Estudio dE la ExprEsión difErEncial dE factorEs dE

Estudio de la expresión
diferencial de factores
de virulencia por distintos
aislamientos clínicos atípicos
de
Pseudomonas sp.
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ
Ricardo Duarte Jáquez
Rector
David Ramírez Perea
Secretario General
Manuel Loera de la Rosa
Secretario Académico
Daniel Constandse Cortez
Director del Instituto de Ciencias Biomédicas
Luis Enrique Gutiérrez Casas
Coordinador General de Investigación y Posgrado
Ramón Chavira Chavira
Director General de Difusión Cultural y Divulgación Científica
Universidad Autónoma de Ciudad Juárez
Estudio de la expresión
diferencial de factores
de virulencia por distintos
aislamientos clínicos atípicos
de
Pseudomonas sp.
Marisela Aguirre Ramírez
Ciencias Naturales y Exactas
Coordinación General de Investigación y Posgrado
Lisbeily Domínguez Ruvalcaba
Coordinadora de la colección
Aguirre Ramírez, Marisela.
Estudio de la expresión diferencial de factores de virulencia por distintos aislamientos clínicos atípicos de Pseudomonas sp. / Marisela Aguirre Ramírez. Ciudad Juárez, Chih. : Universidad Autónoma de Ciudad
Juárez, 2013. (Colección Textos Universitarios, Serie Investigación)
24 p.; 30 cm.
Incluye bibliografía
Colección Reportes Técnicos de Investigación Isbn: 978-607-7953-80-7
Serie ICB, Vol. 9. isBn: 978-607-9224-99-8
Contenido:
1.– Introducción. 2.– Planteamiento. 3.– Metodología. 4.– Resultados.
5.– Conclusiones.
D. R. © Aguirre Ramírez, Marisela.
La edición, diseño y producción editorial de este documento estuvo a cargo de la Dirección General de Difusión Cultural y Divulgación Científica, a través de la Subdirección
de Publicaciones.
Resumen
Abstract
Palabras clave
Usuarios potenciales
Reconocimientos
Índice
6
8
9
9
9
I. Introducción
El genoma de Pseudomonas aeruginosa
La respuesta sensora de quórum de Pseudomonas aeruginosa
11
12
II. Planteamiento
III. Metodología
IV. Resultados
Referencias
V. Conclusiones
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Resumen
P
seudomonas aeruginosa es una Gama-proteobacteria y patógeno oportunista de humanos. Es la principal bacteria Gram negativa responsable de
muertes a nivel hospitalario. El sistema sensor de quórum (QS por sus siglas en inglés) es la respuesta que regula la expresión de varios compuestos
citotóxicos y enzimas hidrolíticas que determinan la patogenicidad de la bacteria. La
piocianina derivada de las fenacinas, inhibe la respiración celular y produce el estrés
oxidativo. Elastasa, además de su actividad proteolítica de tejidos, es un inmunomodulador. Los ramnolípidos son biosurfactantes que tienen actividad hemolítica y
quimiotáctica neutrófilica.
Veinte y dos cepas fueron aisladas de pacientes adultos que presentaron neumonía
en el Hospital de Especialidades del “Centro Médico Nacional Siglo XXI_IMSS”. Estas
cepas comparten algunas características de Pseudomonas aeruginosa (crecimiento a
42º C expresión de oxidasa, el gen toxA), y fueron clasificadas fenotípicamente como
P. aeruginosa. Sin embargo, producen diferencialmente sus factores de virulencia y
la genotipificación por 16S y 23S no corresponde a la especie P. aeruginosa. Razón por
la cual se les dio el nombre de atípicas.
El objetivo de este proyecto es cuantificar la producción de piocianina, elastasa y
ramnolípidos patógeno atípico Pseudomonas spp. Para ello crecimos la bacteria en
condiciones de alta producción ramnolípidos (medio PPGAS) durante 24 horas. Utilizamos los métodos espectrofotométricos para cuantificar los tres tipos de factores de
virulencia antes mencionados. Por los resultados, se clasificaron las cepas en cuatro
grupos según el tipo de los patrones de expresión: 1) el que no produce ninguno de
los tres factores de virulencia; 2) la cepa que sobre expresa la de los tres factores de
virulencia; 3) el grupo que sobre expresa dos de los tres factores de virulencia y 4) el
grupo que sobre se expresa sólo uno de los tres factores de virulencia.
