fcv618e - Tesis Electrónicas UACh

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UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
Facultad de Ciencias
Escuela de Bioquímica
Expresión del receptor V1b de vasopresina de rata acoplado
a la proteína amarilla fluorescente (YFP) en células
polarizadas (MDCK)
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico.
Profesor Patrocinate : Sr. Carlos B. González F. – Instituto de Fisiología –
Facultad de Medicina.
Carolina Ivonne Villanueva Mohr
Valdivia Chile 2004
Dedicatoria
Dedicada a mi Familia
en especial a mi Madre Marlene Mohr F.
y mis abuelos Julia y Osvaldo.
También quisiera dedicar esta tesis a mi Padre
que si bien no esta entre nosotros siempre será parte de mi Vida.
Agradecimientos
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Quisiera expresar mis más sinceros agradecimientos a mi profesor patrocinante el Dr. Carlos
González por permitirme formar parte de este proyecto de investigación, permitiéndome así,
desarrollarme como profesional en el área de la investigación.
También quisiera agradecer a todo el personal del instituto de Fisiología comenzando por: el B.Q.
Sr Carlos Reyes, T.M. Sra Silvia Troncoso, por su constante preocupación. También quisiera
agradecer a la B.Q. Sra Danae Campos por sus constantes guía y preocupación a lo largo de esta
tesis. Al igual quisiera agradecer al B.Q. Sr. José Sarmiento por sus consejos.
Quisiera agradecer al Laboratorio de Farmacología de la Facultad de Medicina Veterinaria al
permitirme el manejo equipos para el desarrollo de esta tesis.
A mis amigos y compañeros de laboratorio, Mauricio Sáez, Guetón Perdomo, Carolina Añazco y
Karina Vargas por su comprensión y ayuda.
A Osvaldo, por su tiempo, ayuda, preocupación y comprensión en los momentos difíciles.
Esta tesis fue realizada en el Instituto de Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad
Austral de Chile y financiada por el proyecto FONDECYT 1030206.
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LISTA DE ABREVIATURAS
α 2-AR : Receptor α 2 adrenérgico
ACTH : Hormona adenocorticotrópica.
ATP : Adenosina trifosfato
AVP : [Arg8]- Vasopresina
[3H] AVP : [Arg8]- Vasopresina tritiada
BSA : Albúmina de suero de bovino
cAMP : Adenosina monofosfato cíclico
cDNA : DNA complemetario
DAG : Diacilglicerol
DEPC : Dietilpirocarbonato
DMEM : Medio Eagel modificado por Dulbecco
DMSO : Dimetilsulfóxido
DNasa H : Desoxirribonucleasa H
dNTP : Deoxirrobonucleótidos
EDTA : Acido etilendiaminoteraacético
FcIgG : Segmento Fc de inmunoglobulina G
FSH : Hormona folículo estimulante
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GFP : Proteína verde fluorescente
GPCRs : Receptores acoplados a proteína G
GPKs : Kinasas de receptores acoplados a proteína G.
HEPES : N(2 hiroxietilpiperazina-N(2etanosulfónico)
IP3 : Inositol trifosfato
KD : Constante de disociación
LB : Medio de cultivo Luria-Bertani
LH : Hormona luteinizante
LDL : Lipoproteínas de baja densidad
LMP : Agarosa de bajo punto de fusión
MDCK : Línea celular derivada de epitelio de riñón de perro
mGluR7 : Receptor de glutamato metabotrópico R7
NDI : Diabetes insípida nefrogénica
PCR : Reacción en cadena de la polimerasa.
PKA : Proteína kinasa A
PKC : Proteína kinasa C
PLC : Fosfolipasa C
RNasa : Ribonucleasa
TSH : Hormona tirotrofina.
RT-PCR : Reacción de la polimerasa en cadena desde RNA total.
