuchillo o escapelo con bisturí.
- Espátulas.
- Pipetas serológicas desechables de 10 ml.
- Pipetas volumétricas de 10, 5, 4, 2 y 1 ml.
- Micropipeta de 50 a 200 µl.
- Matraces volumétricos de 1000 y 100 ml.
- Gradilla para tubos de ensayo.
- Tubos de centrífuga de vidrio de 50 ml con tapas de rosca recubiertas de teflón
- Microjeringas de 10 µl.
- Frascos cónicos para automuestreador de 1 ml o viales de 2 ml con insertos de 100µl.
- Tubos de cultivo de borosilicato de 10 ml de 13 x 10 mm.
- Pipetas Pasteur.
- Columnas C18 para limpieza en fase sólida de 3ml de 500 mg o cartuchos similares
C18.
- Tubos de centrífuga desechables de borosilicato de 15 ml con tapa fenólica de rosca o
equivalente.
- Frascos ámbar.
- Cronómetro.
- Columna para cromatografía de gases DB-1 de 30 m de longitud 0.254 mm de
diámetro interno, con una película de 0.25 µm de espesor o equivalente.
- Columna para cromatografía de gases OV-1 de 25 m de longitud 0.20 mm de diámetro
interno, de sílica fundida unida a metil silicona con un espesor de película de 0.33µm.
8. Estándares
Los estándares de referencia usados son:
Cloranfenicol de 99 % de pureza mínimo y Metacloranfenicol.
8.1. Soluciones Patrón 500 µg/ml.
Pesar 50 mg de los estándares de cloranfenicol y metacloranfenicol, ponerlos en
matraces volumétricos separados de 100 ml, disolver y llevar a volumen con metanol.
8.2. Soluciones intermedias 50 µg/ml.
Poner 10 ml de la solución patrón en un matraz volumétrico de 100 ml y diluir al
volumen con metanol.
8.3. Soluciones de trabajo 100 ng/ml.
Transferir 200 µl de la solución anterior a un matraz volumétrico de 100 ml y llevar a
volumen con metanol.
Todos los estándares deberán guardarse en frascos ámbar a -4°C. Las soluciones patrón
y las intermedias tienen una vida de anaquel de 6 meses y los estándares de trabajo de 1
mes.
9. Procedimiento de extracción
9.1. Preparación de las muestras.
9.1.1. Quitar tanto como sea posible, la grasa del músculo y el tejido conectivo del
hígado y el riñón, utilizando el cuchillo o el bisturí.
9.2. Extracción.
9.2.1. Pesar 10 ± 0.1 g de tejido molido y homogeneizado en un tubo de centrífuga de
50 ml.
9.2.2. De igual forma, preparar con cada serie de muestras un tejido blanco y tres
muestras para recuperación.
9.2.3. Adicionar a todas las muestras, 100 µl de metacloranfenicol estándar interno de la
solución de 100 ng/ml para tener 1 ppb.
9.2.4. Fortificar las 3 muestras de recuperación con 50, 100 y 200 µl del estándar de
trabajo, para tener respectivamente 0.5, 1.0 y 2.0 ppb.
9.2.5. Agregar a todas las muestras 15 ml de la solución reguladora de fosfatos de pH
6.8 ± 0.1 y 200 µl de la solución de beta-glucoronidasa (800 unidades).
9.2.6. Mezclar en un homogeneizador de tejidos por 30 a 60 s a temperatura ambiente.
9.2.7. Incubar todos los tubos a 37°C durante 90 min. Después de la incubación, poner
las muestras en refrigeración toda la noche.
9.2.8. Equilibrar los tubos a temperatura ambiente.
9.2.9. Agregar 15 ml de acetato de etilo a cada tubo.
9.2.10. Mezclar en agitador vórtex por 30 s para extraer el cloranfenicol.
9.2.11. Centrifugar a 2,000 rpm durante 2 min para separar las fases.
9.2.12. Remover la capa superior de acetato de etilo con una pipeta desechable y
transferir a un tubo de centrífuga limpio de 50 ml.
9.2.13. Repetir la extracción de las muestras, conforme al procedimiento establecido en
los puntos 9.2.9. al 9.2.12. de esta norma y combinar los extractos.
