TESIS Para cubrir parcialmente los requisitos necesarios

CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA Y DE EDUCACIÓN SUPERIOR
DE ENSENADA
PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIAS
CON ORIENTACIÓN EN ACUICULTURA
ANÁLISIS CITOGENÉTICO EN TRES ESPECIES DE ABULONES DE BAJA
CALIFORNIA MEDIANTE PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES
TESIS
Para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de
DOCTOR EN CIENCIAS
Presenta:
Cristian Jorge Gallardo Escarate
Ensenada, Baja California, México, Abril de 2005.
INDICE GENERAL
Acta de aprobación de tesis .....................................................................................................i
Resumen ................................................................................................................................. ii
Abstract................................................................................................................................. iii
Dedicatoria ............................................................................................................................iv
Agradecimientos ..................................................................................................................... v
Indice de figuras ...................................................................................................................vii
Indice de tablas....................................................................................................................... x
................................................................................1
................................................................................8
Generales ............................................................................................................................8
Específicos ..........................................................................................................................8
................................................................................9
III. 1. Importancia de abulones en acuicultura ..................................................................9
III. 2. Introducción a la genética de abulones..................................................................11
III.3. El valor de estudios citogenéticos ...........................................................................15
1. 3. 1. Citogenética molecular.....................................................................................16
1. 3. 2. Citogenética de organismos acuáticos .............................................................19
1. 3. 3. Citogenética de moluscos .................................................................................19
1. 3. 4. Implicaciones de tamaño genómico..................................................................22
1. 3. 5. Análisis de imágenes como una herramienta en citogenética..........................25
..............................................................................28
IV. 1. Obtención de cariotipos en abulones a partir de larvas.........................................28
4. 1. 1. Obtención de organismos .................................................................................28
4. 1. 2. Obtención de placas metafásicas......................................................................29
4. 1. 3. Tratamiento hipotónico.....................................................................................29
4. 1. 4. Fijación.............................................................................................................29
4. 1. 5. Confección de preparaciones ...........................................................................29
4. 1. 6. Desarrollo de cariotipos...................................................................................30
IV. 2. Procedimientos de FISH para la localización cromosómica de genes ..................31
4. 2. 1. FISH para ADNr 18S+5.8S+ 28S ....................................................................31
4. 2. 2. FISH para regiones Teloméricas y GATA........................................................34
4. 2. 3. Detección inmunocitoquímica ..........................................................................35
IV. 3. Relaciones cromosómicas entre Haliotis rufescens, H. fulgens y H. corrugata.....35
IV. 4. Desarrollo de un método para estimar tamaño genómico mediante análisis de
imagenes fluorescentes .....................................................................................................36
4. 4. 1. Material biológico ............................................................................................36
4. 4. 2. Recolección de muestras y preparación celular para tinción de ADN ..........37
4. 4. 3. Captura de imágenes ........................................................................................38
4. 4. 4. Análisis de imágenes fluorescentes...................................................................39
IV. 5. Estimación de contenido de ADN cromosómico en abulón rojo H. rufescens .......41
4. 5. 1. Preparación de cromosomas y tinción de ADN................................................41
4. 5. 1. Análisis de imágenes en contenidos de ADN cromosómicos............................41
4. 5. 2. Análisis estadístico ...........................................................................................42
IV. 6. Estimación de tamaño genómico en Argopecten purpuratus .................................42
4. 6. 1. Material biológico ............................................................................................42
4. 6. 2. Obtención de hemocitos y tinción fluorescente de ADN...................................43
4. 6. 3. Análisis estadístico ...........................................................................................43
..............................................................................44
V. 1. Cariotipo cuantitativo de Haliotis rufescens............................................................44
V. 2. Cariotipo cuantitativo de Haliotis fulgens ...............................................................47
V. 3. Cariotipo cuantitativo de Haliotis corrugata...........................................................50
V. 4. Hibridación in situ fluorescente en Haliotis rufescens ............................................53
V. 5. Hibridación in situ fluorescente en Haliotis fulgens................................................55
V. 6. Hibridación in situ fluorescente en Haliotis corrugata ...........................................56
V. 7. Relaciones cromosómicas entre H. rufescens, H. fulgens y H. corrugata ...............60
V. 8. Estimación de tamaño genómico mediante análisis de imágenes fluorescentes......63
5. 8. 1. La naturaleza del desvanecimiento DAPI-fluorescentes ..................................63
5. 8. 2. La relación entre desvanecimiento DAPI-fluorescente y tamaño genómico....69
V. 9. Contenido de ADN cromosómico en abulón rojo del Pacífico Haliotis rufescens ..75
V. 10. Estimación de tamaño genómico en dos poblaciones de Argopecten purpuratus .82
5. 10. 1. Mediciones morfológicas................................................................................82
5. 10. 2. Análisis de tamaño genómico mediante desvanecimiento fluorescente .........82
..............................................................................87
VI. 1. Relaciones cromosómicas entre Haliotis rufescens, H. fulgens y H. corrugata.....87
VI. 2. Desarrollo de citogenética molecular en moluscos: aplicación en abulones de
Baja California .................................................................................................................92
VI. 3. Desarrollo de un método de cuantificación de contenido de ADN genómico
mediante análisis de imágenes fluorescentes ...................................................................96
VI. 4. Contenido de ADN cromosómico en abulón rojo Haliotis rufescens ...................100
VI. 5. Estimación de tamaño genómico en dos poblaciones de Argopecten purpuratus
mediante análisis de imágenes fluorescentes .................................................................102
............................................................................105
............................................................................109
i
TESIS DEFENDIDA POR
Cristian Jorge Gallardo Escarate
Y APROBADA POR EL SIGUIENTE COMITÉ
Dr. Josué Álvarez Borrego
Dr. Miguel Ángel del Río Portilla
Director del Comité
Co-Director del Comité
Dra. Carmen Paniagua Chávez
Dr. Axayácatl Rocha Olivares
Miembro del Comité
Miembro del Comité
Dr. Jorge de la Rosa Vélez
Miembro del Comité
Dra. Mónica Hernández Rodríguez
Dr. Federico Graef Ziehl
Coordinador del Programa de
Director de Estudios de Posgrado
Posgrado en Ciencias con
Orientación en Acuicultura
Abril de 2005
ii
RESUMEN de la tesis que presenta Cristian Gallardo Escarate, presentada como requisito
parcial para la obtención del grado de DOCTOR EN CIENCIAS con especialidad en
ACUICULTURA. Ensenada, Baja California, México. Abril de 2005.
ANÁLISIS CITOGENÉTICO DE TRES ESPECIES DE ABULONES DE BAJA
CALIFORNIA MEDIANTE PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES
Resumen aprobado por:
Dr. Josué Álvarez Borrego
Dr. Miguel Ángel del Río Portilla
Director del Comité
Co-Director del Comité
El objetivo fundamental de la citogenética es analizar cómo la estructura y comportamiento de
los cromosomas garantizan la conservación de la información genética a través de la herencia.
Asimismo se estudian las variaciones que afectan a los cromosomas, sus consecuencias genéticas y
sus implicaciones evolutivas.
El objetivo del presente trabajo doctoral fue caracterizar citogenéticamente tres especies de
abulones de Baja California mediante procedimientos de análisis de imágenes. Para lo cual, se
obtuvieron células larvales de Haliotis rufescens, H. fulgens y H. corrugata. El análisis cariotípico
mostró que las tres especies estudiadas presentan un número diploide de 2n=36 cromosomas. Sin
embargo, la relación de longitudes de los brazos cromosómicos mostró que H. rufescens posee
8M+9SM+1ST pares cromosómicos, H. fulgens posee 8M+8SM+2ST y H. corrugata posee
10M+7SM+1ST.
El uso de sondas ribosómicas mediante FISH, permitió la localización de dos clusters de genes
ribosómicos 18S-5.8S-28S que integran las NOR’s. De este modo, en todas las especies estudiadas
se localizó un NOR sobre el cromosoma 4, mientras que un segundo NOR fue observado sobre el
cromosoma 5 de H. rufescens, cromosoma 11 de H. fulgens y cromosoma 2 de H. corrugata.
Adicionalmente, regiones teloméricas (TTAGGG)n y (GATA)n fueron encontradas en el genoma de
los abulones mediante FISH para estos tipos de secuencias.
Los análisis estadísticos sobre la morfología cromosómica, mostraron que de los 18 pares
cromosómicos de cada especie, 8 pares son similares en las tres especies estudiadas, 3 pares son
propios de H rufescens, 7 pares de H. fulgens y 2 pares de H. corrugata. Las relaciones
cromosómicas mostraron que H. rufescens y H. corrugata son entre sí citogenéticamente más
similares que cualquiera de ellas con respecto a H. fulgens.
Adicionalmente, el presente trabajo propuso un nuevo método de estimación de tamaño
genómico mediante la cuantificación de desvanecimiento DAPI-fluorescente. La relación entre los
valores de desvanecimiento fluorescente de un organismo u especie y su tamaño genómico fue
encontrada estadísticamente significativa (p<0.001) y lineal (r = 0.99). Una aplicación directa fue
desarrollada para cuantificar el contenido de ADN cromosómico en H. rufescens y para estimar el
tamaño genómico de dos poblaciones de Argopecten purpuratus.
En conclusión, el presente trabajo doctoral aporta nueva información citogenética de tres
especies de abulones de Baja California. Asimismo, aporta con el desarrollo de un nuevo método de
estimación de tamaño genómico mediante análisis de imágenes fluorescente.
Palabras clave: Cariotipos, FISH, H. rufescens, H. fulgens, H. corrugata, análisis de imágenes,
tamaño genómico.
iii
ABSTRACT of the Thesis presented by Cristian Gallardo Escarate as a partial requirement to
obtain the DOCTOR IN SCIENCE degree with orientation in AQUACULTURE. Ensenada, Baja
California, México. April 2005.
CITOGENETIC ANALYSIS OF THREE ABALONE SPECIES FROM BAJA
CALIFORNIA BY MEANS OF DIGITAL IMAGE PROCESSING
Abstract approved by:
Dr. Josué Álvarez Borrego
Dr. Miguel Ángel del Río Portilla
Director del Comité
Co-Director del Comité
The fundamental aim of the cytogenetics is to analyze how both structural and behavior of the
chromosomes guarantee the conservation of the genetics information throughout the inheritance.
Likewise, the variations that could be affect to the chromosomes, its genetic consequences, and
evolutionary implications are studied.
The aim of the present doctoral work was to characterize cytogenetically three abalone species
from Baja California by means of image analysis procedures. Thus, larvae cells were obtained from
Haliotis rufescens, H. fulgens, and H. corrugata. Karyotype analysis showed that all studied species
have a diploid number of 2n=36 chromosomes. However, the relationship of chromosomal arms
lengths showed that H. rufescens has 8M+9SM+1ST chromosome pairs, H. fulgens has
8M+8SM+2ST, and H. corrugata has 10M+7SM+1ST.
The using of ribosomal probes by means of FISH, allowed to locate two clusters of ribosomal
genes 18S-5.8S-28S that form the NOR’s. In this way, in all the studied abalone species was
localized one NOR onto the chromosome 4, while one second NOR was observed onto the
chromosome 5 of H. rufescens, chromosome 11 of H. fulgens, and chromosome 2 of H. corrugata.
Furthermore, both telomeric (TTAGGG)n and (GATA)n regions were found in the abalone’s
genome by means of FISH for these kinds of sequences.
Statistical analyses carried out on the chromosomal morphology showed that in the 18
chromosome pairs of each species, 8 pairs are similar in the three studied species, and 3 pairs
belongs to H rufescens, 7 pairs to H. fulgens, and 2 pairs to H. corrugata. Chromosome
relationships showed that both H. rufescens and H. corrugata are cytogenetically most similar than
anyone with respect to H. fulgens.
In addition, the present work proposed a new method for genome size estimation by means of
DAPI-fluorescent fading quantification. The relationship between the fluorescent fading values of
an organism or species, and its genome size was found statistically significative (p<0.001) and
lineal (r = 0.99). A direct application was performed in order to quantify the chromosomal DNA
content in H. rufescens, and to estimate genome size of two populations of Argopecten purpuratus.
In conclusions, the present doctoral work contributes with new cytogenetic information of three
abalone species from Baja California. Likewise, It is contributes with a new method for genome
size estimation by mean of fluorescent image analysis.
Key words: Karyotypes, FISH, H. rufescens, H. fulgens, H. corrugata, image analysis, genome
size.
iv
A mí amada Paty
y a mi hijo Cristian Ignacio
v
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por el apoyo económico, a
través a los siguientes proyectos de investigación:
-
Proyecto 36075-B "Procesado Automático de Partículas Biogénicas", a cargo del Dr.
Josué Álvarez Borrego.
-
Proyecto 33018-B “Marcadores genéticos en el abulón Haliotis spp.”, a cargo del Dr.
Miguel Ángel del Río-Portilla.
-
Programa Integral de Fortalecimiento del Posgrado, Departamento de Acuicultura,
CICESE.
Al Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada por el apoyo
económico, a través a los siguientes proyectos:
-
Proyecto Interno CICESE 7090, de la División de Física Aplicada, Departamento de
Óptica "Procesamiento de Patrones Complejos y de Superficies Marinas", a cargo del
Dr. Josué Álvarez Borrego.
-
Proyecto Interno CICESE 6555, de la División de Oceanología, Departamento
Acuicultura "Genética molecular de especies acuiculturales", a cargo del Dr. Miguel
Ángel del Río-Portilla.
Al programa de Becas para Estudios de Postgrado de la Comisión Nacional de
Investigación Científica y Tecnológica (CONICyT) convenio BID, Chile.
Al programa de Becas para Estudios de Postgrado de la Organización de los Estados
Americanos (OEA).
vi
Al Dr. Josué Álvarez-Borrego por haberme recibido desde el fin del mundo como aprendiz.
Por el valor o la locura de inculcarme la ciencia interdisciplinaria. Por su amistad.
Al Dr. Miguel Ángel del Río-Portilla por la búsqueda del equilibrio entre las imágenes y la
genética. Por las discusiones entorno a la hipótesis, a la metodología y a los cromosomas.
A la Dra. Laureana Rebordinos de la Universidad de Cádiz, España y a su equipo de trabajo
durante la estancia de investigación en el Laboratorio de Genética.
Al M en C Mario A. Bueno por su ayuda en el procesado de imágenes y por su amistad en
todo momento.
A la Sociedad Cooperativa de Producción Pesquera (SCPP), Pescadores Nacionales de
Abulón (PNA), S.C. de R.L. por el apoyo logístico durante las estancias de investigación en
Isla de Cedros y de manera muy especial al Oceanólogo José Guadalupe González Avilés
por su ayuda en la obtención de larvas de abulón. Por mostrarme que la experiencia en
laboratorio vale más que cualquier protocolo.
A los Doctores Carmen Paniagua, Axayácatl Roche y Jorge de la Rosa, miembros del
Comité de tesis, por las sugerencias y disposición durante todo el trabajo doctoral.
Finalmente, a mi pequeña gran familia que desde el otro lado del mundo me han brindado
su apoyo incondicional en todo momento.
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura
Página
1
Relaciones filogenéticas entre especies de abulones de California
sugerida mediante comparación inmunocitoquímica de hemocianinas
(Meyer, 1967). Diagrama obtenido de Leighton (2000).
12
2
Relaciones filogenéticas de abulones californianos y japoneses
inferida a partir de secuencias de ADN del gen lisina en
espermatozoides. Diagrama tomado de Lee y Vacquier (1995).
13
3
Esquema de procedimiento de obtención de placas metafásicas desde
larvas de abulón.
30
4
Procedimiento general de medición de tamaño genómico a través de
la cuantificación del desvanecimiento fluorescente de ADN.
40
5
Cromosomas de Haliotis rufescens. a) Imagen digital de placa
metafásica, b) Cariotipo de H. rufescens.
45
6
Carioidiograma de Haliotis rufescens. M, metacéntrico; SM,
submetacéntrico; ST, subtelocéntrico; T, telocéntrico.
47
7
Cariotipo de Haliotis fulgens (2n=36).
48
8
Carioidiograma de Haliotis fulgens. M, metacéntrico;
submetacéntrico; ST, subtelocéntrico; T, telocéntrico.
9
Cariotipo de Haliotis corrugata (2n=36).
51
10
Carioidiograma de Haliotis corrugata. M, metacéntrico; SM,
submetacéntrico; ST, subtelocéntrico; T, telocéntrico.
53
11
Arreglo cariotípico de Haliotis rufescens con hibridación in situ
fluorescente para sonda de gen ribosomal mayor 18S-5.8S-28S.
54
12
FISH en Haliotis rufescens. a) Cromosomas mitóticos metafásicos
después del tratamiento con sonda telomérica (TTAGGG)n, b) Núcleo
interfásico con sonda telomérica, c) Cromosomas mitóticos después
de ser marcado con sonda (GATA)n, d) Núcleo interfásico marcado
con sonda (GATA)n.
57
SM,
50
viii
LISTA DE FIGURAS (continuación)
Figura
Página
13
FISH en Haliotis fulgens. a) Cromosomas mitóticos hibridados con
sonda ADNr 18S-5.8S-28S, b) Núcleo interfásico con sonda ADNr, c)
Cromosomas metafásicos con sonda telomérica (TTAGGG)n, d)
Núcleo interfásico con sonda telomérica, e) Cromosomas metafásicos
hibridados con sonda (GATA)n, f) Núcleo interfásico con sonda
(GATA)n. Flechas azules indican regiones NOR en cromosomas
homólogos. Flechas amarillas muestran heteromorfismos de NOR
entre cromátidas hermanas. Flechas blancas indican señales
intersticiales de ADNr.
58
14
FISH en Haliotis corrugata. a) Cromosomas mitóticos hibridados con
sonda ADNr 18S-5.8S-28S. b) Núcleo interfásico con sonda ADNr. c)
Cromosomas metafásicos después de aplicar FISH con sonda
telomérica (TTAGGG)n. d) Núcleo interfásico con sonda telomérica.
e) Cromosomas metafásicos hibridados con sonda (GATA)n. f)
Núcleo interfásico con sonda (GATA)n. flechas azules indican
regiones NOR en cromosomas homólogos. Flechas amarillas
muestran heteromorfismos de NOR entre cromátidas hermanas.
Flechas blancas indican señales intersticiales de ADNr.
59
15
Dendrograma que muestra el patrón de agrupamiento obtenido para la
morfología cromosómica de Haliotis rufescens, H. fulgens y H.
corrugata usando análisis UPGMA. La escala muestra el número de
cromosomas de morfología similar.
60
16
Secuencia de imágenes de desvanecimiento fluorescente en núcleos
de eritrocito en tilapia, Oreochromis mossambicus. La barra de color
indica la intensidad pixélica de 0 a 255.
64
17
Perfiles de desvanecimiento DAPI-fluorescente para distintos tipos
celulares. EZT, espermatozoides de tilapia. ERT, eritrocitos de tilapia.
EZR, espermatozoides de abulón rojo. ERTr, eritrocitos de trucha
arco iris.
66
18
Imagen digital DAPI-fluorescente descompuesta en los tres canales de
color (rojo, verde y azul) en eritrocitos de tilapia.
67
ix
LISTA DE FIGURAS (continuación)
Figura
Página
19
Descomposición de canales RGB en perfiles de desvanecimiento
fluorescente. EZT, espermatozoides de tilapia. EZR, espermatozoides
de abulón rojo. ERT, eritrocitos de tilapia. ERTr, eritrocitos de trucha
arco iris.
68
20
Relación de integral de desvanecimiento fluorescente (ID) con el
contenido genómico haploide y diploide en eritrocitos de tilapia
Mozambica.
69
21
Estimación de la media de la integral de desvanecimiento (ID) en
espermatozoides de tres especies de abulones. EZR; abulón rojo.
EZAZ; abulón azul. EZAM; abulón amarillo.
71
22
Estimación de la varianza de la integral de desvanecimiento (ID) en
espermatozoides de tres especies de abulones. EZR; abulón rojo.
EZAZ; abulón azul. EZAM; abulón amarillo.
72
23
Modelo lineal entre tamaño genómico e integral de desvanecimiento.
Espermatozoides: EZ, de tilapia; EZR, de abulón rojo; EZAZ, de
abulón azul; EZAM, de abulón amarillo. Hemocitos: HemAZ, de
abulón rojo; Heme, de abulón rojo; HemAM, de abulón amarillo.
Eritrocitos: ERT, de tilapia; ERTr, de trucha arco iris.
73
24
a) Imagen original de placa metafásica teñida con DAPI. b) Imagen
digital convertida en pseudocolor o en 256 niveles de brillo.
75
25
Procedimiento de análisis de ADN cromosómico fluorescente. a)
Mediciones cromosómicas. b) Imagen en pseudocolor. c) Máscara
binaria para detección de borde. d) Región de ADN cromosómico de
interés obtenido por multiplicación entre (b) y (c).
76
26
Secuencia de desvanecimiento fluorescente en cromosoma 16 de H.
rufescens.
77
27
Curva desvanecimiento fluorescente en cromosoma 16 de H.
rufescens.
77
28
Contenido medio de ADN en cromosomas de H. rufescens (n=18).
Las barras representan dos desviaciones estándar.
79
x
LISTA DE FIGURAS (continuación)
Figura
Página
29
Correlación entre contenido de ADN cromosómico y longitud
cromosómica en H. rufescens. Los números representan el par
cromosómico según el cariotipo. Líneas discontinuas representan el
error estándar del modelo.
80
30
Correlación entre contenido de ADN cromosómico y área
cromosómica en H. rufescens. Los números representan el par
cromosómico según el cariotipo. Líneas discontinuas representan el
error estándar del modelo.
81
31
Variación de valor-C en población Arica de A. purpuratus. El valor-C
fue calculado por aproximación de desvanecimiento fluorescente en
núcleos de hemocitos.
84
32
Variación de valor-C en población Tongoy de A. purpuratus. El
valor-C fue calculado por aproximación de desvanecimiento
fluorescente en núcleos de hemocitos.
