realpure spin viral dna/rna kit

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RBMEGS07
REALPURE SPIN VIRAL DNA/RNA KIT
Ref. RBMEGS07 100 Test
1. INTRODUCCIÓN
1. INTRODUCTION
REALPURE Spin Viral DNA/RNA Kit is designed
for the rapid simultaneous purification of viral
DNA and RNA from cell –free samples such as
serum, plasma and cerebrospinal fluid.
REALPURE Spin Viral DNA/RNA Kit está
designado para una rápida purificación simultánea
de ADN y ARN viral a partir de muestras libres de
células, como suero, plasma y fluido
cerebroespinal.
Viruses, when lysed by detergent and Proteinase K,
release total viral nucleic acids. Then, in the
presence of a chaotropic salt, viral nucleid acids
bound selectively to glass fiber membrane in a
special centrifuge tube. The nucleic acids remain
bound while a series of a rapid wash and spin steps
removes contaminating cellular components.
Finally, low salt elution removes the viral nucleic
acids from the glass fiber membrane. The process
does not require nucleid acids precipitation,
organic solvent extractions, or extensive handling
of the nucleid acids.
Los virus cuando son lisados con un detergente y
proteinasa K, liberan los ácidos nucleicos virales.
Luego, en presencia de sales caotrópicas, los ácidos
nucleicos virales se unen selectivamente a una
membrana de sílica en una spin columna. Los
ácidos nucleicos permanecen unidos mientras que
una serie de lavados y pasos de centrifugación
eliminarán los componentes celulares
contaminantes. Finalmente, con un tampón de
elución los ácidos nucleicos virales serán eluidos
de la membrana. Este proceso no requiere
precipitaciones alcohólicas, extracciones con
disolventes orgánicos, o extensivos manejos de
ácidos nucleicos.
The REALPURE Spin Viral DNA/RNA Kit can
be used for the isolation of viral RNA and DNA
from a broad range of RNA and DNA viruses.
However, performance cannot be guaranteed
for every virus species and must be validated by
the costumer.
El REALPURE Spin Viral DNA/RNA Kit puede
ser utilizado para la extracción de ADN y ARN
viral a partir de un amplio rango de virus de ADN y
ARN. No obstante, el éxito no se puede garantizar
para todas las especies de virus y deberá ser
validada por el usuario
Sistema de
producción
certificado
bajo norma
ISO
Production
system
certified
under ISO
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REAL es una marca registrada por Durviz, s.l.
2. COMPONENTES DEL KIT
KIT COMPONENTS
Tampón de Lisis Viral
Viral Lysis Buffer
Tampón de Lavado Viral 1*
Viral Wash Buffer 1*
Tampón de Lavado Viral 2*
Viral Wash Buffer2*
Tampón de Elución
Elution Buffer
Proteinasa K *
Proteinase K*
RNA Carrier *
Viral Spin Columnas
Viral Spin Columns
Tubos de Recogida
Collection Tubes
Ref.
Ref. RBMEGS07
100 preps
Tª
REA01V
25 ml
RT
REA03V
36 ml
RT
REA04V
20ml
RT
REA05
15 ml
RT
REA02
40 mg
4ºC
REA11
620 µg
-20ºC
RSCV01
100 unid.
RT
R30
200 unid.
RT
(*)
(*)
Estas soluciones deben ser preparadas como se
indica en el apartado de preparaciones preliminares.
These solutions must be prepared as indicated in
the Preliminary Preparations section of the
protocol.
Equipos y reactivos necesarios no
incluidos en el kit:
Equipment and additional reagents required
* 100 % Ethanol
* 1.5 ml microtubes
* Microcentrifuge.
* Etanol 100 %.
* Microtubos de 1.5 ml
* Microcentrifuga.
3. PROTOCOLO GENERAL
GENERAL PROCEDURE
3.1 Consideraciones preliminares
3.1 Preliminary conditions
•
•
El tampón de Lisis Viral (REA01V) y el
Tampón de Lavado Viral 1 (REA03V)
contienen guanidine hydrochloride, el cual
puede formar componentes reactivos cuan se
combinan con lejía. Ambos tampones son
agentes irritantes, por esta razón
recomendamos el uso de guantes y gafas para
su manipulación. en caso de contacto con la
piel o ojos ,lavar con abundante agua.
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Viral Lysis Buffer (REA01V) and Viral Wash
Buffer 1 (REA03V) contain guanidine
hydrochloride, which can form highly reactive
compounds when combined with bleach. Both
are irritant agents, for this reason we
recommend to use gloves and glasses for its
manipulation.
REAL es una marca registrada por Durviz, s.l.
