La proteína S100A9 es un nuevo ligando del receptor CD85j, y la

La proteína S100A9 es un nuevo ligando del receptor CD85j, y la interacción
S100A9/CD85j está implicada en el control de la replicación del VIH-1 por las
células asesinas naturales (NK).
Uriel Moreno-Nieves y Daniel Scott-Algara
Unité de Régulation des Infections Rétrovirales, Institut Pasteur, Paris, France
Universidad Paris 7 Diderot
1. Introducción
El virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) afecta actualmente a 34 millones de adultos
y niños en todo el mundo. En el año 2010, se estima que hubo alrededor de 2.7 millones de nuevas
infecciones y 1.8 millones de muertes ocasionadas por esta creciente epidemia. Es por eso que enfoques
innovadores para prevenir la transmisión del VIH son urgentemente necesarios.
La infección por el VIH se presenta en tres fases, identificadas por un conjunto de síntomas e
indicadores clínicos. El virus infecta principalmente los linfocitos T CD4+, que constituyen una parte
esencial del sistema inmunitario, al igual que otras células como las células dendríticas (DC),
monocitos/macrófagos, etc. Las tres fases clínicas de la infección por el VIH son: la fase aguda, que se
caracteriza por un pico de viremia y una disminución importante de la población de linfocitos T CD4+
periféricos y en los tejidos linfoides asociados a las mucosas; la fase de latencia, que tiene una duración
variable y que se caracteriza por una replicación viral crónica, una activación del sistema inmunitario
asociado con un disfuncionamiento de varios tipos de células inmunitarias; y la fase SIDA, definida por
una disminución de linfocitos T CD4+, de menos de 200/mm3 de sangre, y una carga viral importante, la
fase SIDA se caracteriza por una gran susceptibilidad a infección oportunistas (virales, bacterianas o
fúngicas) y/o a complicaciones tumorales responsables de la muerte del paciente.
El sistema inmunitario innato comprende las células y los mecanismos que defienden al hospedero
de infecciones por otros organismos, de forma no específica. Las células asesinas naturales (NK) forman
parte del sistema inmunitario innato y desempeñan un papel importante en la contención de la
replicación viral en las etapas muy tempranas de la infección, y en el desarrollo de la respuesta inmune
adaptativa mediante la interacción con otras células inmunes, incluyendo las DC y los linfocitos T
CD4+. La función de las células NK es regulada por la integración de señales inhibidoras y activadoras
generadas por un arsenal de receptores que se encuentran en la superficie de la célula; las células NK
son activadas cuando las señales de activación superan a las de inhibición.
Varios grupos han descrito alteraciones en las funciones de las células NK y en la expresión del
repertorio de receptores (conjunto de receptores expresados en la superficie de la célula) tras la
infección por el VIH. Algunos de estos cambios funcionales de las células NK han sido descritos muy
temprano durante la infección aguda, y se conoce que el disfuncionamiento en el compartimiento
persiste y aumenta durante de la fase crónica, incluso con un tratamiento antirretroviral exitoso. El papel
preciso que desempeñan las células NK durante la infección por el VIH no se conoce completamente. Se
ha demostrado que existen asociaciones genéticas entre algunos haplotipos de receptores KIR
(expresados por las células NK) y algunas moléculas HLA-I, que correlacionan con una progresión lenta
hacia el SIDA o con el control de la infección, probablemente modulando la función de las células NK
durante la infección por el VIH. Es importante destacar que existe evidencia creciente que sugiere que
las células NK pueden tener una actividad anti-VIH. Sin embargo, todavía no se entiende
completamente cómo las células NK reconocen y eliminan las células infectadas por el VIH, controlan
la replicación viral y la progresión de la enfermedad.
Nuestro equipo demostró anteriormente que las células NK CD85j+ controlan eficientemente la
replicación del VIH-1 en las DC in vitro, y que el mecanismo de control utilizado es independiente de la
citotoxicidad y necesita un contacto de célula a célula (Scott-Algara et al. PlosOne, 2008). El receptor
CD85j es un receptor inhibidor expresado por varias células del sistema inmunitario humano, y
actualmente los ligandos conocidos del receptor CD85j son las moléculas de MHC-I, así como la
proteína viral UL18. Sin embargo, nuestros experimentos sugieren que la actividad anti-VIH-1 de las
células NK CD85j+ depende específicamente de la interacción entre el receptor CD85j y un(os)
ligando(s) diferentes de las moléculas HLA-I.
2. Objetivos
Identificar el (los) ligando(s) del receptor CD85j expresados por las DC tras la infección por el VIH1 e investigar su implicación en el control de la replicación del VIH-1 en las DC y las células T CD4+
infectadas.
3. Materiales y métodos
A partir de sangre de donantes sanos se obtuvieron las células mononucleares de sangre periférica
(PBMC) por centrifugación sobre gradiente de Ficoll-Paque. Los monocitos, células NK y linfocitos T
CD4+ autólogos fueron purificados a partir de las PBMC por selección magnética. Las DC fueron
generadas a partir de los monocitos por estimulación con IL-4 y GM-CSF durante 7 días.
Se utilizaron los virus VIH/Bal R5 (VIH) y VIH/Bal R5 expresando la proteína GFP (VIH/GFP).
Para identificar el(los) ligando(s) del receptor CD85j diferentes de las moléculas HLA-I, las DC
fueron infectadas por el VIH, el receptor CD85j y las moléculas HLA-I fueron bloqueadas, las células
fueron lisadas y los lisados fueron co-inmunoprecipitados usando el receptor CD85j recombinante. Las
proteínas en la fracción eluida fueron analizadas por SELDI-TOF-MS, electroforesis en condiciones no
desnaturantes, secuenciadas y confirmadas por Western blot. La interacción CD85j/ligandos fue
confirmada por tests ELISA (datos no mostrados).
