62798_Platelia Candida Ag - Bio-Rad

PLATELIA® TOXO IgM TMB
96 PRUEBAS
72751
KIT PARA LA DETECCIÓN CUALITATIVA DE LAS IgM
ANTI-TOXOPLASMA GONDII EN EL SUERO O
PLASMA HÚMANO POR LA TÉCNICA
INMUNOENZIMÁTICA
IVD
Todos los productos fabricados y comercializados por la sociedad Bio-Rad se
hallan bajo un sistema de garantía de calidad desde la recepción de las
materias primas hasta la comercialización de los productos finales.
Cada lote de producto final se somete a un control de calidad y sólo se
comercializa si está en conformidad con los criterios de aceptación.
El fabricante conserva la documentación referente a la producción y al control
de cada lote.
ÍNDICE
1-
OBJETIVO DE LA VALORACIÓN
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43
2-
INTERES CLINICO
3-
PRINCIPIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44
4-
COMPOSICION DEL KIT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45
5-
PRECAUCIONES, HIGIENE Y SEGURIDAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46
6-
MATERIAL NECESARIO, PERO NO SUMINISTRADO . . . . . . . . . . . . . .48
7-
RECONSTITUCION DE LOS REACTIVOS, VALIDEZ Y CONSERVACIÓN . .48
8-
MUESTRAS
9-
PROCEDIMIENTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .51
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50
10- ADAPTACIONES A LOS SISTEMAS
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52
11- CÁLCULOS E INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS . . . . . . . . . . . .53
12- ESPECIFICACIONES Y LIMITES DE LA PRUEBA . . . . . . . . . . . . . . . . . .55
13- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59
42
1- OBJETIVO DE LA VALORACIÓN
PLATELIA® TOXO IgM TMB es un kit de diagnóstico in-vitro que permite la
detección cualitativa de las IgM séricas dirigidas contra Toxoplasma gondii
(T. gondii).
2- INTERÉS CLÍNICO
T. gondii es un protozoario capaz de infectar a numerosas especies de
mamíferos y pájaros. Estas infecciones, habituales en el hombre y en los
animales, se desarrollan generalmente de forma inapreciable desde el
punto de vista clínico. La prevalencia de esta infección en la población,
detectada por la presencia de anticuerpos específicos en el suero, varía
en función de la región y de la edad.
En caso de una primoinfección de la madre durante el embarazo, esta
infección puede provocar graves secuelas en el feto (en especial, una
alteración de las funciones cerebrales) e incluso un aborto. La inmunidad
antigua de la madre, demostrada mediante la presencia de anticuerpos
IgG al inicio del embarazo, protege al feto de la infección por este parásito.
La segunda población sensible a esta infección está representada por los
pacientes inmunodeprimidos, como los enfermos afectados de SIDA. Estas
infecciones se deben, casi exclusivamente, a una infección a partir de un
foco parasitario (quiste) quiescente del paciente, cuya existencia es previa
a la infección por el virus HIV.
El diagnóstico de la infección toxoplásmica se confirma con la demostración
de la presencia del parásito, pero su búsqueda mediante el examen
directo es difícil, por no decir aleatorio. La serología representa la base
del diagnóstico y del seguimiento de la toxoplasmosis. La presencia de
anticuerpos específicos permite confirmar una contaminación por T. gondii; el
estudio combinado de los anticuerpos pertenecientes a diferentes isotipos
permite, generalmente, fechar la infección y orientar la terapéutica en
caso de infección reciente, o establecer medidas profilácticas adecuadas
al riesgo de aparición de una toxoplasmosis: medidas higiénico-dietéticas
en mujeres embarazadas que no presenten anticuerpos, quimiofilaxia en
los sujetos inmunodeprimidos seropositivos para T. gondii.
43
3- PRINCIPIO
El principio de esta prueba es una valoración inmunoenzimática en doble
“sandwich” con captura de los anticuerpos IgM séricos en la fase sólida
(microplaca recubierta de anticuerpo anti-cadena µ humana).El anticuerpo
monoclonal anti-T. gondii marcado con peroxidasa utilizado en esta prueba
es específico de una importante proteína de la superficie de los taquizoítos.
Esta proteína, de PM 30.000, es uno de los blancos favoritos de la
respuesta inmunitaria humoral.
1ª etapa
Los sueros control negativo, valor umbral, control positivo y muestras a
ensayar se diluyen a 1/101 y se dispensan en los pocillos de la
microplaca. Durante esta incubación, 1 hora a 37°C, las IgM presentes
en la muestra son captadas por la fase sólida. Las IgG y las otras
proteínas del suero se eliminan con los lavados que se realizan al final
de la incubación.
2ª etapa
Una mezcla de antígeno toxoplásmico (Ag T. gondii) y de anticuerpo
monoclonal anti-T. gondii marcado con peroxidasa (ACM-POD) se deposita
en todos los pocillos de la microplaca. Durante esta segunda incubación,
1 hora a 37°C, si la muestra ensayada contiene IgM anti-T. gondii, estas
IgM captadas por la fase sólida fijan el complejo (Ag T. gondii-ACM-POD).
El Ag T. gondii y el ACM-POD no fijados o en exceso se eliminan con los
lavados que se realizan al final de la incubación.
3ª etapa
La presencia del complejo inmune (fase sólida anti IgM, IgM anti-T. gondii,
Ag T.gondii, ACM-POD), se revela con la adición, en cada pocillo, de
una solución de revelado enzimático.
4ª etapa
Tras media hora de incubación a temperatura ambiente (18-30°C), la
reacción enzimática se detiene con la adición de ácido sulfúrico 1N. La
densidad óptica obtenida a 450/620 nm es proporcional a la cantidad
de IgM anti-T. gondii.