85
xi
LISTA DE TABLAS
Tabla
Página
I
Algunas Superfamilias del Orden Archaeogastropoda y su número
cromosómico diploide. Simbología: * en Patterson, 1969; + en
Jarayabhand et al., 1998.
21
II
Longitud cromosómica total, longitud relativa e índice centromérico
para Haliotis rufescens (2n=36).
46
III
Longitud cromosómica total, longitud relativa e índice centromérico
para Haliotis fulgens (2n=36).
49
IV
Longitud cromosómica total, longitud relativa e índice centromérico
para Haliotis corrugata (2n=36).
52
V
Análisis estadísticos usando pruebas de ANOVA y Tukey. Un par
cromosómico fue considerado igual entre dos especies, sólo si ambos
brazos no muestran diferencia significativa (p<0.05). (BC) brazo corto,
(BL) brazo largo, (ND) no existe diferencia significativa, (S) si existe
diferencia significativa, (=) el par es igual en las tres especies, (R) el par
es propio de H. rufescens, (F) el par es propio de H. fulgens, (C) el par
es propio de H. corrugata.
61
VI
Matriz de similitud cromosómica entre H. rufescens, H. fulgens y H.
corrugata.
62
VII
Valor medio y desviación estándar de ID para las especies de valor-C
conocido.
70
VIII
Intervalos de confianza (95%) de α , β y ϕ en ajuste de modelo lineal
calculado mediante análisis de Fisher.
74
IX
Contenido de ADN en cromosomas de Haliotis rufescens y su
conversión a Mega pares de base (Mpb).
78
X
Medición de tamaños genómicos en dos poblaciones de A. purpuratus
mediante análisis de imágenes fluorescentes (n=15 individuos).
83
XI
Prueba ANOVA para tamaños genómicos de dos poblaciones de A.
purpuratus.
86
1
Los abulones han sido conocidos por el hombre desde hace largo tiempo. La primera
mención de estos gastrópodos marinos en la literatura fue realizada en la 4ta centuria A.C.
por Aristóteles en su cuarto libro, capitulo 4, sección 13, sobre el sistema digestivo:
“.......pero en la patella de campo como algunas personas suelen llamarle, u oreja de
mar (haliotis), como es llamada por otros, el excremento sale por debajo de la concha, la
cual es perforada. El estómago también es distinto, encontrándose detrás de la boca, y de
esta manera, es el ovarium en este animal. La posición de todas estas partes puede ser
observada en disecciones”
Publicaciones taxonómicas sobre la familia Haliotidae comienzan con Linnaeus (1758),
quien describe las primeras siete especies con su sistema de nomenclatura binominal. Este
trabajo fue continuado por Gmelin (1791), quien adhiere además otros veinte taxa. Reevé
2
(1846) describe 42 nuevos taxa y escribe en el mismo año la totalidad de la familia
Haliotidae (Geiger y Poppe, 2000).
Los abulones se distribuyen en aguas templadas y tropicales, estando ausentes en
regiones cercanas a los polos. Probablemente el tipo de sustrato (hábitat rocoso) y el
alimento (algas pardas), explicaría la ausencia de especies en la costa Noreste de América
donde predominan condiciones arenosas. Sin embargo, no se han encontrado especies de
abulones en la costa oeste de América del Sur, donde el hábitat predominante es similar al
encontrado en la costa oeste de Norte América. Dicho patrón en la distribución de especies
de abulones, limitada a ciertas regiones es una incógnita. Sin embargo, parte de la respuesta
de cómo los abulones han predominado la costa Noroeste de América desde Alaska hasta
Baja California, México, puede ser encontrada en la barrera de aguas cálidas, entre las dos
áreas templadas cercanas al lado del ecuador. No obstante, la ocurrencia de dos especies de
abulones en las islas Galápagos e isla Cocos, Costa Rica, invalidan este argumento en
cierto grado, dado que las corrientes oceánicas facilitarían la dispersión a estas islas en
particular (Geiger y Poppe, 2000).
El interés de estudiar las distintas especies que componen la familia Haliotidae se
encuentra no tan sólo en las características particulares de radiación evolutiva, sino también
en el fuerte interés comercial (Oakes y Ponte, 1996). En este sentido, actualmente la
producción mundial de abulón es encabezada por Australia y Japón con producciones de
alrededor de 5,000 toneladas métricas durante el año 2002. Sin embargo, sólo por concepto
de acuicultura la producción mundial de abulón fue liderada en el 2002 por países asiáticos
como China (4,500 ton) y Taiwán (3,000 ton). En México, durante el mismo período se
alcanzó una captura alrededor de 1,000 toneladas métricas, en comparación con las 4,500
3
toneladas producidas entre 1970-1980. Por concepto de acuicultura, actualmente México
produce 53 toneladas, las cuales son aportadas principalmente por abulón rojo y azul
(FISTECH, 2004).
Lo anterior hace evidente que durante las últimas tres décadas la actividad pesquera del
abulón en la costa de California y Baja California haya declinado. Lo cual puede ser
atribuido principalmente a un estado de sobreexplotación, la ocurrencia de eventos
climatológicos y potenciado a su vez por la aparición de enfermedades en poblaciones
naturales y de cultivo (Tegner et al., 1989; Leighton, 2000; Lafferty et al., 2004). En este
sentido, estudios que abordan aspectos como reproducción, fisiología, nutrición y genética
del abulón han sido llevados a cabo para suplir la demanda de este recurso a través de la
acuicultura (Hahn, 1989; González y Scoresby, 1996; Elliott, 2000; Del Río-Portilla y
González-Avilés, 2001; Durazo-Beltrán et al., 2004).
En referencia a la aplicación de estudios genéticos de abulones en acuicultura, éstos han
sido abordados desde distintas perspectivas. Algunas de ellas como mejora genética
(Powers et al., 1996), criopreservación de gametos provenientes de reproductores elegidos
con valor genético (Gwo, 2000), marcadores moleculares asociados a un fenotipo particular
(QTLs) que puedan ser utilizados para asistir programas de selección (Kirby et al., 1998; Li
et al., 2002; Evans et al., 2004), producción de híbridos interespecíficos (Owen et al., 1971;
Brown, 1995), producción monosexual (Fujino et al., 1990), producción de triploides (Arai
et al., 1986; Fujino et al., 1987; Kudo et al., 1991; Zhang et al., 1998; Maldonado et al.,
2001), manipulación genética (Powers et al., 1995; Tsai et al., 1997) y programas de
selección mediante la utilización de marcadores a nivel poblacional (Huang y Hanna, 1998;
Elliott et al., 2000; Hamm y Burton, 2000; Rothaus et al., 2003).
4
Dentro del ámbito de estudios genéticos aplicados a la acuicultura, han despertado gran
atención aquellos relacionados con las manipulaciones citogenéticas de organismos
marinos (Greg, 2001; Beaumont y Hoare, 2003). En abulones se han aplicado exitosamente
procedimientos de inducción a ginogénesis mediante la incorporación citoplasmática de
núcleos espermáticos inactivados por irradiación con luz ultravioleta (Fujino et al., 1990;
Li et al., 2000). En contraste, procedimientos de androgénesis en moluscos se han
reportados como poco exitosos (Wada, 2000), siendo hasta el momento su aplicación en
organismos marinos restringida sola a peces (Pandian y Kirankumar, 2003; Tariq et al.,
2004).
Probablemente una de las aplicaciones citogenéticas en acuicultura que ha sido
reportada más ampliamente es la referida a manipulaciones de ploidías o cromosómicas
(Beaumont y Fairbrother, 1991; Greg, 2001; Beaumont y Hoare, 2003). En este sentido,
organismos triploides y tetraploides han sido utilizados principalmente en el cultivo de
tilapias (Byamungu et al., 2001), ciprínidos (Basavaraju et al., 2002) y salmónidos
(Johnson et al., 2004). En referencia a moluscos, Stanley et al. (1981) fueron los primeros
en reportar la producción de triploides en la ostra Crassostrea virginica mediante la
incubación de los embriones en citocalasina-B. Desde entonces, han sido numerosas las
metodologías desarrolladas para obtener triploides, entre las cuales se encuentran choques
de temperatura, presión hidrostática, agentes químicos como la cafeína, citocalasina-B y 6Dimetilaminopurina (6-DMAP) (Beaumont y Fairbrother, 1991; von Brand-Skopnik y
Ibarra-Humphries, 2002). El interés en desarrollar biotecnologías de ploidía radica en que
los organismos inducidos presentan esterilidad parcial o total, lo cual resulta en la
canalización alterna de la energía que sería utilizada para reproducción hacia crecimiento
5
somático (Nell, 2002). En abulones, el uso de organismos triploides en granjas de cultivo
representa una alternativa que permitiría acortar los tiempos requeridos por los abulones
para llegar a una talla comercial (~5 años). Los principales estudios de inducción a
poliploidía fueron desarrollados principalmente en abulones japoneses (Arai et al., 1986;
Fujino et al., 1987; Kudo et al., 1991; Zhang et al., 1998) y australianos (Liu et al., 2004a;
Liu et al., 2004b; Liu et al., 2004c).
Paralelamente a estudios de manipulaciones cromosómicas, han sido llevados a cabo la
descripción cariológica de 15 especies de abulones (Gallardo-Escarate et al., 2004), siendo
actualmente descritas para la familia Haliotidae 65 especies (Lindberg, 1992; Geiger y
Poppe, 2000). Según Geiger y Groves (1999) la mayoría de los estudios cromosómicos en
abulones han sido realizados en las regiones Mediterránea, Indo-Pacífico y Pacífico Norte,
revelando que el número cromosómico en abulones varía entre los 2n=28~36. En referencia
a haliótidos nativos del Pacífico Noroeste o costa de California sólo han sido descritos
citogenéticamente H. cracherodii (Minkler, 1977) y H. rufescens (Gallardo-Escarate et al.,
2004). Sin embargo, actualmente es considerado que en las costas de California habitan
siete especies; H. k. kamtschatkana, H. kamtschatkana assimilis, H. corrugata, H.
cracherodii, H. fulgens, H. rufescens, H. sorenseni y H. walallensis con distribución desde
Alaska hasta la Baja California central en México (Cox, 1962). Adicionalmente, análisis
taxonómicos recientes ha unido a dos de estas como subespecies de H. kamtschatkana
(Leighton, 2000).
Actualmente, estudios citogenéticos en abulones se han limitado a la descripción
cariológica, siendo escasos los estudios de caracterización cromosómica. Sin embargo,
avances recientes en técnicas de biología molecular han permitido la caracterización y
6
localización de secuencias o regiones cromosómicas en otras especies de moluscos,
principalmente bivalvos. Adicionalmente, varios tipos de secuencias han resultado muy
útiles como sondas en estudios de caracterización de la cromatina mediante hibridación in
situ fluorescente (FISH). Una de ellas es la secuencia repetida (GATA)n que permite
detectar la presencia de este microsatélite, y por tanto la presencia de regiones A-T en el
genoma de los organismos. Esta secuencia se ha descrito en un amplio rango de eucariontes
y en algunos casos se ha observado una asociación con el sexo (Jones y Singh, 1985). Hasta
el momento, en moluscos sólo se ha estudiado en F. lignaria (Vitturi et al., 2000a), M.
neritoides (Colomba et al., 2002) y en el caracol Cerethium vulgatum (Vitturi et al., 2002).
Por otro lado, la secuencia telomérica que se encuentra en los cromosomas de todos los
vertebrados (TTAGGG)n, también se ha analizado en otros organismos mediante FISH. En
invertebrados su distribución es más heterogénea. Así, se encuentra en los cromosomas de
algunas especies como el gastrópodo M. neritoides (Colomba et al., 2002) pero ausente en
otras como Oxynoe olivacea (Vitturi et al., 2000b). Su estudio resulta por tanto de gran
interés dentro del análisis filogenético, ya que se pueden considerar como específicas de
grupos (Blackburn, 2001).
Conjuntamente con la aplicación de técnicas moleculares en citogenética, en los últimos
años ha recibido gran interés la integración de procedimientos de análisis de imágenes
(Netten, 1997). Esto ha permitido obtener mayor información en imágenes fluorescentes
adquiridas tanto desde microscopía confocal, como de microscopía convencional de
epifluorescencia (Schwarzacher y Heslop-Harrison, 2000). En referencia a análisis de
imágenes cromosómicas, actualmente están disponible numerosos programas de cómputo,
sin embargo, muchos de ellos están diseñados específicamente para preparaciones
7
humanas, otros vertebrados y plantas. Dichos programas se han desarrollado con diversas
aplicaciones citogenéticas desde búsqueda de placas metafásicas sobre una preparación,
generación automática de cariotipos, medición cuantitativa de señal de fluorescencia y
posición, patrones de condensación cromosómica, alineamiento cromosómico, entre otras.
(Schrock et al., 1996; Kato y Fukui, 1998; Houtsmuller et al., 2000; Gray et al., 2002;
Weierich et al., 2003; Langer et al., 2004).
En referencia a aplicaciones de análisis de imágenes en invertebrados marinos, han sido
escasos los estudios llevados a cabo en comparación con los existentes para vertebrados y
plantas. Probablemente la principal limitación de aplicación de procedimientos de análisis
de imágenes en citogenética de invertebrados y específicamente de moluscos, sea que las
preparaciones cromosómicas provienen desde larvas y no desde cultivos celulares como en
el caso de vertebrados y plantas. Esto conlleva a que las variaciones cromosómicas
morfológicas debidas al grado de condensación del ADN pueden originar errores en la
identificación adecuada del cariotipo de una especie o individuo. En este sentido, en la ostra
del Pacífico Crassostrea virginica se ha descrito que la variación individual de longitudes
cromosómicas debida a factores de condensación es de alrededor de 5% (Zhang et al.,
1999a).
El presente trabajo doctoral plantea un estudio citogenético de tres especies de abulones
presentes en Baja California. Asimismo, se propone el desarrollo y utilización de análisis
de imágenes como procedimientos alternativos a la cariología clásica en moluscos. Lo
anterior permitirá reducir el error ocasionado por las mediciones manuales, al permitir
realizar aproximaciones más cuantitativas y detalladas de la naturaleza de los cromosomas.
8
Generales
1. Aportar nueva información citogenética de tres especies de abulones de Baja California.
2. Desarrollar procedimientos de análisis de imágenes que permitan caracterizar
citogenéticamente a Haliotis rufescens, H. fulgens y H. corrugata.
Específicos
1. Establecer protocolos citogenéticos para la obtención de cariotipos de H. rufescens, H.
fulgens y H. corrugata a partir de larvas.
2. Aplicar procedimientos de FISH para la localización cromosómica de genes.
3. Establecer relaciones citogenéticas en las tres especies de abulones estudiadas.
4. Desarrollar y aplicar un nuevo método para estimar tamaño genómico mediante análisis
de imágenes fluorescentes.
5. Validar la utilización de análisis de imágenes en el estudio citogenético.
9
III. 1. La Importancia de las abulones en la acuicultura
Los abulones son gastrópodos marinos herbívoros que integran un solo género (Haliotis),
siendo uno de los gastrópodos más primitivos evolutivamente. Su hábitat natural son
sustratos rocosos (Hahn, 1989). Existen aproximadamente entre 65 y 55 especies de abulón
en todo el mundo, los cuales se distribuyen en ambos hemisferios (Lindberg, 1992; Geiger
y Poppe, 2000). Las especies de abulón más grandes se localizan en aguas templadas y las
más pequeñas en aguas tropicales. La mayoría de las especies de abulón se encuentran
distribuidas en el Pacífico sur, el Pacífico central y en parte del Océano Indico. El abulón
en su ambiente natural se encuentra en las costas de la mayoría de las aguas templadas y
tropicales con excepción de Sudamérica y la costa Noroeste de Norteamérica (Geiger y
Poppe, 2000).
10
El abulón tiene una gran demanda como alimento en el mercado mundial
(principalmente el asiático), se consume en diferentes presentaciones, y cada una de estas
varía en precio que puede fluctuar desde los 32 dólares americanos por kilogramo de
producto entero congelado, hasta los 1,200 dólares americanos por kilogramo de producto
seco. Al tomarse en cuenta los costos que implica el proceso, manejo y mercadeo para los
productos procesados, así como los altos precios que se pagan por las diferentes
presentaciones del abulón, la ganancia neta tiende a reflejar un precio promedio por
organismo similar al obtenido por el producto entero congelado (Gordon y Cook, 2001).
La pesquería comercial del abulón en las costas de Norteamérica empezó hace 150 años
y los primeros cultivos comenzaron en la década de los 60s (McBride, 1998). En México,
el cultivo de abulón es una actividad que se ha intensificado como resultado de la
disminución de las capturas de las diferentes especies que habitan la zona Noroeste del país
(Tegner et al., 1989; Gordon y Cook, 2001). Las especies que se capturan en esta zona son
principalmente el abulón azul (Haliotis fulgens), el abulón rojo (H. rufescens), el abulón
amarillo (H. corrugata) y el abulón negro (H. chracherodi) (Celis-Ceseña, 1996). El abulón
en diversos países del mundo se ha cultivado exitosamente desde la etapa de larva hasta
lograr organismos adultos en condiciones controladas (Hahn, 1989). Sin embargo, existen
etapas críticas en el cultivo de abulón, como lo es la inducción al asentamiento de las
larvas, la metamorfosis y la nutrición de postlarvas (Kawamura et al., 1998). Actualmente
la producción mundial por concepto de acuicultura de abulón es liderada por países
asiáticos como China y Taiwán con producciones para el año 2002 de 4,500 y 3,000
toneladas métricas respectivamente. La pesquería comercial durante el año 2002 fue
encabezada por Australia y Japón con producciones de alrededor de 5,000 toneladas
11
métricas. En México, durante el mismo período se alcanzó una producción de alrededor de
1,000 toneladas métricas, en comparación con las 4,500 toneladas producidas entre 19701980 (FISTECH, 2004). Por concepto de acuicultura, en México sólo son cultivados el
abulón rojo y el abulón azul en granjas de producción comercial (McBride, 1998), siendo la
producción para el año 2002 de 53 toneladas (FISTECH, 2004).
III. 2. Introducción a la genética de abulones
Estudios genéticos llevados a cabo en la familia Haliotidae pueden ser sintetizados
mediante el análisis de dos aproximaciones. La primera en referencia a la distribución
biogeográfica y evolutiva de los representantes actuales de haliótidos y la segunda en
referencia a estudios de genética poblacional conducentes a la mantención de la
variabilidad genética en poblaciones naturales y de cultivo. Estudios genéticos conducentes
a determinar las relaciones evolutivas y biogeográficas de abulones, radican principalmente
en que la taxonomía y sistemática de la familia permanece hoy en día inconclusa. En este
sentido, el número de especies varía ampliamente de un autor a otro, por ejemplo Cox
(1962) describe 130 especies mientras que Lindberg (1992) y Geiger y Poppe (2000)
reportan 65 y 55 especies de abulones respectivamente. Probablemente, la confusión en el
número de especies sea debida a que dichos estudios fueron basados principalmente en
caracteres fenotípicos como morfología de la concha, la cual puede variar
considerablemente dentro de una especie (Talmadge, 1963). Adicionalmente, pocos
estudios cladísticos en abulones han sido desarrollados integrando evidencias como
caracteres morfológicos, ecología y datos moleculares. Estudios sobre isoezimas usando
12
electroforesis de proteínas han proporcionado las primeras evidencias sobre las relaciones
filogenéticas en varias especies de abulones (Brown y Murray, 1992; Brown, 1993). Sin
embargo, ellos no han permitido comparar especies relacionadas distantemente y en
ocasiones los árboles filogenéticos inferidos desde polimorfismos isoenzimáticos no
concuerdan con los árboles basados en análisis de ADN nuclear o mitocondrial (Karl y
Avise, 1992). Las primeras evidencias de relaciones filogenéticas entre especies de
abulones de California fueron obtenidas mediante comparación de pigmentos sanguíneos
(hemocianinas) por Meyer (1967). El grado de interacción entre antígeno y anticuerpo
mostró que H. rufescens, H. sorenseni, H. kamtschatkana assimilis estarían cercanamente
relacionada, mientras que H. corrugata, H. fulgens, H. walallensis aparecen
moderadamente más distante. Adicionalmente, el análisis sugirió que H. cracherodii sería
una especie con una mayor diferenciación genética (Fig. 1).
Figura 1. Relaciones filogenéticas entre especies de abulones de California sugerida
mediante comparación inmunocitoquímica de hemocianinas (Meyer, 1967). Diagrama
obtenido de Leighton (2000).
13
Resultados obtenidos a través de herramientas moleculares de ADN, han demostrado
ser en general congruentes con las relaciones inmunocitoquímicas encontradas por Meyer
(1967). Sin embargo, H. cracherodii ha sido reportado más relacionado a H. corrugata y
ambos a su vez con los abulones japoneses H. gigantea y H. discus hannai. Adicionalmente
este estudio dejó a una distancia genética mayor a H. fulgens en comparación con las otras
especies de abulones Californianos (Fig. 2).
Figura 2. Relaciones filogenéticas de abulones californianos y japoneses inferida a partir
de secuencias de ADN del gen lisina en espermatozoides. Diagrama tomado de Lee y
Vacquier (1995).
Estudios en poblaciones naturales de abulones han descrito la presencia de híbridos
interespecíficos en seis especies de abulones en la costa de California (Owen et al., 1971).
Adicionalmente, Leighton y Lewis (1982) llevaron a cabo una serie de cruzas
14
experimentales con cuatro especies de abulones. Cruzas entre H. rufescens, H. corrugata,
H. fulgens y H. sorenseni, demostraron que es posible obtener entre un 30-60% de
desarrollo embrionario en fertilizaciones efectuadas dentro de los primeros 30 minutos
posdesove. Asimismo, entre hembras de H. rufescens y machos de H. fulgens son capaces
de producir F1 y F2 fértiles. La evidencia observada en torno a la producción de híbridos
interespecíficos demuestra que las especies de abulones en California poseen una alta
afinidad filogenética. La concepción genético-poblacional de especie se entiende como un
sistema biológico discreto e integrado de organismos reproductivamente aislados de otros
sistemas de características similares (Reig, 1983). Desde un punto de vista genético, los
reordenamientos cromosómicos, entre otros factores, constituyen importantes mecanismos
involucrados en el aislamiento reproductivo poscigótico (Fontdevila, 1987). En este sentido
debido a la escasa información cariológica disponible, actualmente no existen estudios
filogenéticos en abulones que integren este tipo de análisis y que permitan a su vez generar
estudios comparativos.
