Cambios cualitativos y cuantitativos producidos por dosis diferentes

Resumen: M-094
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2006
Cambios cualitativos y cuantitativos producidos por dosis diferentes
de 5-fluouracilo en células esplénicas.
Lettieri, Carolina N. - Aispuru, Gualberto R.
Aquino Esperanza, José A. - Aguirre, Maria V. - Brandan, Nora C.
Cátedra de Bioquímica. Facultad de Medicina. Universidad Nacional del Nordeste.
Mariano Moreno 1240. Corrientes. CP 3400. Argentina.
e-mail [email protected].
Antecedentes:
En el individuo adulto el bazo posee numerosas funciones, entre las que se destaca su rol como órgano hematopoyético
e inmunológico, además de su papel en el proceso de eliminación de células sanguíneas dañadas y seniles en circulación1,2. Este órgano, constituido fundamentalmente por celularidad linfoide, constituye un sitio de respuesta inmunológica humoral. En este proceso, los linfocitos B producidos y liberados en médula ósea migran hacia el bazo, órgano
linfoide secundario, para ejercer aquí una respuesta inmunitaria frente a antígenos vehiculizados por la sangre3. Para
esto, es necesario un continuo recambio y proliferación linfocitaria, lo cual demanda altas tasas de división y muerte
celular en un medio altamente influenciado por diversas citoquinas, factores de crecimiento e interacciones celulares3,4.
Además, se hallan en menor cuantía, poblaciones de células eritroideas y mieloideas provenientes de la médula ósea a
través de la circulación. Estas células poseen el potencial para asumir un rol hematopoyético extramedular1.
Actualmente son muchas las drogas usadas como terapéutica con un efecto citotóxico sobre el bazo, entre las que se
hallan las empleadas para el tratamiento de neoplasias5.
La quimioterapia basada en el antimetabolito 5-fluorouracilo (5-FU), droga ampliamente utilizada, en general se ve
asociado con la supresión de la función inmune2. Sin embargo, son pocos los reportes sobre los efectos inmunológicos
del 5-FU sobre el bazo. Esta droga genera alteraciones a nivel de la población linfoide de este órgano no bien caracterizadas. Mucho menos es lo que se conoce acerca de la acción sobre las restantes estirpes celulares en éste órgano5,6.
El presente trabajo pretende evaluar en un modelo murino in vivo los cambios diferenciales producidos tras la administración de diferentes dosis de 5-FU (150mg/Kg.-200mg/Kg.) sobre el peso del bazo, viabilidad, celularidad, mitosis,
apoptosis y distintas líneas celulares del tejido esplénico. La determinación de estos parámetros propone la posibilidad
de su aplicación en el ser humano.
Materiales y métodos:
Animales y administración de la droga: Se utilizaron ratones adultos isogénicos de la cepa Swiss CF1 (peso aproximado
26 a 28 g) provenientes del bioterio de la Facultad de Medicina de la UNNE. Estos animales fueron fuente de muestras
de bazo. Los ratones fueron mantenidos con dieta estándar y dispusieron de agua libremente.
El 5-Fluorouracilo (Sigma, St. Louis, MO) se disolvió en solución salina estéril a una concentración de 150mg/Kg y
200mg/kg. Los ratones (n=6) recibieron una sola inyección por vía intraperitoneal de 5-Fluorouracilo. El grupo control
recibió Solución Salina (n=6).
Se anestesiaron los animales con pentobarbital 3%. La eutanasia se produjo por dislocación cervical a los 0, 1, 2, 3, 4, 5,
6, 7, 10, 15 y 20 días posteriores al tratamiento.
Determinación de viabilidad celular: Se obtuvieron muestras de células esplénicas a cada día del esquema experimental
a través de malla estéril. Las células fueron suspendidas en buffer PBS (137mM NaCl, 2,5mM KCl, 4,3mM Na2HPO4,
12 H2O, 14mM KH2PO4, solución stock x 10) y mantenidas en hielo hasta que se realizó el contaje celular. Un pequeño volumen de Trypan Blue (0.4 %) (Sigma) fue agregado a un igual volumen de suspensión celular y la mezcla se
incubó por 5 minutos. La muerte celular se determinó por la presencia del Trypan Blue citoplasmático. El número total
de células y el porcentaje de células no viables fue determinado usando un hemocitómetro bajo microscopia óptica.
