Desarrollo de una metodología eficiente y repetitiva ara la

DESARROLLO DE UNA METODOLOGÍA EFICIENTE Y REPETITIVA PARA
LA TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE VARIEDADES DE INTERÉS
AGRONÓMICO DE FRIJOL (Phaseolus vulgaris)
Resumen ejecutivo
El propósito principal de este trabajo fue obtener semillas transgénicas de frijol
en la generación T1 de eventos de transformación genética, a partir del
bombardeo con el plásmido pWRG1515 que confiere resistencia a higromicina,
así como de eventos derivados de la transformación con la cepa
pGV2260(pFADGUS) con resistencia a la paromomicina.
En esta etapa se utilizaron 31 de 124 plantas resistentes que fueron
seleccionadas con el agente selectivo higromicina 10 mg/L. Estos eventos son
derivados de la transformación genética con el plásmido pWRG1515 + Citrato
sintasa de la variedad Negro Sinaloa.
De
los
experimentos
de
transformación
genética
con
Agrobacterium
tumefaciens se utilizaron 33 de 69 plantas resistentes seleccionadas con el
agente selectivo paromomicina 20 mg/L. Estos eventos son derivados de la
transformación genética con el plásmido pGV2260(pFADGUS).
Para la hibridación del ADN genómico se llevó a cabo la detección del gen de
la higromicina fosfotransferasa, derivada del plásmido pWRG15115; se
analizaron plantas derivadas de la clona 83 para detectar la integración del gen
de la higromicina fosfotransferasa, y se detectó la señal del gen de la
neomicina fosfotransferasa tipo II, presente en el plásmido pFADGUS del
sistema de Agrobacterium tumefaciens en la clona 38.
Para el análisis de PCR se seleccionaron ocho plantas transgénicas
transformadas con el plásmido pWRG1515 mediante la biobalística para
determinar la presencia del promotor CaMV35S del gen de hptll.
Todas las plantas analizadas mostraron el producto del transgen: un fragmento
de 537 pb. Se usaron controles negativos de callos no transformados. El
control positivo fue un fragmento CaMV35S aislado y purificado.
Las plantas fueron establecidas en condiciones de invernadero para promover
la formación de semillas transgénicas en la generación T1. Las plantas
completaron el ciclo en forma normal y produjeron un promedio de semillas
normal para las condicione de invernadero utilizadas (26 °C temperatura
máxima, 55% de humedad relativa, con fertilización semanal aplicada al suelo y
foliar cada dos semanas.
Como resultado de la investigación, destaca que se incrementó el número de
semillas transgénicas derivadas de varios eventos de transformación, en donde
se encontró que las plantas producidas son fenotípicamente normales y podrán
ser utilizadas para análisis futuros en programas de fitomejoramiento, bajo
permisos de bioseguridad definidos.
Por último, cabe mencionar que con este proyecto el investigador estima que
se generó el único sistema de transformación genética de frijol a nivel mundial,
el cual permite mantener por tiempos prolongados material transgénico en la
fase callos(tres años o más) y a partir de esos callos regenerar plantas que son
fenotípicamente normales y producen semillas variables.
Demanda o problemática que atiende
Estudiar la transformación genética de frijol, con el fin de regenerar plantas que
son fenotípicamente normales y que producen semillas variables.
Resultados obtenidos y/o descripción. Características de la tecnología
generada
Detección del gen de la higromicina fosfotransferasa derivada del plásmido
pWGR1515, que fue utilizado en los experimentos de biobalística.
Análisis de nueve eventos de transformación genética para detectar la
integración de la higromicina fosfotransferasa.
Detección de la señal del gen de la neomicina fosfotransferasa tipo II (NPTII)
presente en el plásmido pFADGUS del sistema de Agrobacterium tumefaciens.
Análisis de 10 eventos de transformación independientes derivados de la
selección en paromomicina.
Aislamiento de DNA de plantas derivadas de semillas transgénicas de frijol
generadas a través de la biobalística y Agrobacterium tumafaciens.
Southern blot e hibridación y PCR de dos eventos de transformación genética.
Impactos
Todas las plantas analizadas fueron positivas, tanto por el sistema de
biobalística como el de Agrobacterium, lo cual permite concluir que el sistema
de regeneración de plantas que el investigador desarrolló en laboratorio
permite llevar a cabo la clonación de material transgénico en forma
satisfactoria.
Lo anterior es explicable debido al origen unicelular de los embriones
somáticos que son los que están generando los callos embriogénicos y a su
vez las plantas transgénicas. A diferencia de los sistemas de regeneración de
plantas a través de la organogénesis en donde la probabilidad de generar
plantas quimeras es muy grande y por lo tanto indeseable para la ingeniería
genética de plantas. Los agentes selectivos empleados condujeron a la
producción de clonas transgénicas con capacidad de regeneración de plantas
estables. También se encontró que estos nuevos caracteres genéticos son
transmitidos a la progenie en forma estable.
Costos estimados de la aplicación de los resultados y/o tecnología generada
Las ventajas de este desarrollo científico derivan de que se logró aumentar el
promedio de semilla por planta, mediante: la producción de 1520 semillas
transgénicas de frijol de la variedad Negro Querétaro, derivadas de 12 eventos
diferentes de transformación genética por biobalística con el plásmido
pWRG1515 + Citrato sintasa, que da un promedio de 49 semillas por planta; y
producción de 1577 semillas transgénicas de frijol de la variedad Negro
Sinaloa, derivadas de 12 eventos diferentes de transformación genética, con
un promedio de 47.78 semillas por planta.
Ámbito de aplicación
En primera instancia, la aplicación de este conocimiento científico está en la
comunidad científica, y en segundo lugar, una vez que sea aprobada la
transferencia de esta tecnología, en los productores de frijol.
Información adicional o comentario
Para determinar la concentración de cada una de las muestras de las que se
extrajo el DNA fue necesario verificar que no existieran moléculas de RNA con
la ayuda de un gel de agarosa al 1%, además de observar que el DNA no
estuviera degradado, debido a que estos factores pudieran generar
inconsistencias en la lectura.
Clave del proyecto: SAGARPA 2003-C01-199
Sistema Producto y/o línea estratégica de atención: fitomejoramiento
Investigador: SIMEÓN BAUTISTA PÉREZ
Institución: