Glucosa tetrasaca´ rido como biomarcador diagno´ stico de la

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Med Clin (Barc). 2013;141(3):106–110
www.elsevier.es/medicinaclinica
Original breve
Glucosa tetrasacárido como biomarcador diagnóstico de la enfermedad de Pompe:
estudio en 35 pacientes
Joaquı́n Bobillo Lobato a, Pilar Durán Parejo a, Pedro Tejero Dı́ez b y Luis M. Jiménez Jiménez a,*
a
b
Servicio de Bioquı´mica Clı´nica, Hospital Universitario Virgen del Rocı´o, Sevilla, España
Bio-Rad Laboratories S.A., Diagnostics Group, El Prat de Llobregat, Barcelona, España
I N F O R M A C I Ó N D E L A R T Í C U L O
R E S U M E N
Historia del artı´culo:
Recibido el 19 de septiembre de 2012
Aceptado el 7 de febrero de 2013
On-line el 5 de junio de 2013
Fundamento y objetivos: La enfermedad de Pompe es un trastorno originado por la deficiencia de la
enzima alfa glucosidasa ácida (GAA). En esta afección se produce un acúmulo de glucógeno lisosomal en
diferentes tejidos, estando especialmente implicados los músculos esquelético y cardı́aco. El diagnóstico
de confirmación se realiza mediante identificación del déficit de GAA. Existen, además, otros
biomarcadores diagnósticos secundarios, como la glucosa tetrasacárido (Glc4), que se muestra elevada
en orina de estos pacientes. Ası́, con este trabajo queremos poner de manifiesto la utilidad de la Glc4
como biomarcador diagnóstico para la enfermedad de Pompe en sus diferentes formas de presentación,
utilizando un método de high-performance liquid chromatography (HPLC, «cromatografı́a lı́quida de alta
resolución») con detección ultravioleta (UV) adaptado para nuestro estudio.
Pacientes y métodos: Hemos analizado un total de 75 individuos: 40 controles sanos y 35 pacientes
diagnosticados de enfermedad de Pompe. Se han recogido muestras de orina de 24 h de todos ellos y se
han determinado sus niveles de Glc4 mediante HPLC/UV.
Resultados: La evaluación de la Glc4 urinaria muestra una gran capacidad de discriminación entre
individuos sanos/enfermos. Además, los resultados obtenidos nos han permitido establecer el nivel de
decisión o punto de corte más apropiado para la identificación de los enfermos.
Coclusiones: Los niveles de Glc4 urinarios se encuentran elevados en los pacientes con enfermedad de
Pompe, y aunque se encuentran incrementados en otras dolencias, la existencia de un déficit de GAA,
junto a una clı́nica compatible, proporcionan una alta sensibilidad para el diagnóstico de esta grave
enfermedad.
ß 2012 Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.
Palabras clave:
Enfermedad de Pompe
Glucosa tetrasacárido
Biomarcador diagnóstico
Curva caracterı́stica operativa del receptor
Tetra-saccharide glucose as a diagnostic biomarker for Pompe disease: A study
with 35 patients
A B S T R A C T
Keywords:
Pompe disease
Tetra-saccharide glucose
Diagnostic biomarker
Receiver operating characteristic curve
Background and objectives: Pompe disease is a disorder originating from an acid alpha-glycosidase (AAG)
enzyme deficiency. This disease produces an accumulation of lysosomal glycogen in different tissues,
whereby the skeletal and heart muscles are especially involved. The established diagnosis is achieved
through the identification of the AAG deficiency. There are also other secondary diagnostic biomarkers,
such as tetra-saccharide glucose (Glc4), which shows high levels in the urine of these patients. In this
study it is highlighted the usefulness of Glc4 as a diagnostic biomarker for Pompe disease in its different
forms of presentation, using a high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection
(HPLC/UV) adapted to the study.
