La extracción y purificación del ADN para el análisis por PCR. Mitos

Newsletter Microbial
http://www.microbial‐systems.com Núm.
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Enero ‐ Febrero de 2009 Informaciones sobre Análisis Microbiológicos por PCR La extracción y purificación del ADN para el análisis por PCR.
Mitos y realidades
“De los tres pasos Introducción En PCR, el ácido desoxirribonucleico (ADN) es
críticos que comel analito. Por tanto, una buena muestra impliponen el análisis de ca siempre un correcto proceso de obtención de
esta molécula a partir de material biológico.
patógenos por
La extracción de ADN consta de una etapa de
PCR, la extracción lisis, que consiste en romper las estructuras
confinan el citoplasma y liberar al medio su
de ADN es quizás que
contenido y otra de purificación, que implica la
el más desconoci- retirada de la solución final de la mayoría de
elementos que pueden interferir en la PCR.
do... ”
“...las suspensiones
densas de bacterias
gramnegativas
pueden liberar su
ADN en condiciones bastante suaves... ” Lavado del pellet. Se realiza con alcohol
frío volviendo a centrifugarse
•
Recuperación. El sedimento se puede resuspender en agua o tampón Tris tras ser
secado completamente.
La confirmación de la presencia de ADN se
lleva a cabo mediante electroforesis en un gel
de agarosa i posterior tinción con bromuro de
etidio y observación con luz UV o directamente
al espectrofotómetro mediante espectro de
absorción de 200 a 350 nm. El ADN purificado
De los tres pasos críticos que componen el aná- se puede cuantificar con un espectrofluorímetro
lisis de patógenos por PCR (Fig. 1), la extrac- mediante el uso de fluoróforos específicos
ción de ADN es quizás el más desconocido y (Picogreen®, Molecular Probes)
sobre el que más control podemos ejercer.
El paso 3 puede realizarse con la ayuda de mi-
Enriquecimiento
Extracción ADN
Detección PCR
Figura 1. La extracción de ADN es un paso clave en los análisis microbiológicos por PCR La extracción del ADN de las células o virus
donde se halla confinado es un paso previo en
muchos procedimientos analíticos y diagnósticos.
Etapas en la extracción de ADN
“La incorporación
de controles internos de amplificación en los kits
permite el control
del nivel de inhibición de las reacciones...”
•
nicolumnas equipadas con una membrana de
sílica que retiene específicamente el ADN permitiendo el paso de las moléculas y sales que
acompañan la reacción de lisis. Finalmente se
lava con alcohol y se eluye el contenido
Los pasos necesarios para una correcta extrac- Inhibidores de la PCR ción y purificación del ADN mediante un proce- Se trata de substancias que interfieren con las
dimiento químico son:
ADN polimerasas termoestables ya sea mediante el bloqueo directo total o parcial de su activi1. Lisis de las células o virus. Las sales caotró- dad catalítica o mediante la unión directa al
picas ayudan a romper la estructura tridi- ADN de doble cadena. Por ejemplo, algunas
mensional de macromoléculas como las substancias interaccionan con los iones Mg2+
proteínas o los ácidos nucleicos consiguiendo su desnaturalización. La adición de un Tabla 1. Principales substancias inhibidoras de la PCR
detergente como el SDS es necesaria a meInhibidor
Origen
nudo para eliminar las membranas.
2. Degradación de la fracción proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adición
de una proteasa. La fracción proteica puede
precipitarse mejor con la ayuda de sales
como el acetato de amonio o el acetato
sódico.
3. Purificación. Consta de 3 fases:
•
Precipitación del ADN. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol frío o isopropanol i recuperar
mediante una centrifugación. El alcohol
del sobrenadante se llevará las sales añadidas previamente.
‐ 1 ‐ Sales biliares
Heces
Polisacáridos complejos
Heces, material vegetal
Colágeno
Tejidos
Grupo hemo
Sangre
Ácidos húmicos
Suelo, material vegetal
Melanina y eumelanina
Pelo, piel
Mioglobina
Tejido muscular
Proteinasas
Leche
Iones de calcio
Leche, huesos
Urea
Orina
Hemoglobina, Lactoferrina
Sangre
Inmunoglobina G (IgG)
Sangre
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(un cofactor crítico de la actividad catalítica) o disminuyen su
disponibilidad pudiendo inhibir la PCR.
En la tabla 1 se recogen algunas de las principales substancias
inhibidoras conocidas.