En referencia a estudios de genética poblacional conducentes al mantenimiento de la
variabilidad genética de cultivo, éstos han sido exitosamente aplicados en programas de
selección (Beaumont y Hoare, 2003). Sin embargo, la aplicación de esta tecnología para
mejoramiento genético en acuicultura ha demostrado ser demasiado lenta, por lo cual son
pocos los estudios en abulones en esta área (Jonasson et al., 1997). Sin embargo, algunos
estudios han sugerido que el crecimiento en abulones de cultivo está condicionado entre
otros agentes por factores genéticos, con lo cual programas de selección se presentan como
una alternativa para mejorar este carácter (Hara, 1990). Para entender la relación entre la
variación genética y un carácter de valor económico, es necesario establecer y evaluar
15
numerosas líneas familiares, por lo cual para acceder a esta información es necesario la
mantención de un gran número de organismos, lo cual dificulta aún más la aplicabilidad del
procedimiento de selección, ya sea en familia o en masa (Elliott, 2000). Alternativamente,
los programas de selección pueden ser sustentados mediante el uso de marcadores
moleculares que permitan asistir la selección de organismos reproductores. En este
contexto, investigaciones conducentes a establecer regiones microsatélites en abulones
(Kirby et al., 1998; Li et al., 2002) se presentan como una alternativa dentro de la mejora
genética en abulones de cultivo.
III.3. El valor de estudios citogenéticos
A través del análisis citogenético, es posible describir el número cromosómico de una
célula u organismo. El establecimiento de la identidad cromosómica es el primer paso para
los estudios de mapeo genómico. También pueden ser utilizados en análisis taxonómicos,
dado que cada especie posee un cariotipo distintivo, en términos de número y morfología
cromosómica. Asimismo, mediante el análisis citogenético es posible reconocer y
caracterizar los progenitores de un híbrido, además identificar un organismo poliploide
(Gersen y Keagle, 1999).
El estudio del número cromosómico, estructura, función y comportamiento con relación
a la herencia genética, es una parte integral en la citogenética. Los cromosomas son
reconocidos como portadores de ADN en eucariontes, dado que proveen la base estructural
para la transmisión de la información genética. Las características morfológicas de los
cromosomas han sido estudiadas con microscopía de alta resolución aunado a tinciones
16
específicas de ADN. De esta forma, características morfológicas comunes como
constricción primaria (centrómero) en diferentes posiciones a lo largo del cromosoma ha
permitido la identificación y clasificación cromosómica (Levan et al., 1964). Sin embargo,
dado que las características centrales de estructura y función de los cromosomas están
definidas a nivel del ADN, el análisis citogenético ha integrado información sobre la
estructura molecular, con lo cual se ha descubierto la forma en que los genes están
organizados dentro de los cromosomas, definiendo así su funcionalidad (Appels et al.,
1998; Allen et al., 1999).
El estudio de los cromosomas ha tenido un mayor impacto en estudios de mapeo
genómico en distintas especies tanto animales como vegetales. La identificación de
regiones específicas de ADN mediante técnicas moleculares permite observar
microscópicamente la localización de estas regiones en los cromosomas (Schwarzacher y
Heslop-Harrison, 2000). Adicionalmente, el entendimiento de la estructura cromosómica
provee una medida de análisis de los cambios secundarios que pueden ocurrir durante
procedimientos de ingeniería genética y manipulación cromosómica (Appels et al., 1998).
1. 3. 1. Citogenética molecular
El hallazgo de técnicas para identificar genomas y cromosomas en preparaciones
cromosómicas ha representado un gran progreso en la citogenética vegetal y animal, ya que
disponer de marcadores cromosómicos permite estudiar la organización del genoma y la
arquitectura nuclear. Las técnicas de bandeos permiten revelar zonas de ADN altamente
repetido (heterocromatina constitutiva), pero no diferencian la composición molecular del
ADN. En ausencia de bandas marcadoras no es posible identificar cromosomas con
17
morfología similar. Además en especies alógamas suele existir polimorfismo para número
y posición de zonas heterocromáticas, lo que dificulta la caracterización cromosómica y la
detección de regiones con presencia de introgresión. Un notable ejemplo de polimorfismo
en bandas heterocromáticas lo constituye el estudio de líneas y razas nativas de maíz
(Poggio et al., 2000). Los marcadores moleculares combinados con la citogenética han
resultado ser de gran utilidad para entender la organización cromosómica y la distribución
física de las secuencias repetidas (Gersen y Keagle, 1999). El gran potencial de las técnicas
de hibridación in situ resulta de combinar información acerca de la morfología nuclear o
cromosómica con la información molecular de la estructura de las secuencias. Aunque estas
técnicas se conocen desde los 60s utilizando marcación radioactiva, en organismos marinos
se comenzó a aplicar a fines de la década de los 80s debido a la gran disponibilidad de
secuencias clonadas para ser utilizadas como sondas. Además, la posibilidad de utilizar
ADN genómico total como sonda (GISH) y modernos sistemas de marcación y detección
no radioactivos han impulsado el uso de esta técnica en forma rutinaria, complementando
los resultados obtenidos por metodologías más clásicas. Mediante la aplicación de estas
técnicas se obtienen datos que podrán ser utilizados en estudios de sistemática, filogenia,
biodiversidad, evolución, mejoramiento y biotecnología (Sessions, 1996).
La hibridación in situ (ISH) de sondas de ácidos nucleicos en preparaciones
cromosómicas involucra cuatro pasos fundamentales que son: 1) obtener una sonda
marcando secuencias de ADN, 2) reacción de hibridación entre la sonda y el ADN blanco
(cromosomas), ambos desnaturalizados previamente. Las secuencias complementarias de la
sonda y del ADN de los cromosomas hibridarán, en relación a su homología, 3) remoción
de la sonda que no se unió o que se hibridó en forma inespecífica, 4) Detección de la
18
hibridación y visualización de la hibridación a través de fluorocromos (Wilkinson, 1998;
Schwarzacher y Heslop-Harrison, 2000).
Una de las aplicaciones de la técnica de “fluorescent in situ hybridization” (FISH) es la
obtención de un mapa físico, funcional y estructural del genoma utilizando secuencias de
distinto origen como sondas. El análisis de la organización física de secuencias repetidas,
genes, secuencias clonadas, rDNA, transgenes, retrovirus, etc., permite identificar
cromosomas, analizar la arquitectura nuclear del genoma y verificar hipótesis acerca de la
relación entre posición y función de determinadas secuencias. Otras aplicaciones de esta
técnica consisten en determinar la distribución y posición de material cromosómico
extraespecífico, la existencia de apareamiento y recombinación intergenómica, la existencia
de segregación preferencial (responsables de herencia no mendeliana de algunos tipos
cromosómicos), la presencia y tipo de rearreglos cromosómicos y analizar la segregación
de determinados cromosomas en estudios evolutivos y programas de mejoramiento
genético. Estos son relevantes para comprender la relación entre estos fenómenos y
variaciones en la expresión génica (Wilkinson, 1998).
La hibridación in situ utilizando ADN genómico total como sonda (GISH o Genomic
ISH) revela homologías específicas del ADN, principalmente en lo que respecta a
secuencias repetidas y ha permitido realizar aportes relevantes en estudios evolutivos,
sistemáticos y en mejoramiento tanto animal como vegetal. Esta técnica ha facilitado, por
ejemplo, el reconocimiento de especies parentales en híbridos y poliploides, analizar
afinidades
genómicas
interespecíficas,
detectar
reestructuraciones
cromosómicas,
corroborar que en el núcleo existen dominios espaciales de genomas o secuencias
particulares, detectar la existencia de apareamiento intergenómico y recombinación
19
(Marasek et al., 2004). Además, permite analizar la organización nuclear y desarrollo
cromosómico en especies e híbridos; detectar la presencia de cromosomas o segmentos
cromosómicos introgresantes en planes de mejoramiento; analizar afinidades genómicas
interespecíficas en cuanto a variación en secuencias de ADN repetitivo (Pita et al., 2003).
1. 3. 2. Citogenética de organismos acuáticos
Probablemente la mayor parte de los estudios citogenéticos en organismos acuáticos están
basados principalmente en peces y en moluscos. En referencia a peces, diversos estudios
citogenéticos han sido llevados a cabo principalmente en salmónidos, ciprínidos y cíclidos
(Mandrioli et al., 2000; Inafuku et al., 2002; Porto-Foresti et al., 2002; Martins et al.,
2004). Dentro de estos estudios, un especial interés ha despertado el estudio de la
distribución genómica de regiones de ADN altamente repetitivas, ADN satélite, regiones
teloméricas, ADNr 45S y 5S, y elementos nucleótidos intercalados (SINEs y LINEs)
(Martins et al., 2004). Recientemente, estudios citogenéticos relacionados con los
mecanismos de determinación sexual en peces han generado un especial interés debido a la
posibilidad de producir líneas monosexuales en el cultivo de algunas especies (Devlin y
Nagahama, 2002). Sin embargo, en peces es posible encontrar un amplio espectro de
mecanismos genéticos de determinación sexual, con lo cual los estudios de mapeo
cromosómico permanecen aún inconclusos (Nanda et al., 2003).
1. 3. 3. Citogenética de moluscos
Antes de la década de los 70s, estudios de citogenética en moluscos fueron realizados
principalmente con base en el número cromosómico de las especies (Patterson, 1969).
20
Posteriormente, técnicas basadas en tinciones cromosómicas, medidas de longitud relativa,
proporción de brazos e índices centroméricos han proporcionado información sobre la
morfología de los cromosomas, permitiendo la comparación entre cariotipos a nivel inter e
intraespecífico (Nakamura, 1986; Thiriot-Quiévreux, 1990; Insua y Thiriot-Quiévreux,
1991; Thiriot-Quiévreux, 1994; Ladrón de Guevara et al., 1996; Jarayabhand et al., 1998;
Park et al., 2000).
Entre los moluscos, los ostrélidos han sido los más extensamente estudiados en cuanto a
aspectos genéticos, esto último, debido probablemente a su importancia comercial. De las
veintidós especies de la familia Ostrelidae que han sido estudiadas citogenéticamente todas
poseen un número diploide de 2n=20, excepto por una especie, Dendrostrea folium, la cual
posee un complemento cromosómico de 2n=18 (Ieyama y Inaba, 1974). Esta estabilidad en
el número de los cromosomas no refleja necesariamente una igualdad morfológica, ya que
existen variaciones tanto en forma como en tamaño y, por lo tanto, en el contenido de
ADN. Estos polimorfismos pueden ser explicados por procesos de naturaleza
Robertsoniana, los cuales pueden incluir fisión cromosómica (paracéntrica o pericéntrica) o
fusión de brazos cromosómicos. El proceso de fisión ocasionaría un aumento en el número
cromosómico, mientras que la fusión de brazos o segmentos cromosómicos probablemente
ocasionaría una disminución en el número de cromosomas de la especie. En ambos casos la
morfología de los cromosomas cambia por aumento o disminución de segmentos (Gersen y
Keagle, 1999). Estudios de polimorfismos cromosómicos en moluscos han sido llevados a
cabo en el gastrópodo Nucella lapillus usando técnicas de tinción de plata y FISH para la
región organizadora de nucleolos (Pascoe y Dixon, 1994; Pascoe et al., 1996; Pascoe et al.,
2004).
21
Tabla I. Algunas Superfamilias del Orden Archaeogastropoda y su número cromosómico
diploide. Simbología: * en Patterson, 1969; + en Jarayabhand et al., 1998.
ESPECIE
Superfamilia Pleurotomariacea
Familia Haliotidae
Haliotis tuberculata
Haliotis lamellosa
Haliotis diversicolor
Haliotis exigua
Haliotis planata
Haliotis varia
Haliotis asinina
Haliotis ovina
Haliotis japonica
Haliotis aquatilis
Haliotis cracherodii
Haliotis discus discus
Haliotis discus hannai
Haliotis madaka
Haliotis rufescens
Haliotis fulgens
Haliotis corrugata
Superfamilia Fissurellacea
Familia Fissurellidae
Clypina picta
Macrochisma sinensis
Macrochisma dilatata
Fissurella latimarginata
Fissurella costata
Fissurella maxima
Superfamilia Patellacea
Familia Acmaeidae
Patelloida saccharina l.
Patelloida pygmaea
Patelloida lampaniccla
Notacmea schrenckii
Notacmea conccina
Notacmea fuscoviridis
Familia Patellidae
Cellana toreuma
Cellana eucosmia
Cellana nigroilneata
Patella vulgata
Superfamilia Trochacea
Familia Trochidae
Cantharidus callichroa
Gibbula richardi
Thalotia japonica
Monodonta labio
Monodonta neritoides
Tegula lischke
Tegula nigerrima
Tegula pleifferi c.
Tegula toreuma
Stomatella lyrata
Familia Turbinidae
Turbo cornutus
Lunella coronata c.
Astralium haematragum
Superfamilia Neritacea
Familia Neritidae
Puperita japonica
Clithon retropictus
Septaria sp.
Dostia violacea
Familia Helicinidae
Paleohelicina sp.
Pluropoma sp.
Pluropoma sp.
2N
REFERENCIA
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32
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34
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36
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36
36
36
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Colombera & Tagliaferri, 1983 +
Colombera & Tagliaferri, 1983 +
Nakamura, 1985 +
Aria et al., 1988 +
Aria et al., 1988 +
Nakamura, 1986 +
Jarayabhand et al., 1998
Jarayabhand et al., 1998
Nishikawa, 1962 *
Nishikawa, 1962 +
Minkler, 1977 +
Aria et al., 1982 +
Aria et al., 1982 +
Nakamura, 1986 +
Gallardo-Escarate et al., 2004
Presente estudio
Presente estudio
34
32
32
32
32
32
Nishikawa, 1962 *
Nishikawa, 1962 *
Nishikawa, 1962 *
Amar, 2003
Amar, 2003
Amar, 2003
18
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18
18
18
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Nishikawa, 1962 *
Nishikawa, 1962 *
Nishikawa, 1962 *
Nishikawa, 1962 *
Nishikawa, 1962 *
Nishikawa, 1962 *
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Nishikawa, 1962 *
Nishikawa, 1962 *
Nishikawa, 1962 *
Vitturi et al., 1982
36
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36
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42
Nishikawa, 1962 *
Vitturi et al., 1982
Nishikawa, 1962 *
Nishikawa, 1962 *
Nishikawa, 1962 *
Nishikawa, 1962 *
Nishikawa, 1962 *
Nishikawa, 1962 *
Nishikawa, 1962 *
Nishikawa, 1962 *
36
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Nishikawa, 1962 *
Nishikawa, 1962 *
Nishikawa, 1962 *
22
24
24
28
Nishikawa, 1962 *
Patterson, 1967a *
Natarajan (pers. com.) *
Patterson, 1967a *
36
36
36
Burch, 1967a *
Burch, 1967a *
Burch, 1967a *
22
En el Orden Archaeogastropoda al cual pertenece a la familia Haliotidae existen datos
cariotípicos para 5 Superfamilias, 8 Familias y 53 especies (Tabla I). El número diploide
más pequeño y conservado corresponde a especies de Patellacea, todas con 2n=18. En las
otras Superfamilias, el número diploide varía entre 22 y 42 (Patterson, 1969; Vitturi et al.,
1982; Jarayabhand et al., 1998; Amar, 2003; Gallardo-Escarate et al., 2004). Para el caso
de los abulones, la mayoría de los estudios cromosómicos han sido realizados en las
regiones del Indo-Pacífico (Geiger y Groves, 1999). Sin embargo, el registro cariológico
proveniente de quince especies de abulones, revela que la familia Haliotidae posee un
número cromosómico que varia entre los 2n=28~36.
1. 3. 4. Implicaciones de tamaño genómico
Dentro del análisis citogenético, recientemente han recibido una gran atención las
relaciones evolutivas implicadas en el contenido de ADN nuclear en plantas y animales.
Las primeras mediciones detalladas del contenido de ADN nuclear fueron realizadas en la
década de los 40s, varios años antes de que Watson y Crick propusieran la estructura
molecular del ADN. En los años siguientes Hewson Swift desarrolló el concepto de “valorC” en referencia a la fase haploide de ADN en plantas. Posteriormente Mirsky y Ris
(1951), llevaron a cabo el primer estudio sistemático de tamaño genómico en animales,
incluyendo representantes de todas las cinco superclases de vertebrados así como también
de algunos invertebrados. A partir de estos resultados preliminares se hizo evidente que el
contenido de ADN varía enormemente entre las especies y que esta variación no guarda
relación con la noción intuitiva de la complejidad del organismo. Posteriormente, esta
observación fue reafirmada en los años siguientes a medida que aumentaron los estudios
23
sobre tamaño genómico, denominando así a esta característica de los organismos como la
“Paradoja del valor-C” (Thomas, 1971). Pocos años después junto con el descubrimiento
del ADN no-codificante la paradoja fue resuelta, sin embargo, numerosos cuestionamientos
permanecen hasta hoy en día inconclusos, llevando a denominar este tipo de estudios como
el “enigma del valor-C” (Gregory, 2001b). En este sentido, gran interés ha despertado los
mecanismos por los cuales el ADN no-codificante se distribuye o se pierde a través del
genoma. Asimismo, los procesos por los cuales existe una mantención diferencial o
supresión entre las especies, además de las implicanciones citológicas y fisiológicas del
tamaño genómico (Vinogradov, 1995).
El tamaño genómico en eucariontes varía más de 200,000 veces incluyendo a los
protistas. En animales, el rango es aproximadamente de 2,500 veces mientras que en los
vertebrados son alrededor de 350 veces (Gregory, 2001a). Actualmente, han sido descritos
los tamaños genómicos de aproximadamente 3000 animales (Gregory, 2001a) y cerca de
4000 plantas (Bennett y Leitch, 2001), así como una variedad de hongos, protistas y
bacterias.
El conocimiento del tamaño genómico de una especie no sólo es relevante en términos
generales de cuestionamientos biológicos, sino también puede ser útil en la clasificación de
organismos conjuntamente con la información cariológica de una especie. Probablemente
hoy en día en el clima de la biología molecular, el aspecto más importante del tamaño
genómico sea que éste es un factor importante para el desarrollo de futuros proyectos
genómicos de secuenciación, así como para estudios de estructura genómica y evolución
(Gregory, 2002).
24
La relevancia de la información obtenida a través del estudio de tamaño genómico ha
ocasionado una intensificación en el desarrollo de metodologías capaces de estimar de
manera más precisa la cantidad de ADN nuclear, con lo cual, diversos métodos se han
utilizado para cuantificar ADN nuclear (Hardie et al., 2002). Algunas de las primeras
metodologías de estimación de tamaño genómico estuvieron basadas en técnicas de
extracción de ADN genómico. Sin embargo, esta técnica fue reportada como imprecisa
debido a que era necesario conocer la concertación celular desde la cual se había realizado
el proceso de extracción del ADN (Hardie et al., 2002). Posteriormente, estas técnicas de
extracción fueron reemplazadas por metodologías densitométricas, las cuales están basadas
en la cuantificación de la coloración de muestras sometidas a reacción de Feulgen.
Brevemente, las técnicas densitométricas parten de la premisa que la intensidad de
coloración es directamente proporcional con la cantidad de ADN presente. La cantidad de
tinción, es determinada mediante la cantidad de luz que es absorbida (densidad), sin
embargo, la cuantificación de densidad no es posible realizarse directamente, con lo cual
debe ser estimada indirectamente a través de la transmitancia. La transmitancia de una
muestra debe ser calculada mediante la diferencia entre la luz incidente que pasa a través de
un objeto (por ejemplo un núcleo) y la luz total transmitida (Hardie et al., 2002). A pesar
que los métodos densitométricos son actualmente muy utilizados para estimar tamaño
genómico(Gregory, 2003), debido a que han integrado algunos procedimientos de análisis
de imágenes, la principal desventaja es que la luz al pasar por una muestra será afectada por
los fenómenos propios de la luz como difracción, reflexión y refracción, con lo cual la
medición precisa de la luz transmitida total podría afectar la cuantificación de la
absorbancia o densidad. Como una alternativa a las tinciones densitométricas, es posible
25
cuantificar la intensidad de fluorescencia mediante el uso de tinciones específicas para
ADN. En este sentido, la fluorometría se ha desarrollado tanto para mediciones estáticas o
cuantificación directa en un solo plano o en mediciones dinámicas como en el caso de la
citometría de flujo. En el caso de mediciones estáticas, se han desarrollados microscopios
especiales capaces medir directamente la fluorescencia desde un frotis celular, con lo cual
ha sido posible determinar niveles de ploidía tanto en espermatozoides como en organismos
poliploides (Uchimura et al., 1989; Ishibashi et al., 2003). En referencia a la citometría de
flujo, probablemente es la técnica con mayor aceptación y difusión en cuanto a medición de
tamaño genómico (Dolezel et al., 2004). Desde su desarrollo a finales de los 70s para
detectar contenidos anómalos de ADN en células cancerígenas, la citometría de flujo se ha
vuelto esencial en la investigación del tamaño genómico de animales y plantas (Tiersch et
al., 1989; Rodriguez-Juiz et al., 1996). Brevemente, este método consiste en tratar una
muestra de células en suspensión con fluorocromos ADN-específicos. La medición de la
fluorescencia se realiza mediante la incidencia de un haz de luz láser sobre un flujo de
células teñidas con el fluorocromo (Martínez et al., 1990). Esta técnica ha sido descrita
como rápida y precisa (Haynes, 1988). Sin embargo, presenta algunas limitaciones como la
necesidad de células en suspensión, un gran número de células por análisis y evidentemente
un mayor costo de equipamiento.