7
8
Abstract
P
seudomonas aeruginosa is an opportunistic human pathogen Gammaproteobacteria. It is the main Gram-negative bacterium responsible of nosocomial deaths. The quorum sensing (QS) response regulates the expression
of several cytotoxic compounds and hydrolytic enzymes that determine the
bacteria pathogenesis. The phenazyne derivative pyocyanin, inhibits cellular respiration and produces oxidative stress. Elastase, besides its broad tissue proteolitic
activity, is an immunomodulator. Rhamnolipids biosurfactans have haemolytic and
neutrophil chemotactic activity.
Twenty-two strains were isolated from patients of Hospital “Centro Médico Nacional Siglo XXI_IMSS”. These strains share some characteristics of Pseudomonas
aeruginosa (growth at 42o C, toxA gene, oxidase expression) and were phenotipicaly
clasified as they would be the same species. However, they produce diferentially their
virulence factors and the genotypification by 16S and 23S do not correspond to PAO1
strain. That is its atipical name.
The aim of this project is quantify the production of pyocyanin, elastase and rhamnolipids by the atypical pathogen Pseudomonas spp. For this purpose we grew the bacteria in high rhamnolipids production conditions (PPGAS medium) for 24 h. We used
spectrophotometric methods to quantify the three types of virulence factors. By the results, we classified the strains in four kind groups according to the expression patterns:
1) the one that do not produce any of the three virulence factors; 2) the strain that over
expresses the all three 3) the group that over expresses two of the three virulence factor
and 4) the group that over expresses just one of the three virulence factors.
Estudio de la expresión diferencial de factores de virulencia
por distintos aislamientos clínicos atípicos de Pseudomonas sp.
Palabras clave:
Pseudomonas aeruginosa, factores de virulencia.
Usuarios potenciales:
Los datos son de calidad suficiente para ser publicables en una revista de arbitraje internacional. Por lo que podrían ser de referencia para cualquier institución que
haga investigación básica y/o aplicada del tema.
Reconocimientos:
El presente trabajo es producto de la tesis de licenciatura de la alumna Alejándra
Cárdenas Rodríguez, que pertenece al programa de Química de ICB, UACJ.
El presente proyecto se ha realizado en colaboración con la Dra. Rosario Morales
Espinosa, la Mtra. Gabriela Delgado Sapién y el Técnico Juan Luis Sánchez Méndez del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Medicina,
UNAM. Este equipo nos proporcionó las cepas de trabajo se ha abocado a la caracterización genotípica y fenotípica de las muestras.
Se reconoce, además, el apoyo del Departamento de Ciencias Químico-Biológicas
del Instituto de Ciencias Biomédicas de la UACJ en el suministro de material e infraestructura para la realización del presente proyecto.
Abstract
9
I. Introducción
P
seudomonas aeruginosa es una γ-proteobacteria ubicua en la naturaleza, ya
que se puede encontrar en ambientes tan diversos como suelos, hábitats marinos, aguas someras, aguas prístinas y residuales y en tejidos de plantas y
animales (Soberón-Chávez, 2001). Asimismo, es de gran importancia médica
por ser un patógeno oportunista que infecta principalmente a pacientes con fibrosis
quística o inmunocomprometidos y por su alta resistencia natural a antibióticos. Adicionalmente, esta bacteria es capaz de degradar una gran variedad de compuestos orgánicos como hidrocarburos alifáticos, compuestos aromáticos y disolventes halogenados (Maier y Soberón-Chávez, 2000). La respuesta sensora de quorum en P. aeruginosa
regula la secreción de varios compuestos tóxicos y enzimas hidrolíticas involucrados en
la patogenicidad de la bacteria (Smith e Iglewski, 2003) y la producción de ramnolípidos, que es un biosurfactante relacionado en la formación de biopelículas (Davey y col.,
2003) y la utilización de hidrocarburos como fuente de carbono (Zhang y Miller, 1992).