Patients and methods: A total of 75 individuals have been analyzed: 40 healthy controls and 35 patients
diagnosed with Pompe disease. Twenty-four hour samples of urine were collected from all of the
patients and their Glc4 levels were determined by means of HPLC/UV.
* Autor para correspondencia.
Correo electrónico: [email protected] (L.M. Jiménez Jiménez).
0025-7753/$ – see front matter ß 2012 Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.
http://dx.doi.org/10.1016/j.medcli.2013.02.035
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Results: The evaluation of the urinary Glc4 shows a high discrimination ability between healthy/sick
individuals. In addition, the results obtained have allowed to establish the most appropriate level of
decision or cut-off point for the identification of sick people.
Conclusions: Glc4 urinary levels are found to be high in patients suffering from Pompe disease and even
though increased levels are also found in other conditions, the existence of a AAG deficiency together
with a compatible clinical symptoms, prove very helpful for a correct diagnosis of this serious disease.
ß 2012 Elsevier España, S.L. All rights reserved.
Introducción
Pacientes y métodos
La enfermedad de Pompe (déficit de maltasa ácida o glucogenosis
tipo II) es un trastorno autosómico recesivo causado por la
deficiencia de la enzima lisosomal alfa glucosidasa ácida (GAA)1.
En esta afección se produce un acúmulo de glucógeno lisosomal en
diferentes tejidos, estando especialmente implicados los músculos
esquelético y cardı́aco. Presenta un espectro continuo de sı́ntomas
que dependen de la edad de inicio, los órganos afectados y el grado de
miopatı́a existente2. Tiene 2 formas principales de presentación: a)
forma infantil, con una rápida progresión de la enfermedad,
existencia de cardiomegalia prominente, debilidad e hipotonı́a, y
muerte debida a fallo cardiorrespiratorio durante el primer año de
vida, se trata de la forma más grave de la enfermedad, y b) forma del
adulto, constituida por un grupo heterogéneo de pacientes con inicio
desde la infancia tardı́a hasta edades adultas, con afección muscular
variable de progresión lenta y centrada en el músculo esquelético, no
incluyendo la miocardiopatı́a grave entre sus sı́ntomas.
El diagnóstico se confirma mediante ausencia (forma infantil) o
marcada reducción (forma adulta) de la actividad GAA en
diferentes muestras biológicas: fibroblastos, biopsia muscular,
leucocitos totales o linfocitos aislados3. Recientemente, la determinación de GAA en sangre seca recogida sobre papel ha supuesto
un gran avance en el diagnóstico3.
No obstante, otros biomarcadores secundarios pueden contribuir al diagnóstico de la enfermedad. Entre ellos se encuentra la
glucosa tetrasacárido (Glc4), que se eleva en la orina de los
enfermos Pompe4, y se está postulando como un parámetro
diagnóstico de gran relevancia.
La Glc4 (Glca1-6Glca1-4Glca-4Glc) es una dextrina producida
por la digestión del glucógeno y otros polı́meros de glucosa
ramificados con enlaces glucosı́dicos alfa 1-4 y alfa 1-65. Diferentes
estudios han demostrado que este tetrasacárido se encuentra
incrementado en condiciones asociadas con aumento del almacenamiento de glucógeno: glucogenosis (GSD II, GSD III, GSD VI y GSD
IX), distrofia muscular de Düchenne y otras enfermedades con
afectación muscular. De esta forma, la hipótesis predominante
en la actualidad considera que la Glc4 es producto de la
degradación intravascular del glucógeno liberado del tejido
muscular afectado en diferentes procesos patológicos5.