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V1a : Receptor V1a de vasopresina
V1b : Receptor V1b de vasopresina
V2 : Receptor V2 de vasopresina
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1. RESUMEN
Estudios en células polarizadas han demostrado que los receptores acoplados a proteínas G
(GPCRs) se encuentran en la superficie apical o basolateral de la célula o en ambas. Los
receptores de vasopresina pertenecen a esta superfamilia de GPCRs. Por lo menos 3 subtipos de
receptores de vasopresina han sido identificados, V1a, V1b o V3 y V2. El receptor V1b se
expresa mayoritariamente en pituitaria anterior y por acción de vasopresina se produce la
secreción de la hormona adrenocorticotropa (ACTH). Estudios previos han demostrado que los
receptores V1a y V2 de vasopresina se localizan en la membrana basolateral de células
polarizadas. En el presente trabajo se estudió la localización subcelular del receptor V1b en
células MDCK. Mediante RT-PCR se clonó el cDNA del receptor V1b de hipófisis de rata en el
vector pGEM-T y luego se subclonó tanto en el vector pcDNA 3.0 como también en pEYFP-N1,
dejando al receptor V1b y a la proteína amarilla fluorescente (YFP) en el mismo marco de
lectura. Posteriormente, se realizaron transfecciones estables utilizando ambas construcciones y
se comprobó la expresión de la proteína quimérica mediante Western-blot. Ensayos funcionales
permitieron establecer que el receptor V1b acoplado a YFP se une a vasopresina con una afinidad
similar al receptor nativo y es igualmente capaz de aumentar las concentraciones de calcio
intracelular. Mediante microscopía confocal se determinó que el receptor V1b se destina
mayoritariamente a la superficie basolateral en células MDCK al igual que los receptores V1a y
V2.
SUMMARY
Studies in polarized cells have demonstrated that G-protein coupled receptors (GPCRs) localized
in apical or basolateral surface of the cell. Arginine vasopressin (AVP) receptors belong to the
superfamily of GPCRs. At least three receptor subtypes have been identified, V1a, V1b o V3 and
V2. V1b receptor is expressed mainly in anterior pituitary and its activation modulates the release
of adrenocorticotropic hormone (ACTH). Previous studies have demonstrated that V1a & V2
vasopressin receptors localize in the basolateral membrane in polarized cells. In this work, we
studied subcellular localization of V1b receptors in MDCK cells. We used RT-PCR to clone V1b
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c-DNA from rat pituitary to pGEM-T vector and then we subcloned V1b in pcDNA 3.0 and
pEYFP-N1 plasmids, leaving the receptors V1b and the fluorescent yellow protein (YFP) in
frame. Then, stable transfections using both constructions were carried out and the expression of
the fusion protein was performed by Western blotting. Functional assays allowed us to establish
that V1b receptor coupled to YFP binds vasopressin with an affinity similar to native receptor
and it was able to increase the intracellular calcium concentration. Using confocal microscopy we
found that V1b receptor is targeted to the basolateral membrane in MDCK cells, like V1a and V2
receptors.
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2. INTRODUCCION
La hormona arginina (Arg8)vasopresina (AVP), es un nonapéptido cíclico compuesto por nueve
residuos aminoacídicos y un puente disulfuro entre las Cys 1 y 6 (Du Vigneaud, 1954). En
mamíferos es sintetizada como prohormona junto a su neurofisina respectiva (Ritchter, 1983),
principalmente en las neuronas magnocelulares del núcleo supraóptico y paraventricular del
hipotálamo y es liberada a la circulación sistémica en el lóbulo neural de la hipófisis (Pickering
et. al., 1983). A su vez, AVP, es también liberada dentro del sistema nervioso central mediante
prolongaciones axonales que nacen en los núcleos hipotalámicos y que se proyectan a distintas
regiones del cerebro. El control fisiológico de la síntesis y liberación de AVP es regulado por
cambios en la osmolaridad plasmática, lo cual es detectado por osmorreceptores especializados
ubicados en la región del hipotálamo anterior (Thrasher et. al. 1982; Yang et. al. 1994).
Esta hormona a nivel periférico ejerce diferentes efectos biológicos, en el riñón regula el balance
de solutos y agua, participa además, en la contracción de la musculatura lisa vascular, agregación
plaquetaria, glicogenólisis hepática y secreción de la hormona adrenocorticotropa (ACTH). A
nivel cerebral actúa como neurotransmisor en varias respuestas fisiológicas tales como
termorregulación y modulación del aprendizaje y memoria (Grazzini et. al., 1996).