La viabilidad celular se expresó como el porcentaje (±SEM) de células vivas/número de células totales. Se realizó por
triplicado a cada tiempo del protocolo experimental.
Determinación de celularidad: Suspensiones de células de Bazo con buffer PBS de cada tiempo y dosis correspondiente
se utilizaron para determinar la celularidad, empleando para esto una cámara de Neubauer y diluciones en solución Turk
(1/20). Todas las determinaciones se realizaron por triplicado y los resultados fueron expresados como el promedio de
células nucleadas por órgano x 106 (±SEM).
Cuantificación de apoptosis y mitosis por microscopia óptica: Las células teñidas con May-Grundwald-Giemsa se observaron mediante microscopia óptica. Se detectaron las células apoptóticas y mitóticas en base a cambios morfológicos
típicos: fragmentación nuclear, formación de cuerpos apoptóticos y burbujas en la membrana plasmática para la apoptosi y husos mitóticos y cariocinesis para la mitosis. Para su cuantificación se medió el índice apoptotico y mitótico, definido como el número de células en apoptosis o mitosis por campo, respecto al número de células totales observadas por
campo. Se contaron diez campos representativos por extendido, realizados por triplicado y los resultados se expresaron
como la media (±SEM)
Contaje diferencial de células sanguíneas en bazo:
Se determinaron, en extendidos coloreados con May-Grundwald-Giemsa. Contándose por triplicado 500 a 1000 células
bajo microscopio óptico. Se clasificaron en: eritroides, mieloides y linfoides. Los resultados se expresaron como la
media y valores absolutos para cada línea celular.
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Cálculos estadísticos: Los resultados fueron analizados utilizando el Software INSTAT y PRISM Versión 4.0 (GraphPad Software, San Diego, California, USA) considerando estadísticamente significativo: p <0.05. Los gráficos se obtuvieron usando el software GraphPad Prisma y Adobe Photoshop 6.0. Los análisis de correlación se realizaron utilizando
el test de correlación de Spearman rank.
Discusión de resultados:
Peso del órgano:
Como se observa en la figura 1 al realizar la medición del peso del bazo de los animales este disminuye paulatinamente
posterior a la injuria por 5-FU, con cambios estadísticamente significativos (p< 0.01) siendo la mayor pérdida causada
por la administración de 200mg/Kg. de la droga. El déficit es máximo el día 4 para la aplicación de 150mg/Kg. recuperándose lentamente en los días sucesivos (p<0.01) hasta alcanzar el valor control el día 15. Ante la administración de
200mg/Kg. el descenso del peso es mas acentuado en los días 5 y 6 (p<0.01) no recuperando valores basales al final de
la experiencia.
p e s o o r g a n o 2 0 0 m g /k g
peso del organo(cgr)
15
p e s o 2 0 0 mg /kg
10
**
**
p e s o 1 5 0 mg /kg
*
* *
**
** ** ** **
**
**
**
**
**
**
5
0
0
1
2
3
4
5
6
D ias
7
10
15
20
Figura 1: Peso del órgano (cgr) posterior a la administración de dosis diferentes (150mg/Kg.- 200mg/Kg.) de 5FU. Los resultados son expresados como la media ± SD de tres experiencias diferentes (6 animales por lote)* p<0.05,
**p<0.01.
Viabilidad y celularidad en bazo.
Al comparar el tratamiento con diferentes dosis del citotóxico se evidencian cambios significativos en la viabilidad
celular. Alcanzando mayor mortalidad a las 48hs post quimioterapia (p<0.01) para ambas dosis. Observándose que a
mayor dosis (200mg/Kg.) la disminución de la viabilidad es más acentuada con un déficit del 27.59% del valor control.
