MÉTODO ENZIMÁTICO PARA PREDECIR LA DEGRADACIÓN DE LAS PROTEÍNAS Í EN EL RUMEN Dr. Alejandro Velásquez Briceño Octubre de 2012 INTRODUCCIÓN EFECTOS DE LA DINÁMICA DE DEGRADACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE LA DIETA EN EL RUMEN DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA LIMITACIONES DE LAS METODOLOGÍAS PARA MEDIR LA DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS EN EL RUMEN ALIMENTACIÓN ANIMAL EFICIENCIA SINCRONÍA Energía/Nitrógeno RUMINAL DINÁMICA DE DEGRADACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE LA DIETA EN EL RUMEN Salud ruminal Degradación de la materia orgánica DINÁMICA DE DEGRADACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE LA DIETA EN EL RUMEN Proteína Metabolizable Metabolismo del N en el animal Excreción de N-compuestos al medio ambiente MEDICIÓN DE LA DEGRADACIÓN DE LAS PROTEÍNAS Residuo de proteína no degradada Productos de la hidrólisis PRINCIPALES LIMITACIONES DE LAS METODOLOGÍAS PARA PREDECIR LA DEGRADABILIDAD DE PROTEÍNAS EN EL RUMEN Protocolos P t l complejos Animales A i l fistulados Falta de flexibilidad analítica Baja B j repetibilidad METODOLOGÍAS PARA ESTUDIAR DEGRADABILIDAD DE PROTEÍNAS In vivo In situ In vitro Químico QUÍMICO ¾ Fraccionamiento químico de las proteínas (Sniffen et al., 1992) FQP: FRACCIONAMIENTO QUÍMICO DE LAS PROTEÍNAS FRACCIONES NITROGENADAS ¾Pool A = N soluble no proteico (no precipitable con TCA). ¾Pool B1 = N soluble (proteína precipitable con TCA). ¾Pool B2 = N insoluble en buffer, soluble en Detergente Neutro. ¾P l B3 = N iinsoluble ¾Pool l bl en DN, DN soluble l bl en D Detergente t t Á Ácido. id ¾Pool C = Indisponible (residuo no hidrolizado). Sniffen et al. (1992) BIOLÓGICAS & ENZIMÁTICAS ¾ In situ con bolsas de dacrón (Mehrez y Ørskov, 1977) ¾ In vitro con enzimas comerciales (Pichard y Van Soest, 1977) ¾ In vitro con fluido ruminal inhibido (Broderick, 1987-2004) ¾In vitro con fluido ruminal libre de MO (Luchini et al al., 1993) ¾In vitro con enzimas ruminales (Kohn y Allen, 1995; Velásquez y Pichard, 2010) MÉTODO ENZIMÁTICO PARA ESTUDIAR DEGRADABILIDAD DE PROTEÍNAS EN EL RUMEN In vitro con enzimas ruminales (Velásquez y Pichard, 2010) HIPÓTESIS Utilizando una preparación de extractos enzimáticos de origen ruminal, es posible simular in vitro la degradabilidad de las proteínas en el rumen. rumen EVENTOS ENZIMÁTICOS HIDROLÍTICOS EN EL RUMEN Adherencia y colonización microbiana de partículas Principalmente bacterias y protozoos Degradación enzimática Intracelular Sustrato inducción Extracelular Control génico Síntesis de enzimas Acción sinérgica de enzimas hidrolíticas en la degradación del sustrato PROTEASAS AMILASAS, PROTEASAS, AMILASAS CELULASAS, CELULASAS XILANASAS (Hristov et al., 2008; Riasi et al., 2008) CULTIVO DE FLUIDO RUMINAL IN VITRO ENERGÍA & NITRÓGENO INTERACCIONES ECOLÓGICAS MICROBIALES CULTIVO DE FLUIDO RUMINAL IN VITRO INCREMENTO EN BIOMASA & BIODIVERSIDAD MICROBIAL DEPENDENCIA SUSTRATO (INDUCCIÓN) CONCENTRACIÓN Ó ENZIMÁTICA Á CULTIVO DE FLUIDO RUMINAL IN VITRO DIVERSIDAD ENZIMÁTICA MATERIALES Y MÉTODOS ANIMALES DONANTES DE FLUIDO