La lectura de los resultados en densidad óptica respecto a un valor
umbral permite confirmar o rechazar la presencia de anticuerpos de
clase IgM anti-T. gondii.
44
4- COMPOSICIÓN DEL KIT
Todos los reactivos están destinados para uso exclusivo de diagnóstico in
vitro.
Etiquetado
R1 Microplate
NATURALEZA DE LOS REACTIVOS
Microplaca :
12 tiras de 8 pocillos divisibles sensibilizados con
los anticuerpos anti-cadena µ humana.
Presentación
1 placa
R2
Concentrated Solución de lavado concentrada (10x) : Tampón TRIS
Washing
NaCl pH 7,4, 1% Tween® 20. Concentrado 10 veces.
Solution
Conservante : 0,01% Thimerosal.
1 frasco
100 ml
R3
Negative
Control
Control no reactivo : Tampón TRIS-NaCl (pH 8 ± 0,2),
glicerol, albúmina bovina, E 102 y E 122.
Conservante : < 0,5% Proclin®.
1 frasco
1ml
R4a
Cut-off
Control
Control Valor Umbral : Suero humano débilmente IgM
reactivo frente a los Ag de T. gondii y negativo en Ag
HBs y en anticuerpos anti-HIV1, anti-HIV2 y anti-HCV.
Conservante: < 0,01% Timerosal
1 frasco
1 ml
R4b
Positive
Control
Control positivo : Tampón TRIS-NaCl (pH 8 ± 0,2),
suero humano IgM reactivo frente a los Ag
de T. gondii y negativo en antígeno HBs y en
anticuerpos anti-HIV1, anti-HIV2 y anti-HCV,
albúmina bovina, glicerol, E 102 y E 122
Conservante: < 0,01% Timerosal y < 0,5% Proclin®
1 frasco
1 ml
R6a
Antigen
Antígeno T. gondii :
Antígeno T. gondii en forma liofilizada.
2 frascos
qs. 7 ml
R6b
Conjugate
(50x)
Conjugado : Anticuerpo monoclonal de origen
múrido anti- T. gondii (P30) marcado con peroxidasa;
se presenta en forma líquida concentrada 50 veces.
1 flacon
0,4 ml
R7
Diluent
Diluyente para muestras y conjugado, listo para usar :
TRIS-NaCl (pH 7,7 ± 0,15), albúmina bovina,
0,1% de Tween® 20 y rojo fenol.
Conservante: < 0,01 % Timerosal
2 frascos
80 ml
R8
TMB
Substrate
Buffer
Tampón sustrato : Solución de ácido cítrico
y de acetato de sodio pH 4,0 que contiene
0,015% de H2O2 y 4% de DMSO.
1 frasco
60 ml
R9
Chromogen: Cromógeno :
TMB Solution Solución que contiene tetrametil benzidina (TMB)
R10
Stopping
Solution
Solución de parada :
Solución de ácido sulfúrico 1N
Hojas adhesiva
1 frasco
5 ml
1 frasco
28 ml
4
45
5- PRECAUCIONES, HIGIENE Y SEGURIDAD
46
Precauciones
La calidad de los resultados depende del respecto de las buenas
prácticas de laboratorio siguientes:
• No utilizar reactivos después de la fecha de caducidad.
• No mezclar en uno mismo ensayo reactivos que procedan de kits con
números de lote diferentes.
NOTA : se pueden utilizar otros lotes de solución de lavado (R2,
identificada 10 x en azul sobre la etiqueta), de tampón sustrato (R8,
identificado TMB buf. en azul), de cromógeno (R9, identificado TMB sol.
en verde) y de solución de parada (R10, identificada 1N en rojo),
diferentes a los suministrados en el kit siempre y cuando se utilice un
mismo y único lote durante todo el ensayo. Estos reactivos también
pueden utilizarse con otros productos de nuestro laboratorio; contacte
con nuestros servicios técnicos para una información más detallada.
• Antes de la utilización, esperar 30 minutos para que los reactivos se
estabilicen a temperatura ambiente.
• Reconstituir cuidadosamente los reactivos evitando toda contaminación.
• No realizar la prueba en presencia de reactivos que produzcan vapores
(ácidos, alcalinos, aldehídos) o polvos que puedan alterar la actividad
enzimática del conjugado.
• Utilizar preferentemente material de uso único. En su defecto, utilizar
una cristalería perfectamente lavada y enjuagada con agua destilada.
• No dejar secar la microplaca entre el final del lavado y la distribución de
los reactivos.
• La reacción enzimática es muy sensible a todos los metales o iones
metálicos. Por tanto, ningún elemento metálico debe entrar en contacto
con las diferentes soluciones que contienen el conjugado o el sustrato.
• La solución de revelado (tampón sustrato + cromógeno) debe ser incolora.
La aparición de una coloración azul en los minutos siguientes a la
reconstitución indica que el reactivo es inutilizable y se debe sustituir.
Para esta preparación, utilizar preferentemente recipientes y material
de distribución de plástico de uso único o una cristalería previamente
lavada con ácido clorhídrico 1N y perfectamente enjuagada con agua
destilada y secada. Conservar esta preparación protegida de la luz.
• Utilizar una punta de pipeta desechable para cada suero.
• El lavado de los pocillos es una etapa esencial de la manipulación:
respetar el número de ciclos de lavado prescrito y comprobar que
todos los pocillos están completamente llenos, y después completamente
vacíos. Un mal lavado puede producir resultados incorrectos.
• No utilizar nunca el mismo recipiente para distribuir el conjugado y la
solución de revelado.
• Comprobar la exactitud de las pipetas, así como el correcto funcionamiento
de los aparatos utilizados.