El genoma de Pseudomonas aeruginosa
El “core” del genoma de P. aeruginosas se caracteriza por presentar una sintenia
altamente conservada y un bajo porcentaje de substitución nucleotídica (5%) (Kiewitz
y Tümmler, 2000; Spencer y col., 2003); incluso en aislamientos de hábitats alejados temporal y espacialmente, conservan dicha estabilidad genómica (Römling y col.,
1994). La presencia de islas e isletas genómicas determinan la parte variable del
genoma de distintas clonas o cepas específicas (Ernst y col., 2003; Wolfgang y col.,
2003); por lo que el tamaño del genoma de P. aeruginosa puede varía entre 5.2 y 7
Mpb (Schmidt y col., 1996). Asimismo, todos los factores de virulencia se encuentran
formando parte del “core” (Mathee y col., 2008) y no se observa una correlación entre
el contenido genómico de las cepas infecciosas y el medio ambiente en el que fueron
aisladas (Wolfgang y col., 2003); lo cual indica que todas las cepas de P. aeruginosa
son potencialmente patógenas.
11
12
La respuesta sensora de quórum
de Pseudomonas aeruginosa
La respuesta sensora de quorum (QS, por sus siglas en inglés) fue descrita
inicialmente en la bacteria marina Vibrio fischeri, la cual produce luz al colonizar y
aumentar su población en los órganos de luz de algunos peces y calamares (Fuqua y
col. 2001). El QS es un mecanismo genético que regula la expresión de los genes de
bioluminiscencia en condiciones de alta densidad poblacional. Esto se debe a que la
bacteria sintetiza y secreta al medio una molécula inductora (3-oxo-hexanoil homoserina lactona), que al aumentar su concentración interactúa con el factor transcripcional LuxR e induce la producción de luciferasa (Greenberg, 1997; Urbanowski y
col., 2004). La respuesta QS en P. aeruginosa es de mayor complejidad con respecto
a V. fischeri, no sólo por ser un sistema que involucra múltiples reguladores como se
describirá mas adelante, sino porque ser modulada por factores medioambientales y
diversas condiciones de estrés (Soberón-Chávez y col., 2005).
La expresión de los genes regulados por la respuesta QS en P. aeruginosa depende
de la síntesis de dos autoinductores (AI), la butanoil-homoserina lactona (C4-HSL)
y el 3-oxo-dodecanoil-homoserina lactona (3-O-C12-HSL), que al unirse a los reguladores transcripcionales RhlR y LasR, respectivamente, activan la transcripción de
diversos genes (Schuster y col., 2003; Wagner y col., 2003). Alrededor del 6% de genoma de P. aeruginosa es regulado por la respuesta QS (Schuster y col., 2003; Wagner
y col., 2003). Éste es un sistema jerárquico en el que LasR-3-O-C12-HSL activa la
transcripción de los genes rhlR (Latifi y col., 1996; Pesci y col., 1997; Medina y col.,
2003), rhlI (butanoil homoserina lactona sintasa, de Kievit y col., 2002) y lasI (3-oxododecanoil homoserina lactona sintasa, Seed y col., 1995), además de la de varios genes que codifican para factores de virulencia (van Delden y col., 1998). La regulación
dependiente de RhlR es un poco más compleja, promueve la expresión, entre otros,
de los genes encargados de la biosíntesis de ramnolípidos (rhlAB). En ausencia de
C4-HSL, RhlR puede actuar como represor de algunos genes como rhlR, rhlA, y lasB
(elastasa B) (Medina y col., 2003; Anderson y col., 1999) y en presencia de su AI puede
activar la expresión de rhlA, lecA (lectina PA-IL), y del operón phzA-G1 (biosíntesis
de piocianina) (Medina y col., 2003; Winzer y col., 2000; Gallagher y col., 2002).
P. aeruginosa produce una tercera molécula que regula la expresión de la respuesta QS, la 2-heptil-3-hidroxi-4-(1H)-quinolina, llamada PQS por sus siglas en inglés
Pseudomonas quinolone signal (Pesci y col., 1999). La señalización dependiente de
esta molécula afecta principalmente la expresión de los genes dependientes de RhlR
(lecA y phzA1) (McKnight y col, 2000; Diggle y col., 2003).
Estudio de la expresión diferencial de factores de virulencia
por distintos aislamientos clínicos atípicos de Pseudomonas sp.