La expresión de los ligandos de CD85j en las DC infectadas por el VIH-1 fue analizada por
citometría de flujo. Las células fueron infectadas por el VIH/GFP y se utilizaron los anticuerpos antiS100A8, anti-S100A9 y anti-S100A8/A9 para determinar la expresión de dichas proteínas en las células
que replican o no el virus.
Las proteínas S100A8 y S100A9 monomericas y S100A9 tetramericas fueron producidas en E.coli
por empresas independientes.
La respuesta funcional de las células NK a los ligandos se determinó por la desgranulación
(expresión de CD107a en la superficie de la célula) y la producción de citoquinas (IFN-γ y TNF-α
intracelulares) después de una estimulación de 12 horas.
Para determinar el efecto de los ligandos de CD85j sobre la actividad anti-VIH-1 de las células NK,
las células NK fueron pre-estimuladas con dichas proteínas durante 12 horas y puestas en cultivo con
DC o linfocitos T CD4+ infectados por el VIH. El control de la replicación viral se estudió por
citometría de flujo analizando el porcentaje de células infectadas en el cultivo (en el caso de la infección
por VIH se determinó el porcentaje de células p24+, y en el caso de la infección por VIH/GFP se
determinó el porcentaje de células GFP+) y también se estudió la producción viral en el sobrenadando
por test ELISA p24, en los días 7 y 10 post-infección.
4. Resultados
Para determinar los ligandos del receptor CD85j, distintos de las moléculas HLA-I, expresados por
las DC tras la infección por el VIH, las DC fueron infectadas por el VIH y dos días después de la
infección el receptor CD85j y las moléculas HLA-I fueron bloqueadas y las DC fueron lisadas.
Utilizando una proteína recombinante CD85j se co-inmunoprecipitó las proteínas que interactúan con
CD85j, dichas proteínas fueron analizadas por espectrometría de masa, electroforesis en condiciones no
desnaturantes, secuenciadas y confirmadas por Western blot. Se determinó que el receptor CD85j
interactúa con dos proteínas endógenas de la familia S100: las proteínas S100A8 y S100A9, al igual que
con sus formas multiméricas. Los monómeros de S100A8, los monómeros y tetrámeros de S100A9
fueron producidos en E. coli por una empresa independiente, y se confirmó la interacción entre el
receptor CD85j y las tres proteínas por test ELISA (datos no mostrados). Se observó que el receptor
CD85j tiene una mayor afinidad por las proteínas S100A9 (monómero y tetrámero) comparado con la
proteína S100A8.
La expresión de S100A8, S100A9 y el complejo proteico S100A8/S100A9 fue analizada en las DC
tras la infección por el VIH. Se utilizó el virus VIH/GFP para poder caracterizar las células que replican
el virus. Se observó que la infección de las DC por el VIH-1 induce una modulación de la expresión de
las proteínas S100 en la superficie de las células, y que dicha modulación es diferente según la proteína
analizada. La expresión de la proteína S100A8 y del complejo S100A8/A9 disminuye tras la infección
mientras que la expresión de la proteína S100A9 aumenta. También se observó que la expresión de
S100A9 es restringida a las DC que no replican el virus.
Del punto de vista funcional, se quiso determinar si los ligandos del receptor CD85j modulan la
capacidad secretoria o lítica de las células NK. Para esto, las células NK fueron estimuladas por los
ligandos durante 12 horas y se analizó la producción de IFN-γ y TNF-α intracelular y la expresión de
CD107a, que es un marcador de desgranulación. Se observó que los tetrámeros S100A9 inducen una
producción de TNF-α sin aumento de la capacidad de desgranulación. Sin embargo, aunque los
monómeros S100A9 no inducen un aumento inmediato de la producción de TNF-α tras la estimulación,
se observa que si las células NK son estimuladas una segunda vez (con células tumorales) las células
NK son capaces de producir grandes cantidades de TNF-α comparado con el control.
Los resultados anteriores de nuestro laboratorio muestran que la población de células NK CD85j+
controla la replicación del VIH en las DC y que dicho control necesita la interacción del receptor CD85j.
Habiendo encontrado que CD85j interactúa con la proteína S100A9, quisimos determinar si la
estimulación de las células NK con esta proteína, sea en forma monomérica o tetramerica, induce un
mejor control de la infección VIH de células autólogas. La pre-incubación de las células NK con los
monómeros S100A9 inducen un leve aumento de la supresión de la replicación del VIH-1 en las DC
infectadas, pero no es significativo. Por el contrario, la pre-incubación de las células NK con los
tetrámeros S100A9 estimula la actividad supresiva de la replicación del VIH-1 en los linfocitos T CD4+
infectados.
5. Conclusión
En nuestros experimentos, hemos demostrado que el receptor inhibidor CD85j interactúa con la
proteína endógena S100A9, y que la expresión de esta proteína aumenta durante la infección de las DC
por el VIH. La estimulación de las células NK por S100A9 induce la producción de la citoquina proinflamatoria TNF-α sin modificar la capacidad lítica. Finalmente, observamos que cuando las células
NK son estimuladas con los tetrámeros de S100A9, las células NK controlan mejor la replicación del
VIH en los linfocitos T CD4+.
De esta manera, es posible que la interacción del receptor inhibidor CD85j de las células NK con la
proteína S100A9 pueda estar implicada en el establecimiento y/o la regulación de la respuesta específica
anti-VIH-1 de las células NK.