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RBMEGS07
3.2 Preparaciones preliminares
3.2 Preliminary Preparations
•
•
•
•
•
•
•
Disolver la proteinasa K en 2 ml de agua libre
de nucleasas y conservar a –20ºC. Se
recomienda realizar varias alícuotas para evitar
demasiados ciclos de descongelado-congelado.
A esta temperatura es estable durante 1 año.
Añadir 20 ml Ethanol 100 % al Viral Wash
Buffer 1 (REA03V) .Mantener el envase bien
cerrado para evitar la evaporación del etanol.
Añadir 80 ml Ethanol 100 % al Viral Wash
Buffer 2 (REA04). Mantener el envase bien
cerrado para evitar la evaporación del etanol.
Carrier RNA: El protocolo de purificación
recomendado utiliza 5.6 µg carrier RNA por
muestra. Si usted desea utilizar menos carrier
RNA por muestra, es necesario validar la
cantidad de carrier RNA necesario para cada
tipo de muestra y aplicaciones posteriores.
Los eluidos que se obtienen con este kit
contienen tanto ácidos nucleicos virales como
carrier RNA, y las cantidades de carrier
RNA pueden exceder las cantidades de
ácidos nucleicos virales. Los cálculos de
cuanta cantidad de eluido deberá ser añadido a
las aplicaciones posteriores deberá basarse en
las cantidades de carrier RNA añadido.
Para obtener niveles altos de sensibilidad en
reacciones de amplificación, puede ser
necesario ajustar la cantidad de carrier RNA
añadida al Viral Lysis Buffer.
Protocolo de preparación de Carrier RNA ,
5.6 µg de carrier RNA por muestra:
1. Añadir 620 µl de Agua libre de nucleasas
a los 620 µg de carrier RNA suministrado
en un microtubo del kit para obtener una
solución stock de 1 µg/ µl
2. Mezclar y alicuotar, conservar a -20ºC.
Evitar repetidos ciclos de calentamientoenfriamiento.
3. Calcular el volumen de la mezcla Viral
Lysis Buffer/carrier RNA requerido para
procesar todas las muestras a analizar
simultáneamente. Por ejemplo, para
preparar Viral Lysis Buffer conteniendo
carrier RNA para procesar 10 muestras,
mezclar 58.8 µl carrier RNA stock
solution con 2.1 ml Viral Lysis Buffer.
4. Descongelar la cantidad requerida de la
solución stock de carrier a 1 µg/ µl
5. En un tubo estéril añadir el volumen de la
solución stock al volumen de Viral Lysis
Buffer requerido. Mezclar suavemente con
pipeta.
6. Conservar a 4ºC hasta su uso. Utilizar este
tampón así preparado antes de 1 hora
•
•
•
•
•
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Dissolve the proteinase K in 2 ml of nucleasefree water and store at –20ºC. It is
recommended to do several aliquots to avoid
too many thaw/freeze cycles. At this
temperature it is stable for 1 year.
Add 20 ml Ethanol 100 % to the Viral Wash
Buffer (REA03V). Keep the container closed to
avoid the ethanol evaporation
Add 80 ml Ethanol 100 % to the Viral Wash
Buffer 2 (REA04). Keep the container closed to
avoid the ethanol evaporation.
Carrier RNA: The recommended purification
protocol uses 5.6 µg carrier RNA per sample.
If you wish to use less carrier RNA per sample,
you need to validate the amount of carrier RNA
needed for each sample type and downstream
applications.
Eluates from this kit contain both viral nucleic
acids and carrier RNA, and amounts of carrier
RNA will greatly exceed amounts of viral
nucleic acids, calculations of how much eluate
to add to downstream amplifications should
therefore be based on the amount of carrier
RNA added. To obtain highest levels of
sensitivity in amplification reactions, it may be
necessary to adjust the amount of carrier RNA
added to Viral Lysis Buffer.
To prepare Carrier RNA 5.6 µg carrier RNA
per sample:
1. Add 620 µl RNase free-water to 620 µg
carrier RNA supplied in a tube with the kit,
to obtain 1 µg/ µl carrier RNA stock
solution.
2. Mix thoroughly and aliquot at -20ºC.Avoid
repeated freezing and thawing.
3. Calculate the volume Viral Lysis
Buffer/carrier RNA mix required to
process the desired number of samples
simultaneously. For example to prepare
Viral Lysis Buffer containing carrier RNA
for processing 10 samples, mix 58.8 µl
carrier RNA stock solution with 2.1 ml
Viral Lysis Buffer.
4. Thaw the required amount of 1 µg/ µl
carrier RNA stock solution
5. In a sterile tube, add the volume of carrier
RNA stock solution to the volume Viral
Lysis Buffer. Mix gently by pipetting up
and down.
6. Store at 4ºC until use. Use the buffer
within 1 hour.
