USOS DE M O EN LA BIOTECNOLOGIA
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USOS DE MICROORGANISMOS EN LA BIOTECNOLOGÍA Prof. Alejandro Riquelme INGENIERIA GENETICA es la suma de procedimientos sofisticados para la separación , manipulación y expresión del material genético. En ingeniería genética hay dos tipos de investigación: 1. INVESTIGACION BASICA que significa estudiar los mecanismos de la replicación y de la expresión génica en virus, procariotes y eucariotes 2. INVESTIGACION APLICADA que es el desarrollo de cultivo microbiano capaz de sintetizar productos valiosos como : - INSULINA HUMANA - HORMONA DEL CRECIMIENTO - INTERFERON - VACUNAS - ENZIMAS INDUSTRIALES La ingeniería genética para aplicación comercial recibe el nombre de BIOTECNOLOGIA Algo primordial para la ingeniería genética es la separación y purificación de genes especificaos, proceso llamado CLONACION. LAS ETAPAS DE UN CLONAMIENTO 1. Separación y fragmentación de la fuente de DNA 2. Unión de los fragmentos de DNA a un vector de clonamiento con DNA ligasa 3. Incorporación a los huésped 4. Detección y purificación de los clones deseados 5. Producción de gran números de células o bacteriófagos conteniendo los clones deseados para la separación y estudio de los DNA clonados. VECTORES DE CLONAMIENTO -PLASMIDOS COMO VECTOR DE CLONAMIENTO Propiedades de los plasmidos : 1. tamaño pequeño (fácil de separar y manipular) 2. DNA circular (DNA mas estable) 3. origen de replicación independiente 4. múltiple numero de copias 5. marcadores de selección tales como los genes de resistencia a antibióticos Ejemplo : Plasmido pBR 322 (uno de los plasmidos mas utilizados) que se replica en Escherichia coli Caracteristicas del plasmido pBR 322: 1. es relativamente pequeño : 4361 pb 2. estabilidad en el huésped (E. coli) con un relativo alto numero de copias : 20 – 30 por célula 3. puede ser amplificado en un alto numero – 1000-3000 copias por célula – por inhibición de la síntesis de proteína por la adición de cloramfenicol 4. es fácil de separar en forma súper enrollada 5. una cantidad razonable de DNA foráneo puede ser insertado (mas de 10 kb es inestable) 6. la secuencia de bases completa de este plasmido es conocida, haciendo posible localizar los sitios donde actúan las enzimas de restricción 7. hay un solo sitio de ruptura para varias enzimas de restricción 8. tiene dos marcadores de resistencia a antibióticos: ampicilina y tetraciclina 9. puede ser colocado en células fácilmente por transformación -BACTERIOFAGO COMO VECTOR DE CLONAMIENTO BACTERIOFAGO LAMBDA: actúa como un vector pero la recombinación ocurre en la célula LAMBDA tiene un complejo mapa genético y un gran numero de genes, sin embargo el tercio central del genoma no es esencial y puede ser sustituido con DNA foráneo. Existen Fagos Lambda modificados: Charon fagos, donde algunos sitios de restricción han sido removidos: existen variantes con un solo sitio de restricción y en estas el DNA foráneo puede ser insertado. Mientras aquellos variantes que poseen dos sitios de restricción el DNA foráneo puede reemplazar el DNA lambda, y estos son conocidos como vectores de reemplazo PASOS PARA CLONAR CON LAMBDA 1. separación del vector DNA desde las partículas del fago y digestión con la apropiada enzima de restricción 2. conexión de los dos fragmentos lambda al fragmento del DNA foráneo usando la DNA ligasa 3. empacar el DNA por adición de extracto celular conteniendo las proteínas de la cabeza y la cola 4. infección de E. coli y separación de los fagos clonados 5. chequeo de los fagos recombinantes por la presencia del DNA foráneo. Fragmentos de DNA mayores de 20 kb no pueden ser eficientemente clonados. -COSMIDOS Los cosmidos son vectores plasmidiales conteniendo el DNA foráneo y solamente los sitios cos (extremos cohesivos) del genoma LAMBDA. Estos sitios cos son requeridos para empacar el DNA dentro del virión LAMBDA. Ventaja: - ellos pueden ser usados para clonar fragmentos grandes de DNA - el DNA puede ser guardado en partículas de fago (mas estable y fácil de manejar) -CROMOSOMAS ARTIFICIALES DE LEVADURA ( Y A C ) Estos vectores han sido diseñados para