• No modificar el procedimiento.
Recomendaciones de higiene y seguridad
Todos los reactivos están destinados para uso exclusivo de diagnóstico in vitro.
• Utilizar guantes de un solo uso durante la manipulación de los reactivos.
• No pipetear con la boca.
• El material de origen humano utilizado en la preparación de los
reactivos ha sido probado y encontrado no reactivo en antígeno de
superficie del virus de la hepatitis B (Ag HBs), en anticuerpos dirigidos
contra el virus de la hepatitis C (anti-HCV) y en anticuerpos dirigidos
contra el virus de inmunodeficiencia humana (anti-HIV1 y anti-HIV2).
Ningún método puede garantizar de forma absoluta la ausencia de
agentes infecciosos. Por tanto, los reactivos de origen humano, al igual
que las muestras de los pacientes, deben ser considerados y
manipulados como productos potencialmente infecciosos y respetando
las precauciones de uso.
• Considerar el material directamente en contacto con las muestras, los
reactivos de origen humano y las soluciones de lavado, como
productos contaminados.
• Evitar las salpicaduras de muestras o de soluciones que las contengan.
• Limpiar las superficies manchadas con lejía diluida al 10%. Si el líquido
contaminante es un ácido, neutralizar previamente las superficies
manchadas con bicarbonato de sosa, y después limpiar con lejía y secar
con papel absorbente. El material utilizado para la limpieza deberá
ser desechado en un contenedor especial para residuos contaminados.
• Eliminar las muestras y los reactivos de origen humano, así como el
material y los productos contaminados después de su descontaminación :
- ya sea sumergiéndolos en lejía con una concentración final del 5%
de hipoclorito de sodio durante 30 minutos,
- o bien por calentamiento en autoclave a 121°C durante 2 horas como
mínimo.
El autoclave a 121°C durante 1 hora como mínimo es el mejor método
para inactivar los virus VIH y el virus de la hepatitis B.
47
ATENCIÓN: NO INTRODUCIR EN EL AUTOCLAVE SOLUCIONES
QUE CONTENGAN HIPOCLORITO DE SODIO.
• ATENCIÓN : ciertos reactivos contienen
* ProclinTM 300 < 0,5% : PRODUCTO IRRITANTE
R43: Posibilidad de sensibilizaciÛn en contacto con la piel.
S28-37 : En caso de contacto con la piel, l·vese inmediata y
Xi-irritante abundantemente con agua y jabón. Sense guantes adecuados.
• La manipulación y la eliminación de los productos químicos deben
efectuarse según las buenas prácticas de laboratorio.
• Evitar todo contacto del tampón sustrato, del cromógeno o de la solución
de parada con la piel y las mucosas (riesgo de toxicidad, irritación y
quemaduras).
La ficha de datos de seguridad está disponible bajo petición.
6- MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Agitador tipo vortex.
Aparato de lectura* para microplacas (equipado con filtros 490/620nm).
Baño maría o incubador seco* con termostato a 37°C ± 1°C.
Contenedor para residuos contaminados.
Hipoclorito de sodio (lejía) y bicarbonato de sodio.
Agua destilada.
Probetas graduadas de 25, 50, 100 y 1.000 ml.
Guantes de un solo uso.
Gafas de protección.
Papel absorbente.
Pipetas, multipipetas, automáticas o semiautomáticas, regulables o
fijas, para distribuir de 10 a 1000 µL y 1, 2 y 10 ml.
• Sistema de lavado automático*, semiautomático* o manual para
microplacas.
• Tubos de un solo uso.
(*) Consúltenos para una información detallada sobre los aparatos
validados por nuestros servicios técnicos.
7- RECONSTITUCIÓN DE LOS REACTIVOS, VALIDEZ Y
CONSERVACIÓN
Conservar el kit a +2-8°C. Antes de abrirlo, cada elemento del kit
conservado a +2-8°C puede utilizarse hasta la fecha de caducidad
indicada en la caja.
48
Nota : antes de utilizar, dejar que los reactivos se estabilicen a temperatura
ambiente (+18-30°C).
1) Reactivos listos para usar
• Reactivo 1 (R1) : microplaca
Cada soporte marco que contiene 12 tiras de 8 pocillos divisibles está
acondicionado en una bolsa ZIP. Abrir la bolsa con unas tijeras o un
escalpelo de 0,5 a 1 cm por encima del ZIP. Sacar el marco y volver a
introducir inmediatamente en la bolsa las tiras no utilizadas. Cerrar la
bolsa cuidadosamente y volver a guardarla a +2-8°C. Las tiras así
conservadas son estables durante 1 mes.
• Reactivo 3 (R3), reactivo 4a (R4a), reactivo 4b (R4b), reactivo 10 (R10) :
Estos reactivos conservados a +2-8°C son estables hasta la fecha de
caducidad indicada en la etiqueta (incluso una vez abiertos).
2) Reactivos para reconstituir
• Reactivo 2 (R2): Solución de lavado concentrada 10 veces
Diluir 10 veces la solución en agua destilada (100 ml de R2 en 900 ml
agua destilada) para obtener la solución de lavado lista para usar.
Preparar unos 350 ml para una placa de 12 tiras con lavado manual. Tras
la dilución, la solución de lavado se conserva 2 semanas a +2-8°C. La
solución de lavado concentrada puede conservarse a +2-25°C.
• Reactivo 6a (R6a): Antígeno T. gondii
El antígeno en forma liofilizada se debe rehidratar antes de usar con 7 ml
de solución de dilución (R7). Una vez diluida, la solución antigénica (R6a
diluida) debe ser totalmente límpida (6 tiras por frasco).
