METODOS DE IONIZACION Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 1 METODOS DE IONIZACION TÉCNICAS DE IONIZACIÓN EN FASE GASEOSA TÉCNICAS DE IONIZACIÓN EN FASE CONDENSADA TÉCNICAS DE IONIZACIÓN EN FASE LÍQUIDA A PRESIÓN ATM. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 2 METODOS DE IONIZACION TÉCNICAS DE IONIZACIÓN EN FASE CONDENSADA Técnica Proyectil TD Desorción térmica (calor) DEI Desorción por Ionización por electrones electrones DCI Desorción por Ionización Química iones de gas reactivo FD Desorción por el campo campo eléctrico PDMS Desorción por plasma iones pesados (MeV) SIMS EM de iones secundarios iones acelerados (keV) LD Desorción por láser luz (fotones) LSIMS E M en fase líq. de iones secundarios iones acelerados (keV) FAB Bombardeo por átomos rápidos átomos acelerados (keV) MALDI Desorción por láser asistida por matriz luz (fotones) DESI Desorción por electrospray (electrospray) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 3 Métodos de ionización Desorción por EI / Desorción por CI Son en realidad una modificación en la introducción de muestra de EI / CI Requisitos -Muestra sobre el haz de electrones o plasma de iones -Calefacción rápida -Evaporación sobre una superficie inerte Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 4 Métodos de ionización Desorción por EI / Desorción por CI DEI / DCI Espectro DCI de manitol (gas reactivo agua) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 5 Métodos de ionización Desorción por EI / Desorción por CI (DEI / DCI) (M+H)+ Espectro DCIFacultad de adenosina (gasy reactivo amoníaco) de Ciencias Exactas Naturales UBA 6 Métodos de ionización Desorción por EI / Desorción por CI (DEI / DCI) Espectro DCI de N-palmitoil dihidrolactocerebrósido Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 7 Métodos de ionización Desorción por EI / Desorción por CI DEI / DCI Ventajas Ln k - La muestra se calienta a menor temperatura - Método simple - Útil para mono hasta tetrasacáridos y péptidos pequeños Descompos. Vaporiz. Desventajas 1/T - Los espectros observados resultan de varios fenómenos - No es muy reproducible (varía con T y la posición del tip) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 8 Métodos de ionización Desorción por campo eléctrico FD Similar a FI salvo que la muestra recubre el emisor Efecto túnel por influencia de un campo eléctrico elevado (108 V / cm) En estas condiciones, la energía requerida para la desorción de un ion es menor que la necesaria para la evaporación de la sustancia neutra Si la muestra esta cationizada, los iones pueden extraerse a menor campo que para efecto túnel Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 9 Métodos de ionización Desorción por campo eléctrico Probe emitter Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 10 Métodos de ionización Desorción por campo eléctrico Introducción de muestra - Directa (en solución) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 11 Métodos de ionización Desorción por campo eléctrico Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 12 Métodos de ionización Desorción por campo eléctrico Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 13 Métodos de ionización Desorción por campo eléctrico . Comparación de espectros EI, CI y FD de clorotrifenilmetano . Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 14 Métodos de ionización Desorción por campo eléctrico Características de la muestra/técnica Más suave que FI -Es necesario solubilidad en algún sv volátil -Polaridad baja a alta -Acepta sales (evitar sales inorgánicas que dañan el emitter) -PM: 1 a 2500 u -No produce fragmentaciones (útil para PM) Sensibilidad: 104 < EI (103 < CI) Tipo de analito Modo positivo Dominante// raro Modo negativo Baja polaridad M+. // [M+H]+ M2+ [2M]+. - Polaridad media M+. [M+H]+ // [M+Cat]+ M2+ [2M+H]+ [2M+Cat]+ - Alta polaridad [M+H]+ [M+Cat]+ [2M+H]+ [2M+Cat]+ // M+. M2+ [M-H]- // [M+An]- iónico K+A- + // [KA]+. K+ [Kden+A n-1] Exactas Facultad Ciencias y Naturales UBA A- [An+Kn-1]- 15 Métodos de ionización Desorción por plasma 252Cf PDMS Técnica de bombardeo con proyectiles de alta energía (MeV) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 16 Métodos de ionización Desorción por plasma 252Cf PDMS Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 17 METODOS DE IONIZACION TÉCNICAS DE IONIZACIÓN EN FASE CONDENSADA Técnica Proyectil TD Desorción térmica (calor) DEI Desorción por Ionización por electrones electrones DCI Desorción por Ionización Química iones de gas reactivo FD Desorción por el campo campo eléctrico PDMS Desorción por plasma iones pesados (MeV) SIMS EM de iones secundarios iones acelerados (keV) LD Desorción por láser luz (fotones) LSIMS E M en fase líq. de iones secundarios iones acelerados (keV) FAB Bombardeo por átomos rápidos átomos acelerados (keV) MALDI Desorción por láser asistida por matriz luz (fotones) DESI Desorción por electrospray (electrospray) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 18 Métodos de ionización Espectrometría de masa de iones secundarios SIMS Proyectiles: átomos o iones (KeV) FAB SIMS LSIMS (FIB) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 19 Métodos de ionización Espectrometría de masa de iones secundarios SIMS ¨sputtering¨ + + + Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 20 Métodos de ionización SIMS Cs + Xe+, Cs+ ip: potencial incidente del haz primario dp: profundidad del haz tm: tiempo de observación del haz secundario Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 21 Métodos de ionización Espectrometría de masa de iones secundarios SIMS 174 Muestreo directo de un hongo por SIMS, mostrando la presencia del alcaloide muscarina Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 22 Métodos de ionización Bombardeo por átomos rápidos (cañón FAB) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 23 Métodos de ionización Bombardeo por átomos rápidos muestra iones secundarios Diagrama de un cañon de FAB Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 24 Métodos de ionización /LSIMS Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 25 Métodos de ionización FAB/LSIMS Ionización Transferencia de carga, fragmentación al azar, reacciones ion-molécula Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 26 Métodos de ionización Mecanismo de formación de iones por FAB Modelo cámara de burbujas Impacto del haz primario cascada de colisiones e- secundarios núcleo de burbuja de vapor Crecimiento de la burbuja Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Kosevich et al. RCM (2003) 17, 1781-1792 UBA 27 Métodos de ionización Mecanismo de formación de iones por FAB Modelo cámara de burbujas La burbuja llega a la superficie La burbuja se desintegra liberando su contenido gaseoso Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Kosevich et al. RCM (2003) 17, 1781-1792 UBA 28 Métodos de ionización Mecanismo de formación de iones por FAB vacío selvedge superficie Disociaciones unimoleculares extracción analizador Desorción vibracional___________se rompen uniones intermoleculares débiles C0,+, A0,+, M0 Reacciones simples_____________formación o disociación rápida de uniones (C +M)+ Ionización_____________________ M +., M-. C: catión, A: anión, M: molécula no iónica Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Método unificado para SIMS y otros métodos de desorción-ionización29 UBA Métodos de ionización LSIMS / FAB (y SIMS molecular) Procesos de formación de iones M0 (s) C+ (s) M0 (s) e- M0 (g) C+ (g) M0 (g) C+ A- M0 (s) M0 (g) M+. o M-. (M+C)+ (g) (M+A)- (g) selvedge superficie ioniz. electrónica desorción directa selvedge cationización selvedge anionización H+ (M+H)+ (g) M0 (s) M0 (g) (CmAn)+ o - (s) (CmAn)+ o - (g) C+ (s) + nS0 (l) CSn+ (g) C+ (g) + nS0 (g) CSn+ (g) CSn+ (g) C+ (g) + nS0 (g) nC (s) Cn + o – (g) M10(s) + M10(s) +H+ (2M + H)+ (g) selvedge protonación superficie desorción directa superficie solvatación selvedge cationización del sv vacío desolvatación superficie emisión de cluster M2+ (g) superficie Facultad Ciencias Exactas M: molécula, C+: catión, A-: anión, C:deát. o moléc., S:y Naturales solvente UBA 30 Métodos de ionización Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 31 Métodos de ionización LSIMS vs FAB PM 347 Cs+ vs Xe Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA (131) Xe: 2-10 keV (133) Cs: 35 keV 32 Métodos de ionización LSIMS / FAB Matrices más comunes O2N OH CH2OH HOH2C glicerol m-nitrobencilalcohol NBA OH CH2OH SH N HOH2C CH2OH HSH2C CH2SH glicerol/tioglicerol OH 3 trietanolamina TEA HO SH SH HO 1:5 ditiotreitol/ditioeritritol magic bullet Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 33 Métodos de ionización LSIMS / FAB Funciones de la matriz líquida Absorbe la energía del haz primario Mantiene una alta concentración de iones frescos en la superficie Permite utilizar mayores flujos de partículas bombardeantes Aisla las moléculas de sustrato, minimiza las reacciones intermoleculares disminuyendo las energías de la red de los sólidos iónicos permitiendo la desorción de aniones o cationes intactos. Participa en el mecanismo de formación de iones secundarios. Ayuda a cationizar por tratamiento ácido: catión [M+H]+ (y [M+C]+) Ayuda a anionizar por tratamiento básico: anión (M+H)- Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 34 Métodos de ionización LSIMS / FAB Inconvenientes Aumenta notoriamente el ruido en los espectros Ejemplo: glicerol [(C3H8O3)n + H] + m/z 93, 185, 277.... [(C3H8O3)n + Na] +; [(C3H8O3)n + H - H2O]+; [(C3H8O3)n - H] – Clusters [MH + Glicerol]+; m/z [93 + (92)x]; [91 + (92)y] + Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 35 Métodos de ionización LSIMS / FAB matrices Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 36 Métodos de ionización LSIMS / FAB matrices matriz Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 37 Métodos de ionización LSIMS / FAB Características generales que debe cumplir una matriz Debe solubilizar la muestra Debe tener baja presión de vapor Debe tener una viscosidad tal que los solutos puedan alcanzar la superficie Debe producir el menor número posible de interferencias Debe ser químicamente inerte Se pueden agregar co-solventes y/o aditivos Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 38 Métodos de ionización LSIMS / FAB Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 39 Métodos de ionización LSIMS / FAB Espectro FAB en modo positivo de vasopresina Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 40 Métodos de ionización LSIMS / FAB Espectro FAB modo positivo tetramesitilporfirina (NBA) Facultad de Cienciasde Exactas y Naturales UBA 41 Métodos de ionización LSIMS / FAB Espectro FAB modo de una mezcla de 5 péptidos Facultadpositivo de Ciencias Exactas y Naturales UBA 42 Métodos de ionización LSIMS / FAB O OH [M-H-MeOH]- O NH O O OH O [M-H]- Modo positivo Modo negativo [M+H]+ [M+K]+ Espectros LSIMS matriz glicerol Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA [M+Na]+ X 43 Métodos de ionización LSIMS / FAB Características de la muestra/técnica -Es necesario solubilidad en la matriz -Polaridad media a alta y sales (aditivos para no polares o polaridad media) -Acepta sales -PM: 300 a 5000 u (máx. 24000) -No produce muchas fragmentaciones (útil para PM y iones diagnóstico) Sensibilidad: depende la muestra Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 44 Métodos de ionización LSIMS / FAB Iones característicos Tipo de analito Modo positivo Dominante// raro Modo negativo Dominante//raro Baja polaridad M+. // [M+H]+ M-. // [M-H]- Polaridad media [M+H]+ M+. // [M+Cat]+ [M-H]- M-. Alta polaridad [M+H]+ Iónico K+A- K+ [M+Cat]+ [Kn+An-1]+ // // M+. [KA]+. [M-H]- // [M+An]M-. A- [An+Kn-1]- // [KA]-. Cat: Li, Na, K u otros metales An: Cl, Br, I, HSO4 Cualquier tipo de analito [M+H+matriz]+ Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 45 Bibliografía - Desorption Mass Spectrometry. Are SIMS and FAB the same?. Lyon P. A. (Ed.) 1985. ACS Symposium series, ACS. - Ionization Methods in Organic Mass Spectrometry. Ashcroft A. 1997. The Royal Society of Chemistry. - La espectrometría de masa en imágenes. Esteban L. 1993. ACK Editores. - Mass Spectrometry. Principles and Applications. De Hoffmann, E., Charette, J. y Stroobant, V. 1996. John Wiley & sons Ltd. - Practical Organic Mass Spectrometry. Chapman J. R. 1993. John Wiley & sons Ltd -Mass Spectrometry. JH Gross. 2004. Springer Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 46