9.2.14. Reducir el volumen del acetato de etilo a 1 ml en evaporador de nitrógeno, con
un flujo bajo de nitrógeno, usando un baño seco de temperatura constante a 60°C.
9.2.15. Adicionar 4 ml de la sol. acuosa de NaCl al 4 % a todos los tubos y agitar en
vórtex durante 5 a 10 seg.
9.2.16. Continuar la evaporación del acetato de etilo en el evaporador de nitrógeno hasta
eliminar el acetato de etilo, dejando solo un pequeño residuo aceitoso.
9.2.17. Agregar 5 ml de hexano a los 4 ml de la capa acuosa de NaCl al 4 %. Agitar en
vórtex por 10 seg. Centrifugar a 2,000 rpm por 1 min. Remover la capa superior y
descartar.
9.2.18. Agregar nuevamente 5 ml de hexano a los 4 ml de la capa acuosa de NaCl al 4
%. Agitar en vórtex por 10 seg. Centrifugar a 2,000 rpm por 1 min. Remover la capa
superior y descartar.
El procedimiento establecido en los siguientes pasos del 9.2.19. al 9.2.22., deberán
realizarse inmediatamente uno tras otro y no permitir que seque el adsorbente.
9.2.19. Preparar una columna C18 para cada muestra, blanco y muestras fortificadas,
lavando cada columna secuencialmente con 5 ml de metanol, 5 ml de cloroformo, 5 ml
de metanol y 10 ml de agua destilada. Descartar los lavados.
9.2.20. Cargar el extracto acuoso completo dentro de la columna C18 usando una pipeta
Pasteur desechable. Descartar el eluato.
9.2.21. Lavar el tubo de la muestra mezclando en vórtex dos veces con 1 ml de agua
destilada y agregar los lavados a la columna C18. Descartar el eluato.
9.2.22. Lavar cada columna C18 con 1 ml de agua destilada seguido por 2 ml de una
mezcla de metanol:agua 20:80. Dejar eluir completamente el último lavado a través de
la columna. Descartar los lavados.
9.2.23. Eluir el cloranfenicol de la columna C18 con dos porciones de acetonitrilo de
1.5 ml cada una, colectando el eluato en un tubo de cultivo limpio de 10 ml.
9.2.24. Evaporar el eluato de acetonitrilo a aproximadamente 0.5 ml, NO A
SEQUEDAD, en un evaporador de nitrógeno usando un baño seco de temperatura
constante a 60°C con un flujo bajo de nitrógeno.
9.2.25. Transferir a un frasco cónico de 1 ml. Lavar el tubo de 10 ml adiconando 0.5 ml
de acetonitrilo, mezclando en vórtex 5 seg. y agregando al frasco de 1 ml. Evaporar a
sequedad suavemente con nitrógeno en un calentador seco a 60°C.
PRECAUCION: Evitar la presencia de humedad en los siguientes pasos.
9.2.26. Al residuo seco, agregar 200 ul de Sylon HTP o equivalente.
9.2.27. Tapar y agitar en vórtex 5 seg. Reaccionar a 60-70°C en un baño seco de
temperatura constante por 15 min.
9.2.28. Evaporar el exceso de reactivos en el módulo con bloques de calentamiento en
seco a 60°C con flujo bajo de nitrógeno, a aproximadamente 10 µl.
PRECAUCION: Un tiempo excesivo de secado puede resultar en pérdida del analito.
9.2.29. Reconstituir el residuo en 100 µl de una mezcla de ciclohexano:hexano 60:40,
agitar en vórtex 5 seg.
9.2.30. Inyectar un volumen adecuado en microlitros del material derivatizado, en
cromatógrafo de gases para determinación cuantitativa o en cromatógrafo de gasesespectrómetro de masas para confirmación.
9.3. Resumen del método
El método anteriormente descrito se resume de la siguiente manera:
Pesar 10.0 ± 0.1 g de tejido
muscular. Pesar además
tejido blanco y muestra de
recuperación. Agregar a
todos el estándar interno
Fortificar las muestras de
recuperación a 0.5, 1.0 y
2.0 ppb de cloranfenicol
Adicionar 15 ml de sol.
reguladora de fosfatos y 800
unidades de enzima, mezclar
e incubar a 37°C, 90 min.