Los efectos biológicos de esta hormona están mediados por una familia de receptores acoplados a
proteína G (GPCR), que poseen siete dominios de transmembrana hidrofóbicos alternados por
dominios intra y extracelulares, además de un amino terminal extracelular y un carboxilo
terminal citoplasmático (Jard et. al., 1986). Tres subtipos de receptores de vasopresina han sido
identificados sobre la base de sus diferentes perfiles farmacológicos y funcionales los que han
sido denominados V1a, V1b ó V3 y V2 (Jard et. al., 1986).
El receptor V2 se expresa predominantemente en las células principales del túbulo colector renal,
donde controla la liberación y reabsorción de agua y urea vía la estimulación de adenilatociclasa
(Thibonnier et. al., 1994). Se han clonado en la ultima década los receptores V2 de rata (Lolait et.
al., 1992) y humano (Birnbaumer et. al., 1992), como también el V2 de ratón, cerdo y bovino
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(Oksche et. al., 2002). El cDNA del receptor V2 presenta una secuencia nucleotídica de 1.222 pb,
que codifica para una proteína de 370 aminoácidos (MR = 40.518). Posee dos sitios putativos de
N-glicosilación en el extremo amino terminal extracelular y numerosos sitios de fosforilación en
la región carboxilo terminal de la proteína (Lolait et. al., 1992).
La unión de AVP al receptor V2 estimula adenilatociclasa, produciendo aumento de AMPc y una
posterior activación de proteína Kinasa A (Birnbaumer, 2000) induciendo la inserción de
vesículas que contienen aquaporina 2 en la membrana apical, permitiendo de esta forma la
reabsorción de agua en las células principales en el túbulo colector renal (Laycock, et. al., 1998).
Por otra parte el receptor V1a también conocido como V1a vascular / hepático, se encuentra más
ampliamente difundido, encontrándose presente en la musculatura lisa vascular, hepatocitos,
plaquetas, linfocitos, monocitos, neumocitos tipo II, en la corteza adrenal, cerebro (hipocampo,
septum, y amígdalas), órganos reproductivos, epitelio renal, células renales mesangiales,
produciendo en estos tejidos contracción y proliferación celular, agregación plaquetaria, aumento
de los factores de coagulación y la glicogenólisis (Thibonnier et. al., 1994).
En los últimos tiempos se ha clonado el receptor V1a de hígado de rata (Morel et. al., 1994)
hígado de humano (Howl et. al., 1991). El cDNA del receptor V1a de hígado de rata posee una
secuencia nucleotídica de 1.354 pb que codifica para una proteína de 394 aminoácidos con una
masa molecular aparente de 44.202 Da. Este receptor presenta dos sitios putativos de Nglicosilación en el extremo amino terminal extracelular y numerosos sitios potenciales de
fosforilación localizados en el tercer dominio intracelular y en la región carboxilo terminal, lo
que sugiere que la función del receptor es regulada por proteínas kinasas (Morel et. al., 1992).
Thibonnier y colaboradores clonaron en 1994 el cDNA del receptor V1a de hígado humano
encontrando una secuencia nucleotídica de 1.472 pb que codifica para una proteína de 418
aminoácidos.
Estudios farmacológicos y bioquímicos desarrollados en cultivos primarios de pituitaria de rata
han mostrado la existencia de un receptor específico de pituitaria para la liberación de AVP
relacionado con el receptor V1 (Antonni et. al., 1988). Este receptor es, sin embargo,
farmacológicamente distinto al receptor V1a presente en hígado, cerebro, médula adrenal y
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musculatura lisa vascular. Es por ello que se ha denominado V1b ó V3. El receptor V1b ha sido
localizado en las células corticotropas de la pituitaria anterior de humanos y ratas (Antonni et. al.,
1984; 1988; DuPasquier et. al., 1991) donde media la secreción de ACTH. También se ha
observado que es expresado en menor grado en algunas áreas discretas del cerebro y algunas
células endocrinas (Burbach et. al., 1992; Lolait et. al., 1995; Richardson et. al., 1995 y Grazzini
et. al., 1996). También se ha encontrado en algunos tejidos periféricos como riñón, timo, corazón,
pulmón, bazo, útero y mamas (Lolait et. al., 1997).
