Nuevos criterios para la valoración del potencial de

Nuevos criterios para la valoración del potencial de irritación y
sensibilización de preparados dermofarmacéuticos
Dra. Mª Pilar Vinardell Martínez-Hidalgo, Profesora Titular de Fisiología, Facultad de
Farmacia, Universitat de Barcelona, e-mail: [email protected].
Los preparados dermofarmacéuticos tienen una aplicación no sólo en la higiene y el
cuidado de la piel, si no también en aspectos relacionados con la belleza. Todos estos
preparados entran en contacto con la piel o sus anejos y en algunos casos su aplicación
puede tener efectos no deseados. Entre estos efectos se puede citar la acción irritante
provocada por el producto al ser aplicado directamente sobre la piel, el efecto
fotoirritante cuando posteriormente a su aplicación incide la luz ultravioleta del sol
provocando una irritación de la piel o bien un efecto sensibilizante debido a algunos de
los componentes del preparado, básicamente colorantes o perfumes.
Es necesario evaluar previamente el potencial riesgo de estos productos para garantizar
una seguridad total al usuario. La historia sobre la valoración del potencial de irritación
de los preparados cosméticos se inicia en los años 30, cuando se detectaron en Estados
Unidos, varios casos de ceguera provocada por máscaras para pestañas. Estos graves
incidentes llevaron a la FDA (Food and Drug Administration) a potenciar el estudio de
posibles métodos de valoración de la irritación. Como resultado de estos estudios, John
H Draize desarrolló un método para evaluar el potencial de irritación ocular y dérmica y
que se ha venido conociendo desde entonces como el método de Draize (Draize et al.
1944). Este método se publicó por primera vez en 1944 y se aceptó por la OECD como
método oficial de valoración de la irritación.
El método utiliza el conejo como animal de experimentación. Los animales son
rasurados previamente, y se les aplica el producto sobre la piel. Posteriormente se cubre
la zona tratada con una gasa y se procede al vendaje del animal para evitar que se
elimine el producto. Después de un tiempo de contacto con la piel, que puede variar en
función de la aplicación y tipo de producto, se retira el apósito y se valoran las lesiones
de la piel, en función del grado de eritema y edema provocado. La valoración es
totalmente subjetiva y da una puntuación que permite clasificar a los productos según
diferentes niveles de irritación. Este método ha estado muy cuestionado, no solo por los
aspectos éticos de agresión a los animales, si no también por la subjetividad del mismo
y la variabilidad en los resultados, así como las diferencias entre la piel humana y la del
conejo.
Una modificación del método consiste en la determinación del potencial fotoirritante al
someter la piel del animal a la luz ultravioleta después de haber aplicado el producto. En
este caso se utilizan conejos, ratas, ratones y cobayos a los que se rasura la piel del
lomo, se aplica el producto y se expone la piel a una fuente controlada de luz
ultravioleta durante un cierto tiempo. Posteriormente se valora de la misma manera el
grado de irritación por la aparición de edema y eritema (Lovell and Sanders, 1992; Vohr
et al. 2000).
Los ensayos de sensibilización se han realizado en animales siendo el método de
maximización realizado en cobayas el más utilizado. Dicho método fue descrito por
Magnusson y Kligman en 1969. Se rasura la piel del cobaya y se realiza una inyección
intradérmica del producto en estudio junto con adyuvante de Freund para potenciar el
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efecto sensibilizante. Una semana después se aplica el producto tópicamente y se
mantiene durante 48 horas mediante un vendaje oclusivo. A los 21 días se vuelve a
aplicar el producto y se mantiene durante 24 horas y después de retirar el apósito y el
producto se valora la aparición de edema o eritema a las 48 y 72 horas de la aplicación
del producto. El ensayo es largo ya que se tarda más de 21 días y requiere el uso de
numerosos animales entre controles y tratados.
La opinión pública y las organizaciones de defensa de los animales han criticado
duramente la utilización de animales de experimentación para la valoración del
potencial efecto irritante y sensibilizante de los preparados cosméticos, resaltando la
necesidad de sustituirlos por métodos in vitro.
La prohibición de ensayos de cosméticos con animales viene de la Directiva
2003/15/CE del Parlamento Europeo y en España del Real Decreto 209/2005 25 de
febrero. Si bien en muchos casos no se dispone de métodos alternativos totalmente
validados y aceptados por las legislaciones, por lo que resulta difícil su aplicación.