Ası́, en los últimos años, la Glc4 urinaria se ha ido consolidando
como un biomarcador no invasivo de gran interés para el diagnóstico
y seguimiento de los pacientes con enfermedad de Pompe, ya que
pone de manifiesto la elevación del almacenamiento muscular
de glucógeno en este trastorno6,7. Se han desarrollado diferentes
metodologı́as para la determinación de la Glc4 incluyendo
inmunoensayos, cromatografı́a de afinidad con anticuerpos especı́ficos, high-performance liquid chromatography (HPLC, «cromatografı́a lı́quida de alta resolución») con detección ultravioleta (UV) o
electroquı́mica, ultra performance liquid chromatography (UPLC,
«cromatografı́a gaseosa/lı́quida») con detección mediante espectrometrı́a de masas (MS/MS), cromatografı́a lı́quida de ultra
resolución con detección mediante espectrometrı́a de masas, etc.
Nuestro grupo tiene experiencia en la utilización de este
metabolito como parámetro analı́tico de apoyo en el diagnóstico de
enfermedad de Pompe. Con este trabajo pretendemos mostrar la
eficiencia que representa la cuantificación de este compuesto en el
diagnóstico de la enfermedad.
Sujetos y muestras
Se analizó un grupo control (n = 40) constituido por sujetos
normales con edades comprendidas entre los 2 meses de edad y los
60 años. El grupo de pacientes Pompe (n = 35) estuvo constituido
por 7 pacientes con la forma infantil clásica, 2 de presentación
infantil no-clásica y 26 pacientes de presentación en la edad adulta.
Las muestras de orina se recogieron durante un perı́odo de 24 h, y
se conservaron a -20 8C hasta la determinación analı́tica.
Preparación de las muestras
La cuantificación mediante HPLC requiere un proceso previo
de derivatización de las muestras realizado según el método de
Poulter y Burlingame modificado8. El reactivo de derivatización se
prepara como se indica a continuación:
-
N-butil-4-aminobenzoato: 54 mg.
Cianoborohidruro sódico: 47 mg.
Ácido acético: 110 ml.
Metanol: 1.760 ml.
La derivatización de muestras/calibradores se realiza del
siguiente modo:
- 50 ml de orina/calibrador.
- 10 ml de solución del estándar interno (1,2 mmol).
- 140 ml de reactivo de derivatización.
Se procede a continuación a incubar las muestras/calibradores
en termobloque a 80 8C durante 45 min, y posteriormente se
diluyen con 900 ml de una mezcla de acetonitrilo/agua (15/85 v/v).
La fase de extracción de muestras/calibradores se lleva a cabo
mediante cromatografı́a de intercambio iónico usando cartuchos
LiChrolut1 RP-18 (40-63 mm) 100 mg previamente acondicionados mediante lavados sucesivos con metanol, agua y una mezcla de
acetonitrilo/agua (15/85 v/v). Los oligosacáridos derivatizados son
eluidos finalmente mediante la adición de 1 cc de una mezcla de
acetonitrilo/agua (30/70 v/v).
El eluido está ya preparado para inyectar directamente en el
sistema de HPLC.
Análisis y cuantificación mediante cromatografı´a lı́quida de alta
resolución
Los oligosacáridos derivatizados son separados en una columna
Synergi1 4 m Hydro-RP 80A 250 4,6 mm con un flujo de 1,1 ml/min
y detección UV a 304 nm.
La fase móvil está formada por:
- Solución A: tetrabutilamonio cloruro 10 mM en acetonitrilo/agua
20/80 (v/v).
- Solución B: acetonitrilo puro.
Se utiliza una separación en gradiente lineal que deberá
pasar de 92 a 86% de la solución A respecto a la solución B en un
espacio de tiempo de 20 min.
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Las áreas de los picos de Glc4 y estándar interno (cetopentosa)
se calculan automáticamente con corrección de la lı́nea base,
usando la ratio de ambas áreas para la cuantificación de la Glc4.
se normalizaron respecto a las concentraciones de creatinina
urinaria.
La figura 1 muestra, a su vez, la descripción estadı́stica de los
resultados obtenidos agrupados según rangos de edad, debido a
que los valores de este metabolito van disminuyendo con esta9,10,
observándose esta tendencia tanto en los controles sanos como en
los individuos con enfermedad.