1. 3. 5. Análisis de imágenes como una herramienta en citogenética
El mayor desarrollo de tecnologías de análisis de imágenes ha estado asociado sin duda a
estudios de citogenética humana (Schrock et al., 1996; Trask, 2002). Asimismo, las
aplicaciones citogenéticas moleculares han aumentado considerablemente mediante el uso
26
de nuevas tecnologías de análisis de imágenes. Modernos dispositivos de captura de
imágenes han permitido la visualización de señales de fluorescencia indetectables para el
ojo humano. De esta forma, es posible obtener información cuantitativa y, conjuntamente
con análisis matemáticos, procesar una mayor cantidad de información (Young, 1996). Sin
embargo, la mayoría de los estudios citogenéticos en invertebrados disponibles hasta ahora,
establecen las diferencias cromosómicas entre especies a partir del análisis cariológico
clásico. Los cromosomas son clasificados cualitativamente en categorías (metacéntrico,
submetacéntrico, subtelocéntrico y telocéntrico) con base en la relación de la longitud entre
el brazo largo y brazo corto de cada par cromosómico (Levan et al., 1964). Este método
separa la variación continua de la posición del centrómero en clases discretas y no
considera el tamaño absoluto de cada cromosoma. Este procedimiento considera diferentes
a pares cromosómicos similares que caen en distintas clases cualitativas o considera iguales
a pares que, siendo distintos caen dentro de la misma categoría. Sin embargo, variaciones
morfológicas debidas al grado de condensación del ADN en los cromosomas pueden
originar errores en la identificación adecuada del cariotipo de una especie o individuo
(Appels et al., 1998). Lo anterior ha hecho necesario la búsqueda de modificaciones a la
metodología clásica propuesta por Levan et al. (1964) y de nuevos procedimiento de
identificación y clasificación cromosómica. En este sentido los métodos de biología
molecular aplicados en citogenética, conjuntamente con la aplicación de procedimientos de
análisis de imágenes, han aportado con nueva información en torno al grado de
diferenciación genómica de los cromosomas (Netten, 1997). Adicionalmente, la integración
de análisis estadísticos en las mediciones morfométricas de los cromosomas ha permitido
verificar diferencias significativas en el tamaño medio de brazos cromosómicos en algunas
27
especies de fissurélidos, pectínidos y ostrélidos (Ladrón de Guevara et al., 1996; Gajardo et
al., 2002; Amar, 2003). Otro tipo de aproximación es la utilización de herramientas
computacionales, en este sentido la utilización de análisis de imágenes permite reducir el
error ocasionado por las mediciones manuales, generando resultados más cuantitativos y
detallados de la naturaleza morfológica de los cromosomas (Schrock et al., 1996). En la
ostra Crassostrea virginica, se ha descrito a través de mediciones digitales que la variación
individual cromosómica en larvas es del 5%, lo cual estaría relacionado directamente con
las variaciones morfológicas debidas tanto a factores biológicos como a diferentes grados
de condensación del ADN durante el ciclo celular (Zhang et al., 1999a).
Recientemente en los últimos años han adquirido mayor atención a las técnicas de
identificación mediante la utilización del teorema de convolución. En un principio esta
aplicación fue centrada en la industria militar. Sin embargo, a partir de los años 70s se ha
incluido en el reconocimiento óptico-digital de imágenes cada vez más complejas como
objetos movidos, rotados, escalados, degradados o fuera de foco. Esto ha dado lugar al
desarrollo de técnicas invariantes, es decir, técnicas que reconocen como idénticos a objetos
iguales a pesar de tener cambios de posición, escala, rotación, entre otras. Sin embargo el
procesamiento invariante es una tarea difícil y motivo por el cual, las técnicas encaminadas
a resolver este problema son variadas (Pech-Pacheco y Álvarez-Borrego, 1998; AlvarezBorrego y Chávez-Sánchez, 2001; Castro-Longoria et al., 2001; Alvarez-Borrego et al.,
2002; Fájer-Ávila y Álvarez-Borrego, 2002; Pech Pacheco et al., 2002; Villalobos-Flores et
al., 2002; Castro-Longoria et al., 2003; Pech Pacheco et al., 2003).
28
IV. 1. Obtención de cariotipos en abulones a partir de larvas
4.1.1. Obtención de organismos
Para el presente estudio se utilizaron ejemplares adultos maduros de abulón rojo Haliotis
rufescens, azul H. fulgens y amarillo H. corrugata. Los ejemplares de abulón rojos fueron
obtenidos de la granja de Abulones Cultivados S.A., localizada en el Ejido Eréndira. Los
ejemplares de abulón amarillo y azul fueron colectados desde Isla de Cedros (28°03’N;
115°8’W). Ambas localidades ubicadas en Baja California, México. Los organismos fueron
mantenidos y acondicionados para desovar tanto en el laboratorio húmedo del
Departamento de Acuicultura, CICESE como en el laboratorio de producción larval de la
Cooperativa de Pescadores Nacionales del Abulón, Isla de Cedros.
29
4. 1. 2. Obtención de placas metafásicas
Para la obtención de placas metafásicas se utilizaron larvas 24 h pos-fertilización (Fig. 3).
Como antimitótico se utilizó colchicina, que es un alcaloide que impide la formación del
huso mitótico deteniendo las células en metafase. Las larvas recién recolectadas fueron
puestas en un medio con colchicina 0.05% disuelta en agua de mar microfiltrada a
temperatura ambiente por 4 h.
4. 1. 3. Tratamiento hipotónico
La hipotonía permite que las células aumenten de volumen, facilitando la técnica de
aplastado o goteo, mejorando así la dispersión de los cromosomas. Las larvas fueron
tratadas con agua de mar microfiltrada al 50% durante 30 minutos.
4. 1. 4. Fijación
Se utilizó Carnoy modificado (metanol: ácido acético, 3:1) recién preparado, a una
temperatura de 4 ºC aproximadamente. El fijador frío se deslizó lentamente por las paredes
del tubo Eppendorf de 1.5 ml para evitar dañar el tejido. Se realizaron 3-4 cambios por
decantación y duración de 30 minutos cada uno. Las muestras se mantuvieron en solución
Carnoy por aproximadamente una semana y posteriormente en etanol al 70% a 4ºC.
4. 1. 5. Confección de preparaciones
El tejido fue disgregado con ácido acético 50% a temperatura ambiente en un tubo de 1.5
ml. Luego de mantenerlo en forma vertical y sin moverlo durante 10 minutos, se extrajo el
sobrenadante con una pipeta Pasteur. El líquido se goteó sobre un portaobjeto precalentado
entre 40-50ºC y desde una altura aproximada de treinta centímetros. Las preparaciones se
30
dejaron secar al aire. En el caso de los abulones azul y amarillos se tiñeron los cromosomas
con DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) en buffer fosfato salino (1xPBS) pH 7.4 a una
concentración 0.5 µg/ml por períodos que variaron entre 10-20 minutos. En el caso del
abulón rojo se utilizó sólo contraste de fases.
Figura 3. Esquema de procedimiento de obtención de placas metafásicas desde larvas de
abulón.
4.1.6. Desarrollo de cariotipos
La figura 3 muestra el procedimiento general de obtención de placas metafásicas desde
larvas de abulón. Adicionalmente, las mejores placas metafásicas fueron capturadas
digitalmente a 1000x en un microscopio de epifluorescencia (Leica modelo DMRXA2)
equipado con una cámara digital a color de 36-bits y 3.3 MegaPixel (Leica modelo
31
DC300). Las imágenes capturadas fueron utilizadas para obtener dos tipos de
aproximaciones. La primera fue obtener valores morfométricos de los brazos de cada
cromosoma a través del programa Image Pro-Plus versión 3.0 (Copyright© 1993-1998
Media Cybernetics). Las mediciones fueron usadas para determinar la longitud relativa de
los cromosomas (longitud del par cromosómico / longitud total del juego cromosómico x
100) y el índice centromérico de cada cromosoma (longitud del brazo corto / longitud total
del cromosoma x 100). Con las mediciones de las mejores placas metafásicas se construyó
el cariotipo promedio. Asimismo, el ordenamiento de los cromosomas fue realizado con
base en la nomenclatura propuesta por Levan et al. (1964).
IV. 2. Procedimientos de FISH para la localización cromosómica de genes
4. 2. 1. FISH para ADNr 18S+5.8S+ 28S
4. 2. 1. 1. Obtención de sondas para ADNr 18S+5.8S+ 28S
Para obtener la sonda ribosomal que hibridara sobre las regiones cromosómicas que
contenían ADNr, se utilizó la sonda pDm238 (Roiha et al., 1981) clonada en el plásmido
pBR322. Esta sonda contiene los genes 18S, 5.8S y 28S y los espaciadores de Drosophila
melanogaster, abarcando una región de 12 kb. El plásmido se mantuvo en células
bacterianas de E. coli (cepa JM109) cultivadas en medio LB (Luria-Bertani; bactotriptona
1%, extracto de levadura 0.5%, cloruro sódico 1%, agar 1.5%) y ampicilina (60 µg/ml).
Para almacenar y mantener la cepa bacteriana es posible obtener 800 µl de la cepa en su
fase exponencial más una concentración de final de ampicilina de 100 µg/ml en medio LB
sin agar. A los 800 µl de cepa se agregan 200 µl de glicerol al 10%, posteriormente se
32
almacenó en tubos de 1.5 ml a -20°C. Para reactivar la cepa y proceder a extraer el
plásmido, se descongeló la cepa almacenada y se inoculó en medio LB sin agar con
ampicilina 60 µg/ml durante toda la noche y en agitación constante a 37°C. La recolección
de las bacterias se obtuvo por centrifugación. La extracción del plásmido se realizó
mediante el Kit para purificación de ADN plasmídico, NucleoSpin®Plasmid QuickPure
(Macherey-Nagel) según instrucciones del fabricante.
4. 2. 1. 2. Marcaje de sonda ribosómica obtenida desde ADN plasmídico
La sonda fue marcada con digoxigenina, esteroide presente en las especies vegetales
Digitalis purpurea y D. lanata. Esta molécula se incorpora al ADN enzimáticamente por el
método de “Nick translation”, el cual se basa en la facultad de la DNAsa I para producir, a
bajas concentraciones de la enzima y en presencia de Mg+2, cortes en el ADN producidos al
azar. La ADN Polimerasa I de E. coli sinteriza en dirección 5’→3’ ADN complementario
utilizando como cebador el extremo 3’-OH del corte. La actividad exonucleasa 5’→3’ de
esta misma enzima elimina simultáneamente nucleótidos en la dirección de síntesis. Uno de
los nucleótidos añadidos es un análogo de la timina, el dUTP marcado con la molécula
digoxigenina. Para el presente estudio se utilizó el Kit DIG-Nick translation Mix
(Boehringer Mannheim) según instrucciones del fabricante. Este kit contiene tampón de
reacción en glicerol (50%), ADN polimerasa I, ADNsa I, dATP 0.25mM, dCTP 0.25mM,
dGTP 0.25mM, dTTTP 0.17mM y DIG-11-dUTP 0.08mM. La reacción se llevó a cabo en
un volumen de 20 µl conteniendo 1 µg de ADN, 4 µl de la solución del kit y agua destilada.
La mezcla se incubó durante 90 minutos a 15°C. Después de la incubación, se colocó en
hielo.
33
El marcaje es considerado óptimo cuando el tamaño de los fragmentos producidos está
comprendido en un rango de 200-500 nucleótidos. Para comprobar el tamaño de los
fragmentos se tomó una alícuota de 3 µl de la mezcla y se añadió 1µl de tampón de carga
(glicerol 30%, azul de bromofenol 0.5%). Posteriormente se desnaturalizó a 95°C durante 3
minutos manteniéndose posteriormente en hielo durante otros 3 minutos. El tamaño de los
fragmentos se determinó en un gel de agarosa al 2% en tampón 1xTAE más un marcador de
peso molecular. En aquellos casos en los que se obtuvieron fragmentos mayores de 500
nucleótidos se continuó con la incubación a 15°C durante 30 minutos más, verificándose
nuevamente el tamaño de los fragmentos. En el momento en que se alcanza el tamaño
adecuado de pares de bases, se detuvo la reacción con EDTA 1µl 0.5 M (pH 8.0) e
incubación durante 10 minutos a 65°C.
Una vez realizado el marcaje de la sonda, se añadió a la mezcla 6 µl de ADN de
esperma de salmón (10 mg/ml) y 6 µl de ARN de levadura (10 mg/ml). Posteriormente la
sonda se precipita en etanol 100% y acetado de sodio 3 M durante toda la noche a -20°C.
Al día siguiente se recogió el precipitado por centrifugación y se lavó con etanol al 70%
frío. Posteriormente, se secó el ADN mediante centrifugación y se resuspendió en una
solución de hibridación (Formamida 50%, 2xSSC, fosfato sódico 50mM y dextransulfato
10%) a la concentración de 4ng/ µl (250 µl). Dentro del proceso de hibridación fue
necesaria la desnaturalización del ADN tanto de la sonda marcada como del ADN
cromosómico, que en el caso de los genes ribosomales se realizó a la vez. Para
desnaturalizar los portaobjetos y las sondas, se agregaron 20 µl de la solución de
hibridación que contiene la sonda y se llevaron los portaobjetos a 72ºC en una placa
calefactora. El proceso de hibridación fue realizado durante toda la noche a 37°C.
34
Posteriormente se realizaron los siguientes lavados pos-hibridación: 3x5 min en 50%
formamida 2xSSC a 44ºC, 3x5 min en 0.1XSSC a 60 ºC, 1x5 min. 2XSSC, 1x5 min en
TNT y 1x30 min en TNB a temperatura ambiente.
4. 2. 2. FISH para regiones Teloméricas y GATA
4. 2. 2. 1. Obtención de sondas para regiones Teloméricas y GATA
Hibridación in situ de fluorescencia fue llevada a cabo para determinar la presencia de
secuencias altamente repetidas en abulones. Para la cual en el presente estudio se utilizaron
las sondas de secuencias teloméricas (TTAGGG)n y el microsatélite (GATA)n. Ambas
sondas fueron amplificadas mediante PCR en volúmenes de reacción de 50µl y en ausencia
de template usando (TTAGGG)5 y (CCCTAA)5 y (GATA)7 y (TATC)7 como iniciadores
respectivamente (Ijdo et al., 1991). Las condiciones de PCR fueron: 10 ciclos a 94°C por 1
min, 55°C por 30 sec, 72°C por 1 min y treinta ciclos de PCR de amplificación estándar a
una temperatura de anillamiento de 60°C. El anillamiento escalonado de los iniciadores
proporciona una plantilla de cadena simple para la extensión de la Taq polimerasa. De esta
forma, en los primeros 10 ciclos de la PCR mientras se forman más plantillas, éstas sirven a
su vez como iniciadores y plantillas de los siguientes ciclos de la PCR, dando lugar a una
población heterogénea de moléculas que constan de arreglos de repeticiones de varias
longitudes (de 2-25KB en el caso de regiones teloméricas). Los productos de PCR fueron
visualizados mediante electroforesis en 2% de gel de agarosa. El marcaje de la sonda de
ADN fue realizado mediante el método de Nick translation conjugado con digoxigenina. La
hibridación in situ se llevó a cabo en condiciones similares a las descritas anteriormente
para el gen ADNr, seguido por tres lavados pos-hibridación por 5 min cada uno a 42°C
35
(sonda telomérica) o 37°C (sonda GATA) en 50% de formamida en 2xSSC, pH 7.0, tres
cambios de 5 min a 37°C en 2xSSC, pH 7.0, 5 min en 4xSSC/0.1% Tween20 a temperatura
ambiente, 5 min en 1xPBS/0.1%Tween20/1% Reactivo bloqueador, 30 min en 1xPBS con
1% de Reactivo bloqueador.
4. 2. 3. Detección inmunocitoquímica
Para la detección y amplificación de la señal de hibridación, las preparaciones
cromosómicas fueron incubadas con anticuerpos anti-digoxigenina de ratón a 0.5 µg/ml y
detectada con anti-ratón de conejo conjugado con fluoresceína isothiocyanato (FITC) a 0.2
µg/ml, y finalmente para amplificar las señales de fluorescencia con anti-conejo de cabra
conjugado con FITC a una concentración de 0.1 µg/ml. Las placas cromosómicas fueron
sobreteñidas y montadas con 30 µl de IP-V 500 ng/ml (ioduro de propidio más Vectashield
antidesvanecimiento). Las imágenes fluorescentes de FISH fueron obtenidas mediante un
microscopio de epifluorescencia (Axioskop 2 plus, Zeiss) y grabadas mediante un cámara
digital (CoolSnap, Photometrics ® Inc.).
IV. 3. Relaciones cromosómicas entre Haliotis rufescens, H. fulgens y H. corrugata
Con finalidad de establecer relaciones citogenéticas entre las tres especies de abulones se
realizó un análisis morfométrico cromosómico mediante la utilización de análisis de
imágenes. Adicionalmente se contrastaron los valores obtenidos para cada cariotipo
promedio mediante la construcción de carioidiogramas según Spotorno (1985). Dicho
método emplea los valores de las mediciones estandarizadas como porcentaje del juego
36
haploide. Con los valores porcentuales de cada par cromosómico se calcularon para cada
brazo, su longitud promedio, desviación estándar e intervalos de confianza al 95%.
De esta forma, se estableció y comparó el grado de similitud cariotípica entre las
especies estudiadas, las medidas cromosómicas porcentuales del brazo corto (%BC) y brazo
largo (%BL) de cada par cromosómico fueron transformadas al arcoseno de la raíz
cuadrada de la proporción, para evitar restricciones de distribución. Las diferencias de
ambos brazos fueron probadas independientemente para cada par cromosómico usando un
análisis de varianza de una vía y una prueba a posteriori de comparaciones múltiples de
Tukey. Como regla general, un par cromosómico fue considerado igual entre dos especies,
sólo si ambos brazos no mostraron diferencia significativa de tamaño (P < 0.05). Con la
información obtenida de la prueba Tukey, se construyó una matriz de similitud especieespecie, donde se representó el número de cromosomas de igual morfología entre cada
especie. Finalmente, para representar gráficamente los resultados, se construyó un
dendrograma mediante un análisis UPGMA (Unweighted Pair Grouping Method of
Averanges). Los análisis antes mencionados fueron realizados mediante el paquete
estadístico STATISTICA® 6.1 (Copyright® StatSoft, Inc. 1998-2002).
IV. 4. Desarrollo de un método para estimar tamaño genómico mediante análisis de
imágenes fluorescentes
4. 4. 1. Material biológico
Para determinar las relaciones entre el tamaño genómico y desvanecimiento fluorescente de
ADN, se utilizaron distintas especies de valor-C conocido (cantidad total de ADN
37
contenido dentro del complemento haploide medida en picogramos (pg)). Peces: tilapia
Mozámbica, Oreochromis mossambicus valor-C=0.81 pg (Cui et al., 1991) y trucha arco
iris, Oncorhynchus mykiss valor-C=2.40 pg (Hardie y Hebert, 2003). Moluscos: abulón
rojo, Haliotis rufescens valor-C=1.8 pg, abulón azul, H. fulgens valor-C =1.70 pg y abulón
amarillo, H. corrugata valor-C = 2.0 pg (Hinigardner, 1974).
4. 4. 2. Recolección de muestras y preparación celular para tinción de ADN
Para la estimación de tamaño genómico en peces se utilizaron eritrocitos así como núcleos
de espermatozoides. La sangre de los peces fue recolectada por punción del arco braquial
con una jeringa de 1.5 ml. Previamente, los peces fueron anestesiados con hydroxyl-phenol
(0.2 mg/ml). Monocapas de células de glóbulos rojos fueron adheridas sobre los
portaobjetos según Hardie et al. (2002). Posteriormente, los frotis fueron dejados secar al
aire junto con metanol como solución fijadora. Después de la fijación, los frotis fueron
deshidratados mediante el incremento del grado de etanol (70%, 90% y 100%), dos
cambios por 5 minutos cada vez y finalmente almacenados a 4°C. Las muestras de
espermatozoides fueron obtenidas de tilapias en estado reproductivo mediante masaje
abdominal. Los frotis de espermatozoides fueron fijados sobre portaobjetos con solución de
Carnoy fresco (metanol: ácido acético, 3:1) a 4°C y posteriormente dejados secar al aire.
Para la recolección de muestras en moluscos, se utilizaron hemocitos y espermatozoides de
abulones. La hemolinfa fue obtenida directamente desde el nódulo sinusal cardiaco
mientras que los espermatozoides fueron obtenidos por inducción al desove de ejemplares
adultos según Morse et al. (1977). Los frotis fueron procesados de manera similar a las
muestras de espermatozoides de tilapia.
38
Las células fijadas sobre los portaobjetos fueron lavadas tres veces con tampón fosfato
salino (1xPBS; (13 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM Na2HPO4, 0.2 mM KH2PO4, pH 7.4)
por 15 minutos. Posteriormente, los frotis fueron incubados con tinción de DAPI en
oscuridad por 25 minutos a temperatura de laboratorio. La solución de DAPI fue preparada
con 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Sigma Chemical; St. Louis, MO) en 1xPBS a
una concentración de 0.5 µg/ml. Esta concentración permitió obtener imágenes
fluorescentes con la menor cantidad de fluorocromo adherido al citoplasma (sobretinción).
4. 4. 3. Captura de imágenes
Para la captura digital de imágenes fluorescentes se programó una subrutina de captura
mediante el programa QWIN (Copyright® by Imaging Systems Ltd, Cambridge, U. K.,
1997). La subrutina permitió capturar una imagen digital de 348 X 258 píxeles cada 1600
milisegundos durante un período de desvanecimiento fluorescente en el mismo campo de
observación. Adicionalmente, el programa almacenó las imágenes capturadas en un archivo
para su análisis. Las condiciones de captura fueron; tiempo de exposición de CCD de 509
milisegundos, gamma igual a 1 (respuesta lineal) y profundidad de color de 8 bits/canal.