RUMINAL ¾Dos vacas adultas fistuladas al rumen con cánula de 15 cm de diámetro. ¾Alimentadas Ali t d a nivel i l d de mantención t ió con d dos d dosis i diarias. ¾La alimentación consistió en: 1) Heno de alfalfa (80 %) 2) Maíz grano chancado (20 %) 3) Sales minerales (120 g/d) ¾Contenido de Proteína Cruda 14,7%. PREPARACIÓN DEL FLUIDO RUMINAL PARA SU CULTIVO IN VITRO Colección de fluido ruminal (3,5 litros) 4 horas postprandial Separación de la fracción líquida q y sólida (filtración) ( ) 1 kg fracción líquida 1 kg fracción sólida Mezcla Homogenización (2 minutos) Waring Blendor Filtración en paño quesero y en lana de vidrio con vacío y gaseo permanente de CO2 (Goering y Van Soest, 1970) Fluido ruminal preparado para su cultivo in vitro ESTRATEGIA DE INCUBACIÓN IN VITRO DEL FLUIDO RUMINAL MEDIO DE CULTIVO ¾ 100 ml: ¾ 100 ml: ¾ 100 ml: ¾ 200 ml: ¾ 20 ml: ¾ 5 g: inóculo (fluido ruminal). solución macro y micro mineral. buffer bicarbonato de sodio (pH 6,8). agua destilada. solución reductora (Sulfuro de sodio). sustratos mixtos inductores. CONDICIONES AMBIENTALES ¾39ºC. ¾pH 6,8. ¾anaeróbica (presión positiva de CO2). Composición de los sustratos inductores y tiempo de incubación en la fase previa a la extracción enzimática. Ingredientes Tratamientos Sustrato de incubación Almidón de maíz FDN de ballica Afrecho soya + harina alfalfa* Incubación h % Rico en proteína 10 40 50 4 Rico en almidones 60 20 20 4 Rico en fibra 05 75 20 6 Control** 00 00 00 0 *Afrecho de soya + Harina de alfalfa: 50/50. incubar ** Fluido ruminal sin incubar. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS ENZIMÁTICOS Centrifugación del fluido ruminal cultivado. cultivado 6000 g, 4ºC, 10 minutos Resuspensión del pellet en buffer fosfato de potasio, 50 mM; pH 7,1 (Nouaille et al., 2004) Sonicación S i ió de d la l masa microbiana i bi (4 ciclos x 30 s, 70 W-20 kHz) (Pan et al., 2003) Centrifugación a 15000 g x 15 minutos a 4ºC (separar restos y detritos celulares) Recuperación del sobrenadante (contenido enzimático) Precipitación de proteínas: Sulfato de amonio (55 %) %). Agitación orbital por 1 hora a 0ºC Centrifugación a 16000 g x 30 minutos a 4ºC (recuperar enzimas en el precipitado) Resuspensión del pellet rico en enzimas Buffer Tris-HCL 50 mM (pH 6,5) ((Karadzic et al.,, 2004)) P Diálisis de extracto enzimático (24 horas) Mantención de extracto enzimático dializado a -32ºC x 1 hora Liofilización de extracto enzimático Almacenamiento de extracto enzimático a - 32ºC A F RESULTADOS Zimograma de actividad proteolítica de los extractos enzimáticos. Zimograma de actividad proteolítica de los extractos enzimáticos. Sustrato: g gelatina. Extracto enzimático* Peso molecular KDa *Sg Extracto enzimático ** P PM kDa A 130 F P C AZA *** F 2998a sp C 2132b sp ZA** 1ª 117 2ª 85 3ª 49 4ª 34 5ª 6ª 25 * Extracto de actividad enzimática preferentemente: proteolítico (P), amilolítico (A), fibrolítico (F) y control (C). ** Zona de actividad proteolítica, (sp) square pixels. Estudio de la cinética de degradación de proteínas a través de extractos enzimáticos de origen ruminal y comparación con metodologías t d l í tradicionales. t di i l CONDICIONES Y TIEMPOS DE INCUBACIÓN ¾ Incubación: - 100 mg PC de cada sustrato. - Extracto enzimático (P+A+F). - 30 mll d de b buffer ff Tris-HCl T i HCl 50 mM M ((pH H6 6,5). 