En rata, el gen del receptor V1b presenta tres exones y dos intrones, un primer intrón corto de
161 pb similar al descrito para el receptor de oxitocina y un segundo intrón de aproximadamente
9 Kb que está ubicado en el final del sexto dominio de transmembrana, lo cual es característico
de otros receptores de esta familia (Rozen et. al., 1995; Thibonnier et. al., 1996 y Ventura et. al.,
1999). Parte del segundo exón codifica para los primeros seis dominios de transmenbrana y parte
del tercer exón codifica para el séptimo dominio de transmembrana (Aguilera et. al., 2003).
En la última década se han clonado dos tipos de cDNA del V1b de hipófisis de rata. Saito y
colaboradores en 1995 clonó el receptor V1b obteniendo una secuencia nucleotídica de 1.275 pb
que codifica para una proteína de 425 aminoácidos, con una masa molecular aparente de 47.031
Da. Por otra parte, Lolait y colaboradores en 1995 clonaron el cDNA de hipófisis de rata del
receptor V1b obteniendo una secuencia nucleotídica de 1.263 pb que codifica para una proteína
de 421 aminoácidos de una masa molecular aparente de 46.683 Da. En tanto, el cDNA del V1b
de hipófisis de humano (Keyzer et. al., 1994; Sugimoto et. al., 1994) presenta 1.272 pb y codifica
para una proteína de 424 aminoácidos que presenta una masa molecular aparente de 46.947 Da
(Keyzer et. al., 1994).
El receptor V1b de vasopresina presenta un sitio de N-glicosilación (Asn21) en el dominio Nterminal extracelular y potenciales sitios de fosforilación para proteína kinasa A en Thr375,
proteína kinasa C en Thr385 y caseína kinasa en Ser403 en la región C-terminal intracelular.
Presenta un numero alto de residuos conservados, como por ejemplo, Cys107 y Cys186 en el
segundo y tercer dominio extracelular con los cuales puede formar un puente disulfuro requerido
para la estructura del receptor, además, dos potenciales sitios de palmitoilación en Cys352 y Cys353
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en el extremo C-terminal intracelular que pueden estar envueltas en el anclaje del receptor a la
membrana plasmática (Lolait et. al., 1995).
La unión de AVP a los receptores tipo V1 (V1a y V1b), produce la activación de una proteína
denominada Gq/11 que activan a su vez a fosfolipasa C, la cual es una enzimas especificas de
fosfoinositol, encargadas de degradar el fosfoinositol bisfosfato (PIP 2), generando inositol
trifosfato (IP3) y diacilglicerol. Varios estudios han demostrado la existencia de una variedad de
vías de señalización asociadas al receptor V1a expresado endógentamente en el tejido o líneas
celulares. Estos incluyen activación de fosfolipasa A2 y D que incrementan el calcio intracelular
y permite la acidificación celular a través de la activación de la bomba Na+/H+ (Briley et. al.,
1994).
El IP3, pequeña molécula hidrosoluble, difunde por todo el citosol y gatilla dentro de la célula la
liberación de Ca+² desde el retículo endoplasmático, al unirse a canales de Ca+². Por otra parte, el
diacilglicerol puede ser degradado a ácido araquidónico que puede actuar como mensajero o ser
utilizado en la síntesis de eicosanoides. Por otro lado, el diacilglicerol activa a una proteína
serina/treonina kinasa denominada proteína kinaza C produciendo fosforilación de proteínas
(Thibonnier et. al., 1994; Alberts et. al., 1996).
El estudio del tráfico y destino intracelular de GPCR es importante puesto que la función de la
cascada de transducción de señales, requiere de la correcta distribución de las proteínas que
participan en ella (Schülein et. al., 1998). Un modelo ampliamente utilizado en el estudio del
correcto tráfico de proteínas de membrana son las células epiteliales polarizadas (RodriguezBoulan y Gonzalez, 1999). Estas células forman una barrera que separa compartimentos
biológicos y que regula la homeostasis a través del control del transporte de iones y solutos desde
los distintos compartimentos.
La membrana de células epiteliales polarizadas presenta un dominio apical y un dominio
basolateral separados por “tight junction” o uniones estrechas. Cada dominio está compuesto por
distintos tipos de proteínas y lípidos, permitiéndole de este modo cumplir diversas funciones
biológicas (Lipardi et. al., 2002; Roush et. al., 1998). En el caso particular de los GPCRs
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heptahélices, éstos han sido ubicados tanto en el dominio apical como basolateral de células
epiteliales (Hermosilla et. al., 2001).