La recuperación se produce en forma lenta y progresiva (p<0.01) siendo la aplicación de la menor dosis la que alcanza
valores normales al final de la experiencia.
(Figura 2a)
En las células esplénicas tratadas con 5-FU el efecto sobre la celularidad muestra cambios estadísticamente significativos a partir de las 24hs para 200mg/Kg. de la droga (p<0.01) hallándose el mínimo valor el día 2 post injuria (p<0.01).
Posteriormente se comprueba un ascenso lento y progresivo en los días 3, 4, 5 y 6 (p<0.01) manteniéndose por debajo
del control hasta el final del estudio. Sin embargo, para 150mg/Kg. la disminución es menor y se halla una máxima
pérdida el día 3. Alcanzando parámetros normales a partir del día 5 y en los días posteriores es estadísticamente significativo el ascenso por encima del control hasta el día 20(p<0.01).
b- Celularidad
200
110
**
100
90
**
** **
80
70
Celulas (x106)
Porcentaje de células vivas
a- Viabilidad
**
**
**
**
**
**
150
**
**
100
50
**
**
0
5
10
15
20
** ** **
** **
**
** **
0
60
0
5
10
15
20
Dias
Dias
150mg/Kg
**
200mg/Kg
150mg/Kg
200mg/Kg
Figura 2: Viabilidad (a) y celularidad (b) de bazo posterior a la administración de dosis diferentes (150mg/Kg.200mg/Kg.) de 5-FU. Los resultados son expresados como la media ±SD de tres experiencias diferentes (6 animales
por lote)* p<0.05, **p<0.01.
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Mitosis y apoptosis.
Al cuantificar ambos fenómenos en bazo murino se observó que existe un aumento de la apoptosis estadísticamente
significativo a expensas de una disminución de la división celular en los primeros 5 días de quimioterapia (p<0.01)
presentando una pérdida del equilibrio entre ambos procesos según el valor control. Se evidenció una inversión de la
curva entre los día 6 y 10 notándose un aumento de la mitosis (p<0.01) y un descenso progresivo de la muerte celular.
La intensidad del fenómeno es mas acentuado ante la aplicación de mayor dosis (200mg/kg) no observándose diferencias con la mitosis ante dosis diferentes. (Figura 3-A y B)
A.
B.
25
25
**
Porcentaje
20
porcentaje
Apoptosis
20
apoptos is
mitosis
15
**
**
10
**
**
5
**
**
**
**
**
Mitosis
**
10
**
**
5
**
**
15
**
*
0
**
0
0
5
10
15
20
0
**
**
**
**
**
5
10
Dias
15
20
Dias
Figura 3: Mitosis y apoptosis en bazo posterior a la administración de dosis diferentes (150mg/Kg.- 200mg/Kg.)
de 5-FU. Los resultados son expresados como la media ± SD de tres experiencias diferentes (6 animales por lote)*
p<0.05, **p<0.01.
Líneas celulares.
Al determinar los efectos del 5-FU sobre el número total de células linfoides en tejido esplénico se observa una disminución importante a las 24hs post tratamiento con su máxima expresión a las 48hs con valores estadísticamente significativos (p<0.01). Efecto que se manifiesta en forma similar para ambas dosis. Retorna a valores normales a los 6 días
(p<0.01) post injuria y presenta un aumento sostenido a partir del día 7 que se mantiene hasta el día 20 post inyección
con 5-FU.(Figura 4 A y B)
En la línea eritroide se evidencia que la administración de la menor dosis (150mg/Kg.) provoca una caída que alcanza
en el día 2 un descenso de aproximadamente un 95% respecto del control (p<0.01) siendo la recuperación lenta y alcanzando valores normales al final de la experiencia (Figura 4 A). En cambio, para la mayor dosis de 5-FU la máxima
reducción se observa a las 24hs manteniendo valores subnormales hasta el día 20 (p<0.01) (figura 4 B)
Los cambios observados en los precursores mielodes en bazo demuestran una respuesta similar ante la administración
de dosis diferentes del citotóxico. Un descenso estadísticamente significativo el día 2 (p<0.01) con tendencia a aumentar en forma progresiva en los días siguientes del estudio (p<0.01). Alcanzando la normalización el día 10 del tratamiento (p<0.01).