ATENCIÓN : : La aparición de una turbidez importante indica que el
reactivo es inutilizable y se debe sustituir.
El antígeno T. gondii R6a diluido debe utilizarse en los 30 minutos siguientes
a su reconstitución. Si sólo se utiliza una parte de la microplaca, la
solución de Ag T. gondii R6a diluida debe almacenarse inmediatamente
a - 20°C en alícuotas de 1,1 ml por tira (el antígeno sólo puede
descongelarse una vez). De esta forma, el antígeno puede conservarse
3 meses a - 20°C.
• Reactivo 6b (R6b): Conjugado concentrado
El anticuerpo monoclonal se presenta en forma líquida, concentrado 50 veces.
Para una microplaca, diluir extemporáneamente 0,3 ml del conjugado (R6b)
en 15 ml de solución de dilución (R7). Homogeneizar bien. El conjugado
49
(R6b) diluido debe utilizarse en los 30 minutos siguientes a su reconstitución
(dividir los volúmenes por 10 para una tira).
• Solución de trabajo del conjugado: reactivo 6a diluido (R6a) + reactivo
6b diluido (R6b)
Para una microplaca entera, añadir extemporáneamente 12 ml de
conjugado diluido (R6b diluido) y 12 ml de antígeno T. gondii tras la
reconstitución (R6a diluido) (los 2 frascos).
Dividir los volúmenes por 12 para una tira.
La solución de trabajo del conjugado debe utilizarse en las 4 horas
siguientes a su reconstitución.
• Solución de revelado enzimático: reactivo 8 (R8) + reactivo 9 (R9)
Diluir 11 veces la solución de cromógeno (R9) en el tampón sustrato (R8)
(ej: 1 ml de reactivo R9 + 10 ml de reactivo R8). Tras la dilución, los
reactivos son estables 6 horas si se conservan en oscuridad a
temperatura ambiente (+18-30°C).
8- MUESTRAS
1. Las pruebas se efectúan sobre muestras de suero o de plasma
(obtenidas con anticoagulantes como EDTA, heparina y citrato)
2. Respetar las siguientes pautas para la extracción, tratamiento y
conservación de estas muestras:
• Extraer una muestra de sangre según las prácticas habituales.
• Para los sueros, dejar que el coágulo se forme completamente antes
de centrifugar.
• Conservar los tubos cerrados.
• Tras la centrifugación, separar el suero o el plasma del coágulo o
de los hematíes y conservarlo en tubo cerrado.
• Las muestras podrán conservarse a +2-8°C cuando la prueba se
realice en los 7 días siguientes.
• Para una duración de almacenamiento superior o en el caso de envíos,
las muestras se congelarán a -20°C (o a una temperatura menor).
• No congelar / descongelar las muestras más de tres veces.
• Antes de efectuar la prueba, homogeneizar (vortex) cuidadosamente
las muestras tras su descongelación.
3. Los resultados no se ven afectados en las muestras que contienen hasta
90 g/l de albúmina o 100 mg/l de bilirrubina, así como en las
muestras lipémicas que contienen el equivalente a 36 g/l de trioleína
50
(triglicérido) o en las muestras hemolizadas que contienen hasta 10
g/l de hemoglobina.
4. No calentar las muestras.
9- PROCEDIMIENTO
Seguir estrictamente el protocolo propuesto.
Utilizar los estándares en cada preparación de la prueba para validar la
calidad de esta última. Aplicar las buenas prácticas de laboratorio.
1. Establecer cuidadosamente el plan de distribución e identificación de
las muestras.
2. Preparar la solución de lavado diluida (R2) (ver apartado 7).
3. Sacar el marco soporte y las tiras (R1) del embalaje protector.
4. Lavar una vez todos los pocillos de la microplaca con la solución R2
diluida. Secar la placa dándole la vuelta sobre una hoja de papel
absorbente.
5. Diluir las muestras a ensayar y los estándares a 1/101: 10 µl de suero
+ 1 ml de diluyente R7. Homogeneizar bien (vortex)
6. Para la realización manual de la prueba, distribuir los estándares y las
muestras diluidas según el siguiente esquema:
- Pocillo A1:
200 µl de control no reactivo (R3)
- Pocillo B1:
200 µl de control Valor-Umbral (R4a)
- Pocillo C1:
200 µl de control Valor-Umbral (R4a)
- Pocillo D1:
200 µl de control positivo (R4b)
- Pocillos E1, F1, G1, H1:
200 µl de muestras diluidas.
7. Cuando sea posible, cubrir la microplaca con una película autoadhesiva
apretando bien toda la superficie para garantizar la estanqueidad.
Incubar la microplaca en el baño maría con termostato o en un
incubador seco de microplacas durante 1 hora ± 5 minutos a 37 ± 1°C.
8. Antes de que finalice la primera incubación, preparar las soluciones
de antígeno T. gondii (R6a) diluida y de conjugado (R6b) diluida
necesarias para la reacción, y a continuación la solución de trabajo
del conjugado, reactivo 6a diluido (R6ad) + reactivo 6b diluido
(R6bd); para una microplaca completa, 12 ml de conjugado diluido a
1/50 (R6b diluido y 12 ml de antígeno T. gondii (R6a) diluido (los
2 frascos). Dividir los valores entre 12 para una tira. Homogeneizar
bien (ver apartado 7).
51
9. Al finalizar la primera incubación, retirar la película adhesiva, aspirar
el contenido de todos los pocillos en un contenedor para residuos
contaminados (que contenga hipoclorito de sodio) y realizar 3
lavados. Secar la placa dándole la vuelta sobre una hoja de papel
absorbente. Si se utiliza un lavador automático, respetar el mismo
ciclo operativo (ver apartado 10).