El mantenimiento de la asimetría de las proteínas en los distintos dominios de membrana, es
realizado por un continuo tráfico de las proteínas recién sintetizadas, desde el Trans-Golgi
Network (TGN) a la membrana plasmática por medio de vesículas. Este tráfico puede ocurrir por
dos vías, directa o indirecta. En la vía directa las proteínas recién sintetizadas son transportadas
desde el TGN a uno de los dominios de membrana ya sea apical o basolateral. Un ejemplo es lo
que ocurre con los receptores α2A
y
α2C adrenérgicos, que son distribuidos directamente a la
membrana basolateral (Keefer et. al., 1994; Wozniak et. al., 1996). Por el contrario, en la vía
indirecta o transcitosis, las proteínas son primero enviadas desde el TGN a un dominio desde el
cual son endocitadas y transportadas a la superficie opuesta. Es el caso del receptor de
polinmunoglobulinas (pIgR) éste es endocitado desde el dominio basolataeral y transportado al
domino apical (Lipardi et. al., 2002; Kéller et. al., 1997 y Sarnataro et. al., 2000).
Se han identificado señales de distribución apical y basolateral, sin embargo, la correcta
distribución de las proteínas de membrana parece depender del correcto balance entre las señales
apicales y basolaterales (Nelson y Yeaman, 2001; Matter y Mellaman, 1994). Dentro de las
señales de distribución basolateral encontramos los motivos que contienen tirosina como es
YXXØ (donde X representa cualquier aminoácido y Ø cualquier aminoácido con un grupo
hidrofóbico) importante en la mediación de la endocitosis por clatrina (Bonifacino y
Dell’angelica, 1999). Otra señal de distribución basolateral característica es el motivo di-leucina
(Hunziker y Fumey, 1994; Mirande et. al., 2001). Por otra parte se han identificado
microdominios de membrana enriquecidos en esfingolípidos y colesterol conocidos como rafts o
balsas lipídicas que cumplen un rol en la distribución hacia la superficie apical (Simons e Ikonen,
1997). Algunas de las proteínas que se encuentran en la superficie apical presentan glicosilfosfatidilinositol (GPI) (Brown y Rose, 1992). También se ha descrito que la presencia de N y
O-glicanos en el dominio luminal de las proteínas promueve la distribución apical posiblemente
debido a interacciones con lectinas en el TGN que inducen a la proteína a dirigirse a la superficie
apical (Fiedler et. al., 1994). La retención y distribución de proteínas juega un rol crucial en el
mantenimiento de la polaridad celular, por ejemplo, la cola citoplasmática de varias proteínas que
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se encuentran en la superficie basolateral contienen dominios de unión a PDZ los cuales
interactúan con proteínas PDZ citosolicas, reteniéndola en la membrana (Fanning y Anderson,
1999).
Se han realizado numerosos estudios de tráfico y distribución subcelular de GPCR utilizando
como modelo células epiteliales polarizadas, un ejemplo de ello son, los receptores α2A (Keffer y
Limbrird, 1993), α2B, α2C adrenérgico (Woznaok y Limbird, 1996), al igual que el receptor de la
hormona estimulante de la tiroide (TSH), el receptor de la hormona folículo estimulante (FSH) y
el receptor de la hormona luteinizante LH (Beau et. al., 1997) y el receptor purinérgico P2Y11
(Zambon et. al., 2001) los cuales se expresan en el dominio basolateral de la célula. Por el
contrario, en el dominio apical ha sido observado el receptor A1 de adenosina (Saunders et. al.,
1996) y el receptor de rodopsina (Chuang y Sung, 1998).
En el caso particular de los receptores de vasopresina, se ha establecido que los receptores V1a
(Campos et. al., 2001) y V2 (Shülein et. al., 1998; Andersen-Beckh et. al., 1999) de vasopresina
se localizan en la membrana basolateral de células polarizadas. Estudios recientes han mostrado
la presencia de señales de distribución basolateral en el segundo dominio intracelular del receptor
V2, prevaleciendo frente a las señales apicales encontradas en el carboxilo terminal (Hermosilla y
Schülein, 2001). Por el contrario, en el receptor V1a se han descrito en el C-terminal motivos
hidrofóbicos tal como Leu-Leu que podrían estar envueltos en el destino a la membrana
basolateral (Campos et. al., 2001). Es por ello, que como objetivo general de esta tesis se ha
considerado de interés estudiar la distribución subcelular del receptor V1b de hipófisis de rata en
células epiteliales polarizadas (MDCK), un modelo de estudio bien caracterizado, utilizando
proteína amarilla fluorescente (YFP), una variante de la Aequorea victoria green (GFP) como
marcador molecular del monitoreo de proteínas.