Para evaluar la importancia de este metabolito como biomarcador diagnóstico decidimos construir una curva ROC. Esta es una
herramienta útil que pone de manifiesto la exactitud diagnóstica y
aporta un criterio unificador en el proceso de evaluación de una
prueba. La estimación cuantitativa de esta exactitud se obtiene
mediante el cálculo del área bajo la curva ROC.
La figura 2 ejemplifica la curva ROC obtenida para los pacientes
de la forma adulta de presentación de la enfermedad.
Como hemos indicado, el área bajo la curva nos permite
cuantificar cuán buena es la capacidad de discriminación de
un biomarcador entre individuos sanos/enfermos. Además, las
Elaboración de la curva caracterı´stica operativa del receptor
Con los resultados obtenidos tras la cuantificación de los niveles
de Glc4 en las 2 poblaciones analizadas, construimos sendas curvas
receiver operating characteristic (ROC, «caracterı́sticas operativas del
receptor») utilizando el software estadı́stico IBM1 SPSS1 Statistics
20.0,0.
Resultados
Siguiendo este protocolo se calcularon las concentraciones de
Glc4 urinarias correspondientes a todos los sujetos de los grupos
control y enfermos Pompe (fig. 1). En todos los casos, los resultados
Valores de Glc4
Gl c4 (m mol/molcreeatinina)
65
60
Pacientes pompe
55
Sujetos control
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
10
20
30
40
50
60
Edad
SUJETOS CONTROL
PACIENTES POMPE
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
0a3
4 a 10
11 a 25
> 25
0a3
4 a 10
11 a 25
> 25
6
8
9
17
7
0
12
16
Media
4,14
1,67
0,64
0,79
29,54
-
16,42
6,88
D.S.
1,40
1,25
0,29
0,21
20,88
-
14,68
9,93
P5
2,15
0,84
0,32
0,43
5,66
-
1,84
0,73
P95
5,38
3,76
1,10
1,06
58,30
-
38,41
27,31
Valor
Mínimo
1,49
0,79
0,31
0,33
4,92
-
1,19
0,64
Valor
Máximo
5,53
3,96
1,22
1,15
65,63
-
46,49
37,14
Grupos
de e dad
n
Figura 1. Distribución de los valores de glucosa tetrasacárido (Glc4) tanto en la población de controles sanos como en la de pacientes con enfermedad de Pompe. Asimismo,
se muestra la descripción estadı́stica de los resultados obtenidos distribuidos en grupos según rangos de edad.
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CURVA ROC
Curva COR
1,0
Forma adulta
de la enfermedad de Pompe
Susceptibilidad
0,8
Área
bajo la
curva
0,6
0,4
Valor de corte
establecido
1,025
Sensibilidad
1-Especificidad
0,893
0,115
0,949
0,2
Sensibilidad: 89,3%
Especificidad: 88,5%
0,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1-Especificidad
Figura 2. Curva receiver operating characteristic (ROC, «caracterı́sticas operativas del receptor») para la valoración de la glucosa tetrasacárido en el diagnóstico de la forma
adulta de la enfermedad de Pompe.
coordenadas de cada uno de los puntos que componen la curva y
sus correspondientes valores de sensibilidad / 1 - especificidad
permiten establecer el nivel de decisión o punto de corte más
apropiado para la clasificación de los enfermos.
Los resultados obtenidos para la forma infantil muestran una
curva ROC de área de 0,980, y entre las coordenadas de valores
sensibilidad / 1 - especificidad, destacamos el valor de 4.925 mmol/
mol de creatinina con una sensibilidad y especificidad del 85,7%. Para
la forma del adulto obtuvimos un área de 0,949, fijando el valor
1.025 mmol/mol de creatinina como el punto de corte, con una
sensibilidad del 89,3% y una especificidad del 88,5%.