10.Distribuir 200 µl de la solución de trabajo de conjugado en todos los
pocillos. Agitar esta solución antes de usar.
11.Cuando sea posible, cubrir con una película autoadhesiva nueva e
incubar la microplaca en el baño maría con termostato o en un
incubador seco de microplacas durante 1 hora ± 5 minutos a 37 ± 1°C.
12. Al finalizar la segunda incubación, retirar la película adhesiva,
aspirar el contenido de todos los pocillos en un contenedor para
residuos contaminados y realizar 4 lavados. Secar la placa dándole la
vuelta sobre una hoja de papel absorbente. Si se utiliza un lavador
automático, respetar el mismo ciclo operativo.
13.Distribuir rápidamente en todos los pocillos 200 µl de la solución de
revelado enzimático (R8 + R9) previamente preparada. Dejar que la
reacción se desarrolle en la oscuridad durante 30 minutos a
temperatura ambiente (18 a 30°C). Durante esta incubación, no
utilizar película adhesiva.
14.Añadir 100 µl de solución de parada (R10) manteniendo la misma
secuencia y el mismo ritmo de distribución que para la solución de
revelado.
15.Limpiar cuidadosamente la parte inferior de las placas. Leer la
densidad óptica a 450/620 nm con un lector de placas en los
30 minutos siguientes a la parada de la reacción. Las tiras siempre
deben conservarse protegidas de la luz antes de la lectura.
16.Antes de transcribir los resultados, comprobar la concordancia entre la
lectura y el plan de distribución y de identificación de las placas y de
las muestras.
10- ADAPTACIONES A LOS SISTEMAS
• Lavado :
Siga estrictamente los procedimientos de lavado descritos para
obtener el máximo rendimiento de la prueba.
- Procedimiento de lavado con LP35 :
Tras encender el LP35, validar la opción parámetro lavado. Elegir un
número de ensayo entre 1 y 20, y validar. Elegir el procedimiento de
52
base 086 y, a continuación, el modo placa. Una vez efectuados los
ajustes, el lavador vuelve al modo lavado.
- Otros instrumentos de lavado : póngase en contacto con nuestra
empresa para obtener información sobre las adaptaciones y los
procedimientos especiales.
• Lectura : el conjunto de cálculos, validación del ensayo e interpretación
del resultado para cada muestra en función de la densidad óptica se
realiza automáticamente con los espectrofotómetros lectores de
microplacas equipados con filtros de 450 y 620 nm que comercializamos.
• Otros instrumentos :
Póngase en contacto con nuestra empresa para obtener información sobre
las adaptaciones y los procedimientos especiales.
11- CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
1) Validación del ensayo
Análisis de los resultados obtenidos con los controles en cada microplaca
para cada ensayo. Para validar la manipulación, deben respetarse los
siguientes criterios:
• Valores de las densidades ópticas :
- DO R3 ≤ 0,100
- DO R4b ≥ 1,000
• Relaciones :
- DO R4a / DO R3 ≥ 3
- DO R4b / DO R4a ≥ 1,8
Si estas especificaciones no se cumplen, repetir la manipulación desde el
principio.
2) Cálculos de la densidad óptica valor umbral, de la relación
y del índice de fijación de la muestra
• La densidad óptica valor-umbral DOMR4a corresponde a la media de
las densidades ópticas del suero valor umbral R4a.
• Le resultado también puede expresarse utilizando la siguiente relación:
- Relación-Muestra = DO Muestra / DOMR4a
• Si la densidad óptica de la muestra es superior a la densidad óptica
valor umbral DOMR4a, el resultado también se puede expresar como
índice de fijación:
- Índice de fijación del suero =
. (DO muestra - DOMR4a)/(DO R4b - DOMR4a)*10
53
3) Interpretación de los resultados
Respecto a la
densidad óptica Valor-Umbral
En relación
muestra
D.O. muestra < DOMR4a x 0,80
Relac. muestra < 0,8
D.O. muestra ≥ DOMR4a x 0,80
D.O. muestra < DOMR4a
Relac. Muestra ≥ 0,8
Relac. muestra < 1
D.O. muestra ≥ DOMR4a
Relac. Muestra ≥ 1
Resultado
Suero
negativo
Suero
dudoso
Suero
positivo
Interpretación /
Recomendaciones
No hay primoinfección por
T. gondii probable
Resultados a confirmar:
- con un nuevo ensayo unos 10 – 20
días después del 1º control
- con el estudio cuantitativo de las IgG
Resultados a confirmar :
- con un nuevo ensayo unos 10 – 20
días después del 1º control
- con el estudio cuantitativo de las IgG
El índice de fijación permite un enfoque semicuantitativo de los resultados
procedentes de 2 sueros del mismo paciente. Un índice de fijación que
se encuentre entre 0 y 1 corresponde a un suero positivo límite.
• Límites del procedimiento :
El diagnóstico de una infección reciente por el parásito se basa en un
conjunto de datos clínicos y biológicos, por lo que el resultado de una
única valoración no constituye una prueba suficiente para el diagnóstico
de una infección reciente. Sólo el conjunto de datos clínicos y serológicos
(aumento significativo del título de las IgG anti-T. gondii procedentes
de 2 sueros del mismo paciente obtenidos con un intervalo mínimo de
3 semanas y ensayados durante una misma valoración (kit Platelia® Toxo
IgG TMB) y presencia de IgM anti-T. gondii con un valor significativo)
permite el diagnóstico de una infección reciente por el parásito.
• La sola presencia de IgM anti-T.gondii no permite confirmar una
infección reciente en evolución, puesto que estas IgM pueden persistir
durante muchos meses, e incluso años, tras la infección. La presencia
de IgM obliga, por una parte, a realizar el estudio cuantitativo de las
IgG anti-T. gondii y, por otra, seguir la evolución de la respuesta de
los anticuerpos anti-T. gondii de un paciente al menos con una segunda
toma de muestra realizada 10 - 20 días después.