Como hipótesis de este trabajo se planteó que el receptor V1b acoplado a la proteína YFP
presenta una distribución basolateral en células polarizadas y conserva las características
funcionales similares al receptor V1b nativo.
Para determinar la validez de la hipótesis planteada se propusieron los siguientes objetivos
específicos:
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1. Clonar el fragmento codificante del receptor V1b de vasopresina desde hipófisis de rata.
2. Subclonar el fragmento codificante del receptor V1b de vasopresina acoplado a la proteína
amarilla fluorescente (YFP)
3. Expresar de forma estable el receptor V1bYFP en células epiteliales polarizadas MDCK.
4. Realizar ensayos funcionales del V1bYFP.
5. Determinar la localización subcelular del receptor V1b de vasopresina en MDCK.
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3. MATERIALES Y METODOS
3.1. Materiales
3.1.1. Reactivos
En el desarrollo de esta tesis, se emplearon los siguientes reactivos:
Sigma Chemical Co.: Bromuro de etidio (EtBr), agar, kanamicina, ampicilina, extracto de
levadura, peptona, tritón X-100, lisozima, lauril sulfato de sodio (SDS), N,N,N’,N’tetrametiletendiamina (TEMED), bicarbonato de sodio, fosfato de sodio monobásico, ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido (N[2 hiroxietilpiperazina-N(2 etanosulfónico)])
(HEPES),
acetato
de
sodio,
colorante
azul
de
tripan,
ATP-Tris,
ácido
4((dipropilamino)sulfonil)benzoico) (Probenecid), RNasa A, azul de bromo fenol, tripsina, polilisina, dimetil sulfóxido (DMSO), dietilpirocarbonato (DEPC).
Merck, Darmstadt, Alemania: glicerol, ácido acético glacial, isopropanol absoluto, etanol
absoluto, cloruro de sodio, ácido clorhídrico, acetato de sodio, hidróxido de sodio, acetato de
potasio, cloruro de magnesio, persulfato de amonio (APS), glucosa, cloruro de calcio.
Invitrogen : Enzima Superscript II RT (200U/μl), tampón primera hebra 5X, Oligo dT15-18
(500μg/ml), DTT 0.1M, deoxirribonucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), DNasa I (1U/µl),
MgCl2 25 mM, tampón 10X DNasa I, Taq DNA polimerasa (5U/μl), MgCl2 50 mM, tampón 10X
para PCR, las endonucleasas EcoRI (10U/μl), HindIII (10U/μl), XbaI (10U/µl), SalI (10U/µl),
NotI (15U/µl), SmaI (10U/µl), KpnI (10U/µl), ApaI (10U/µl), BamHI (10U/µl), tampón
endonucleasas 2 (Tris-HCL 50mM pH:8.0, MgCl2 10mM, NaCl 50mM), tampón endonucleasas 3
(Tris-HCL 50mM pH:8.0, MgCl2 10mM, NaCl 100mM), tampón endonucleasas 4 (Tris-HCL
20mM pH 7.5, MgCl2 5mM, KCl 50mM), marcador de tamaño molecular 1 Kb DNA ladder,
marcador de tamaño molecular de 100 pb, DNA /HindIII (0,5μg/μl), células DH5α, medio Eagle
modificado por Dulbecco (DMEM), antibiótico antimicótico (penicilina 10000 U/ml,
streptomicina 10 mg/ml, anfotericina b 25 µg/ml).
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Promega: T4 ligasa , tampón 10X para T4 ligasa, Kit pGEM-T, Kit sistema de purificación de
midiprepraraciones de DNA “Wirzard Plus”
Clontech: Vector pEYFP-N1
Qiagen: Kit de purificación DNA QIAEX® II.
Boehringer-Mannheim - Roche: FuGene 6
Biotex.USA: Ultraspec RNA.