Para la medición de fluorescencia, se utilizó un microscopio motorizado de
epifluorescencia modelo Leica DMRXA2, equipado con una cámara color de 36-bits
modelo Leica DC300 (3.3 Mega Pixels). Las condiciones de fluorescencia fueron; filtro de
excitación de UV 340-380 nm, espejo dicromático DM 400 nm, filtro de supresión LP 425,
banda de absorción AB 435-485 nm y lente objetivo Fluotar PL 63X/0.7.
39
4. 4. 4. Análisis de imágenes fluorescentes
El análisis de imágenes fue llevado a cabo mediante el desarrollo de un algoritmo
específicamente construido con lenguaje MATLAB (Copyright© 1984-2000, The
MathWorks, Inc.). El algoritmo fue construido con la finalidad de procesar la información
de la intensidad de fluorescencia durante un período de desvanecimiento DAPIfluorescente. Para lo cual, se midió la intensidad de fluorescencia mediante una ventana de
13x13 píxeles alrededor del núcleo. Esta ventana fue utilizada para estimar el promedio de
la intensidad “ADN-DAPI fluorescente” o formalmente como intensidad media pixélica
(IMP). Las imágenes fluorescentes fueron convertidas desde color a 256 niveles de brillo (8
bits/canal). Adicionalmente, el algoritmo permitió analizar simultáneamente numerosos
núcleos sobre la muestra. De esta forma, el proceso generó una captura secuencial durante
un período de desvanecimiento fluorescente hasta la pérdida total de fluorescencia del
ADN. Gráficamente, si unimos todos los puntos IMP durante un período de pérdida de
fluorescencia, el área bajo la curva representará una función de integración de
desvanecimiento fluorescente (ID) como:
n
ID = ∑ ( IMP) i ∗ ∆t
( 1)
i =1
donde el subíndice
i representa el número de imágenes en un período de desvanecimiento y
∆t el intervalo entre la captura de imágenes. Así ID representa la función integral mediante
la suma de la intensidades medias pixélicas a través del período de desvanecimiento
fluorescente del ADN.
40
Adicionalmente, se construyeron una serie de algoritmos con la finalidad de estimar el
número de núcleos necesarios para obtener un valor representativo de ID y determinar la
información de brillo que contribuye cada canal RGB. Después de obtener los valores de
ID para cada tipo celular utilizado como referencia se ajustaron los resultados a un modelo
lineal entre ID y el tamaño genómico reportado para las especies de referencia.
Adicionalmente se obtuvo el 95% de intervalo de confianza para los descriptores de la
ecuación lineal. La figura 4 muestra el procedimiento general de la medición de tamaño
genómico a través de la cuantificación del desvanecimiento fluorescente de ADN.
Figura 4. Procedimiento general de medición de tamaño genómico a través de la
cuantificación del desvanecimiento fluorescente de ADN.
41
IV. 5. Estimación de contenido de ADN cromosómico en abulón rojo Haliotis rufescens
4. 5. 1. Preparación de cromosomas y tinción de ADN
La obtención de cromosomas fue realizada según la metodología descrita anteriormente en
el punto IV. 1. Asimismo las preparaciones cromosómicas se tiñeron con la solución de
DAPI descrita en el punto 4. 4. 2, para estimar contenido de ADN según el método
propuesto de desvanecimiento fluorescente.
4. 5. 1. Análisis de imágenes en contenidos de ADN cromosómicos
La captura de imágenes fue realizada mediante la programación en QWIN descrita en el
punto 4. 4. 3 pero modificado para capturar un imagen digital de 2088 X 1550 píxeles y con
un tiempo de exposición de CCD de 209 milisegundos. El procedimiento de análisis de
imágenes fue llevado a cabo por tres algoritmos desarrollados en MATLAB. El primer
algoritmo fue construido en orden de obtener sub-imágenes de 51 X 51 píxeles a partir de
las imágenes inicialmente capturadas de 2088 X 1550 píxeles. Cada sub-imagen de 51 X 51
píxeles contiene un solo cromosoma metafásico, el cual fue capturado secuencialmente
durante un período de desvanecimiento fluorescente. La identificación del tipo
cromosómico contenido en la sub-imagen fue realizada según el cariotipo de H. rufescens.
El segundo algoritmo fue usado para generar una máscara binaria (valores pixélicos 0 y 1)
sobre el contorno del cromosoma. El propósito de ésta máscara fue filtrar las intensidades
pixélicas del fondo de la imagen mediante la multiplicación entre la imagen fluorescente y
la máscara binaria. De esta forma, fue posible obtener la mayor cantidad de información
sólo del ADN cromosómico. El tercer algoritmo fue generado para estimar los valores de
42
ID para cada tipo cromosómico. La estimación de ID fue realizada similarmente a lo
descrito en el punto 4. 4. 3.
4. 5. 2. Análisis estadístico
Para obtener las variaciones del contenido de ADN de cada par homólogo, se estimó el
porcentaje de variación de ADN cromosómico y su contribución a la variación total del
tamaño genómico. Estos cálculos fueron realizados mediante un ANOVA de una vía y una
prueba a posteriori Tukey. Los supuestos de ANOVA, distribución normal y
homogeneidad de varianza fueron comprobados usando las pruebas de KolmogorovSmirnov y de Bartlett respectivamente. Los análisis estadísticos fueron realizados mediante
el paquete estadístico STATISTICA® 6.1 (Copyright® StatSoft, Inc. 1998-2002).
IV. 6. Estimación de tamaño genómico en Argopecten purpuratus
4. 6. 1. Material biológico
Treinta ejemplares de A. purpuratus provenientes de dos poblaciones fueron utilizados para
estimar su tamaño genómico promedio. Quince ejemplares fueron recolectados desde una
población silvestre en la localidad de Arica (18° 28' Sur) y quince fueron recolectadas
desde una población de cultivo en Bahía Tongoy (30° 15’ Sur), ambas áreas están
localizadas al norte de Chile. Datos de longitud (lc), ancho (anc) y altura (alc) de concha
fueron obtenidos para cada ejemplar. Asimismo se calculó la proporción de anc/lc y alc/lc.
43
4. 6. 2. Obtención de hemocitos y tinción fluorescente de ADN
El tamaño genómico de A. purpuratus fue estimado a través de núcleos de hemocitos en
ejemplares adultos (8-9 cm. de altura de concha). La hemolinfa fue extraída desde el
músculo aductor de animales vivos usando una jeringa de insulina. Posteriormente, la
hemolinfa fue fijada sobre portaobjetos con solución Carnoy (metanol: ácido acético, 3:1) a
4°C. La estimación del tamaño genómico fue realizada según el procedimiento descrito en
los puntos 4. 4. 2 – 4. 4. 4.
4. 6. 3. Análisis estadístico
En referencia a las longitudes de concha y a las proporciones anc/lc and alc/lc, estas fueron
comparados entre las poblaciones mediante una prueba t. Para obtener la variación de
tamaño genómico tanto a nivel intraespecífico como a nivel interpoblacional, distintos
análisis estadísticos fueron realizados para estimar el porcentaje de variación a cada nivel
muestreal (individuo y poblaciones) y su contribución a la variación total del tamaño
genómico. El coeficiente de variación fue estimado desde la dispersión de los valores de
contenido de ADN individual (desviación estándar * 100). Asimismo se realizaron análisis
de varianza anidado de una y dos vías mediante la utilización del paquete estadístico
STATISTICA® 6.1.
44
V. 1. Cariotipo cuantitativo de Haliotis rufescens
Para la obtención del cariotipo de H. rufescens, varias imágenes digitales fueron capturadas
y procesadas para eliminar ruido y bajo contraste. Después de procesar la imagen fue
posible obtener imágenes cromosómicas de mejor contraste y por tanto, fue posible realizar
mediciones más exactas de la morfología de los cromosomas. La figura 5a muestra una
placa metafásica sin teñir y mejorada mediante procesamiento de imágenes. Las
observaciones cariológicas en células larvales de abulón rojo mostraron un número diploide
igual a 36 cromosomas. La distribución relativa de longitudes cromosómicas fue derivada
para obtener el cariotipo del abulón rojo del Pacífico Haliotis rufescens (Figura 5b). Los
valores medios y desviaciones estándar de los 18 pares cromosómicos se muestran en la
Tabla II.
45
Figura 5. Cromosomas de Haliotis rufescens. a) Imagen digital de placa metafásica, b)
Cariotipo de H. rufescens.
La relación de longitudes de los brazos cromosómicos fue utilizada para graficar el
cardiograma representativo para la especie. Este indicó que el abulón rojo posee ocho pares
metacéntricos (1, 3, 6, 7, 14, 15, 17 y 18), nueve pares submetacéntricos (2, 4, 5, 8, 9, 10,
46
11, 12 y 13) y un par cromosómico clasificado como subtelocéntrico (16). Los pares
cromosómicos 14 y 17 fueron difíciles de identificar debido principalmente al traslape de
sus respectivas longitudes porcentuales cromosómicas (Fig. 6).
Tabla II. Longitud cromosómica total, longitud relativa e índice centromérico para Haliotis
rufescens (2n=36).
Longitud total
Longitud
Índice
(µm)
relativa (%)
Centromérico
(media ± de)
(media ± de)
(media ± de)
1
5.67 ± 0.19
6.52 ± 0.56
43.95 ± 0.15
M
2
5.58 ± 0.07
6.42 ± 1.03
32.53 ± 0.18
SM
3
5.39 ± 0.06
6.20 ± 0.55
46.91 ± 0.11
M
4
5.30 ± 0.10
6.09 ± 0.78
31.30 ± 0.13
SM
5
5.24 ± 0.01
6.03 ± 0.91
29.91 ± 0.09
SM
6
5.20 ± 0.03
5.97 ± 0.26
44.66 ± 0.15
M
7
5.08 ± 0.13
5.84 ± 0.44
41.68 ± 0.03
M
8
5.07 ± 0.07
5.83 ± 0.68
31.72 ± 0.29
SM
9
4.99 ± 0.07
5.74 ± 1.01
26.38 ± 0.15
SM
10
4.65 ± 0.04
5.34 ± 0.80
28.97 ± 0.13
SM
11
4.63 ± 0.09
5.32 ± 0.70
29.70 ± 0.13
SM
12
4.58 ± 0.02
5.26 ± 0.52
34.67 ± 0.08
SM
13
4.50 ± 0.04
5.17 ± 0.78
27.59 ± 0.17
SM
14
4.44 ± 0.07
5.10 ± 0.17
46.23 ± 0.21
M
15
4.32 ± 0.05
4.96 ± 0.31
42.74 ± 0.20
M
16
4.31 ± 0.05
4.95 ± 1.63
16.31 ± 0.14
ST
17
4.46 ± 0.06
4.45 ± 0.27
45.56 ± 0.15
M
18
3.75 ± 0.07
4.31 ± 0.34
44.48 ± 0.19
M
Cromosoma
Par no.
* M, metacéntrico; SM, submetacéntrico; ST, subtelocéntrico.
Tipo*
Cromosómico
47
5
T
SM
ST
M
2
4
16
5
4
1
8
3
% Brazo largo
9
3
11 10
6
7
13
12
15
17
18
14
2
1
0
0
1
2
3
4
5
% Brazo corto
Figura 6. Carioidiograma de Haliotis rufescens. M, metacéntrico; SM, submetacéntrico;
ST, subtelocéntrico; T, telocéntrico.
V. 2. Cariotipo cuantitativo de Haliotis fulgens
Cromosomas metafásicos de abulón azul H. fulgens, mostraron un número diploide de
2n=36 (Fig. 7). Los valores medios y de desviación estándar de la longitud total, longitud
relativa e índice centromérico fueron estimados a partir de las mediciones de brazos
cromosómicos usando análisis de imágenes (Tabla III). La longitud máxima de los
cromosomas fue 6.07 ± 0.12 µm y la mínima fue de 3.13 ± 0.21 µm. El carioidiograma
obtenido para el abulón azul mostró que esta especie posee ocho pares metacéntricos (1, 3,
48
6, 9, 10, 16, 17 y 18), ocho pares submetacéntricos (2, 4, 5, 7, 8, 11, 12 y 13), y dos pares
de cromosomas subtelocéntricos (14 y 15) (Fig. 8).
Figura 7. Cariotipo de Haliotis fulgens (2n=36).
49
Tabla III. Longitud cromosómica total, longitud relativa e índice centromérico para
Haliotis fulgens (2n=36).
Longitud total
Longitud
Índice
(µm)
relativa (%)
Centromérico
(media ± de)
(media ± de)
(media ± de)
1
6.07 ± 0.12
8.00 ± 0.27
47.45 ± 0.16
M
2
5.06 ± 0.81
6.67 ± 0.12
34.09 ± 0.15
SM
3
4.84 ± 0.11
6.37 ± 0.38
48.37 ± 0.17
M
4
4.72 ± 0.68
6.23 ± 0.49
39.81 ± 0.18
SM
5
4.16 ± 0.93
5.48 ± 0.22
34.16 ± 0.14
SM
6
4.62 ± 0.35
6.08 ± 0.12
44.69 ± 0.13
M
7
4.56 ± 0.68
6.01 ± 0.07
39.41 ± 0.10
SM
8
4.41 ± 0.79
5.82 ± 0.40
37.27 ± 0.17
SM
9
4.24 ± 0.49
5.59 ± 0.20
42.74 ± 0.15
M
10
4.14 ± 0.36
5.45 ± 0.10
43.77 ± 0.12
M
11
4.04 ± 0.69
5.32 ± 0.20
37.98 ± 0.15
SM
12
3.98 ± 0.87
5.24 ± 0.26
34.51 ± 0.09
SM
13
3.81 ± 0.51
5.02 ± 0.31
40.59 ± 0.15
SM
14
3.86 ± 1.38
5.09 ± 0.21
24.73 ± 0.14
ST
15
3.63 ± 1.29
4.78 ± 0.25
24.82 ± 0.17
ST
16
3.50 ± 0.25
4.61 ± 0.19
44.97 ± 0.12
M
17
3.13 ± 0.08
4.13 ± 0.23
48.29 ± 0.20
M
18
3.13 ± 0.21
4.13 ± 0.22
45.20 ± 0.09
M
Cromosoma
Par no.
* M, metacéntrico; SM, submetacéntrico; ST, subtelocéntrico.
Tipo*
Cromosómico
50
5
T
ST
SM
2
M
1
4
14
4
5 8
% Brazo largo
15
7
11
12
3
6
9
3
10
13
16
18
17
2
1
0
0
1
2
3
4
5
% Brazo corto
Figura 8. Carioidiograma de Haliotis fulgens. M, metacéntrico; SM, submetacéntrico;
ST, subtelocéntrico; T, telocéntrico.
V. 3. Cariotipo cuantitativo de Haliotis corrugata
Las metafases examinadas en el abulón amarillo H. corrugata, mostraron un número
cromosómico diploide de 2n=36 (Fig. 9). La longitud cromosómica total mostró un
máximo de longitud cromosómica de 5.82 ± 0.12 µm y un mínimo de 3.46 ± 0.05 µm,
adicionalmente se obtuvieron los valores de longitud relativa e índice centromérico (Tabla
IV). Mediante el arreglo de pares cromosómicos, el cariotipo consistió en diez pares
51
metacéntricos (1, 3, 6, 9, 10, 11, 14, 15, 17 y 18), siete pares submetacéntricos (2, 4, 5, 7, 8,
12 y 13), y un par de cromosomas subtelocéntricos (16) (Fig. 10).
Figura 9. Cariotipo de Haliotis corrugata (2n=36).
52
Tabla IV. Longitud cromosómica total, longitud relativa e índice centromérico para
Haliotis corrugata (2n=36).
Longitud total
Longitud
Índice
(µm)
relativa (%)
Centromérico
(media ± de)
(media ± de)
(media ± de)
1
5.82 ± 0.12
7.28 ± 0.27
48.02 ± 0.06
M
2
5.00 ± 0.08
6.26 ± 0.12
35.90 ± 0.11
SM
3
4.82 ± 0.03
6.03 ± 0.38
46.70 ± 0.05
M
4
4.80 ± 0.06
6.00 ± 0.49
39.95 ± 0.08
SM
5
4.59 ± 0.02
5.74 ± 0.22
36.93 ± 0.06
SM
6
4.53 ± 0.06
5.66 ± 0.12
43.81 ± 0.09
M
7
4.52 ± 0.05
5.66 ± 0.07
34.51 ± 0.09
SM
8
4.45 ± 0.02
5.57± 0.40
36.91 ± 0.08
SM
9
4.44 ± 0.04
5.55 ± 0.20
49.16 ± 0.07
M
10
4.34 ± 0.01
5.43 ± 0.10
41.09 ± 0.07
M
11
4.32 ± 0.08
5.40 ± 0.20
47.98 ± 0.16
M
12
4.29 ± 0.02
5.36 ± 0.26
37.38 ± 0.04
SM
13
4.24 ± 0.02
5.30 ± 0.31
34.82 ± 0.08
SM
14
4.22 ± 0.09
5.28 ± 0.21
44.74 ± 0.10
M
15
4.07 ± 0.03
5.09 ± 0.25
47.04 ± 0.03
M
16
4.03 ± 0.02
5.04 ± 0.19
22.44 ± 0.04
ST
17
4.01 ± 0.01
5.02 ± 0.23
48.59 ± 0.02
M
18
3.46 ± 0.05
4.32 ± 0.22
45.50 ± 0.07
M
Cromosoma
Par no.
* M, metacéntrico; SM, submetacéntrico; ST, subtelocéntrico.
Tipo*
Cromosómico
53
5
T
SM
ST
2
4
1
7 5
16
8
12 10
13
% Brazo largo
M
3
4
3
6
14 11
9
15
17
18
2
1
0
0
1
2
3
4
5
% Brazo corto
Figura
10.
Carioidiograma
de
Haliotis
corrugata.
M,
metacéntrico;
SM,
submetacéntrico; ST, subtelocéntrico; T, telocéntrico.
V. 4. Hibridación in situ fluorescente en Haliotis rufescens
Arreglos cariotípicos en cromosomas de abulón rojo conjuntamente con FISH-ADNr,
permitió visualizar los principales sitios de localización de los clusters 18S-5.8S-28S. La
sonda de ADNr produjo intensas señales de hibridación sobre los telómeros de los brazos
largos de dos pares de cromosomas submetacéntricos (pares 4 y 5). Los cromosomas
metafásicos obtenidos desde larvas mostraron heteromorfismos de FISH-ADNr entre
cromátidas hermanas (par 7) y señales bajas de hibridación en zonas cromosómicas
intersticiales. Estas señales intersticiales fueron encontradas tanto en cromosomas
54
submetacéntricos como en subtelocéntricos (pares 8 y 16 respectivamente) (Fig. 11). Sin
embargo, la localización específica de estas regiones de baja señal de hibridación mostró
una alta variabilidad citogenética en todas las metafases analizadas. Adicionalmente
heteromorfismos en la localización de los principales cluster de FISH-ADNr, fueron
observados entre cromosomas ambos homólogos del par 12 y 13 (Fig. 11).
Figura 11. Arreglo cariotípico de Haliotis rufescens con hibridación in situ fluorescente
para sonda de gen ribosomal mayor 18S-5.8S-28S.
55
La aplicación de hibridación fluorescente in situ mediante un sonda de ADN de la
región telomérica, mostró que esta especie presenta una secuencia hexamérica altamente
repetitiva (TTAGGG)n similar a la descrita en vertebrados. Las señales de hibridación
fueron localizadas en las regiones terminales de todos los tipos cromosómicos analizados
(Fig. 12a). La visualización de núcleos interfásicos marcados con la sonda telomérica
(TTAGGG)n permitió evidenciar que las regiones teloméricas presentan una distribución
periférica al núcleo (Fig. 12b). Adicionalmente, la hibridación con sondas del microsatélite
(GATA)n fue observada en el genoma de H. rufescens (Fig. 12c). Sin embargo, la
localización de estas regiones fue muy variable, tanto en regiones intersticiales
cromosómicas como en las regiones teloméricas. Esto último fue posible observarlo en
núcleos interfásicos hibridados con la sonda (GATA)n (Fig. 12d).
V. 5. Hibridación in situ fluorescente en Haliotis fulgens
Hibridaciones in situ mediante la sonda de ADNr 18S-5.8S-28S mostró la localización de
los principales cluster de ADNr sobre las regiones teloméricas de los brazos largos en dos
pares cromosómicos submetacéntricos (pares 4 y 11). Cromosomas metafásicos obtenidos
desde larvas mostraron heteromorfismo en la localización de NOR entre cromatidas
hermanas, asimismo fueron localizadas bajas señales de hibridación en regiones
cromosómicas intersticiales principalmente en cromosomas de tipo submetacéntricos. Sin
embargo, la localización específica de las regiones con baja señal de hibridación mostró ser
altamente variable (Fig. 13a y 13b).
56
Después de aplicar los procedimientos de hibridación in situ con sonda telomérica
(TTAGGG)n sobre cromosomas mitóticos de abulón azul, estos mostraron fuertes señales
de hibridación en la regiones teloméricas de los cromosomas analizados (Fig. 13c). La
visualización
de núcleos interfásicos hibridados con la sonda telomérica permitió
corroborar la distribución periférica de estas regiones (Fig. 13d). Asimismo, con la
finalidad de comprobar la existencia del microsatellite (GATA)n, cromosomas de H.
fulgens mostraron una evidente señal de hibridación en todos los bivalentes analizados (Fig.
13e). La localización de estas regiones microsatélites fueron encontradas tanto en las
regiones intersticiales como en las regiones teloméricas (Fig. 13f).
V. 6. Hibridación in situ fluorescente en Haliotis corrugata
La localización de las regiones NOR mediante la sonda de ADNr 18S-5.8S-28S, fue
encontrada para el caso de abulón amarillo sobre las regiones teloméricas de dos pares
cromosómicos del tipo submetacéntrico (pares 2 y 4). Heteromorfismos en la localización
de NORs fueron encontrados entre cromátidas hermanas. Asimismo, la presencia de
regiones de hibridación en intersticiales fue observada tanto en cromosomas metacéntricos
como en submetacéntricos. La localización de zonas de hibridación de baja intensidad de
fluorescencia fue encontrada altamente variable a lo largo del genoma en H. corrugata
(Fig. 14a y 14b).