5) - 39ºC. os s enzimática: e át ca 100 00 U UE. ¾ Dosis ¾Estrategia cinética: sustrato limitante. ¾Tiempos de incubación: 0, 0 1, 1 3 3, 6 6, 12 12, 18 18, 24 24, 36 y 48 h h. SUSTRATOS EVALUADOS ¾Afrecho de soya y ((AS)) ¾Gluten feed (GF) ¾Afrecho de canola (AC) ¾Afrecho de maravilla (AM) ¾Harina de alfalfa (HA) ¾T éb l alejandrino ¾Trébol l j di (TA) ¾Ballica perenne (BP) ¾ Avena sativa (AV) RESULTADOS Degradación de proteína (48h) de acuerdo a las metodologías enzimas ruminales (EER), proteasas de Streptomyces griseus (Sg); degradación de proteína in situ y fraccionamiento químico de las proteínas (FQP). Promedio de ocho sustratos alimenticios. 84 8 b 84,8 100 Degrada ación 48 h (% % PC) 90 75,5 c 89,6 , a 74,6 c 80 70 60 50 40 30 20 10 0 EER EER Sg Sg In In situ situ FQP FQP Metodología METODOLOGÍA Letras distintas entre barras señalan diferencias significativas según método de comparaciones χ² (P<0,05). Tasa de proteolisis (kd) de acuerdo a las metodologías enzimas ruminales (EER), proteasas de Streptomyces griseus (Sg) y degradación de proteína in situ. situ Promedio de ocho sustratos alimenticios. 0,086 a Ta sa d e p ro te o liisis (kd ) 0,1 0,09 0,08 0,071 b 0,064 c 0,07 0 06 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 EER EER Sg Sg In situ In situ Metodología METODOLOGÍA Letras distintas entre barras señalan diferencias significativas según método de comparaciones χ² (P<0,05). dede proteína. Afrecho de DegradaciónDegradación de proteína acuerdo a las metodologías enzimas ruminales e incubación situ soya in situ. soya. Afrecho de soya Límite persistencia proteolítica 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Degrad dación (% % PC) 93,2 a 85,6 b Enzim as rum In situ Enzimas rum: kd = 0,066 0 066 In situ: kd = 0,072 Lag enzimas ruminales = 0 h Lag in situ = 2,73 h 0 6 12 18 24 30 36 Ti Tiem po iincubación b ió (h) 42 48 CONCLUSIONES 1. El cultivo in vitro de fluido ruminal en un medio enriquecido, permite obtener extractos enzimáticos con una elevada actividad proteolítica. p 2. Los extractos enzimáticos presentan diversas proteasas. No obstante, la distribución de éstas en los zimogramas, en general, son muy similares entre los preparados enzimáticos de fluido ruminal cultivado y sin cultivar. 3. Es posible incrementar la actividad proteolítica de extractos enzimáticos ruminales con adición de carbohidrasas. 4. El uso de los preparados enzimáticos ruminales resultó exitoso para describir la actividad proteolítica en las primeras horas de incubación. No obstante, en tiempos tardíos se observa una disminución de dicha actividad respecto a la técnica in situ. situ 5 L 5. La d degradación d ió proteica t i observada b d mostró t ó una alta lt repetibilidad tibilid d en la aplicación del método desarrollado en esta investigación, lo cual constituye una ventaja para la estandarización futura de la técnica. GRACIAS POR SU ASISTENCIA Y ATENCIÓN