Otra importante fuente de inhibición son los propios reactivos
que se usan en el proceso de extracción de ADN, como por
ejemplo, el exceso de KCl, NaCl y otras sales, detergentes iónicos, etanol e isopropanol, fenol y otros.
Los inhibidores pueden eliminarse mediante purificación
química del extracto (pasos 3 a 6) o física mediante columnas
de sílica.
Extracción de ADN en suspensiones bacterianas De todas las muestras biológicas que podemos someter a un
proceso de extracción de ADN, las suspensiones bacterianas,
son quizás las que ofrecen menos problemas por la homogeneidad y riqueza del material. En particular, las suspensiones
densas de bacterias gramnegativas pueden liberar cantidad
suficiente de ADN en condiciones bastante suaves como pueden ser una simple ebullición, congelación o una combinación
de ambas (frezze & thaw).
do, pero muy poco eficacia en bacterias grampositivas.
2. Ebullición (combinado con congelación). Algunos fabricantes incorporan un paso de ebullición de la muestra
previo a la PCR como única acción para extraer el ADN de
la muestra. Si bien esto puede ser usado en suspensiones
con números elevados de bacterias gramnegativas, su baja
eficiencia especialmente con organismos grampositivos,
reduce notablemente el nivel de detección del método.
3. DNAready® (Microbial) Se trata de un tampón de lisis
que incorpora los elementos necesarios para buscar un
equilibrio entre eficiencia y pureza que además está desarrollado para ser especialmente efectivo con bacterias
grampositivas.
Conclusiones En Microbiología de los alimentos, los inhibidores de la PCR
provienen principalmente de la matriz alimentaria analizada o
de los medios utilizados para el enriquecimiento. La incorporación de controles internos de amplificación en los kits permite conocer el nivel de inhibición de las reacciones.
Las bacterias no suelen contener substancias inhibidoras, por
lo que en la mayoría de casos una extracción primaria (lisis y
liberación del ADN) es suficiente para tener resultados satisEl laboratorio de Microbiología que decide incorporar la PCR factorios. Esto no significa necesariamente que se puedan
a sus métodos de investigación de bacterias patógenas en siempre usar métodos poco drásticos, pues éstos no son efectialimentos, lo hace buscando rapidez y simplicidad. La purifi- vos para extraer el ADN de las bacterias grampositivas.
cación del ADN tras el proceso de lisis y liberación tiene como
ventaja la obtención de un analito sin inhibidores a cambio de La utilización de métodos de purificación post-extracción
un sensible aumento del tiempo de análisis y de los pasos de como por ejemplo las minicolumnas de sílica implica un aumento en el coste y en el número de manipulaciones (Tabla 2)
manipulación.
lo que hace que sólo sea aconsejable en aquellas matrices en
Analizar directamente un caldo de enriquecimiento tras un las que los métodos primarios no pueden eliminar los inhibiproceso de extracción primaria de ADN (lisis celular) suele dores.
producir resultados satisfactorios para la mayoría de matrices
alimentarias por lo que un paso
Tabla 2. Comparación del material, tiempo y costes asociados a diferentes métodos de extracción de
de purificación no es estricta- ADN comúnmente utilizados.
mente necesario. Además, los
kits de análisis de patógenos
por PCR incorporan detectores Característica
Macherey-Nagel DNAready
Chelex®
F&T
de inhibición (controles inter6
1
2
2
nos de amplificación). Sola- Pasos centrifugación
mente aquellas matrices cuya Pasos pipeteo
10
2
3
3
presencia de inhibidores no
3
1
2
2
pueda ser contrarrestada dilu- Cambios de tubo
yendo el extracto de ADN obli- Coste por reacción (€)
>3
<1,5
<1,5
<1,5
garán a plantear la adopción de
2h 30min
1h
1h 20min
1h 30min
técnicas de extracción de ADN Tiempo (h)*
que aseguren un extracto puro.
Cambios Tª
2
3
3
7
¿Es necesaria la purificación de ADN en la detección de patógenos en alimentos por PCR? Obtención de ADN sin paso de purificación.
Cada casa comercial acompaña a sus detectores con un méto- Bibliografía Rådström, P. et al. (2004) Pre-PCR processing: Strategies to
do de extracción de ADN. Éstos son fundamentalmente tres:
generate PCR-compatible samples. Mol. Biotechnol. 26, 133–
1. Chelex®. El uso de una resina de sílica ayuda a separar 46.
selectivamente el ADN de la solución. Es un método rápi-
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