• Si la obtención de la muestra se realiza demasiado pronto durante una
primoinfección debutante, puede que no se encuentren anticuerpos
IgM anti-T. gondii. En caso de duda, debe efectuarse una nueva toma
15 días más tarde y deberá repetirse la búsqueda de las IgM.
54
4) Causas de error
El origen de las reacciones no validadas o no reproducibles, con frecuencia
se encuentra relacionado con las siguientes causas:
• Lavado insuficiente de las microplacas.
• Contaminación de las muestras negativas con un suero o un plasma
que contenga un título alto de anticuerpos.
• Contaminación puntual de la solución de revelado por agentes
químicos oxidantes (lejía, iones metálicos...)
• Contaminación puntual de la solución de parada.
5) Ejemplos de resultados obtenidos con PLATELIA® TOXO IgM TMB
Nota : : Los datos siguientes sólo se incluyen como ejemplo y no deben
utilizarse en vez de los obtenidos por el usuario.
• Tabla de resultados
Sueros y
controles
R3
R4a
R4a
R4b
Suero n° 1
Suero n° 2
Suero n° 3
DO medida a
450 nm - 620 nm
0,028
0,691
0,700
1,494
0,109
1,096
2,096
Relación
Índice de fijación
de la muestra
de la muestra
0,15
1,57
3,01
5,0
17,5
Resultado
Negativo
Positivo
Positivo
• Validación del ensayo obtenido :
- Valor de las densidades ópticas :
. DO R3 ≤ 0,100
. DO R4b ≥ 1,000
- Relaciones :
. DO R4a / DO R3 ≥ 3
. DO R4b / DO R4a ≥ 1,8
• Cálculo de la DO valor-umbral :
. DOMR4a =
12- ESPECIFICACIONES Y LÍMITES DE LA PRUEBA
Los estudios se han realizado con muestras obtenidas en tubos secos, tubos
con suero separador (SST) o con activador de coagulación, o en plasmas
obtenidos con anticoagulantes (EDTA, Heparina, Citrato).
55
1. Especificaciones
Las especificaciones de Platelia® Toxo IgM TMB, resumidas a continuación,
se han establecido en 2 centros diferentes utilizando las muestras de
suero recién obtenido procedentes de mujeres embarazadas o de
pacientes inmunodeprimidos, así como muestras de sueros congeladas
negativas y positivas.
• Estudios comparativos
Los estudios se han realizado comparando Platelia® Toxo IgM TMB con
otra prueba EIA comercializada. Se determinó la concordancia relativa,
la especificidad relativa y la sensibilidad relativa en los sueros recién
obtenidos, contabilizándose las muestras dudosas como positivas.
Platelia® Toxo IgM TMB
Resultado Negativo Dudoso Positivo
Otra prueba EIA Negativo
556
1
8
Dudoso
2
1
5
Positivo
4
0
30
Total
562
2
43
Especificidad relativa
Sensibilidad relativa
Concordancia relativa
Dudoso
Total
565
8
34
607
Resultados del estudio prospectivo
557/562
99,1%
(97,8 – 99,7)
41/45
91,1%
(77,9 – 97,1)
587/607
96,7%
(95,28 – 98,13)
2/607
0,33%
• Estudios de especificidad
La especificidad de la prueba Platelia® Toxo IgM TMB se evaluó en
2 centros independientes. La prueba Toxo IgM ELISA utilizada para la
caracterización previa de las muestras está comercializada. Se utiliza
una prueba de aglutinación como 3ª técnica para resolver los resultados
discordantes, contabilizándose las muestras dudosas como positivas.
Los resultados de especificidad son:
- centro 1 :
100%
(263/263)
- centro 2 :
100%
(557/557)
Total :
100%
(820/820)
56
• Estudios de sensibilidad :
La sensibilidad de la prueba Platelia® Toxo IgM TMB se evaluó en
2 centros independientes. La prueba Toxo IgM ELISA utilizada para la
caracterización previa de las muestras está comercializada. Se utiliza
una prueba de aglutinación como 3ª técnica para resolver resultados
discordantes. Las muestras dudosas se contabilizan como positivas. Los
resultados de sensibilidad son:
- centro 1 : 100 %
(80/80)
- centro 2 : 100%
(100/100)
Total :
100%
(180/180)
Los paneles de seroconversiones o de seguimiento de infección correspondientes a:
• 97 muestras (centro 1)
• 48 muestras de 14 pacientes (centro 2)
se han ensayado con Platelia® Toxo IgM TMB. La sensibilidad es del
100% en esta población.
• Prevalencia
La prevalencia de respuesta positiva para los anticuerpos específicos de
tipo IgM contra T. gondii (7,4%) se determinó en 607 sueros recién
obtenidos procedentes de una población de mujeres embarazadas y de
inmunodeprimidos.
HISTOGRAMA DE REPARTICIÓN
Estudio prospectivo con 607 sueros
600
487
Frecuencia
500
Platelia® Toxo IgM TMB
Test EIA
363
400
300
171
200
100
48
0
[
,1
[0
-0
,1
[0
-0
[
,2
,2
[0
4 4
13 19
-0
[
,3
,3
[0
-0
[
,4
,4
[0
6 6
[
,5
-0
,5
[0
1 3
2 8
[
,8
-0
,8
[0
[
,7
-0
,7
[0
1 3
[
,8
-0
2 7
05
[
[
,9
,8
[0
-0
,9
[0
-1
43 18
>
1
Relación Suero /Cut Off
57
2. Precisión
• Repetibilidad intra-ensayo : Se ensayan 3 muestras positivas y 1 negativa
30 veces en la misma serie. Los coeficientes de variación obtenidos en
los sueros positivos son inferiores a 2%.