Con el fin de evaluar la repetibilidad y buen desarrollo de la
metodologı́a empleada, se realizaron mediciones por triplicado
de diferentes niveles de Glc4, obteniéndose un coeficiente de
variación siempre inferior a 1,5%, y un error porcentual siempre
inferior a 2,5%, asegurando de este modo la veracidad de los
resultados (datos no mostrados).
Discusión
Los resultados obtenidos apoyan los antecedentes existentes
que hablan de la Glc4 como biomarcador de gran utilidad para el
diagnóstico de los enfermos Pompe.
Por un lado, la curva ROC es un sistema eficaz para evaluar la
significación diagnóstica de nuestro biomarcador. El trazado de
la curva, las coordenadas de su recorrido, ası́ como el área bajo la
curva, nos proporcionan información muy valiosa.
El área bajo la curva, para ambas formas de presentación,
muestra resultados cercanos a la unidad, observándose una alta
capacidad de discriminación entre individuos sanos y enfermos.
Representando cada punto de la curva un par sensibilidad /
1 - especificidad correspondiente a un nivel de decisión determinado, fijamos para la forma infantil el valor de 4,925 mmol/mol de
creatinina (sensibilidad y especificidad = 85,7%) y para la forma
adulta 1,025 mmol/mol de creatinina (sensibilidad = 89,3% y
especificidad = 88,5%) como puntos discriminatorios.
El establecimiento de estos valores de corte tiene como
resultado la posibilidad de aparición de falsos negativos y
positivos, situación que puede observarse en la descripción
estadı́stica de nuestras poblaciones (fig. 1). Los falsos negativos
aparecen en individuos de edades más avanzadas, con formas
adultas más leves de la enfermedad y, en consonancia con ello,
mostraban también una menor excreción de Glc4. Y en relación con
los falsos positivos, hemos preferido apostar por una sensibilidad
que nos asegure que ningún verdadero positivo se pierda y quede
sin diagnosticar.
En relación con la metodologı́a, la HPLC es una técnica de alta
especificidad, observándose que para este metabolito no existen
señales interferentes en el tiempo de retención de la Glc4 a lo largo
del recorrido cromatográfico, ni en controles sanos ni en pacientes
con enfermedad.
Se trata, además, de un sistema a disposición de muchos
laboratorios clı́nicos debido a su versatilidad, alto rendimiento y
costes no excesivamente elevados, utilizado ya para la determinación de muchos metabolitos en la práctica rutinaria. Este método
puede, por tanto, incorporarse y/o adaptarse con relativa facilidad
y eficiencia a la práctica clı́nica de muchos laboratorios.
Asimismo, la reproducibilidad, estudiada mediante análisis por
triplicado de soluciones de diferentes concentraciones, muestra
coeficientes de variación y porcentajes de error óptimos que hacen
que la técnica empleada cumpla los requisitos para su uso en la
práctica clı́nica.
La metodologı́a empleada por nosotros es similar a la utilizada
por An et al.7, y nuestros resultados están en concordancia con los
publicados por este grupo, y con los obtenidos mediante otras
metodologı́as más recientes (UPLC-MS/MS)10.
Con este estudio podemos concluir que los niveles de Glc4
urinarios se encuentran elevados en los pacientes Pompe y, en
mayor medida, en los pacientes con presentación infantil de la
enfermedad, debido tanto a la mayor excreción en edades más
precoces como a la mayor gravedad de esta forma de la
enfermedad. Y aunque este oligosacárido puede, asimismo,
aparecer elevado en otras enfermedades de almacenamiento de
glucógeno, la existencia de un déficit de la enzima GAA especı́fica,
junto a una clı́nica compatible, proporcionan una alta sensibilidad
para el diagnóstico de esta grave enfermedad.
Financiación
La investigación ha sido financiada por la Fundación Genzyme
dentro del ámbito del Foro Español para el estudio de las
Enfermedades Lisosomales.
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J. Bobillo Lobato et al / Med Clin (Barc). 2013;141(3):106–110
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses,
excepto los reflejados en las filiaciones.
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