II. Planteamiento
S
e aislaron 130 cepas, en su mayoría, de secreciones bronquiales de pacientes
que presentaron neumonía en el Hospital de Especialidades del Centro Médico Nacional Siglo XXI del IMSS por los doctores Gerardo González Valencia y Luis Casanova. En el laboratorio de la Dra. Rosario Morales, se llevó a
cabo una primer caracterización de las cepas a través de algunos marcadores característicos de P. aeruginosa. En todas las cepas se amplificó típicamente el gene toxA
(exotoxina A exclusiva de P. aeruginosa) (Wretlind y Pavlocskis, 1981); asimismo,
todas las cepas crecieron a 42° C (Gilardi, 1972) y presentaron actividad de oxidasa.
Aunque todas ellas coinciden con P. aeruginosa por el método de fenotipificación por
prueba de Api20 para Enterobacterias, veintitrés son diferentes en su patrón de corte
del operón 16S con al enzima I-CeuI (que corta específicamente en una secuencia de
19 pares de bases en el gen 23S del operón ribosómico), por lo cual se les denominó
atípicas (comunicación personal Gabriela Delgado). Adicionalmente, el grupo de la
Dra. Morales, a través de protocolos de hibridación con sondas específicas para los
genes 16S y 23S sobre los perfiles ribosómicos de las cepas atípicas, mostró la presencia de más de cuatro operones ribosómicos; los cual no se han reportado para
aislamientos de P. aeruginosa (comunicación personal Dra. Morales). Algunas de las
cepas atípicas presentan además, diferentes patrones de expresión de algunos factores de virulencia, como son la producción de espuma (ramnolípidos) en medio bajo de
fosfatos (PPGAS) y de pigmento verde-azul (piocinanina).
Por lo anterior, resulta importante la caracterización a nivel molecular de su sistema QS y la regulación de la expresión de sus factores de virulencia. De manera
particular, aquellas cepas que no sintetizan dichos factores pudieran formar parte
de un tipo poblacional recientemente caracterizado en aislamientos clínicos denominados “cheaters” (Sandoz y col., 2007; Diggle y col., 2007). P. aeruginosa se comporta
socialmente a través de la respuesta QS para la síntesis de exoproductos. Sin embargo, algunos individuos mutantes (principalmente en el gene lasR) de la población no
pueden responder a la señales QS, pero se aprovechan de los recursos de la población
general. En una población silvestre, después de nueve días de cultivo el 80% de las
cepas se vuelve mutantes en lasR (Köhler y col., 2009). Por lo que las “cheaters” son
13
14
poblaciones celulares que surgen a partir de cultivos silvestres de cepas patógenas
que se aprovechan de los recursos públicos sin un costo metabólico (Dunny y col.,
2008). Resulta interesante averiguar si los mecanismos de regulación del sistema QS
en éstas cepas atípicas es semejante al de una cepa tipo de P. aeruginosa; así como,
determinar si existe una correlación con su arreglo genómico.
Por lo que en esta parte el proyecto nos dimos a la tarea de cuantificar la producción de tres distintos factores de virulencia (piocianina, ramnolípidos y proteasas),
para posteriromente correlacioarla con la expresión de los genes biosintéticos en las
cepas atípicas y su producción de autoinductores.
Estudio de la expresión diferencial de factores de virulencia
por distintos aislamientos clínicos atípicos de Pseudomonas sp.
III. Metodología
P
. aeruginosa dirige la expresión de tres distinos factores de virulencia, como
son la piocinanina, las proteasas y los ramnolípidos, en respuesta a la regulación genética por el sistema QS (Soberón-Chávez y col., 2005). Las cepas
atípicas, de las cuales se hace mención en los antecedentes, presentan un
patrón variable de producción de algunos factores de virulencia. Por lo que quisimos
determinar la producción de los factores de virulencia. Para lo cual, crecimos las distintas cepas atípicas 24 h de crecimiento en medio PPGAS a 37° C. Las cepas PAO1 y
PAO1 (∆rhlR) se usaron como controles de produción positivo y negativo, respectivamente. La cuantificación de ramnolípidos totales se hizo por el método de detección
de azúcares reductores por orcinol (Chandrasekaran y Bemiller, 1980). Brevemente,
los ramnolípidos se extrajeron con éter a partir de un volumen de cultivo, éstos se resuspendieron en agua e hidrolizan con una solución de orcinol y ácido sulfúrico a 80°
C y se cuantificó a 421 nm en un espectrofotómetro. Las lecturas se interpolaron en
una curva de ramnosa y la concentración de los ramnolípidos se determimnó usando
el coeficiente de extinción molar del crotonato.