REAL es una marca registrada por Durviz, s.l.
3.3 Protocolo para la extracción de ADN y ARN viral a partir de suero, plasma y fluidos
biológicos
Pipetear 25 µl Proteinasa K en un
microtubo de centrifuga estéril.
2. Añadir 200 µl de plasma o suero en el
microtubo. Si usted procesa muestras
menores de 200 µl, ajustar el volumen
final a 200 µl utilizando PBS o 0.9%
NaCl.
3. Añadir 200 µl de Tampón de Lisis Viral
(conteniendo 5.6 µg carrier RNA).
Cerrar el microtubo y vortex
vigorosamente durante 20 segundos.
4. Incubar a 56ºC durante 20 minutos.
5. Centrifugar brevemente el microtubo
para recoger las gotas de la tapa.
6. Añadir 250 µl etanol 100% a la muestra.
Agitar mediante vortex durante 15
segundos.
7. Incubar el lisado por 5 minutos
temperatura ambiente.
8. Añadir el lisado a la Viral Spin Column
con un tubo de recolección..
9. Centrifugar la columna a 8.000-10.000
rpm por 1 min. Eliminar el tubo de
recolección. Colocar la spin columna en un
nuevo tubo de recolección.
10. Lavar la columna con 500 µl de Tampón
de Lavado Viral 1 con etanol.
1.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
Centrifugar la columna a 8.000-10.000
rpm por 1 min.
Lavar la columna con 500 µl de Tampón
de Lavado Viral 2 con etanol.
Centrifugar la columna a 10.000-12.000
rpm por 1 min.
Volver a lavar la columna con 500 µl de
Tampón de Lavado Viral 2 con etanol.
Centrifugar la columna a 10.000-12.000
rpm por 1 min.
Centrifugar la spin columna a máxima
velocidad durante 2 minutos para
eliminar el etanol residual.
Eluir con 30-50 µl de Tampón de
Elución añadido al centro de la
membrana de la columna.
Incubar a temperatura ambiente por 1
minuto.
Centrifugar la spin columna a máxima
velocidad durante 1 minuto. El
microtubo ahora contiene los ácidos
nucleicos virales. eliminar la spin
columna.
Conservar el ADN/ARN viral a -80ºC o
utilizarlo en las aplicaciones posteriores
inmediatamente.
3.3 Protocol for Viral Nucleid Acids from plasma,serum and cell free body fluids
Pipet 25 µl Proteinase K into a sterile
microcentrifuge tube.
2. Add 200 µl of plasma or serum into the
microcentrifuge tube. If you are
processing less than 200 µ l of sample,
adjust final volume to 200 µl using PBS or
0.9% NaCl.
3. Add 200 µl Viral Lysis Buffer (containing
5.6 µg carrier RNA). Close the tube lid
and mix by vortexing for 20 seconds.
4. Incubate at 56ºC for 20 minutes.
5. Briefly centrifuge the 1.5 ml tube to
remove drops from the inside of the lid.
6. Add 250 µl ethanol 100% to the sample.
Vortex for 15 seconds .
7. Incubate the lysate for 5 minutes at room
temperature.
8. Add the lysate to the Viral Spin Column
in a collection tube.
9. Centrifuge the column at 8.000-10.000
rpm for 1 min. Discard the collection
tube. Place the spin column in a new
collection tube.
10. Wash the column with 500 µl Viral Wash
1.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
4/5
Buffer 1 with ethanol. Centrifuge the
column at 8.000-10.000 rpm for 1 min.
Wash the column with 500 µl Viral Wash
Buffer 2 with ethanol. Centrifuge the
column at 10.000-12.000 rpm for 1 min.
Wash the column again with 500 µl Viral
Wash Buffer 2 with ethanol. Centrifuge
the column at 10.000-12.000 rpm for 1
min.
Centrifuge the spin column at maximum
speed for 2 minutes to remove any residual
Wash Buffer.
Elute with 30-50 µl Elution Buffer
adding to the centre of the cartridge.
Incubate at room temperature for 1
minute.
Centrifuge at maximum speed for 1
minute. The recovery tube contains
purified viral nucleic acids. Discard the
spin column.
Store purified viral DNA/RNA at -80ºC or
use RNA/DNA for the desired downstream
application
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4. GUIA DE PROBLEMAS Y POSIBLES SOLUCIONES
TROUBLESHOOTING
We recommend contacting REAL’s laboratory
technical services at Durviz s.l. for any additional
question about work protocols or any problem that
may appear while you are working.
Recomendamos que no duden en ponerse en
contacto con el servicio técnico del laboratorio
REAL en Durviz s.l. para cualquier consulta
adicional respecto a los protocolos de trabajo o
problemas que puedan surgir durante el trabajo.
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