Refrigerar toda la noche
Agregar 15 ml de acetato de
etilo. Mezclar. Centrifugar
a 2000 rpm. Transferir el
acetato de etilo a un tubo
de 50 ml repetir extracción
y combinar los extractos.
Evaporar a 1 ml a 60°C
Agregar 4 ml de NaCl al 4%.
Mezclar y evaporar el
sobrante del acetato de
etilo
A la capa acuosa de NaCl al
4% adicionar 5 ml de hexano,
mezclar, centrifugar a 2000
rpm. Remover la capa
superior y descartar.
Repetir este paso.
Aplicar los 4 ml de NaCl al
4% a una columna
acondicionada C18. Lavar con
1 ml de agua. Lavar con 2 ml
de metanol:agua 20:80.
Descartar los lavados. Eluir
con 2 x 1.5 ml de
acetonitrilo. Evaporar el
acetonitrilo a 0.5 ml.
Al residuo, adicionar 200 µl
de Sylon HTP. Reaccionar 15
min a 60°C. Evaporar el
reactivo en exceso
Reconstituir en 100 µl de
ciclohexano: hexano 60:40.
Inyectar en GC/EC o EC/MS
10. Procedimiento de cuantificación
10.1. Por cromatografía de gases con detector de captura de electrones.
Las siguientes condiciones son para un cromatógrafo de gases Hewlett - Packard
modelo 5880 y deberán considerarse como un ejemplo solamente. El analista deberá
optimizar éstos parámetros para el instrumento que esté usando.
10.1.1. Gas acarreador:
Helio a una velocidad lineal de 29 cm/seg.
10.1.2. Gas de compensación:
Argón/metano 95/5 con un flujo de 50 ml/min.
10.1.3. Temperatura inicial de la columna: 80°C.
10.1.4. Programación de temperatura:
Programar a 30°C/min hasta 260°C,
mantenerla
durante 10 minutos o hasta que el isómero meta y
el cloranfenicol hayan eluido. Programa
nuevamente a 30°C/min hasta 300°C.
10.1.5. Temperatura final de la columna: 300°C por 5 min para asegurar que toda la
muestra
ha sido eluída.
10.1.6. Temperatura del inyector: 280°C
10.1.7. Temperatura del detector: 350°C
10.1.8. Sensibilidad: Atenuación2/8
10.1.9. Tiempo de retención esperado:
Metacloranfenicol de 9.5 a 10.5 min.
Cloranfenicol de 10 a 11 min.
10.1.10. Respuesta esperada: 50% de la escala completa para 2 µl del volumen
final de extracción, que equivale a 0.2 ng de
cloranfenicol.
Inyectar el blanco, las recuperaciones y las
muestras.
10.2. Cálculos
10.2.1. Medir la altura del pico o área del pico, para cada compuesto en las muestras
fortificadas de 0.5, 1.0 y 2.0 ppb, que han sido trabajadas de acuerdo al procedimiento y
calcular la relación de altura o área del pico.
Relación de = altura o área del pico de cloranfenicol
altura o área altura o área del pico de metacloranfenicol
del pico.
10.2.2. Con las relaciones de altura o picos y sus correspondientes concentraciones en
ppb, calcular la regresión lineal de la curva de calibración por el método de mínimos
cuadrados.
y = mx + b
Donde:
y = Relación de altura o área del pico
x = Concentración de cloranfenicol en ppb
m = Pendiente
b = Intercepto
El coeficiente de correlación deberá ser mayor o igual a 0.9945.
10.2.3. Usando la pendiente de regresión y el intercepto, calcular la concentración del
cloranfenicol (x) para cada muestra, con la relación de altura o área de pico obtenida.
10.3. Cuantificación por Cromatografía de gases-Espectrometrometría de masas.
10.3.1. Condiciones y parámetros para CG.
Las siguientes instrucciones son para el instrumento descrito en el punto 6.2.2. de esta
norma y se presentan como un ejemplo. El analista deberá optimizar los parámetros para
el instrumento que esté usando.