Las sondas teloméricas (TTAGGG)n mostraron la presencia de este tipo de secuencia en
las regiones teloméricas de todos los cromosomas de abulón amarillo (Fig. 14c). FISH
sobre núcleos interfásicos mostraron una distribución periférica de la secuencia (Fig. 14d).
57
La presencia del microsatélite (GATA)n fue corroborada en cromosomas de H. corrugata
(Fig. 14e). Sin embargo, la localización de estas secuencias mostró ser altamente variable
(Fig. 14f).
Figura 12. FISH en Haliotis rufescens. a) Cromosomas mitóticos metafásicos después
del tratamiento con sonda telomérica (TTAGGG)n, b) Núcleo interfásico con sonda
telomérica, c) Cromosomas mitóticos después de ser marcado con sonda (GATA)n, d)
Núcleo interfásico marcado con sonda (GATA)n.
58
Figura 13. FISH en Haliotis fulgens. a) Cromosomas mitóticos hibridados con sonda
ADNr 18S-5.8S-28S, b) Núcleo interfásico con sonda ADNr, c) Cromosomas
metafásicos con sonda telomérica (TTAGGG)n, d) Núcleo interfásico con sonda
telomérica, e) Cromosomas metafásicos con hibridados con sonda (GATA)n, f) Núcleo
interfásico con sonda (GATA)n. Flechas azules indican regiones NOR en cromosomas
homólogos. Flechas amarillas muestran heteromorfismos de NOR entre cromatidas
hermanas. Flechas blancas indican señales intersticiales de ADNr.
59
Figura 14. FISH en Haliotis corrugata. a) Cromosomas mitóticos hibridados con sonda
ADNr 18S-5.8S-28S, b) Núcleo interfásico con sonda ADNr, c) Cromosomas metafásicos
después de aplicar FISH con sonda telomérica (TTAGGG)n, d) Núcleo interfásico con
sonda telomérica, e) Cromosomas metafásicos con hibridados con sonda (GATA)n, f)
Núcleo interfásico con sonda (GATA)n. Flechas azules indican regiones NOR en
cromosomas homólogos. Flechas amarillas muestran heteromorfismos de NOR entre
cromatidas hermanas. Flechas blancas indican señales intersticiales de ADNr.
60
V. 7. Relaciones cromosómicas entre H. rufescens, H. fulgens y H. corrugata
Los 18 pares de cada especie de abulón fueron representados de acuerdo a sus respectivos
carioidiogramas, los cuales clasifican a cada par cromosómico de acuerdo a la posición del
centrómero. En la tabla V se muestran los resultados de los análisis estadísticos realizados
para cada par cromosómico. La comparación se realizó considerando todas las
combinaciones posibles entre las tres especies estudiadas. Un par cromosómico fue
considerado igual entre dos especies, sólo si ambos brazos no mostraban diferencia
significativa de tamaño (P < 0.05). Al analizar par a par los cariotipos de las tres especies,
mediante la información descrita en los carioidiogramas y análisis estadísticos aplicados, se
observó que los pares cromosómicos del 1 al 5 no difieren en tipo cromosómico (M, SM,
M, SM, SM respectivamente). De igual forma, los análisis estadísticos indican que no
existen diferencias significativas entre las tres especies. El par cromosómico 6 fue
metacéntrico para las tres especies, sin embargo la mayor diferencia de longitud fue
encontrada en abulón rojo. El cromosoma 7 fue submetacéntrico en abulón amarillo y azul,
pero metacéntrico en abulón rojo. A su vez este par mostró una diferencia significativa en
comparación con abulón azul y amarillo. El cromosoma 8 fue clasificado como
submetacéntrico en las tres especies. Sin embargo, en abulón azul se encontraron
diferencias significativas en longitud con respecto a las otras especies. Los cromosomas 9,
10 y 11 fueron principalmente metacéntricos excepto en el abulón rojo que fue clasificado
como submetacéntrico. Los análisis estadísticos mostraron que estos cromosomas son
altamente variables en longitud entre las tres especies estudiadas.
61
Tabla V. Análisis estadísticos usando pruebas de ANOVA y Tukey (n=10 placas
metafásicas por especie). Un par cromosómico fue considerado igual entre dos especies,
sólo si ambos brazos no muestran diferencia significativa (p<0.05). (BC) brazo corto, (BL)
brazo largo, (ND) no existe diferencia significativa, (S) si existe diferencia significativa,
(R) el par es propio de H. rufescens, (F) el par es propio de H. fulgens, (C) el par es propio
de H. corrugata.
H. rufescens
x
H. corrugata
___________
H. fulgens
H. corrugata
x
x
H. rufescens
H. fulgens
___________ ___________
Cromosoma
BC
BL
BC
BL
BC
BL
Resultado
1
N
N
N
N
N
N
ND
2
N
N
N
N
N
N
ND
3
N
N
N
N
N
N
ND
4
N
N
N
N
N
N
ND
5
N
N
N
N
N
N
ND
6
S
N
N
N
S
N
R
7
S
S
S
N
N
N
R
8
N
N
S
N
S
S
F
9
S
N
S
N
S
N
R, C y F
10
N
N
S
N
S
N
F
11
S
N
S
S
N
N
C
12
N
N
S
N
S
S
F
13
N
N
S
S
N
S
F
14
N
N
S
S
S
S
F
15
N
N
S
S
S
S
F
16
N
N
S
N
S
N
F
17
N
N
N
N
N
N
ND
18
N
N
N
N
N
N
ND
62
Los cromosomas 12 y 13 fueron submetacéntricos en las tres especies. No obstante, las
mayores diferencias significativas fueron encontradas en abulón azul. Los cromosomas 14
y 15 fueron clasificados como metacéntricos en abulón amarillo y rojo, y como
submetacéntrico en abulón azul. Del mismo modo, las mayores diferencias estadísticas se
encontraron en esta especie de abulón. El par 16 fue descrito como submetacéntrico en
abulón rojo y amarillo, excepto en abulón azul clasificado como metacéntrico y
estadísticamente diferente. Los cromosomas 17 y 18 no mostraron diferencias significativas
en longitud cromosómica, como tampoco en el tipo cromosómico metacéntrico en las tres
especies analizadas. Finalmente, de los análisis estadísticos se puede concluir que de los 18
pares que posee cada uno de los cariotipos promedios, 8 pares son iguales en las tres
especies estudiadas, 3 son propios H rufescens, 7 de H. fulgens y 2 de H. corrugata (Tabla
V). Por otro lado, rufescens comparte 9 pares cromosómicos con H. fulgens y 14 pares con
H. corrugata. A la vez, H. fulgens comparte 8 pares cromosómicos con H. corrugata
(Tabla VI).
Tabla VI. Matriz de similitud cromosómica entre H. rufescens, H. fulgens y H. corrugata.
H. rufescens H. fulgens H. corrugata
H. rufescens
H. fulgens
H. corrugata
*
9
14
*
8
*
63
De la matriz de similitud especie-especie, que muestra el número de pares similares
que existen entre cada especie (Tabla VI), se obtuvo un dendrograma usando un análisis
UPGMA (Fig. 15). En éste se observa que H. rufescens y H. corrugata son entre sí más
similares que cualquiera de ellas con respecto a H. fulgens.
Figura 15. Dendrograma que muestra el patrón de agrupamiento obtenido para la
morfología cromosómica de Haliotis rufescens, H. fulgens y H. corrugata usando análisis
UPGMA. La escala muestra el número de cromosomas de morfología similar.
V. 8. Estimación de tamaño genómico mediante análisis de imágenes fluorescentes
5. 8. 1. La naturaleza del desvanecimiento DAPI-fluorescente
Con la finalidad de establecer la relación entre el desvanecimiento DAPI-fluorescente y el
tamaño genómico, se compararon los perfiles de desvanecimiento en núcleos de distintos
64
tipos celulares de tilapia Mozambica, abulón rojo, azul y amarillo y trucha arco iris. Con la
finalidad de visualizar el período de desvanecimiento fluorescente, la Figura 16 muestra
sólo doce imágenes de núcleos de eritrocitos de tilapia teñidos con DAPI. La secuencia
muestra un período entre t = 1.6 a t = 192 segundos a diferentes intervalos de tiempo. La
secuencia muestra que la fluorescencia decrece rápidamente bajo la exposición de luz
ultravioleta. La intensidad de fluorescencia fue visualizada por intensidad pixélica de 256
niveles de brillo.
Figura 16. Secuencia de desvanecimiento fluorescente en eritrocitos de tilapia,
Oreochromis mossambicus. La barra de color indica la intensidad pixélica de 0 a 255.
Para comparar el desvanecimiento fluorescente en diferentes especies y por tanto
diferentes tamaños genómicos, se obtuvieron los perfiles de desvanecimiento en
espermatozoides (EZT) y eritrocitos (ERT) de tilapia Mozambica, espermatozoides de
abulón rojo (EZR) y eritrocitos de trucha arco iris (ERTr). Los perfiles ADN-DAPI
65
mostraron una disminución de la intensidad de fluorescencia en función del tiempo de
exposición a luz ultravioleta (UV). La variabilidad de los perfiles en diferentes frotis,
mostró que la dispersión de los datos ocurre principalmente en los primeros 20 segundos de
exposición a luz UV, después de este intervalo de tiempo el perfil de desvanecimiento se
vuelve más estable independientemente del número de campos medidos. Asimismo, fue
posible observar una diferencia en los tiempos requeridos para que ocurra completamente el
desvanecimiento, de esta forma el tiempo guarda relación con el tipo celular analizado (Fig.
17).
El fluorocromo DAPI unido al ADN emite fluorescencia principalmente en el intervalo
de longitudes de onda del color azul. Sin embargo, en imágenes digitales el color es
aportado por la contribución de tres canales; rojo, verde y azul (RGB). Con la finalidad de
estudiar la contribución de los tres canales RGB, y así determinar cual de ellos aporta la
mayor información de intensidad durante el período de desvanecimiento. Se analizaron los
perfiles de fluorescencia descompuestos en los tres canales RGB. La figura 18 muestra una
imagen de eritrocito de tilapia teñida con DAPI y descompuesta en los tres canales RGB.
Se observa que el canal azul es el canal que aporta la mayor cantidad de información en
comparación con los canales verde y rojo respectivamente. Sin embargo, la mayor cantidad
de información de intensidad aportada por el canal azul, puede estar afectada por ruido de
fondo. En tal caso la intensidad medida no necesariamente puede provenir del núcleo.
66
Figura 17. Perfiles de desvanecimiento DAPI-fluorescente para distintos tipos celulares.
EZT, espermatozoides de tilapia. ERT, eritrocitos de tilapia. EZR, espermatozoides de
abulón rojo. ERTr, eritrocitos de trucha arco iris.
67
Figura 18. Imagen digital DAPI-fluorescente descompuesta en los tres canales de color
(rojo, verde y azul) en eritrocitos de tilapia.
Para determinar si la contribución de cada canal RGB fue similar en los tipos celulares
de referencia e independiente al tamaño genómico, se obtuvieron perfiles de
desvanecimiento para cada canal de color por separado. De esta forma, cada canal (RGB),
fue graficado conjuntamente con un perfil promedio de los tres canales (Fig. 19). Este
análisis mostró que durante el período de desvanecimiento, el canal azul fue el que aportó
la mayor cantidad de información de brillo, mientras que los canales verde y rojo
contribuyeron en menor grado. El canal verde mostró una posición intermedia entre los
otros perfiles, lo cual indicó que este canal posee la capacidad de atenuar las altas
intensidades del canal azul producido por el ruido de fondo e incrementar la baja señal
68
obtenida por el canal rojo. En este sentido, es posible trabajar sólo con el canal verde para
establecer una curva representativa de desvanecimiento fluorescente. Sin embargo, el
trabajar sólo con un canal incrementa los tiempos de cómputo debido a que es necesario
generar una rutina adicional que extraiga el canal verde desde la imagen RGB. A partir de
estos resultados, las mediciones realizadas de desvanecimiento fluorescente en el presente
trabajo, fueron realizadas mediante la correlación de los tres canales de color RGB, el cual
no requiere ningún procesamiento adicional (Fig. 19).
Figura 19. Descomposición de canales RGB en perfiles de desvanecimiento fluorescente.
EZT, espermatozoides de tilapia. EZR, espermatozoides de abulón rojo. ERT, eritrocitos
de tilapia. ERTr, eritrocitos de trucha arco iris.
69
5. 8. 2. La relación entre el desvanecimiento DAPI-fluorescente y el tamaño genómico
Los perfiles de desvanecimiento de fluorescencia fueron usados para estimar el área bajo la
curva mediante una función de integración o integral de desvanecimiento (ecuación 1). Para
verificar la hipótesis, que la integral de desvanecimiento (ID) era función del tamaño
genómico de una célula, se estimaron los valores de ID en espermatozoides y eritrocitos de
tilapia Mozambica. El valor estimado para espermatozoides ID = 2266.51, mostró ser
equivalente a la mitad del valor obtenido para eritrocitos ID = 4521.44. Esta relación
representa los valores de tamaños genómicos haploide y diploide para O. mossambicus
(Fig. 20).
Figura 20. Relación de integral de desvanecimiento fluorescente (ID) con el contenido
genómico haploide y diploide en eritrocitos de tilapia Mozambica.
70
Los valores medios de ID para cada especie utilizada en el presente estudio como
referencia se muestran en la Tabla VII.
Tabla VII. Valor medio y desviación estándar de ID para las especies de valor-C conocido.
Especie
Tipo celular
n
Valor ID
O. mossambicus
espermatozoide
362
2229.4 ± 99.9
O. mossambicus
eritrocito
244
4495.3 ± 83.8
O. mykiss
eritrocito
721
15205.2 ± 47.9
H. rufescens
espermatozoide
264
5312.8 ± 114.8
H. rufescens
hemocito
371
11667.1 ± 117.9
H. fulgens
espermatozoide
374
4972.3 ± 130.4
H. fulgens
hemocito
214
10592.1 ± 157.2
H. corrugata
espermatozoide
399
6404.1 ± 129.5
H. corrugata
hemocito
239
12953.2 ± 289.9
Con el objetivo de estimar la variabilidad de los valores de ID en un tipo celular
específico y de esta forma calcular el tamaño muestreal necesario para obtener un valor
representativo de ID. Una aproximación gráfica, fue desarrollada para estimar el número de
núcleos en el cual los descriptores se estabilizan. De esta forma se generaron números
aleatorios para ordenar los valores y graficarlos. Esto minimizó el efecto del campo sobre el
punto de estabilización del valor ID. De este modo, el punto de estabilización fue
representativo del tamaño muestreal. El análisis fue realizado para cada uno de las especies
y tipos celulares estudiados. La figura 21 muestra gráficamente la dispersión del promedio
ID a medida que se incrementa el número de núcleos espermáticos en abulones. Del mismo
modo, el análisis de la dispersión de la varianza mostró ser estable después de los 100
núcleos medidos. (Fig. 22).
71
Figura 21. Estimación de la media de la integral de desvanecimiento (ID) en
espermatozoides de tres especies de abulones. EZR; abulón rojo. EZAZ; abulón azul.
EZAM; abulón amarillo.
72
Figura 22. Estimación de la varianza
de la integral de desvanecimiento (ID) en
espermatozoides de tres especies de abulones. EZR; abulón rojo. EZAZ; abulón azul.
EZAM; abulón amarillo.
73
De acuerdo a los resultados obtenidos mediante la medición de ID en los distintos tipos
celulares, se procedió a ajustar dichos datos a un modelo lineal junto con los valores de
tamaño genómico descritos para dichas especies. A partir del modelo se estimaron los
descriptores α y β, con los cuales se determinó la ecuación de la recta:
yˆ = 3337.2 xˆ + 596.8
(2)
donde x̂ e ŷ representan los valores de tamaño genómico e integral de desvanecimiento
(ID) respectivamente. El valor de correlación obtenido para la relación entre ID y tamaño
genómico fue de r = 0.99 (Fig. 23).
Figura 23. Modelo lineal entre tamaño genómico e integral de desvanecimiento.
Espermatozoides: EZ, de tilapia; EZR, de abulón rojo; EZAZ, de abulón azul; EZAM, de
abulón amarillo. Hemocitos: HemAZ, de abulón rojo; Heme, de abulón rojo; HemAM,
de abulón amarillo. Eritrocitos: ERT, de tilapia; ERTr, de trucha arco iris.
74
Para estimar los intervalos de confianza al 95% se determinó la esperanza matemática (Ε )
mediante un análisis de Fisher, donde Ε (r ) = ϕ , Ε (αˆ ) = α y Ε ( βˆ ) = β (Tabla VIII).
Tabla VIII. Intervalos de confianza (95%) de α , β y ϕ calculado en sobre el modelo
lineal.
-95%
Parámetros
+95%
3321. 8
≤
α
≤
3358. 5
581. 4
≤
β
≤
805. 8
0.596
≤
ϕ
≤
0.999
En referencia a la aplicación del modelo lineal (ecuación 2) para calcular tamaño genómico
en muestras problema, se obtuvo la siguiente ecuación:
(
)
⎡ IDu + βˆ ⎤
ADNu = ⎢
⎥
αˆ
⎣
⎦
( 3)
donde ADNu = valor de tamaño genómico desconocido y IDu = valor medio de ID
()
obtenido para la muestra. Los valores (α̂ ) y β̂ representan los valores de pendiente de la
recta e intercepto, los cuales a su vez integran la variación del modelo lineal al incrementar
el número tipos celulares medidos. De esta forma, la ecuación de la recta podría cambiar a
medida que se aumenta el número de puntos, ajustándose cada vez más al valor real de
intercepto y pendiente. Sin embargo, al calcular los intervalos de confianza se puede
considerar que la ecuación tendrá un comportamiento lineal dentro de los límites de la
esperanza matemática (E) calculada en la tabla VIII. Adicionalmente, ésta ecuación es
válida únicamente para el intervalo de tamaño genómico 0.81 ≤ ADNu ≤ 4.8 pg.
75
V. 9. Contenido de ADN cromosómico en abulón rojo del Pacífico Haliotis rufescens
Con la finalidad de determinar la intensidad de fluorescencia en cromosomas teñidos con
DAPI se obtuvo la información de brillo en imágenes de 8 bits, esto permitió convertir las
imágenes digitales en pseudocolor para visualizar y cuantificar la intensidad de
fluorescencia mediante 256 niveles de brillo (Fig. 24).
Figura 24. a) Imagen original de placa metafásica teñida con DAPI. b) Imagen digital
convertida en pseudocolor o en 256 niveles de brillo.
En el presente estudio se utilizó el método de desvanecimiento fluorescente con la
finalidad de estimar contenido de ADN cromosómico en abulón rojo H. rufescens. El
procedimiento para obtener la medición de fluorescencia a partir de ADN cromosómico se
muestra en la figura 25. El primer paso fue identificar y clasificar según el cariotipo de H.
rufescens, cada cromosoma capturado a través de mediciones digitales (Fig. 25a). Las
imágenes fluorescentes fueron transformadas a pseudocolor en 256 niveles de brillo (Fig.
25b). Con la finalidad de discriminar el trasfondo de la imagen, se generó una máscara
binaria capaz de detectar el borde cromosómico (Fig. 25c). Finalmente, la aplicación de la
76
máscara sobre la imagen en pseudocolor (multiplicación entre (b) y (c)) permitió
discriminar la información de brillo proveniente del ADN cromosómico (Fig. 25d).
Figura 25. Procedimiento de análisis de ADN cromosómico fluorescente. a) Mediciones
cromosómicas, b) Imagen en pseudocolor, c) Máscara binaria para detección de borde, d)
Región de ADN cromosómico de interés obtenido por multiplicación entre (b) y (c).
Para demostrar el desvanecimiento fluorescente en un solo cromosoma, la figura 26
muestra una secuencia de imágenes desde la exposición inicial a luz ultravioleta hasta la
pérdida total de fluorescencia. Del mismo modo, se obtuvo la curva de desvanecimiento
mediante la aplicación de la ecuación 1. La figura 27 muestra la curva de desvanecimiento
del cromosoma 16 de H. rufescens.
77
Figura 26. Secuencia de desvanecimiento fluorescente en cromosoma 16 de H. rufescens.
Figura 27. Curva desvanecimiento fluorescente en cromosoma 16 de H. rufescens.
78
Mediante la aplicación del modelo lineal obtenido en la ecuación 3 se determinó el
contenido de ADN para cada tipo cromosómico de H. rufescens (Tabla IX). Los valores
mayores de contenido de ADN cromosómico fueron encontrados en el par cromosómico 1,
mientras que la cantidad menor de ADN fue encontrada en el par cromosómico 18.
Tabla IX. Contenido de ADN en cromosomas de Haliotis rufescens y su conversión a
Mega pares de base (Mpb).
1
Contenido medio de
ADN (pg)
0.1106
Desviación
estándar (pg)
0.0045
108,201
2
0.1051
0.0098
102,752
3
0.1035
0.0053
101,175
4
0.1010
0.0093
98,824
5
0.0999
0.0077
97,655
6
0.0976
0.0072
95,490
7
0.0997
0.0089
97,474
8
0.0982
0.0099
96,087
9
0.0994
0.0063
97,243
10
0.1006
0.0094
98,393
11
0.0975
0.0104
95,319
12
0.0979
0.0085
95,757
13
0.0969
0.0075
94,784
14
0.0958
0.0087
93,690
15
0.0934
0.0090
91,355
16
0.0939
0.0076
91,825
17
0.0917
0.0077
89,640
18
0.0890
0.0060
87,056
Total
1.7717
0.0050
1,732,720
Cromosoma
Mpb*
* Número de pares de base = masa en pg x 0.978x109 (Dolezel et al., 2003).
