tema 6.i: mutación selección

TEMA 6.I: MUTACIÓN SELECCIÓN
DESARROLLO DE CEPAS
Los MOTIVOS del desarrollo de cepas:
1. Incrementar la produccion. Alterando la regulacion; alterando la permeabilidad o creando sistemas
que expulsen el producto; incrementar la resistencia a su propio AB o a un metabolito
intermediario (ya que a veces no resisten laa presion del AB).
2.
Propiedades fermentativas mejoradas. Sin pigmentos, que tengan pocas necesidades de
oxigeno,que no produzcan espuma, que sea capaz de crecer en sustratos baratos.
3.
Productos finales unicos. En metabolitos secundarios.
4. Biosintesis de nuevos productos. Usar la ingenieria genetica para obtener AB y metabolitos que
nunca habian sintetizado esos MO (como puede ser la insulina humana sintetizada por e.coli
- MÉTODOS
Mutación-selección
Recombinación
Ingeniería genetica: Tecnología del ADN recombinante "in vitro"
1.- Bases moleculares de la mutación
Mutación: es un cambio heredable en la secuencia de bases de los ácidos nucleícos contenidos en el
genoma de un organismo.
Mutaciones espontáneas:
Radiaciones naturales
Errores durante la Replicación (10-7-10-11)
Mutaciones inducidas por mutágenos:
Metabolitos Secundarios (10-5-10-3)
Mutantes Auxotrofos (10-2-10-1)
Recombinación Genética: es el proceso por el cual los elementos genéticos contenidos en dos
genomas separados se juntan en uno sólo (genes, conjunto de genes, cromosomas).
Frecuencia de Mutación: proporción de mutantes en la población.
1. 2.- Mecanismos mutacionales
1.-Cambios premutacionales
Emparejamiento incorrecto
Dímeros de pirimidina
Alteración química de bases
Alquilación, desaminación
Entrecruzamiento entre cadenas complementarias
Intercalamiento de mutágenos
Ruptura de una cadena
Ruptura de las dos cadenas
Inserción (transposones)
2.-Procesos de reparación
Fotorreactivación
Reparación por escisión: daño ultravioleta,
Daños alquilantes y deaminados
Reparación postreplicativa por recombinación
Reparación SOS: El mecanismos SOS es un mecanismo de emergencia, es inducido a diferencia
de los otros, cuando se encuentran con daños genéticos, repara para que la célula sea viable aunque
comete muchos errores ya que a veces repara sobre vacio, y entonces los errores pasan como
material genético estable a la siguiente generación, como mutación
3.-Mutación
Fracaso parcial del mecanismo de reparación  Mutantes
2.- Mutágenos
I. Mutágenos químicos
a. Análogos de bases (5-bromouracilo que se empareja de forma incorrecta)
b. Agentes que reaccionan con el DNA (producen alquilaciones, hidroxilaciones, aminaciones... y
alteran las bases y producen errores.)
c. Agentes Intercalantes (el mas conocido es el bromuro de etidio, colorante que se intercala
entre ambas cadenas de DNA estabilizandola, cuando este se tiene que copiar, en la zona
donde esta se crea un hueco)
II. Mutágenos físicos
a. Luz Ultravioleta
b. Radiación Ionizante con mas energia q la luz uv, ya q ionizan los componentes y les hace
reactivos (entrecruzamiento de cadenas, ruptura fisica...) ej: rayos X.
III. Mutágenos biológicos
a. Elementos transponibles, un transposon (trozo de DNA que se copia y salta a otra zona del
genoma,ademas son faciles de marcar)
b. Mutagénesis dirigida
Rango (saber que produccion obtenemos), en la natural no perdemos nunca la prouccion de
clortetraciclina; con el resto si; los radiacion UV y los NTG son los que mas producen
Clase mas frecuente (nos interesa que la moda sean mutantes superproductores). Los mas de
radiaciones utravioleta
Frecuencia de cepas con mayor productiivdad, en la natural es bajo, con la uv es muy alta y la mejor.
NTG: agente alquilante mas potente (junto con UV da los mejores resultados)
Mostazas nitrogenadas
MUTACION SELECCION: los pasos de mejor donde sale que tipo de mutageno se uso para Penicillum
notatum. En la ultima etapa se uso sistematicamente la mostaza. se paso de 3 a 7000 mg
3.- Técnicas desarrollo de cepas por mutación-selección
1.-Técnica de selección frente a análogos o antimetabolitos
2.-Técnica de selección de revertientes
3.-Técnica de selección de auxotrofos
4.-Técnica de selección por mutagénesis secuencial
5.-Técnica de selección por comutación
6.-Mutasíntesis (biosíntesis mutacional)
7.- Cosíntesis
___________
1.- Técnica de selección frente a análogos.