En los últimos años se han desarrollado numerosos métodos alternativos para suplir los
métodos tradicionales. Estos nuevos métodos han de ser previamente validados, es decir
se tiene que demostrar su eficacia, y reproducibilidad para sustituir a los métodos con
animales. Los ensayos de validación son muy complejos, requiriendo la participación de
varios laboratorios que simultáneamente ensayen los métodos y la posterior evaluación
de los resultados obtenidos. En Europa se creó en 1991 ECVAM (European Center for
the Validation of Alternative Methods) ubicado en Ispra, cerca de Milán. Se fundó para
cumplir con las necesidades de la Directiva Europea sobre protección de los animales de
experimentación y su función es apoyar activamente al desarrollo, validación y
aceptación de métodos alternativos con la finalidad de reducir, refinar y reemplazar el
uso de animales de laboratorio. También es responsable de una base de datos sobre
métodos alternativos y de la organización de reuniones de expertos en métodos
alternativos.
El proceso de validación de nuevos métodos es complejo y comprende desde el
desarrollo del método en un determinado laboratorio, un ensayo previo de prevalidación
en el que participan pocos laboratorios y el posterior estudio de validación en el que
están implicados más laboratorios. Con los datos de los diferentes laboratorios se
procede a la evaluación del método y la posterior aceptación por las autoridades
reguladoras, siendo esta última fase del proceso la más compleja y lenta.
El proceso es muy largo, así para la fase de prevalidación y validación y revisión se
necesitan más de 4 años y más de 7 años para se aceptados por las autoridades
reguladoras, a parte del tiempo requerido para el desarrollo e investigación de un nuevo
método
Para validar un ensayo se necesita demostrar la necesidad del método para suplir al
método in vivo ya existente, disponer de indicadores del efecto biológico que se
presenta in vivo, un protocolo experimental bien desarrollo, que el método sea
reproducible en el propio laboratorio y en otros laboratorios. También se necesitan
productos de referencia de efecto in vivo muy conocido, que el método tenga una
relación con datos toxicológicos y que el procedimiento cumpla las buenas prácticas de
laboratorio (Hartung et al. 2002).
.
Los métodos in vitro han de reproducir las respuestas que tienen lugar en el organismo
por efecto de los productos. Es necesario conocer la estructura de la piel y de las células
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que son responsables de estos fenómenos. En la piel existe una primera capa o
epidermis en las que los queratinocitos son las células mayoritarias y una capa más
interna o dermis con numerosos fibroblastos. En la epidermis también hay un pequeño
número de células de defensa o células de Langerhans.
Así los ensayos de irritación dérmica tienen en cuenta los fenómenos que suceden en la
piel. Un producto irritante al actuar sobre la piel provoca la liberación de citoquinas
como la IL-1 que desencadena una serie de respuestas con la liberación de otras
citoquinas (Il-6, IL-8, TNF, etc) que provocan cambios morfológicos como
vasodilatación, activación de células endoteliales, etc que se traduce en síntomas
visibles como eritema, edema, dolor o picor (Coquette et al. 2003).
Los dos tipos celulares mayoritarios serán los utilizados en los estudios in vitro,
existiendo diferentes tipos de cultivos (primarios, líneas celulares y kits comerciales). El
cultivo de un único tipo celular permite conocer los mecanismos de acción de los
productos sobre estas células a nivel celular y molecular pero presentan el inconveniente
que es necesario que los productos sean solubles en medios acuosos. Este tipo de
estudio no se puede realizar con preparados cosméticos terminados, pero si con sus
ingredientes por separado, siempre que sean solubles o se puedan solubilizar con
solventes no tóxicos para las células.
Los marcadores que se utilizan para valorar la irritación comprenden los marcadores de
viabilidad celular, la presencia de metabolitos del ácido araquidonico que participa en la
respuesta inflamatoria, la presencia de interleuquinas liberadas como consecuencia del
efecto irritante y últimamente la detección de nuevas proteínas que aparecen en las
células en respuesta al efecto irritante de un producto (proteómica).
Los kits comerciales tienen la ventaja de permitir la aplicación de los preparados tal
cual. Numerosas empresas han desarrollado estos kits que tienen el inconveniente de ser
costosos.
El kit Irritection se basa en la utilización de una matriz con colágeno y gelatina para
imitar a la piel. El producto se aplica y si es irritante provoca cambios en la matriz que
pueden ser detectados por una turbidez.
Otro kit es SkinEthic que intenta similar la piel completa con sus capas y en el que se
valora después de la aplicación del producto, la viabilidad celular, la presencia de
citoquinas, los cambios histológicos del tejido.
Otros modelos son EpiDerm que solo equivale a la epidermis y EpiDermFT que
equivale a la epidermis y a la dermis. En la actualidad estos métodos sólo se han
aceptado para valorar productos corrosivos, por lo tanto sólo son útiles para evaluar
productos químicos y no sirven para los productos dermofarmacéuticos (Faller et al.