replicares en levadura como cromosomas normales, pero ellos tienen sitios donde el DNA puede ser insertado. En la estructura de los YAC-s, estos deben tener: - un origen de replicación - telomeros en los extremos - centromeros (1) - un sitio de clonamiento - un gen para selección Capacidad : 200 a 800 kb pueden ser insertados YAC fue usado en el proyecto GENOMA HUMANO que consiste en mapear, clonar y secuenciar el genoma haploide humano. -VECTOR PARA SECUENCIAR DNA BACTERIOFAGO M 13: fago filamentoso que contiene DNA simple hebra y se replica sin matar su huésped. Con este vector es posible de obtener cultivos infectados que son una fuente continua de DNA. En el procedimiento de SANGER para secuenciar DNA se necesita DNA de simple hebra. También el DNA de simple hebra puede ser usado como prueba o sonda en el método SOUTHERN BLOT. Capacidad : 5 kb pueden ser clonados sin afectar la viabilidad del fago. HUESPED PARA VECTORES DE CLONACION Características ideales de un huésped: - rápido crecimiento - crecimiento en un medio de cultivo barato - no dañino o patogénico - transformable por DNA - estable en cultivo Los mas usados son los microorganismos. Ejemplo: - Bacterias como Escherichia coli y Bacillus subtilis - Levaduras como Saccharomyces cerevisiae -HUESPED PROCARIOTES La mayoría del clonamiento molecular ha sido hecho en E. coli, pero existen algunos problemas de usar esta bacteria. Desventajas de usar E. coli : - es potencialmente patogénico; aun líneas no patogénicas producen endotoxinas que pueden contaminar los productos. - las proteínas extracelulares son retenidas en el espacio periplasmico haciendo difícil su separación y purificación. Otra bacteria llamada Bacillus subtilis (Gram – positiva) también ha sido usada como huésped. Esta bacteria no tiene los problemas que presenta E. coli. pero... Desventaja de usar B. subtilis : inestabilidad del plasmido -HUESPED EUCARIOTICO El clonamiento en microorganismos eucarióticos tiene importante uso en el entendimiento de los detalles de la REGULACION GENETICA en sistemas eucarióticos. La levadura Saccharomyces cerevisiae es la mejor conocida genéticamente y por ende la mas usada como huésped y los vectores plasmidiales como YAC s han sido desarrollados exclusivamente para levaduras. Cultivos de células de mamíferos tiene un amplio uso en investigaciones sobre: - Genética humana - Cáncer - Enfermedades infecciosas - Fisiología En este caso el DNA que se desea clonar puede ser introducido por TRANSFECCION o ELECTROPORACION. En el caso de transfección el DNA del virus SV 40 (virus que causa tumor en los primates) ha sido desarrollado como un vector de clonamiento en líneas de cultivo de tejido humano. También los retrovirus han sido usados como vectores para introducir genes en las células animales. El Virus VACCINIA con un gran DNA de doble hebra ha sido usado para clonar una variedad de genes virales, con el objetivo de producir vacunas. Ventajas de usar células eucarióticas: - poseen sistemas para procesar RNA complejos y realizar las modificaciones post- traduccionales Desventajas: - cultivo caro - difícil de producir en gran escala -la expresión de los genes clonados es frecuentemente baja Por el costo y complejidad de manejo de los cultivos de celulas animales se han usado cultivo de células de insectos, que son mas simples para crecer y se han desarrollado vectores desde DNA de virus que atacan insectos: los BACULO VIRUS. Selección de las células clonadas El crucial paso en la tecnología de DNA recombinante es encontrar el clon correcto entre la mezcla de clones que han sido creados. Si el gen foráneo es expresado en el huésped clonado, entonces existen procedimientos que permiten observar la presencia de esta proteína en las colonias recombinantes; como es el uso ANTICUERPOS COMO METODO DE DETECCION DE LA PROTEINA (Anticuerpo es una proteína del suero producida por un sistema animal que se combina en alta especificidad con otra proteína (antigeno)). Además existen otras técnicas mas complejas haciendo el uso de sondas radioactivas, usadas principalmente cuando la proteína no es expresada en la célula huésped. APLICACIONES