Espectroscopía de emisión molecular

Espectroscopía de emisión
molecular - Aplicaciones
Relacion experimental entre la
fluorescencia y la concentración
φf = Q = fotones emitidos / fotones absorbidos = If / Iabs
Iabs = Iinc· (1 - T) = Iinc·(1 - 10-A) = 1 - 10-εlc
If = φf ·Iabs = φf ·(1 - 10-εlc)
si εlc → 0 ; (1 - 10-εlc) → 2.303 εlc
Y por lo tanto, If = 2.303 φf Iinc εlc
la aproximacion se cumple al 5% si A < 0.05
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Métodos de análisis
Directos: para cuantificar un analito ya fluorescente
Indirectos:
a) por formacion de complejos fluorescentes entre el
analito y una molecula auxiliar.
b) por reaccion química que forma un compuesto
fluorescente.
c) por disminucion de la fluorescencia (quenching) debido
a la presencia del analito.
Metodos directos:
Los iones de lantánidos y actinidos suelen mostrar fluorescencia.
P.ej. Ce, Pr, Nd, U, etc.
Ce (III) λex = 260nm, λem = 350 nm.
U(VI) λex = 520nm, λem = 620 nm.
Algunas moleculas de interes biomédico presentan
fluorescencia. P. ej. Riboflavina (vitamina B12), NADH,
FAD/FADH2, clorofila, aminoacidos aromáticos, porfina, etc
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Metodos indirectos:
a) iones inorgánicos por formacion de complejos fluorescentes
Ca2+ dependent fluorescence
emission spectra of fluo-3
Familia del Calcium Green
EDTA
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Determinación de calcio
• Calceina (λex = 450 nm, λem = 520 nm).
• fura-2, indo-1, fluo-3, fluo-4, Calcium Green-1.
• -Ondas de concentración de Ca2+ en ovocitos, asociados con la
meiosis.
Function and characteristics of repetitive calcium waves
associated with meiosis, Alex McDougall and Christian Sardet,
Current Biology 1995, 5:318-328
Metodos indirectos:
b) moléculas orgánicas por reacción química
- aminas
λex = 390 nm, λem = 475 nm
- aminoácidos
- proteínas
λex = 340 nm, λem = 455 nm
(Y en combinacion
con HPLC)
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Metodos indirectos:
b2) actividad enzimática
Metodos indirectos:
c) por quenching de fluorescencia
Complejo de Zr-alizarina
excitation 470 nm (azul)
emision 520 nm (verde)
Sensibilidad al F- 0.001 ug/ml
Interferentes: Be, CO, Cr, Cu, Fe,
Ni, Th, etc.
Cu2+
Fe3+
Ni2+
Pb2+
F-
Bathocuporine
Rhodamine B
Na(PAN)
Eosin
Alizarina
6x10-3 ppm
2x10-3 ppm
6x10-5 ppm
1x10-1 ppm
1x10-3 ppm
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Quenching estatico
La emision decae con la concentración de quencher.
Sistemas de medición
sensores
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Sanguchitos de cubreobjetos rellenos con una solución 10 mM de [Ru(bpy)3]Cl2, sumergido
en agua dentro de una capsula de Petri.
Las fotos se toman a traves de un filtro anaranjado que deja pasar solamente la
fluorescencia, se divide pixel a pixel por la iluminacion de excitacion correspondiente a cada
punto, se usa la curva de calibracion de Temperatura vs. fluorescencia y se muestran en falso
color con ImageJ, despues de aplicar un filtro gaussian de 5 pixeles.
(a) Durante el calentamiento se ve un gradiente de temperatura de 1 grado aprox.
(b) Placa sin calentamiento, termalizada, se ven variaciones maximas de 0.18 ºC
Video de un sanguchito de cubreobjeto de 22 x 18 mm durante el calentamiento
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Optodos en el mar Negro
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Ver el video de las variaciones en el tiempo en:
http://www.mpi-bremen.de/Binaries/Binary14293/black_sea_fluctuations.gif
Límites analíticos de la técnica
Tiempos caracteristicos de emision: 10-9 - 10-8 s
Repeticion posible de emision: 108 - 109 fot/s/molec
Con instrumental adecuado se detecta una
MOLECULA UNICA.
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“Single molecule fluorescence”
F1FO ATP Synthase:
F1FO-ATPase:
ATP
ADP + Pi
ATP
ADP + Pi
V
H
γ
time
Stepping rotation of F1-ATPase visualized through angle-resolved single-fluorophore imaging.
Proc Natl Acad Sci U S A 2000 Jun 20;97(13):7243-7
Adachi K, Yasuda R, Noji H, Itoh H, Harada Y, Yoshida M, Kinosita K Jr.
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La emision del fluoroforo Cy3 pegado a la subunidad γ de la ATPasa
cambia la polarizacion al rotar en pasos de 120 grados. Cada paso
implica la hidrolisis de una molecula de ATP.
Secuenciacion de DNA
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Excitacion en 2 fotones
Se precisa mucha potencia ...
Absortividad en 2P es muy baja : 1-100 GM (10-50 cm4s-1fot-1)
Asi que la densidad de luz debe ser enorme
I ~ 1030 fot.cm-2s-1
Pinst ~ 100 GW/cm2
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Corrimiento anti-stokes
Excitacion
800 nm
Emission
630nm
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seccionamiento
seccionamiento
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Upconversion
Upconversion
core = NaYF4 - 2% Er3+ - 30% Yb3+
shell = NaYF4
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Tinta de seguridad
Fluorometro con fibra optica
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Punta de la fibra
Espectro de emision
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Deteccion de DNA
Espectroscopía de emisión
molecular - Conclusiones
- la espectroscopía de emisión presenta muy alta sensibilidad
analítica.
- es posible aumentar la selectividad de la técnica mediante
métodos adecuados.
- los equipos tradicionalmente fueron caros, pero su costo está
bajando muy rapidamente.
- es posible hacer medidas de buena calidad con instrumental de
campo basado en equipos de uso masivo (cámaras, celulares, etc)
- la microscopía de fluorescencia permite no sólo la detección
sino la medición de parámetros químicos y físicos con alta
sensibilidad y robustez.
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