NEN Research Products: [3H]AVP
Molecular Probes: Fura 2, anticuerpo anti-GFP
Frigoosor: Suero bovino fetal
Femelo : Mezcla de Centelleo
Equilab: Isopropanol, tolueno, ácido ácetico, metanol.
Fluka A.G: Paraformaldehido.
Dako: Medio de montaje para preparaciones fluorescentes
Bios Chile:
VRBF: 5`CGGGATCCTTCCCCTCCTTCTCTCCCTGA3`
VRBR: 5’GCTCTAGAGAACCAGAGTCCAGGGAATCT3’
V1F: 5’CCCAAGCTTTCCCTGAAATTCTAACTATGAATTCTG3’
V1BpEGFPN1: 5’ACGCGTCGACAAAAAGATGCTGGT3’
3.1.2. Equipos
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Termociclador M.J. Research (MiniCyclerTM), baño termorregulado Memmert, lámpara UV
Camag (type TL900/U), centrífuga clínica Heraeus christ (Biofuge A), agitador termorregulado
Lab-Line (Environ Shaker), fuente de poder Bio-Rad (power PAC200), cámara de electroforesis
para geles de agarosa Bio JSP, transluminador UV Viber-Lourmant, estufa de cultivo Memmert,
cámara fotográfica instantánea Polaroid (DS34), cámara de flujo laminar Nuaire (clase II tipo A),
baño termorregulado Kottermann, estufa de cultivo celular con CO2
Forma Scientific,
microscopio invertido Nixon-TMS, pipeteador automático Durmmand, agitador magnético Cole
Parmer (mod. 4658. Stirrer/ Hot plate), pHmetro WTW (pH521), centríguga clínica Internacional
Equipment (mod. CL), agitador Scientific Industrial (Vortex-2 Genie), balanza electrónica
Shimadzu (321-33557), Balanza analítica Sartorius (LA250S), microscopio de fluorescencia
Zeiss (Axiskop HBO50 con cámara fotográfica MC80), microscopio confocal Micro System
Zeiss LSM (Axiovert 135M, láser aragón), Centrífuga Kubota (KR-20000T), espectrofotómetro
Shimadzu (UV-150-02), bomba de vacío Meduak, espectrofluorímetro Perkin-Elmer (LS50B).
3.1.3. Animales de experimentación
Se extrajo la hipófisis a seis ratas macho Holtzman (Rattus norvergicus), de 300 g cada una, las
cuales estuvieron bajo condiciones normales de laboratorio.
3.2. Métodos
3.2.1. Clonamiento del fragmento codificante del receptor V1b de hipófisis de rata
3.2.1.1. Extracción RNA total
Se realizó la extracción de RNA total según el método descrito por Chomczynski y Sacchi en
1987 con algunas modificaciones según kit Ultraspec.
Hipófisis extraídas de los animales descritos en el punto 3.1.3 se homogenizaron con 1ml de
Ultraspec, se incubó durante 5 min a 4ºC, se agregaron 200 µl de cloroformo por cada ml de
Ultraspec mezclando vigorosamente e incubando en hielo por 5 min. Luego, se centrifugó a
12000 x g 15 min a 4ºC, extrayendo la fase acuosa donde se encuentra el RNA. Posteriormente el
RNA fue precipitado con un volumen de isopropanol igual al obtenido en la fase acuosa, se agitó
por 15 seg, y se dejó en hielo por 10 min, se centrifugó 12000 x g 10 min a 4ºC, se descartó el
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sobrenadante y el precipitado se lavó con 1 ml de etanol 75 diluido con agua estéril tratada con
DEPC. Luego, se mezcló en vortex y se centrifugó a 7500 x g por 5 min, repitiendo este
procedimiento 3 veces. El precipitado seco se disolvió con 50 µl de agua estéril tratada con
DEPC, se incubó 10 min a 55ºC y finalmente se almacenó a -20ºC.
3.2.1.2. Cuantificación RNA total
Para cuantificar el RNA total se midió la absorbancia a 260nm considerando que una unidad de
absorbancia corresponde a 40 μg/ml de RNA. Además se determinó la absorbancia a 280 nm para
obtener una razón A260/A280 que debe ser mayor de 1.5. En una cubeta de cuarzo se cargó 1 ml
de agua estéril tratada con DEPC y se añadieron 4 µl de la muestra de RNA, calculándose la
concentración en µg/µl de RNA total.