2002).
El ensayo de fotoirritación es el único de los métodos que esta totalmente validado y
aceptado por la legislación, apareciendo en los protocolos de la OECD para la
valoración de productos químicos. El método se conoce con las siglas 3T3 NRU que
corresponde a la captación del colorante rojo neutro por una línea celular de fibroblastos
murinos, las células 3T3. (Spielman et al. 1998). En este método se determina la
viabilidad celular después de la aplicación de diferentes concentraciones del producto
en estudio y se determina el valor de la EC50 concentración que provoca una viabilidad
del 50% de las células. El ensayo se repite pero sometiendo las células a una fuente
controlada de luz UV y se vuelve a calcular la EC50. Si en presencia de luz UV el
producto presenta una EC50 inferior que en condiciones control se considera que el
producto es fotoirritante (Benavides et al. 2004).
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Para que un producto produzca una sensibilización dérmica, en una persona susceptible,
tiene que actuar como antígeno y se han de producir una serie de fenómenos. En primer
lugar el producto tiene que ser suficientemente pequeño para atravesar la epidermis a
través del estrato córneo. Una vez haya atravesado la epidermis se unirá proteínas y el
conjunto se unirá a células especializadas de defensa (células de Langerhans) que
actuarán como presentadoras de antígeno. Estas células unidas al antígeno y reguladas
por citoquinas epidérmicas migrarán hacia los nodos linfáticos. Durante la migración las
células sufren una diferenciación adquiriendo las propiedades de células maduras y
serán capaces de presentar el antígeno a las células T. Estas células T específicas
proliferarán y se diseminarán a través de la sangre a todo el cuerpo. En un segundo
contacto con la misma sustancia el cuerpo reaccionará dando una respuesta inflamatoria
local caracterizada por eritema y edema.
En la actualidad se han desarrollado varios métodos in vitro para valorar este efecto y se
basan en la determinación de marcadores característicos. Se utilizan diferentes tipos de
células: queratinocitos, células de Langerhans y células dendríticas.
El cultivo de queratinocitos permite diferenciar entre productos irritantes y alergénicos,
provocando los primeros un incremento de la liberación de una citoquina característica
la IL-1 y los segundos incrementan la producción intracelular de esta citoquina en una
forma dependiente de la dosis, y así mismo incrementa la expresión de un antígeno de
superficie como es el CD40.
Las células de Langerhans representan la principal célula presentadora de antígeno de la
piel, representando del 1 al 3% de la células de la epidermis por lo que resultan difíciles
de aislar. De todos modos se han realizado cultivo de estas células observándose
cambios después de la exposición de las mismas a sustancias alergénicas. Así se han
visto cambios en marcadores se superficie, moléculas de adhesión. También se ha
intentado determinar la capacidad de migración de estas células ya que in vivo realizan
esta función.
Debido a la dificultad para aislar las células de Langerhans se ha recurrido a otros
métodos en los que se utilizan otras células presentadoras de antígeno como son las
células dendríticas obtenidas de diferentes fuentes (Casati et al. 2005). También se ha
visto un efecto de las sustancias alergénicas sobre estas células, incrementándose la
expresión de ciertos marcadores de superficie.
Algunos alergenos se ha demostrado que provocan cambios en las expresión de algunos
genes relacionados con la función inmunológica. En los últimos años el desarrollo de la
Genómica constituye una prometedora área de investigación sobre el efecto de los
productos sobre los diferentes genes implicados en el proceso.
Por último se están desarrollando métodos basados en la utilización de programas de
ordenador y que establecen la relación entre la estructura química y la actividad de los
productos a partir de bases de datos en las que se conoce bien la respuesta de los
productos en función de su estructura química. Son los conocidos como (QSARs
(Quantitative Structure-Activity Relationships). Estos procedimientos predicen el
posible efecto tóxico de un producto basándose en sus propiedades fisicoquímicas y en
la estructura de la molécula, la presencia de determinados enlaces químicos, su
capacidad de unión a proteínas etc.
Los avances de las nuevas metodologías han permitido que todos aquellos ensayos que
antes sólo se podían realizar en animales, en la actualidad ya se puedan realizar in vitro,
si bien todavía no están aceptados mayoritariamente por las autoridades reguladores. Lo
más importante es que estos métodos garanticen la seguridad del consumidor, y ya que
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los diferentes métodos pueden presentar diferente sensibilidad para detectar las
propiedades irritantes o alergénicos de un producto se recomienda utilizar una batería de
ensayos.
En la actualidad se sigue investigando para encontrar métodos fiables, basados en el
conocimiento de los mecanismos fisiológicos que intervienen cuando un producto entra
en contacto con la piel.
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