79
El análisis de varianza realizado para detectar los efectos de variabilidad del contenido
de ADN en cromosomas de Haliotis rufescens, mostró diferencias significativas entre los
tipos cromosómicos (p<0.001). No obstante, un análisis a posteriori mediante una prueba
de Tukey, mostró diferencias estadísticas sólo entre los cromosomas extremos,
específicamente entre los cromosomas 1 - 4 y cromosomas 13 -18 (p<0.05). El contenido
medio de ADN mostró un incremento significativo desde el cromosoma 18 al par
cromosómico 1 (p<0.001) (Fig. 28). La mayor variabilidad de contenidos de ADN fue
observada entre los cromosomas 2, 4, 8, 11 y 15.
Figura 28. Contenido medio de ADN en cromosomas de H. rufescens (n=18). Las barras
representan dos desviaciones estándar.
80
La correlación entre el contenido de ADN cromosómico y el tamaño cromosómico fue
probada mediante la medición tanto de longitud como el área cromosómica. El valor de
correlación encontrado fue estadísticamente significativo (p<0.001) para la relación
ADN/longitud (r = 0.8783) (Fig. 29) y ADN/área (r = 0.9066) (Fig. 30). Sin embargo, este
aumento en el valor de correlación no fue estadísticamente significativo (p>0.05).
Figura 29. Correlación entre contenido de ADN cromosómico y longitud cromosómica
en H. rufescens. Los números representan el par cromosómico según el cariotipo. Líneas
discontinuas representan el error estándar del modelo.
81
Figura 30. Correlación entre contenido de ADN cromosómico y área cromosómica en
H. rufescens. Los números representan el par cromosómico según el cariotipo. Líneas
discontinuas representan el error estándar del modelo.
Con el propósito de determinar el contenido de pares de base de cada cromosoma, se
asumió que el número de pares de base (pb) es equivalente a la masa en picogramos (pg) x
0.978x109 pb (Dolezel et al., 2003). Adicionalmente, la cantidad total de contenido de ADN
cromosómico obtenido por la suma de todos los valores cromosómicos fue equivalente al
tamaño genómico de H. rufescens, 1.7717 ± 0.0050 pg o 1,732,724 convertidos en Mega
pares de bases (Mpb).
82
V. 10. Estimación de tamaño genómico en dos poblaciones de Argopecten purpuratus
5. 10. 1. Mediciones morfológicas
La longitud media de concha fue registrada en 7.69 ± 1.290 y 6.97 ±0.481 cm para las
poblaciones de Tongoy y Arica respectivamente, mientras que la razones alc/lc fue 1.063 ±
0.027 y 1.064 ± 0.021, y las razones anc/lc fueron 0.339 ±0.019 y 0.443 ± 0.023,
respectivamente. El análisis estadístico no mostró diferencias significativas entre las medias
de longitud de concha (t(17)=2.03, p=0.058) o entre las medias de la razones anc/lc (t(28)= 0.12, p=0.90) para ambas poblaciones. No obstante, la media de las razones alc/lc de la
población de Tongoy fue estadísticamente menor que la población de Arica (t(28)= -13.50,
p<0.0001).
5. 10. 2. Análisis de tamaño genómico mediante desvanecimiento fluorescente
La población de Arica mostró un mínimo de tamaño genómico o valor-C de 0.932 pg y un
máximo de 1.179 pg de ADN. El número total de núcleos medidos fue de 5,628. La
variación individual (desviación estándar) fue menor que 0.32 pg de ADN en todos los
organismos muestreados. La población de Tongoy en cambio, mostró un tamaño genómico
mínimo de 1.044 pg de ADN y un máximo valor de 1.285 pg de ADN en 7,538 núcleos
medidos. La variación individual fue entre 0.105 pg y 0.397 pg (Tabla X).
83
Tabla X. Medición de tamaños genómicos en dos poblaciones de A. purpuratus mediante
análisis de imágenes fluorescentes (n=15 individuos).
*Valores medio
Ejemplares de
Arica
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Total
Número de
núcleos
420
168
387
116
194
601
930
595
370
457
257
379
333
223
188
5,628
Ejemplares de
Tongoy
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Total
Número de
núcleos
463
446
135
427
654
485
942
396
555
450
486
502
662
515
420
7,538
Valor-C
1.106
1.023
1.053
1.063
1.120
1.088
1.103
1.043
0.932
1.094
1.016
0.994
1.078
1.179
1.089
1.057*
Valor-C
1.164
1.084
1.082
1.201
1.044
1.197
1.261
1.106
1.231
1.198
1.070
1.285
1.093
1.141
1.106
1.139*
Desviación
estándar
0.177
0.094
0.319
0.130
0.156
0.093
0.148
0.249
0.121
0.150
0.319
0.259
0.148
0.314
0.172
0.057*
Desviación
estándar
0.284
0.181
0.105
0.389
0.243
0.173
0.300
0.171
0.285
0.267
0.172
0.397
0.210
0.216
0.177
0.066*
84
La variación inter-individuos (n=15) fue menor al 6% para ambas poblaciones
(coeficiente de variación). Mientras que la variación del tamaño genómico mostró una
estabilidad tanto en media como en varianza cercana a los 1000 núcleos medidos (Fig. 31 y
Fig. 32). En este contexto, es posible obtener un valor-C representativo en un tamaño
muestreal de 150 núcleos medidos por organismo.
Figura 31. Variación de valor-C en población Arica de A. purpuratus. El valor-C fue
calculado por aproximación de desvanecimiento fluorescente en núcleos de hemocitos.
La población de Arica mostró un tamaño genómico de 1.057 ± 0.057 pg de ADN. Los
intervalos de confianza calculados al 95% fueron 1.026 ≤ valor-C ≤ 1.089 pg de ADN. La
población de Tongoy mostró un valor-C de 1.139 ± 0.066 pg de ADN. Los intervalos de
confianza calculados fueron 1.102 ≤ valor-C ≤ 1.175 pg de ADN.
85
Figura 32. Variación de valor-C en población Tongoy de A. purpuratus. El valor-C fue
calculado por aproximación de desvanecimiento fluorescente en núcleos de hemocitos.
El análisis de varianza realizado para detectar diferencias a nivel individual y
poblacional del tamaño genómico de A. purpuratus, mostró que existen diferencias
estadísticas entre ambas poblaciones (p=0.0011). De este modo, el tamaño genómico de la
población de Tongoy fue significativamente mayor comparado con organismos de la
población de Arica, 1.139 ± 0.066 pg y 1.057 ± 0.057 pg respectivamente. La contribución
de los diferentes niveles muestreales (individuos, población y error) al total de la varianza
del tamaño genómico fue analizado mediante una prueba ANOVA de dos vías anidado
(Tabla XI). La subdivisión de los porcentajes de varianza atribuidos a cada nivel mostró
que la varianza del error (variación intra-individual) representa <1% del total. De este
86
modo, la mayor parte de la variación en el tamaño genómico ocurre entre las poblaciones.
Adicionalmente, el análisis de la variación inter-individual mostró que existen diferencias
estadísticamente significativas cercanas al 6% de contenido de ADN nuclear para ambas
poblaciones.
Tabla XI. Prueba ANOVA para tamaños genómicos de dos poblaciones de A. purpuratus.
Fuente de variación
Población
Individuo (dentro de población)
Error
SC
GL
MC
F
p
15.87
59.82
739.67
1
28
12926
15.87
2.12
0.06
277.3
37.0
<0.001
<0.001
87
VI. 1. Relaciones cromosómicas entre Haliotis rufescens, H. fulgens y H. corrugata
La concepción genético-poblacional de especie se entiende como un sistema biológico
discreto e integrado de organismos reproductivamente aislados de otros sistemas de
características similares (Maynard, 1989). Dentro de los factores que llevarían a la
diferenciación de especies, la segregación espacial no constituye un requisito ineludible
para que surja el aislamiento reproductivo. Desde un punto de vista genético, los
reordenamientos cromosómicos, entre otros factores, constituyen importantes mecanismos
involucrados en el aislamiento reproductivo poscigótico, por su incidencia en la meiosis de
los eventuales híbridos (Maynard, 1989). Las inversiones pericéntricas y las
translocaciones de brazos cromosómicos, combinados con cambios como borrados y
duplicaciones en tándem de secuencias de ADN de mediana y alta repetición, así como las
88
secuencias dispersas transponibles, son reordenamientos que han sido claves en la
especiación de varios taxa de animales (Fontdevila, 1987). Estos reordenamientos, llevarían
a variaciones en la morfología cromosómica basados en cambios de la longitud relativa de
los brazos cromosómicos involucrados, así como a modificaciones en el tamaño absoluto
de los cromosomas (Bianchi et al., 1988).
La distribución simpátrica de Haliotis rufescens, H. fulgens y H. corrugata, permite
suponer la existencia de mecanismos que impiden, al menos parcialmente, el flujo génico
entre estas especies. Los mecanismos de aislamiento reproductivo pueden ser clasificados
en: pre-copulatorios (aislamiento estacional-hábitat, etológico y mecánico) y poscopulatorios (mortalidad gamética, mortalidad cigótica, inviabilidad del híbrido y
esterilidad híbrida) (Maynard, 1989). Sin embargo, estudios en poblaciones naturales de
abulones han descrito la presencia de híbridos en seis especies de abulones en la costa de
California (Owen et al., 1971). La evidencia de hibridación natural en poblaciones de
abulones fue aportada por características morfológicas intermedias y reacciones
inmunológicas. Posteriormente, Leighton y Lewis (1982) llevaron a cabo una serie de
cruzas experimentales con cuatro especies de abulones. Cruzas entre hembras de H.
rufescens y machos de H. corrugata, H. fulgens y H. sorenseni, demostraron que es
posible obtener entre un 30-60% de desarrollo embrionario en fertilizaciones efectuadas
dentro de los primeros 30 minutos posdesove. En los cruces realizados entre hembras de H.
rufescens y machos de H. fulgens se observan que las F1 y F2 son fértiles. Las mejores tasas
de crecimiento fueron encontradas en híbridos de H. rufescens x H. sorenseni y H.
rufescens x H. fulgens respectivamente. La evidencia aportada por el registro de híbridos
naturales (Owen et al., 1971), así como las cruzas experimentales, demuestra que existe una
89
estrecha relación filogenética entre las especies de haliótidos de la costa de California y
Baja California. Asimismo, las diferencias en los porcentajes de desarrollo embrionario y
supervivencia larvaria encontradas en los experimentos de cruzas (Leighton y Lewis,
1982), se pueden explicar en términos de inestabilidad cromosómica del híbrido, sin
embargo, dichos estudios no han sido realizados hasta el momento.
Las primeras evidencias de las relaciones filogenéticas en abulones de California fueron
aportadas mediante comparación de hemocianinas por Meyer (1967). El grado de
interacción inmunológica mostró que H. rufescens, H. sorenseni, H. kamtschatkana
assimilis estarían cercanamente relacionadas, mientras que H. corrugata, H. fulgens, H.
walallensis aparecen moderadamente distantes. Adicionalmente, el análisis mostró que H.
cracherodii sería una especie con una mayor diferenciación genética (Fig. 1).
Posteriormente, los análisis de secuenciación de la lisina llevados a cabo por Lee y
Vacquier (1995) y Swanson y Vacquier (1998) mostraron que H. cracherodii se encuentra
más relacionado con H. corrugata y ambos a su vez con los abulones japoneses H. gigantea
y H. discus hannai. Adicionalmente estos estudios dejaron a una distancia genética mayor a
H. fulgens en comparación con las otras especies de abulones Californianos (Fig. 2).
Recientemente, estudios realizados por Coleman y Vacquier (2002) en secuenciación de
ITS (internal transcribed spacer) de genes ribosomales de la subunidad 5.8S, mostraron que
esta última a pesar de ser altamente conservada dentro del género Haliotis y no aporta
información relevante para la reconstrucción filogenética, los ITS1 e ITS2 proveen
información de longitud y composición de base similar a la encontrada en la mayoría de los
eucariontes (Badwin, 1992). Los alineamientos de las secuencias ITS en todas las especies
de abulones de California confirma la presencia de dos principales agrupamientos. El
90
primero conformado por H. sorenseni, H, walallensis y H. rufescens y el segundo
conformado por H. corrugata y en estrecha relación con los abulones japoneses como H.
discus hannai. Las especies de H. fulgens y H. cracherodii aparecen filogenéticamente más
distantes con respecto a los agrupamientos anteriores. En este sentido, la evidencia aportada
por el presente estudio en cuanto a la comparación cromosómica en tres especies de
abulones de Baja California, es congruente con la evidencia aportada por los estudios de
secuenciación de genes, debido a que muestra que H. rufescens y H. corrugata son entre sí
más similares que cualquiera de ellas con respecto a H. fulgens. Del mismo modo, los
análisis estadísticos muestran que de los 18 pares cromosómicos que posee cada uno de los
cariotipos promedios, 8 pares son iguales en las tres especies estudiadas, 7 son propios de
H. fulgens, 3 de H rufescens, y 2 de H. corrugata. De acuerdo a Thiriot-Quiévreux (1994)
dentro de la evolución cromosómica de ciertos organismos acuáticos es frecuente encontrar
un incremento en tipos cromosómicos submetacéntricos y telocéntricos debido
principalmente a procesos de fisión cromosómica. En este sentido, el bajo número de
cromosomas propios de H. corrugata, así como un mayor número de pares metacéntricos
(10 pares) con respecto a las otras especies estudiadas demuestra una condición basal o
filogenéticamente muy cercana a los abulones japoneses como H. discus hannai.
Adicionalmente, dada la evidencia cromosómica descrita es posible ubicar a H rufescens en
una posición evolutivamente intermedia, mientras que la mayor cantidad de cromosomas
propios de H. fulgens demuestra que esta especie se encuentra filogenéticamente más
alejada y probablemente con cambios cromosómicos más recientes evolutivamente. El
análisis de similitud cromosómica o patrón de agrupamiento demuestra que H. rufescens
comparte más pares cromosómicos con H. corrugata (14 pares) con lo cual quedan unidos
91
dentro de un grupo, mientras que el menor número de cromosomas compartidos H. fulgens
(menos del 50%) deja fuera del agrupamiento al abulón azul (Fig. 15).
En referencia a la distribución biogeográfica de la familia Haliotidae, se han propuesto
tres hipótesis; modelos del borde Pacífico, Indo-Pacífico y Tethys (Geiger y Groves, 1999).
El modelo del borde Pacifico, sustenta que el origen de la familia estaría en la zona del
Noreste de Australia. En este sentido, el punto de radiación de la familia estaría relacionado
con procesos de dispersión larval provenientes desde Japón. Por otra parte, el modelo IndoPacífico describe a esta zona como centro de radiación, debido principalmente a la alta
correlación existente entre la diversidad actual de una especie y de su origen biogeográfico.
El tercer modelo denominado Tethys, sustenta la radiación de la familia desde el
Mediterráneo (mar de Tethys) hasta el Pacifico nororiental. Según este modelo, la radiación
puede ser explicada con base en el número cromosómico de las especies de abulones
actualmente descritas, el cual se incrementa desde el Mediterráneo, siendo representativo
H. tuberculata (2n = 28) (Arai y Wilkins, 1986), moviéndose hacia la región Indo-Pacífico
(2n =32) (Jarayabhand et al., 1998) y finalmente llegando hasta la región del Pacifico Norte
(2n=36) (Nakamura, 1986). No obstante, los antecedentes cariotípicos de esta última región
han sido aportados principalmente por especies distribuidas en la costa del Pacífico
occidental, mientras que el abulón negro, Haliotis cracherodii (2n=36) (Minkler, 1977), era
la única especie reportada para la costa del Pacífico oriental de Baja California. En este
contexto, la información cariotípica descrita para H. rufescens (8M+9SM+1ST), H. fulgens
(8M+8SM+2ST) y H. corrugata (10M+7SM+1ST), aporta nueva información para
haliótidos distribuidos sobre la costa de California. El número cromosómico diploide
descrito en las tres especies estudiadas (2n=36), corrobora una condición conservada entre
92
las especies de abulones del Pacífico Norte. Con lo cual el presente estudio aporta nuevos
antecedentes para sustentar el modelo de Tethys en cuanto a la distribución biogeográfica
de la familia Haliotidae.
VI. 2. Desarrollo de citogenética molecular en moluscos: aplicación en abulones de Baja
California
En las últimas décadas, los estudios citogenéticos realizados en moluscos marinos están
viviendo un desarrollo muy rápido debido a la introducción de nuevas técnicas moleculares.
Así, las técnicas clásicas de bandeo han ido completándose con otras más precisas de
caracterización y localización de secuencias o regiones cromosómicas. Sin embargo, a
pesar de esta revolución técnica, el estudio de especies de las que se tiene un
desconocimiento citogenético casi absoluto, hace imprescindible el uso de todo tipo de
herramientas para una mejor aproximación al conocimiento cromosómico de estas especies.
Así, por ejemplo, en la década de los 80s, los trabajos en moluscos se limitaban al
cariotipo, análisis de la aneuploidía (Thiriot-Quiévreux, 1984), bandeos G y C y algunos
análisis de regiones organizadoras del nucleolo (NORs) (Thiriot-Quiévreux y Ayraud,
1982; Dixon et al., 1986). En la década de los 90s, el número de especies a las que se
aplicaron estas técnicas aumentaron (Thiriot-Quiévreux y Insua, 1992) y las técnicas usadas
se ampliaron a otras como las técnicas de bandeo de restricción y el uso de fluorocromos,
que junto a las de bandeo C permitieron analizar, entre otras, secuencias heterocromáticas
presentes en los cromosomas (Martínez-Lage et al., 1994). Sin embargo, no fue sino hasta
finales de los 90s, cuando aparecen los primeros trabajos moleculares usando FISH de
93
genes ribosómicos en moluscos con interés comercial como los mejillones del género
Mytilus (Insua y Méndez, 1998) y en ostiones del género Crassostrea (Zhang et al., 1999b),
junto con análisis descriptivos de las Ag-NOR y bandeo G (Leitao et al., 1999) en C.
angulata. A partir del año 2000, el número de especies de moluscos que se analizaron con
FISH aumentó: Donax trunculus (Plohl et al., 2002), Oxynoe olivacea (Vitturi et al.,
2000b), Fasciolaria lignaria (Vitturi et al., 2000a), Melarhaphe neritoides (Colomba et al.,
2002) y en C. angulata aparecen trabajos de variabilidad de Ag-NOR y los primeros
resultados de FISH con genes ribosómicos (Cross et al., 2003).
Para la localización de los genes ribosómicos las técnicas que se emplean son varias.
Por un lado la de impregnación argéntica (AgNOR) que detecta las NOR que han estado
activos en la interfase anterior a la metafase en estudio. Sin embargo, a pesar de la utilidad
de esta técnica, se puede subestimar la existencia de otras regiones con genes ribosómicos y
por ello se utiliza la tinción con CMA3 que detecta las secuencias ricas en G-C asociadas a
los NOR. Esta técnica permite ver cambios estructurales como variaciones en el número de
copias de estos genes. Por último, el uso de sondas ribosómicas en las hibridaciones in situ
de fluorescencia, permiten localizar con precisión los genes que codifican para las
subunidades 18S-5.8S-28S que forman los NORs. La mayoría de los trabajos realizados en
moluscos se han centrado en los bivalvos, principalmente en los que tienen mayor valor
comercial. Así los NORs se ha localizado mediante FISH en varias especies de ostiones,
mejillones y almejas (Martínez-Expósito et al., 1997; Insua et al., 1999; Zhang et al.,
1999b; Xu et al., 2001; Cross et al., 2003; Wang et al., 2004).
En referencia a abulones y en nuestro conocimiento, sólo existe un estudio de
localización de NOR mediante impregnación argéntica en el abulón japonés H. discus
94
hannai (Okumura et al., 1999). Dicho estudio, localiza terminalmente a los NOR en los
brazos largos de dos pares cromosómicos. Sin embargo, la localización específica mostró
ser altamente variable entre cromosomas metacéntricos así en como submetacéntricos.
Estos resultados pueden deberse a que las Ag-NOR sólo pueden ser observadas en estados
transcripcionalmente activos. La tinción de plata sólo es capaz de teñir a las NOR cuando
estás se expresan durante la última interfase, debido a que la plata se une a un complejo
ácido proteico asociado con el nucléolo y ARN (Jordan, 1987). Adicionalmente, la
utilización de FISH permite identificar específicamente todos los clusters del gen
ribosómico, independientemente de su estado transcripcional. En este contexto, el presente
estudio en abulones es el primero en describir la localización física de los genes que
codifican las subunidades mayores ribosómicas (18S-5.8S-28S) mediante la aplicación de
FISH. De acuerdo a nuestros resultados dicho gen fue localizado en las regiones
teloméricas de los brazos largos en dos pares cromosómicos submetacéntricos. En H.
rufescens las principales señales de hibridación de NOR se encontraron en los pares 4 y 5,
mientras que en H. fulgens y H. corrugata se observaron en los pares cromosómicos 4 -11,
y 2 - 4 respectivamente. La condición conservada del tipo cromosómico (submetacéntrico)
de los NOR y la similitud del cromosoma 4 con presencia del gen en las tres especies,
probablemente evidencie el origen filogenético común. No obstante, la presencia de
polimorfismos en la localización del gen entre cromatidas hermanas y cromosomas
homólogos fue encontrada altamente variable, así como la presencia de señales de
hibridación intersticial de baja intensidad. Este resultado puede indicar la variabilidad del
número de copias del gen en el genoma, así como sus posibles errores de síntesis durante la
replicación del ADN. En este sentido, la variabilidad de los clusters del gen también se han
95
reportado en otras especies de moluscos (Pascoe et al., 1996; Martínez-Expósito et al.,
1997; Torreiro et al., 1999; Cross et al., 2003).
Dentro de las aplicaciones de FISH, varios tipos de secuencias han resultado muy útiles
como sondas en los estudios de caracterización de la cromatina. Una de ellas es la
secuencia repetida telomérica (TTAGGG)n que se encuentra en los cromosomas de todos
los vertebrados. En invertebrados su distribución es más heterogénea. Así, se encuentra en
los cromosomas de moluscos como Crassostrea gigas (Guo y Allen, 1997), Melarhaphe
neritoides (Colomba et al., 2002) y Cerethium vulgatum (Vitturi et al., 2002), pero ausente
en otras como Oxynoe olivacea (Vitturi et al., 2000b). Su estudio resulta por tanto de gran
interés para el análisis filogenético, ya que son consideradas específicas de grupos
(Blackburn, 2001). Adicionalmente, la aplicación de sondas teloméricas en el presente
estudio, demostró que esta secuencia es encontrada fundamentalmente en los telómeros de
los cromosomas de abulones, lo cual hace evidente el alto grado de conservación de esta
secuencia entre los eucariotas.