PRACTICAS DE INGINERIA GENETICA -FERMENTACIONES MICROBIANAS Un numero de importantes productos son hechos usando microorganismos de los cuales los antibióticos son los mas importantes. La ingeniería genética ha permitido manipular la producción del antibiótico en orden a aumentar el rendimiento o producir antibióticos modificados. -VACUNAS Una vacuna es un material que puede inducir inmunidad a un agente infeccioso. Por ingeniería genética los genes virales de la proteína de la cubierta pueden ser clonados y expresados en bacteria haciendo posible el desarrollo seguro de vacunas. -PROTEINAS ANIMALES Un numero de proteínas animales son de gran interés comercial y medica. El clonamiento de genes para una proteína humana en bacteria para su producción comercial. -PLANTAS Y ANIMALES TRANSGENICOS A través de estos se puede llegar a aumentar la productividad, alterar la calidad nutricional, producir ciertas proteínas. Por introducción del DNA clonado en los huevos fertilizados de animales, o directamente en la células vegetales crecidas en cultivo de tejidos, es ahora posible obtener organismos superiores modificados. -BIOTECNOLOGIA DEL MEDIO AMBIENTE Algunas bacterias poseen genes que codifican para proteínas que degradan contaminantes ambientales. Algunos ejemplos: genes para la biodegradación de pesticidas clorados como clorobenzenos. Algunos plasmidos han sido construidos conteniendo genes para la biodegradación de varios químicos tóxicos. -REGULACION DE GENES Y TERAPIA GENETICA Muchas investigaciones han involucrado el control de la expresión de genes específicos. La mayoría de las investigaciones han llegado al diseño de RNA antisentido y ribozimas que regulan la expresión de genes específicos y ahora es posible curar algunas enfermedades genéticas por la introducción del gen defectuoso o por inhibición de algún gen sobre expresado . PRODUCCION DE PRODUCTOS ANIMALES Y VACUNAS POR INGENIERIA GENETICA DNA polimerasas usadas para PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) originalmente separadas de bacterias termofilas, ahora ellas son producidas en E. coli, en que se ha clonado el gen de la polimerasa de las bacterias termofilas. La mayoría de las enzimas de restricción son también producidas en E. coli. También muchas proteínas de uso industrial ahora son producidas desde genes clonados, como enzimas usadas en los detergentes de lavandería , cuyos genes fueron alterados para obtener una proteína menos sensible al cloro. PRINCIPALES PRODUCTOS BIOTECNOLOGICOS HECHOS POR TECNICAS DE DNA RECOMBINANTE PRODUCTO FUNCION PROTEINAS SANGUINEAS - activador de plasminogeno tisular - factores VII, VIII, IX - eritropoietina - uroquinasa - disuelve coágulos - promueve la coagulación - crecimiento glóbulos rojos - coagulación sangre HORMONAS - Insulina - Hormona de crecimiento - Factor crecimiento epidérmico - Hormona paratiroides - beta-endorfina - Factor crecimiento óseo - Atriopeptina - tratamiento de diabetes - tratamiento de enanismo - daño por quemaduras - regulación del calcio - alivia el dolor - osteoporosos - diurético, antihipertensivo IMMUNO MODULATORES - Interferones - Interleukina 2 - Factor necrosis tumoral - Factor estimulación de colonia - Lisozima - agentes anticancerígenos y antivirales - estimulador células T - agente antitumoral - tratamiento de infecciones y cáncer - anti-inflamatorio VACUNAS - Hepatitis B - Citomegalovirus - Sarampión - Cólera - AIDS - Rabia - prevención hepatitis - prevención infección - prevención sarampión - prevención cólera - prevención SIDA - prevención rabia La producción de insulina no fue una materia simple ya que la insulina activa consiste de dos polipéptidos (A y B) unidos por puentes disulfuros. El gen de la insulina codifica para una preproinsulina (que contiene una secuencia señal, involucrada en la excreción de la proteína ) PREPROINSULINA PROINSULINA INSULINA Dos estrategias han sido usadas para obtener insulina humana en bacteria: 1. producción de proinsulina y conversión a insulina por ruptura química 2. producción de dos cultivos separados de los polipéptidos A y B y su posterior unión de las dos cadenas químicamente.