- Columna: OV-1 capilar de sílica fundida de 25 m de longitud.
- Temperatura del inyector: 230 °C
- Programación de temperatura:
Iniciar a 150°C e incrementar hasta 300°C a una
velocidad de 20°C/min. Mantener esta temperatura
durante 10 min.
- Temperatura de la línea de transferencia: 300°C.
- Velocidad lineal en la columna: 29 cm/s
- Modo de operación del inyector: Sin división de flujo
10.3.2. Condiciones para EM
- Detección: Ionización química por ión negativo mejorado.
- Gas de ionización: Isobutano o metano.
- Presión de la fuente: 1.0 x 10-5 T
- Temperatura de la fuente: 260°C
- Modo de operación: Monitoreo selectivo de ión negativo.
- Tiempo de búsqueda del ión:
10 milisegundos
- Estándar de calibración:
PFTBA; maximizar sobre el ión 452.
- Amplitud de barrido:
0.2 amu.
- Señal esperada/ruido de la menor
intensidad del ión: 10/1.
- Voltaje del filamento:
300 eV.
- Corriente del filamento:
1000 µA.
10.3.3. Determinación
- Inyectar de 2 a 5 µl del estándar externo y analizar los resultados para verificar que el
sistema está funcionando adecuadamente; en caso contrario, hacer los ajustes necesarios
en los parámetros de operación o en la concentración del estándar e inyectar
nuevamente para observar la resolución.
- Inyectar de 2 a 5 µl de cada una de las muestras para confirmación, la recuperación
(estándar de 0.5 ppb) y el tejido blanco. El análisis confirmatorio, se requiere en todas
las muestras que salgan positivas por el método cuantitativo CG/CE.
10.3.4. Criterio para confirmación
- Especificación del tiempo de retención. Comparar el tiempo de retención de la
muestra, con el tiempo de retención del tejido fortificado. Estos deberán estar en un ±
5%.
El siguiente es un ejemplo de tiempos de retención aceptables.
Compuesto Tiempo de retención esperado (min)
Metacloranfenicol
8.2 ± 0.5
Cloranfenicol 9.0 ± 0.5
- Los iones 468, 466, 322 y 304 deben estar presentes. En muestras con niveles altos de
cloranfenicol, se pueden monitorear los iones m/z 358 y 360.
- Calcular por lo menos las siguientes tres relaciones para el estándar, fortificación y
estándar, 466/468, 322/466 y 304/466. Para una confirmación exitosa entre 0.25 y 1.0
ppb, cualquiera de las relaciones de iones anteriores para la muestra deberá estar en un ±
20% de la relación para el tejido fortificado. En muestras con niveles altos de
cloranfenicol, calcular también las relaciones 358/466 y 358/360.
La relación de iones del estándar fortificado deberá igualar la relación de iones de la
muestra en un ± 20%. En las condiciones citadas, se espera lo siguiente:
466/468 = 1.43
322/466 = 0.49
304/466 = 0.57
Las relaciones dependen de la temperatura de la fuente.
11. Informe de resultados
Estos se reportarán en ppb.
12. Sanciones
El incumplimiento a las disposiciones contenidas en la presente norma, será sancionado
conforme a lo establecido en la Ley Federal de Sanidad Animal y la Ley Federal sobre
Metrología y Normalización.
13. Concordancia con normas internacionales
Esta Norma Oficial Mexicana no es equivalente con ninguna norma internacional.
14. Bibliografía
Análisis de cloranfenicol Manual de Procedimientos del Laboratorio de Residuos
Tóxicos y Contaminantes. Revisión 1992. Centro Nacional de Servicios de
Constatación en Salud Animal SARH.
Determination and confirmation of chloramphenicol in veal calf muscle. Chemistry
Laboratory Guidebook. july 1991-Revision. Food Safety and Inspection Service,
Science USDA.
Rowland, W.F. La práctica de la cromatografía de gases. Hewlett-Packard Co. 2a.
Edición (1a. en español) E.U.A.1977.
15. Disposiciones transitorias
Esta Norma entrará en vigor al día siguiente de su publicación en el Diario Oficial de la
Federación.