Por otro lado, la secuencia repetida GATA también se ha analizado en otros organismos
mediante FISH. La utilización de sondas GATA en el presente estudio de
abulones
permitió detectar la presencia de este microsatélite, y por tanto la presencia de secuencias
altamente repetitivas de A-T en el genoma de los organismos. No obstante, la localización
específica de este microsatélite mostró ser altamente variable. Por otro lado, esta secuencia
se ha descrito en un amplio rango de eucariota y en algunos casos se ha observado una
asociación con el sexo (Jones y Singh, 1985). Hasta el momento, en moluscos sólo se ha
estudiado en F. lignaria (Vitturi et al., 2000a) y M. neritoides (Colomba et al., 2002). El
presente estudio aporta con el registro de tres especies más.
96
Finalmente en los últimos años existe un gran interés por el estudio de la organización y
localización de los genes ADNr 5S, que forman la otra familia multigénica de los genes
ribosómicos. Los genes de ADNr 5S se agrupan en repeticiones en tandem en los que cada
repetición consiste en una región codificante muy conservada de 120 pb y un espaciador no
transcrito (NTS) de longitud y secuencia muy variable. En muchos organismos los genes
que codifican las subunidades mayores (18S-5.8S-28S) se encuentran en diferente posición
en el genoma que los del ADNr 5S (Drouin y Moniz de Sá, 1995). Sin embargo, también se
ha descrito co-localizados en el genoma mediante FISH (Drouin y Moniz de Sá, 1995;
Mandrioli et al., 2000; Martins y Galetti Jr., 2001). Todo esto, unido a la alta diferenciación
de los NTS entre especies, hace de este gen un perfecto marcador citogenético de gran
interés para los estudios evolutivos en especies relacionadas. Hasta el momento, existen
muy pocos trabajos realizados en organismos marinos, y en moluscos sólo se ha realizado
en los mejillones M. edulis y M. galloprovincialis (Insua et al., 2001), el berberecho C.
edule (Insua et al., 1999), el pectínido A. opercularis (Insua et al., 1998), el prosobranquio
M. neritoides (Colomba et al., 2002).
VI. 3. Desarrollo de un método de cuantificación de contenido de ADN genómico
mediante análisis de imágenes fluorescente
El tamaño genómico es conocido por variar considerablemente entre especies, no obstante
es relativamente constante entre individuos de una misma especie (Hancock, 2002). De este
modo, el grado de variabilidad entre las especies ha sido descrito como más de 200,000
veces entre los eucariontes (Gregory, 2001b). Sin embargo, la mayor o menor cantidad de
97
ADN no guarda ninguna relación con la complejidad del organismo. Diversas hipótesis han
sido propuestas para explicar esta variación de tamaño genómico. La teoría del gen egoísta
sugiere que la acumulación de ADN genómico a través del tiempo evolutivo puede ser
resultado del proceso de replicación celular, de esta forma el aumento de tamaño genómico
cesa cuando éste comienza a comprometer la viabilidad celular (Orgel y Crick, 1980). De
acuerdo a lo anterior, tamaños celulares mayores pueden tolerar mayor cantidad de ADN y
de esta forma influenciar en el grado de adecuación biológica de una especie a través de un
efecto nucleoesquelético (Cavalier-Smith, 1978). De esta forma, el tamaño genómico puede
ser considerado como un carácter selectivo debido a que un aumento en el tamaño celular
necesita asimismo un incremento nuclear para preservar el balance metabólico (CavalierSmith y Beaton, 1999).
Avances recientes en computación y la tecnología de análisis de imágenes han
permitido obtener estimaciones rápidas y confiables de la cantidad de ADN nuclear que
poseen diversas especies (Hardie et al., 2002). En este sentido, la densitometría mediante
análisis de imágenes ha sido ampliamente aceptada como un método preciso de
cuantificación de ADN genómico (Bertino et al., 1994) y de esta forma utilizado en la
estimación de tamaño genómico tanto en plantas como en animales (Hardie et al., 2002).
No obstante, la desventaja de esta metodología radica básicamente en dos aspectos; el
protocolo de tinción o específicamente de reacción de Feulgen y el proceso de
cuantificación. La reacción de Feulgen se ha utilizado principalmente en densitometría de
ADN debido a que la coloración obtenida en presencia de ADN obedece a una serie de
reacciones químicas, con lo cual la intensidad del color es directamente proporcional a la
cantidad de ADN contenido en un núcleo. Sin embargo, para que ocurra la reacción de
98
Feulgen se necesario producir una hidrólisis del contenido nuclear y de esta forma dejar en
contacto el reactivo de
Schiff (principal componente de la reacción) con el ADN
genómico. Las condiciones de la hidrólisis han sido realizadas tanto en un medio de ácido
débil (HCl 1N a 60°C) o en un medio ácido fuerte (HCl 5 N a 20-30°C). De esto, se puede
considerar que las condiciones de reacción son altamente variables entre protocolos y tipos
celulares estudiados, con lo cual es necesario una estandarización rigurosa tanto de los
reactivos, fijación de muestra y tiempos de hidrólisis (Schulte, 1991). En referencia al
proceso de cuantificación, la densitometría de Feulgen requiere cuantificar la absorbancia
de la luz sobre los núcleos teñidos dado que ésta es directamente proporcional a su
concentración. Sin embargo, la medición de absorbancia es relativamente compleja, por lo
cual debe ser estimada indirectamente a través de la transmitancia. En este sentido, la
transmitancia representa la luz incidente que no es alterada por algún medio capaz de
absorberla. La problemática de esta aproximación, es que la captura digital desprecia los
fenómenos intrínsicos de la luz como son reflexión y refracción. De este modo, la luz que
pasa a través de una muestra siempre será afectada por partículas, suciedad, edad de la
muestra, tipos celulares, etc.
En el campo de la microscopía de fluorescencia, el retardo en el desvanecimiento de la
fluorescencia desde imágenes iniciales de alta intensidad a imágenes de mayor ruido de
fondo producto de la pérdida de fluorescencia, es uno de los factores más importantes en la
obtención de calidad fotográfica (Ono et al., 2001). Dentro de la variedad de fluorocromos
existentes específicos para ADN, el DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole) es el más
ampliamente utilizado debido a su intensidad fluorescencia. Sin embargo, la fluorescencia
de DAPI se pierde rápidamente al ser expuesto a luz ultra violeta y especialmente bajo
99
condiciones optimas de observación como longitud de onda de máxima excitación y lentes
objetivos de alta apertura numérica (Johnson y Nogueira-Araujo, 1981). Por otro lado, el
proceso fotoquímico bajo el cual la fluorescencia decrece no ha sido explicado en su
totalidad, existiendo algunas teorías que sugieren procesos oxidativos y desnaturalización
de proteínas asociadas a ADN (Hirschfeld, 1979; Johnson et al., 1982). Adicionalmente,
con la finalidad de retardar el proceso de desvanecimiento se han propuesto diversos
métodos en microscopía (Ono et al., 2001), no obstante todos ellos se basan en tratar de
remover o disminuir la difusión de oxigeno de la muestra teñida con algún fluorocromo. La
idea es tratar de disminuir el proceso oxidativo del fluorocromo y de esta forma retardar la
pérdida de fluorescencia. Debido a esto, actualmente todas las observaciones fluorescentes
en microscopía utilizan medios de montaje capaces de aumentar la viscosidad de la muestra
y así retardar la difusión de oxígeno.
De acuerdo con los resultados aquí obtenidos, se encontró evidencia que el
desvanecimiento fluorescente en núcleos teñidos con DAPI es función del tiempo de
exposición a luz ultravioleta. Mediante procedimientos de análisis de imágenes fue posible
estimar el área bajo la curva de desvanecimiento y de esta forma establecer una unidad de
medida (integral de desvanecimiento, ID) de la pérdida de fluorescencia en núcleos teñidos
con DAPI. Adicionalmente, mediante la estimación de IDs en varios tipos nucleares, se
observó que dicho proceso es característico de una especie en particular o tipo celular
específico. En este sentido, el presente estudio demostró mediante la comparación de IDs
provenientes tanto de espermatozoides como de eritrocitos de tilapia Mozambica, que el
comportamiento del desvanecimiento fluorescente guarda una estrecha relación con las
cantidades de ADN nuclear haploide y diploide respectivamente. Ahora bien, si los valores
100
de ID son característicos de una especie o tipo nuclear específico, su relación con diferentes
tamaños nucleares puede ser ajustado a un modelo matemático. En este contexto, el
presente estudio determinó que existe una relación lineal entre el tamaño genómico y el
valor calculado de ID. De este modo, dado que el valor de ID medido en un tipo celular
específico es directamente proporcional con respecto al tamaño genómico, es posible
entonces estimar tamaños genómicos desconocidos mediante la aplicación de la ecuación
lineal propuesta en el presente trabajo doctoral.
VI. 4. Contenido de ADN cromosómico en abulón rojo Haliotis rufescens
Por varias décadas los cromosomas han sido analizados mediante técnicas convencionales
cariológicas, las cuales dependen de la caracterización de patrones de bandeo a lo largo de
cada cromosoma en particular. La mayor desventaja de los patrones de bandeo es la
limitada resolución en algunas especies (Langer et al., 2004). Alternativamente, análisis
cromosómicos computarizados se han aplicado principalmente en cromosomas de
mamíferos, con lo cual actualmente existen una variedad de paquetes computacionales
capaces de agilizar los análisis citogenéticos clínicos en humanos (Weierich et al., 2003).
En plantas, sistemas analizadores de imágenes cromosómicas, han permitido aplicar
procedimientos de identificación y clasificación cromosómica en una variedad de estudios
de citogenética vegetal (Fukui et al., 1998; Kato y Fukui, 1998; Lee et al., 2004).
Alternativamente, la estimación de contenidos de ADN cromosómico se ha utilizado
como una vía de identificación y mapeo cromosómico (Dolezel et al., 2004). Sin embargo,
el principal método aplicado para estimar contenido de ADN cromosómico, ha sido la
101
citometría de flujo. Dicha técnica, emplea cromosomas aislados en una suspensión con
presencia de uno o dos fluorocromos. Mediante la incidencia de un láser sobre los
cromosomas es posible obtener un registro de la cantidad de ADN a través de la
cuantificación de la fluorescencia. La desventaja de este método, es que requiere un gran
número de cromosomas en suspensión para minimizar las variaciones debidas a patrones de
condensación (Langlois et al., 1982).
Estudios citogenéticos en invertebrados y en especial en moluscos son particularmente
problemáticos debido al pequeño tamaño cromosómico. Adicionalmente, la aplicación de
citometría de flujo en cromosomas de moluscos se ve dificultada por la actual
imposibilidad de obtener líneas celulares in vitro (Rinkevich, 1999). En este contexto, el
presente estudio representa un método alternativo para estimar contenido de ADN
cromosómico en moluscos mediante análisis de imágenes fluorescentes. Nuestros
resultados, mostraron una correlación positiva (p<0.001) entre el contenido de ADN y los
respectivos tamaños cromosómicos de H. rufescens, de este modo los valores de
correlación estimados fueron superiores al 87%. Las variaciones encontradas entre el
tamaño cromosómico y la cantidad de ADN pueden ser debidas a variaciones en los
patrones de condensación cromosómica. En este sentido, según Zhang et al. (1999a) es
posible encontrar en moluscos una variación morfológica de los cromosomas de alrededor
del 9% entre diferentes placas metafásicas provenientes de distintas preparaciones y tejidos.
No obstante, a pesar de existir dicha variabilidad morfológica la suma de contenidos
individuales de ADN cromosómico (1.7717 ± 0.0050 pg), muestra una estrecha relación el
tamaño genómico descrito para H. rufescens (1.8 pg) (Hinigardner, 1974).
102
VI. 5. Estimación de tamaño genómico en dos poblaciones de Argopecten purpuratus
mediante análisis de imágenes fluorescentes
La estimación del tamaño genómico del bivalvo A. purpuratus, fue planteado inicialmente
como una aplicación directa del método propuesto de desvanecimiento fluorescente en una
especie en la cual hasta el momento no existen antecedentes de su valor-C, a pesar que han
sido descritas otras características citogenéticas como constitución cariotípica y
localización de NOR (Gajardo et al., 2002; von Brand-Skopnik y Ibarra-Humphries, 2002).
Nuestros resultados mostraron diferencias estadísticamente significativas en dos
poblaciones de A. purpuratus (p=0.0011). La población de Tongoy mostró un tamaño
genómico significativamente mayor con respecto a la población de Arica, con valores
medios de 1.139±0.066 pg y 1.057±0.057 pg de ADN respectivamente. Según Dolezel et
al. (2003), 1 pg es equivalente a 0.978 x 109 pb, de esta forma la diferencia entre ambas
poblaciones fue de 8.019 x 107 pb. Los valores encontrados de variación de tamaño
genómico a nivel inter-individual fue equivalente al 6% de contenido de ADN genómica
para ambas poblaciones. En este contexto, Rodriguez-Juiz et al. (1996) describieron una
variación significativa del contenido de ADN nuclear entre individuos de la misma especie,
así como también entre diferentes especies de bivalvos. Dicho estudio mostró que un alto
porcentaje de la variación del tamaño genómico fue localizada a nivel de especies (97%),
mientras que a nivel de individuos de la misma especie la variación encontrada fue del 7%.
Estos datos y nuestros resultados (6%) sugieren que una fracción significante del genoma
en moluscos es capaz de variar entre individuos de la misma especie sin consecuencias
fenotípicas o biológicas. Adicionalmente el valor-C descrito en el presente estudio para A.
103
purpuratus fue encontrado muy cercano a A. irradians (valor-C = 1.2 pg) y dentro del
intervalo descrito para otras especies de pectínidos.
La explicación de la variación del tamaño genómico en las dos poblaciones estudiadas
de A. purpuratus puede centrarse en diferentes aspectos de la evolución del contenido de
ADN en eucariontes. Estudios recientes en poblaciones de Drosophila han descrito
cambios en el tamaño genómico producidos por la activación de elementos transponibles
(ETs) y asociados con la incursión de los organismos en nuevos hábitats (Viera et al.,
2002). El principal cuestionamiento que emerge de este resultado es que el número de sitios
de inserción de ETs sobre las zonas de eucromatina solo contribuye con el 5 a 9% de la
variación total de tamaño genómico observada. Esto sugiere que la variación del tamaño
genómico puede ser causada por otros factores (Kidwell, 2002), así como también por la
inserción de ETs en la eucromatina. Un antecedente importante es que las poblaciones
utilizadas para estimar el tamaño genómico de A. purpuratus provinieron tanto de una
población silvestre (Arica) como de una población de cultivo (Tongoy). En este sentido es
difícil atribuir que el aumento del tamaño genómico en la población de Tongoy sea debido
a un proceso de domesticación. Sin embargo, en las últimas tres décadas esta especie de
bivalvo se han cultivado exhaustivamente en Bahía de Tongoy, Chile (Gajardo y Núñez,
1992). Probablemente, el manejo de la producción larval y el método de selección de
semilla hayan originado un proceso selectivo hacia un genotipo en particular, lo cual puede
evidenciarse por el análisis morfológico realizado en los organismos utilizados para estimar
el tamaño genómico. Dicho análisis mostró diferencias estadísticas (p<0.0001) entre la
morfología de la concha de ejemplares de Tongoy (más aplanados) y ejemplares de Arica
(menos aplanados). En referencia a estudios genéticos poblacionales en esta especie,
104
desafortunadamente se han realizado pocos estudios utilizando marcadores de ADN (von
Brand-Skopnik y Ibarra-Humphries, 2002). Sin embargo, análisis cariotípicos en
A.
purpuratus (Gajardo et al., 2002) mostraron evidencia de diferencias cromosómicas a nivel
poblacional y particularmente en 7 pares cromosómicos de los 32 pares de la especie.
Dicho estudio, utilizó dos poblaciones de cultivo y una de origen silvestre.
105
A través de la utilización de procesamiento de imágenes es posible mejorar imágenes
capturadas con presencia de ruido y bajo contraste. Su aplicación en citogenética nos
permitirá obtener mediciones más exactas sobre la morfología cromosómica al mejorar la
calidad de las imágenes.
Las observaciones cariológicas en células larvales de abulón rojo Haliotis rufescens,
abulón azul H. fulgens y abulón amarillo H. corrugata, mostraron un número diploide igual
a 36 cromosomas.
La relación de longitudes de los brazos cromosómicos fue utilizada para graficar el
cardiograma representativo para la especie. Éste indicó que el abulón rojo posee ocho pares
metacéntricos (1, 3, 6, 7, 14, 15, 17 y 18), nueve pares submetacéntricos (2, 4, 5, 8, 9, 10,
11, 12 y 13) y un par cromosómico clasificado como subtelocéntrico (16). El
carioidiograma obtenido para el abulón azul mostró que esta especie posee ocho pares
106
metacéntricos (1, 3, 6, 9, 10, 16, 17 y 18), ocho pares submetacéntricos (2, 4, 5, 7, 8, 11, 12
y 13), y dos pares de cromosomas subtelocéntricos (14 y 15). Para el abulón amarillo el
cariotipo consistió en diez pares metacéntricos (1, 3, 6, 9, 10, 11, 14, 15, 17 y 18), siete
pares submetacéntricos (2, 4, 5, 7, 8, 12 y 13), y un par de cromosomas subtelocéntricos
(16).
El uso de sondas ribosómicas a través de hibridaciones in situ de fluorescencia (FISH)
en las tres especies de abulones estudiadas, permitió la localización cromosómica de los
genes que codifican para las subunidades 18S-5.8S-28S y que forman principalmente las
NORs. Dicha sondas evidenciaron en las tres especies, dos principales clusters del gen
ribosómico localizados en las regiones teloméricas de cromosomas del tipo
submetacéntricos. Del mismo modo, las tres especies comparten un NOR localizado en el
cromosoma 4, mientras que el segundo NOR fue observado en el cromosoma 5 en abulón
rojo, cromosoma 11 en abulón y cromosoma 2 en abulón amarillo.
La aplicación de FISH mediante sondas teloméricas (TTAGGG)n y (GATA)n,
demostraron la presencia de estos tipos de secuencias en el genoma de las tres especies de
abulones estudiadas. La secuencia hexamérica fue localizada en las regiones terminales de
todos los tipos cromosómicos analizados, mientras que las secuencias microsatélites
(GATA)n fueron observadas dispersas dentro del genoma de abulones.
Los análisis estadísticos sobre la morfología cromosómica, mostraron que de los 18
pares que posee cada uno de los cariotipos promedios, 8 pares son iguales en las tres
especies estudiadas, 3 son propios de H rufescens, 7 de H. fulgens y 2 de H. corrugata. Las
relaciones cromosómicas encontradas evidencian que H. rufescens comparte 9 pares con H.
fulgens y 14 pares con H. corrugata. A la vez, H. fulgens comparte 8 pares con H.
107
corrugata. De este modo, mediante una análisis de similitud es posible inferir que H.
rufescens y H. corrugata son entre sí citogenéticamente más similares que cualquiera de
ellas con respecto a H. fulgens.
Dentro del análisis citogenético es posible incluir el estudio de las variaciones de
tamaño genómico a nivel específico y poblacional. En este sentido, el presente estudio
propone un nuevo método de estimación de tamaño genómico mediante análisis de
imágenes fluorescentes.
Los perfiles desvanecimiento ADN-DAPI en distintos tipos nucleares y por tanto
distintos tamaños genómicos demuestran que existe una disminución de la intensidad de
fluorescencia en función del tiempo de exposición a la longitud de onda de excitación del
fluorocromo (ultravioleta).
La intensidad de fluorescencia de DAPI unido a ADN es posible estimarla mediante la
conversión de imágenes fluorescentes a imágenes de 8 bits/canal o 256 niveles de brillo.
Adicionalmente, la integración de la función de desvanecimiento permite establecer una
unidad de medición de la pérdida de fluorescencia con base en el área de desvanecimiento.
Los valores de ID son función del tamaño genómico de una célula, dado que dichos
valores guardan relación entre los valores de tamaños genómicos haploide y diploide.
La dispersión de los valores ID muestra ser estable en términos de media y varianza
después de los 100 medidos por organismo.
La relación entre los valores de ID de un organismo u especie y su tamaño genómico es
estadísticamente significativa (p<0.001) y lineal (r = 0.99).
108
Mediante la aplicación de la ecuación lineal yˆ = 3337.2 xˆ + 596.8 , obtenida a través del
modelo propuesto es posible estimar tamaños genómico en otros organismos dentro del
intervalo 0.81 ≤ ADNu ≤ 4.8 pg.
Una aplicación del método de estimación de tamaño genómico mediante análisis de
imágenes fluorescentes, es la cuantificación de contenido de ADN cromosómico. De esta
forma, existe una correlación mayor a 87% entre el tamaño cromosómico y el contenido de
ADN.
El método de estimación de contenido de ADN cromosómico representa una alternativa
en la cuantificación directa de ADN en cromosomas de invertebrados, dada la
imposibilidad de aplicar procedimientos de citometría de flujo al no disponer hasta el
momento de líneas celulares in vitro.
A través de la aplicación del método de desvanecimiento fluorescente se determinó el
tamaño genómico en dos poblaciones del bivalvo Argopecten purpuratus. El valor-C
calculado para la población de Tongoy mostró un tamaño genómico significativamente
mayor (p=0.0011) con respecto a la población de Arica, con valores medios de 1.139±0.066
pg y 1.057±0.057 pg de ADN respectivamente. Los valores encontrados de variación de
tamaño genómico a nivel inter-individual fue equivalente al 6% de contenido de ADN
genómica para ambas poblaciones.
109
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