A
B
60
50
50
células x10
6
células x 106
60
40
30
20
40
30
20
10
10
0
0
0
5
10
Días
15
Línea Linfoide
20
0
Línea Eritroide
5
10
Días
15
20
Línea Mieloide
Figura 4: Líneas celulares en bazo posterior a la administración de diferentes dosis (150mg/Kg.- 200mg/Kg) de
5-FU. Los resultados son expresados como la media ±SD de tres experiencias diferentes (6 animales por lote)* p<0.05,
**p<0.01.
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Correlación celularidad con apoptosis.
Al correlacionar el número total de células en bazo con el porcentaje de apoptosis del mismo es extremadamente significativa la relación entre estas variables (r = -0.7035 P<0.0004) apreciándose una relación negativa. Ante índices apoptóticos altos la celularidad disminuye como se observa en los días 1 a 5 post 5-FU. Relación que se invierte en los días
siguientes al descender el porcentaje de apoptosis en relación al número de células del tejido.
Correlación celularidad con mitosis.
Las variables celularidad y mitosis evidencian una correlación positiva considerada significativa (coeficiente de correlación r = 0.5866, P< 0.0133) al aumentar la división celular el número total de células es mayor a partir del día 5 post
injuria con 5-FU.
Correlación celularidad/ células linfoides.
La correlacion de celularidad con el número total de células linfoides es positiva y extremadamente significativa (coeficiente de correlación r = 0.6996 P< 0.0003) Es decir, al aumentar el numero de celulas del tejido esplenico la linea
linfoide recupera sus valores normales.
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Correlación celularidad /células linfoides
bazo 5-FU
Correlación celularidad/mitosis bazo 5-FU
6
ce lularidad x10 6
5
m itosis
porce nta je
a p o p to sis
p o rce n ta je
Correlación celularidad/apoptosis bazo 5-FU
4
3
2
1
0
0
25
50
75
100
celularidad (x106)
125
150
0
25
50
75
celularidad (x106)
100
125
200
175
150
125
100
75
50
25
0
0
10
20
30
40
50
Células linfoides (x106)
Figura5: A) correlación entre celularidad y apoptosis B) correlación entre celularidad y mitosis C)correlacion
celularidad y células linfoides, en bazo luego de la injuria con dosis diferentes de 5-FU. Test de correlación de
Spearman rank.
Conclusiones.
Del estudio realizado puede concluirse los siguientes puntos:
- El peso del bazo disminuye en un 10 a 15% su valor control hacía el día 4 y 5 luego del tratamiento con 5-FU.
- Este quimioterápico ejerce un efecto tóxico directo sobre las células esplénicas, evidenciado por el descenso de la
viabilidad en los primeros 5 días de experiencia.
- Al estudiar la celularidad del bazo se observa una disminución máxima entre los días 2 y 3 dependiendo de la dosis.
- La disminución celular se realiza a expensas de un aumento del índice apoptótico y una disminución del mitótico en
los 6 primeros días post-injuria, afectando principalmente a la línea linfoidea.
- Siendo el bazo un órgano eminentemente linfoide, la disminución de este linaje celular se correlaciona en forma muy
significativa con la disminución de la celularidad total.
- La recuperación celular esplénica se realiza por medio de un aumento de la división celular en el órgano a partir del
6to día, momento en el cual la apoptosis disminuye.
- En lo que cuenta a las líneas eritroide y mieloide, puede verse un descenso marcado en su número desde el primer día
luego de la quimioterapia con 5-FU, siendo el linaje mieloide quien logra recuperarse al final de la experiencia. Por el
contrario las células eritroides se mantienen disminuidas por debajo de los valores controles a lo largo de todo el ensayo.
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