Un análogo estructural es una sustancia química con una estructura similar que mimética perfectamente
a un producto intermediario pero no es esa estructura.
Un análogo estructura en una ruta de producción de aminoácidos es un D-aminoácido, funcionan como
reguladores, pero no sirven estructuralmente porque no se puede incorporar a la proteína, por lo que sólo
cumple su función reguladora.
2.- Técnica de selección de revertientes.
Técnica muy utilizada para la producción de antibióticos.
Partiendo de la cepa parental (C1) que produe antibiotico la
muto, elegimos el que no produce AB, a este le vuelvo a mutar
y seleccionamos los que si producen AB, con una frecuencia
muy alta estos suelen ser mucho mas productores que el
primero.
Un revertiente verdadero es aquel en la que se produce una
mutación en el mismo punto pero de sentido contrario, es decir,
que revierte a la original.
Con el segundo agente mutageno se va a provocar una
mutación puntual que revierta la primera mutación, pero esto
es muy improbable. Lo habitual es que se tenga una segunda
mutación en otro gen que da lugar a una nueva conformación
de la proteína que altera su función compensando la primera
mutación. Es decir, se recupera la función de la proteína y se
compensa la mutación que alteraba el proceso.
Esto afecta al centro alostérico de la proteína, esto es lo que
hace que estos dobles mutantes hagan que se gane en cuanto
a la producción de antibiótico.
3.- Auxótrofos
Objetivo: lisina Pasos a seguir: coger un medio de cultivo líquido y
crecer MO para ponerlos en contacto con el agente
mutágeno y se esperan dos generaciones para que se
generen los mutantes.
Se coge una alícuota de esta población y la pongo en un
medio de cultivo que reúna una serie de características
especiales (medio mínimo (MM) al que le pongo todos
los factores de crecimiento que necesita una célula para
crecer menos lisina).
Para enriquecer este cultivo en este tipo de mutantes
tengo que poner un antibiótico que actúe sólo sobre los
MO que están creciendo, por ejemplo, la penicilina que
actúa sobre la pared celular y así acabo con todos los
que están creciendo, excepto con los auxótrofos de
lisina, que no están creciendo porque no hay lisina.
Posteriormente recupero los MO que quedaron y elimino
los que no me interesan y pongo en un medio que sólo
contenga lisina.
4.- Técnicas «dirigidas».
Dirigir nuestras mutaciones a los genes que nos
interesan.
Se busca obtener un cultivo en el que todas las células
estén en el mismo momento del ciclo -> cultivo
sincrónico.
Auxotrofos
NTG: Muy eficiente. Es un agente alquilante. Tiene una predilección y se une mucho más fuerte. Muta
ADN de cadena sencilla para dar de cadena doble.
Con estas dos premisas, se diseñan las técnicas dirigidas.
Que consisten en el mapeo de genes, se conocen los tiempo de replicación de la bacteria y que genes se
van replicando en cada tiempo y se van añadiendo los agentes mutágenos necesarios para cada gen.
Necesito saber muy bien, la posición de los genes en el cromosoma y la ruta de biosíntesis.
5.- Técnica de selección por comutación.
La replicación es bidireccional simétrica, por lo que si no consigo detectar los genes que me interesan,
detecto más fácilmente los simétricos de la horquilla de replicación, así es más sencillo encontrar los que
necesito en cuanto al tiempo de replicación.
6.- Mutasíntesis
La penicilina esta diseñada para eliminar de la célula tres aminoácidos que pueden ser tóxicos cuando se
acumulan. La penicilina se forma por condensación, un tripéptido.
Productos del metabolismo primario se acumulan y hay que eliminarlos para que no intoxiquen. Y para
ello se utilizan las rutas del metabolismo secundario que tiene como función unirlos y algunos de ellos
tienen función de antibiótico.
Si yo bloqueo un metabolito primario, la célula no produce el antibiótico, la célula ha mutado porque le
falta un elemento. Esto se comprueba mediante el medio de cultivo, si añades este nutriente se vuelve a
conseguir el producto final. Pero en el medio de cultivo no se va a poner el mismo metabolito, sino un
análogo estructural que va a hacer que el antibiótico obtenido tenga características mejores.