Para la cuantificación de piocianina en cultivos de 24 h a 37° C de las cepas atípicas de P. aeruginosa se llevó a cabo el protocolo descrito por Essar y col. (1990).
Brevemente, la extracción del pigmento azul se hizo con cloroformo a partir del sobrenadante de los cultivos. Dicha fase orgánica se acidificó con HCl 0.2N, la cual cambió
a color rojo y se midió a 520 nm en un espectrofotómetro. Los valores obtenidos se
multiplicaron por el coeficiente de extinción molar de la piocianina.
Se cuantificó la producción de elastasas a través de la hidrólisis de elastina acoplada a rojo congo (modificado de Kessler y col., 1993). 25 ul de cada cultivo de las cepas
atípicas crecidas en medio PPGAS a 37°C se agregaron a 20 mg de elastina-rojo congo
en 1ml de Bueffer de reacción en agitación (120 rpm) por 16 hrs a 37° C. El rojo congo
liberado se cuantificó en un espectrofotómetro a 495 nm.
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IV. Resultados
S
e llevó a cabo la cuantificación de la producción de tres factores de virulencia
a partir de las cepas atípicas en medio PPGAS a 37º C por 24 h. Los datos
se ordenaron de acuerdo a su producción de piocianina (Figura 1a). La producción de elastasa (Figura 1b) y ramnolípidos (Figura 1c) se representó en
relación al histograma de piocianina. De acuerdo a los niveles de producción de los
tres factores de virulencia propusimos la siguiente clasificación de las cepas: grupo
1), cepas que no produce ninguno de los tres factores de virulencia; grupo 2), cepas
que sobre expresan los tres factores de virulencia; grupo 3), cepas que sobre expresan
dos de los tres factores de virulencia y grupo 4), cepas que sobre se expresa sólo uno
de los tres factores de virulencia.
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a)
Piocianina (DO 520 nm)
b)
Elastasa (DO 495 nm)
c)
Ramnolípidos (µg/ml)
Estudio de la expresión diferencial de factores de virulencia
por distintos aislamientos clínicos atípicos de Pseudomonas sp.
V. Conclusiones
Los datos preliminares muestran que existe una producción diferencial de los factores de virulencia de la cepas atípicas de Pseudomonas sp.
Los presentes datos se han hecho púbicos en cuatro foros nacionales distintos:
1. Aguirre-Ramírez, M. “Caracterización del sistema sensor de quorum y la producción de factores de virulencia de aislamientos ambientales y clínicos atípicos de Pseudomonas aeruginosa”. Primer Simposio de Investigación del Instituto de Ciencias Biomédicas, UACJ. Ciudad Juárez, Chi. 19 de agosto 2010.
2. Cárdenas-Rodríguez A., Morales-Espinosa M.R., Delgado-Sapién G., SoberónChávez G. y Aguirre-Ramírez M. (2010) “Estudio de la expresión diferencial
de factores de virulencia por distintos aislamientos clínicos atípicos de Pseudomonas aeruginosa”. Memorias de la Segunda sesión de la Cátedra Nacional
Cumex “Mario Molina Henríquez 2010”. Pag. 37. Aceptado.
3. Cárdenas-Rodríguez, A.; Morales-Espinosa, M. R.; Delgado-Sapién, G.; Sánchez-Méndez, J. L. y Aguirre-Ramírez, M. Estudio de la expresión diferencial
de los factores de virulencia en aislamientos clínicos atípicos de Pseudomonas
spp. Segundo Simposio de Investigación del Instituto de Ciencias Biomédicas,
UACJ. Ciudad Juárez, Chi. 19 de agosto 2011.
4. Cárdenas-Rodríguez, A.; Morales-Espinosa, M. R.; Delgado-Sapién, G.; Sánchez-Méndez, J. L. y Aguirre-Ramírez, M. Differential expression of virulence
factors by clinical atypical Pseudomonas spp. isolates. Second Meeting of Biochemistry and Molecular Biology of Bacteria Huatusco, Veracruz. November
7 – 11, 2011 (memoria).
19
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