Muestra
Media
DS
CV %
Negativa
0,06
0,01
11,23
Positiva 1
1,17
0,02
1,51
Positiva 2
1,81
0,03
1,74
Positiva 3
2,92
0,03
1,15
• Reproducibilidad inter-ensayos : Se ensayan 3 muestras positivas y
1 negativa por triplicado, 5 días diferentes por 2 técnicos distintos. Los
coeficientes de variación obtenidos en los sueros positivos son inferiores
a 3%.
Muestra
Media
DS
CV %
Negativa
0,06
0,01
10,92
Positiva 1
1,19
0,027
2,28
Positiva 2
1,83
0,05
2,98
Positiva 3
2,96
0,08
2,78
3. Reactividad cruzada
239 muestras positivas para marcadores susceptibles de provocar
reacciones cruzadas :
Muestra / Marcador
HIV
EBV IgM
EBV IgG
HSV IgM
HSV IgG
VZV IgG
VZV IgM
Sarampión IgM
Sarampión IgG
Paperas IgM
Paperas IgG
Rubéola IgM
Rubéola IgG
CMV IgM
CMV IgG
Factores reumatoides
HAMA
Auto-anticuerpos (ANA)
Mieloma
Total
58
Número
63
9
10
10
10
10
10
10
10
8
10
5
5
5
5
37
2
10
10
239
Muestras Reactivas
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1-
REFERENCES
1.
ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. The diagnosis of toxoplasmosis. Southern
Med. J. 1975; 68, 1433-1443
2.
BELANGER F., DEROUIN F., GRANGEOT-KEROS L., MEYER L. and the
HEMOCO and SEROCO Study Groups. Incidence and risk factors of toxoplasmosis in
a cohort of Human immuno-deficiency virus-infected patients (1988-1995). Clinical
Infectious Diseases 1999; 28, 575-581
3.
BULLOCK S.L., and WALLS, K.W. Evaluation of some of the parameters of the
enzyme-linked immunospecific assay. J. Inf. Dis. (Suppl.) 136: 2, S279-S285
4.
DAFFOS, FORESTIER F., CAPELLA-PAVLOVSKY M., THULLIEZ P., AUFRANT
C., VALENTI D. and COX L. Prenatal management of 746 pregnancies at risk for
congenital toxoplasmosis. New Eng. J. Med. 1988; 318, 271-275
5.
DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L’AULNOIS
D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C.,
DUHAMEL M. and CAPRON A. Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of
congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, 310-315
6.
DEROUIN F., LEPORT C., PUEYO S., MORLAT P., LETRILLART B., CHENE G.,
ECOBICHON J.L., LUFT B., AUBERTIN J., HAFNER R., VILDE J.L.SALAMON R.
and ANRS 005/ACTG 154 Trial Group. Predictive value of Toxoplasma gondii
antibody titres on the occurrence of toxoplasmic encephalitis in HIV-infected
patients.AIDS 1996; 10, 1521-1527
7.
DESMONTS G., COUVREUR J., THULLIEZ Ph., SAINT JOIGNY G. and COLIN J.
Sérodiagnostic de la Toxoplasmose, des méthodes simples, pour des questions précises.
Le concours médical 1985; 107-03, 227-234
8.
DUBEY J.P. and BEATTIE C.P. Toxoplasmosis of animal and man. CRC Press (1988)
9.
JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW
A., ESKILD A. and ENG J. Incidence of Toxoplasma gondii infection in 35 940
pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin.
Microbiol. 1998; 36, 2900-2906
10. JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. Development of specific immunoglobulins
G, M, and A following Toxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway
and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2907-2913
11. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G. Improved Diagnosis of
primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of antiToxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol. 1997 ; 35, 1972-1977
12. LAPPALAINEN M., KOSKELA P., KOSKINIEMI M., AMMALA P., HILESMAA
V., TERAMO K., RAIVIO K.O., REMINGTON J.S., HEDMAN K. Toxoplasmosis
acquired during pregnancy: improved serodiagnosis based on avidity of IgG. J. Infect.
Dis. 1993; 41, 155-158
13.
LECOLIER B. and PUCHEU. Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of
toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, 2 155-158
14. LEBECH M., JOYNSON D.H.M., SEITZ H.M. THULLIEZ P., GILBERT R.E.,
DUTTON G.N., OVLISEN B. and PETERSEN E. Classification system and case
definition of Toxoplasma gondii infection in immunocompetent pregnant women and
their congenitally infected offspring. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, 799-805
15. LUFT B.J. and REMINGTON J.S. Toxoplasmic encephalitis. Clinical Infectious
Diseases 1992; 15, 211-222
16. NAESSENS A., HEUNINCKX W., FOULON W. and LAUWERS S. Evaluation of
seven commercially available enzyme immunoassays for immunoglobulin G and M
antibody detection of Toxoplasma gondii. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 258-262
17. PETITHORY J.C., REITER-OWONA I., BERTHELOT F., MILGRAM M., DE LOYE
J. and PETERSEN E. Performance of European laboratories testing serum samples for
Toxoplasma gondii. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, 45-49
18. REMINGTON J.S. and DESMONTS G. Toxoplasmosis in infectious disease of the
fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co.,
Philadelphia 1976; 191-332
19. SABIN A.B., and FELDMAN H.A. Dyes as microchemical indicators of a new
immunity phenomenon affecting a protozoan parasite (Toxoplasma), Science 1948; 108:
660 – 663
20. SANTORO F., AFCHAIN D., PIERCE J.R., CESBRON J.Y., OVLAQUE G. and
CAPRON A. Serodiagnosis of Toxoplasma infection using a purified parasite protein
P30. Clin. Exp. Immunol. 1885; 62, 262-269
21. SHARMA S.D., MULLENAX J., ARAUJO F.G., ERLICH H.A. and REMINGTON
J.S. Western Blot analysis of the antigens of Toxoplasma gondii recognized by human
IgM and IgG antibodies. J. Immunol. 1983; 131: 977-983
22.
SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P.,
SLIZEWICZ B. and DEROUIN F. Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with
acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody
response by ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3,
63-69
23. SULZER A.J. and HALL EC. Indirect fluorescent antibody tests for parasitic diseases :
IV Statistical study of variation in the indirect fluorescent antibody (IFA) test for
toxoplasmosis. Amer. J. Epidemiol. 1967; 86: 401-407
24. WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D.
and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group Evaluation of six
commercial kits for detection of human immunoglobulin M. antibodies to Toxoplasma
gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, 3112-3115
25.
WONG S.Y. and REMINGTON J.S. Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7,
299-316
RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO
1. Ajustar la temperatura del incubador con termostato a 37±1°C.
2. Diluir a 1/11 el cromógeno R9 en el sustrato R8 (solución de revelado:
R8+R9).
3. Diluir la solución de lavado R2 a 1/10 (R2d).
4. Lavar todos los pocillos 1 vez con la solución de lavado diluida (R2d).
5. Diluir los controles y la muestras a 1/101 con R7.
6. Distribuir los controles y las muestras diluidas a 1/101 en los pocillos
de la siguiente forma:
A
B
C
D
E
F
G
H
1
2
R3
R4a
R4a
R4b
E1
E2
E3
E4
E5
E6
E7
E8
E9
E10
E11
E12
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
7. Incubar durante 1 hora a 37°C.
8. Preparar las soluciones de antígeno T. gondii diluida (R6a) y de
conjugado diluido (R6b), y a continuación la solución de trabajo del
conjugado, reactivo 6a diluido (R6ad) + reactivo 6b diluido (R6bd).
9. Aspirar y lavar 3 veces con la solución de lavado diluida (R2d).
10.Distribuir 200 µl de solución de conjugado (R6ad+R6bd) en todos los
pocillos.
11.Incubar durante 1 hora a 37°C.
12.Aspirar y lavar 4 veces con la solución de lavado diluida (R2d).
13.Distribuir 200 µl de solución de revelado (R8+R9) en todos los
pocillos.
14.Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (+18-30°C)
protegido de la luz.
15.Distribuir 100 µl de solución de parada (R10) en todos los pocillos.
16.Leer las absorbancias en el espectrofotómetro a 450/620 nm.
60
- CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)
- Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic
in vitro)
- Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro)
- EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika)
- Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro)
- Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico
in vitro)
- CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik)
- CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik)
IVD
- For in vitro diagnostic use
- Pour diagnostic in vitro
- Para diagnóstico in vitro
- In vitro-Diagnostikum
- Per uso diagnostico in vitro
- Para uso em diagnóstico in vitro
- In vitro diagnostik
- In vitro diagnose
- Manufacturer
- Fabricant
- Fabricante
- Hersteller
- Produttore
- Fabricante
- Tillverkad av
- Fremstillet af
LOT
EC REP
- Batch code
- Code du lot
- Código de lote
- Chargen-Bezeichnung
- Codice del lotto
- Código do lote
- Batch nr.
- Batchkoden
- Storage temperature limitation
- Limites de températures de stockage
- Temperatura limite
- Lagerungstemperatur
- Limiti di temperatura di conservazione
- Limites de temperatura de armazenamento
- Temperaturbegränsning
- Temperaturbegrænsning
162
REF
- Catalogue number
- Référence catalogue
- Número de catálogo
- Bestellnummer
- Numero di catalogo
- Número de catálogo
- Katalognummer
- Katalognummer
- Authorised Representative
- Représentant agréé
- Representante autorizado
- Bevollmächtigter
- Distributore autorizzato
- Representante Autorizado
- Auktoriserad representant
- Autoriseret repræsentant
- Expiry date YYYY/MM/DD
- Date de peremption AAAA/MM/JJ
- Estable hasta AAAA/MM/DD
- Verwendbar bis JJJJ/MM/TT
- Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG
- Data de expiração AAAA/MM/DD
- Utgångsdatum År/Månad/Dag
- Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD
i
- Consult Instruction for use
- Consulter le mode d'emploi
- Consulte la instrucción para el uso
- Siehe Gebrauchsanweisung
- Consultare le istruzioni per uso
- Consulte o folheto informativo
- Se instruktionsanvisning vid användning
- Se instruktion før brug
The other languages which are required in conformity to the European
Directive can be obtained from your local Bio-Rad agent.
Les autres langues requises par la Directive Européenne sont disponibles
auprès de votre représentant Bio-Rad local.
Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la Directiva
Europea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad.
Die anderen Sprachen, die in Übereinstimmung mit der europäischen IVD
Direktive benötigt werden, erhalten Sie über Ihre lokale Bio-Rad
Niederlassung.
Le altre lingue che sono richieste in conformità con le Direttive Europee
possono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad.
As restantes línguas, obrigatórias em conformidade com a Directiva
Europeia, podem ser obtidas através da subsidiária Bio-Rad mais próxima
de si.
Övriga språk som krävs i enlighet med EG-direktivet kan erhållas från din
lokala Bio-Rad-representant.
De øvrige sprog som kræves i henhold til EU direktiv kan fås ved
henvendelse til den lokale Bio-Rad leverandør.
163