7.- Cosíntesis
Cuando no se puede desregular una ruta metabólica,
tenemos que aplicar esta técnica.
Se obtienen dos mutantes cada uno con la ruta truncada
y la suma de ambos nos da una ruta completa. En el
primer mutante se bloquea la enzima quedándose sin
producto final y así se acumula el producto intermediario
C. El segundo mutante se bloquea justo en el paso
anterior
(B --> C), por ello su ruta se inicia en el producto
almacenado por el mutante 1.
Si cultivo ambos el segundo utiliza el metabolito que está
en el medio producido por el primero para acabar
produciendo el último que se acumula, sin alterar el sistema de regulación de la ruta en ambos mutantes.
Tema 6. II
Mejora de cepas por recombinación
1. Objetivos
2. Recombinación genética en bacterias
I. Transformación
II. Transducción
III. Conjugación
3. Recombinacion genética en hongos
4. Fusión de protoplastos.
I. Recombinación sexual
II. Recombinación parasexual
_____________
1. Objetivos
Reunir en una cepa las mejoras obtenidas en varias por distintos métodos.
Eliminar mutaciones indeseables que tienen efectos pleiotrópicos negativos para el rendimiento (vitalidad
disminuida)
Eliminar en las cepas de alta producción cambios fisiológicos indeseados: producción de espuma.
Necesidades nutricionales.
2. Recombinación genética:
Es el proceso por el cual los elementos genéticos contenidos en dos genomas separados se juntan en
uno solo.
Es una forma efectiva de aumentar la variabilidad genética.
 Métodos naturales y artificiales.
- Objetivo:
Reunir en una cepa las mejoras obtenidas en varias por distintos métodos
Eliminar mutaciones indeseables que tienen efectos pleiotrópicos negativos para el rendimiento (vitalidad
disminuida)
Eliminar en las cepas de alta producción cambios fisiológicos indeseados: Producción de espuma
Necesidades nutricionales
METODOS NATURALES
» Recombinación genética en hongos
- Recombinación sexual:
- Recombinación parasexual: tenemos dos individuos en crecimiento que son haploides. Si se ponen
juntos en una placa las hifas de los hongos se entrecruzan y se unen produciendose anastomosis, se
unen los citoplasmas de las dos líneas parentales haploides y se generan unas células curiosas en las
que coexisten los núcleos de los dos hongos.
Célula con varios núcleos de diferente procedencia y ambos haploides: heterocarionte. De una célula
de este tipo van a salir esporas de un parental y otras del otro parental y ambas haploides. Pero con
cierta frecuencia se produce cariogamia, es decir, dos núcleos haploides se unen para dar lugar a un
núcleo diploide estable, y como consecuencia se produce un entre cruzamiento de los cromosomas y
dará lugar luego a hifas diploides que podrán generar mediante reducción meiótica hifas haploides que
están recombinadas.
» Recombinación genética en bacterias.
Tenemos tres sistemas en la que una parte del genoma de una célula donadora puede pasar dentro de
una célula receptora y una vez dentro recombina. Hay diferencias en cuanto a la transferencia del ADN.
La recombinación siempre es homóloga.
Nunca en procariotas se puede transferir el material genético completo de una célula a otra. En
eucariotas puedo coger el genoma completo de una célula y unirlo al de otra.
Inconvenientes recombinación natural:
1-Frecuencia baja
2-No son corrientes en microorganismos industriales.
MÉTODOS ARTIFICIALES:
Fusión de protoplastos
Método
Eliminación de paredes celulares.
Fusión: PEG, electrofusión
Regeneración de la pared. Diseñar medio y condiciones.
Mediante un detergente o un agente tensioactivo se elimina la pared, membrana o quitina. Tengo dos
células desnudas y mediante PEG las uno, y pueden ocurrir dos cosas, que se generen dos células con
dos núcleos distintos, o que en el caso de los eucariotas se produzca cariogamia o en los procariotas
recombinación.
Ventajas:
La frecuencia de recombinación se incrementa de una forma espectacular.
Aplicable a eucariotas y procariotas
Recombinación intraespecífica, interespecífica
En procariotas: contacto entre genomas completos
Recombinación natural vs fusión de protoplastos
- Frecuencia de recombinación baja
- No son corrientes en MO industriales.