3.2.1.3. Electroforesis en gel de agarosa 1,2 %, conteniendo formaldehído
Método descrito por Lehorach et. al., 1977 y modificado por Roser et. al., 1996 y se describe en
el Molecular Cloning (Sambrook y Russell, 2001)
Para determinar la integridad del RNA total de hipófisis de rata, se realizó una electroforesis en
gel de agarosa al 1,2% formaldehído 2.2 M, en tampón MOPS 10X (MOPS 0,2 M, acetato de
sodio, 20 mM, EDTA 10 mM pH 8,0). La muestra contenía 20µg RNA total, formaldehído 2,2 M,
formamida (denaturada e incubada a 55ºC por 60 min) y tampón de muestra en una proporción
1:10 (glicerol 50%, EDTA 10 mM, azul de bromo fenol 0,25%). Posteriormente se efectuó la
observación de la muestra por exposición del gel sobre el transluminador UV.
3.2.1.4. Síntesis del cDNA del receptor V1b de hipófisis de rata
Se utilizaron 5 μg de RNA total, el cual fue incubado con DNasa I 1U, tampón DNasa I 10X
(acetato de sodio 20 mM, CaCl2 5 mM, PMSF 0,1 mM, glicerol 50 %), en un volumen final de 10
µl, durante 1 h a 25ºC. Luego, se añadió EDTA 25 mM y se incubó por 10 min a 65ºC, para
inactivar la enzima. Se tomaron 0,5 µg del RNA total tratado con DNasa I para la síntesis de la
primera hebra, el cual fue incubado con 500 ng de oligo dT15-18ner durante 5 min. a 70ºC en un
volumen final de 12 μl. Luego se completó a 20 μl con una mezcla que contenía Tris-HCL 50
19
mM pH 8,3, MgCl2 3 mM, 10 mM DTT, 10 mM de cada uno de los desoxirribonucleótidos
(dNTPs) y 100 U de Superscript II RNasa H transcriptasa reversa. La reacción se incubó a 52ºC
durante 50 min, y la enzima se inactivó calentando la mezcla a 70ºC por 10 min. El cDNA
obtenido fue almacenado a -20°C para su posterior utilización. Método descrito en Molecular
Cloning (Sambrook y Rossell, 2001).
3.2.1.5. Diseño de partidores específicos para el receptor V1b de vasopresina
Los partidores específicos para el receptor V1b de vasopresina fueron diseñados a partir de la
secuencia del RNA de rata publicada por Saito y colaboradores (1995). El partidor sentido VRBF
5`CGGGATCCTTCCCCTCCTTCTCTCCCTGA3` que incorpora un sitio de restricción BamH I
y antisentido VRBR 5’GCTCTAGAGAACCAGAGTCCAGGGAATCT3’ que incorpora un sitio
de restricción Xba I que amplificó por RT-PCR un fragmento de 1300 pb que comprende la
secuencia completa del fragmento codificante del receptor V1b de hipófisis de rata.
3.2.1.6. Amplificación del fragmento codificante del receptor V1b de hipófisis de rata
La secuencia completa del fragmento codificante del receptor V1b de hipófisis de rata fue
amplificada mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando el
método descrito por Saito et. al., 1995 y modificado en nuestro laboratorio. Para ello se utilizó
como molde el cDNA sintetizado en el método 3.2.1.4. Para la amplificación se ocuparon 5 μl del
producto de la transcripción reversa en 50 μl de una reacción que contenían Tris-HCL 50 mM pH
8.3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 10 mM de cada desoxirribonucleótido trifosfato (dNTPs),
partidores sentido VRBF y anti-sentido VRBR 10 µM de cada uno y 5U de Taq DNA polimerasa
(invitrogen). Antes de agregar la enzima la mezcla fue denaturada a 95ºC x 5 min. La
amplificación se completó en 34 ciclos con los siguientes pasos: denaturación, 95ºC x 1 min;
apareamiento, 58ºC x 1 min; extensión, 72ºC x 2 min, seguido de una extensión final de 10 min a
72 ºC.
3.2.1.7. Electroforesis en gel de agarosa al 1 %
Para la identificación del producto de amplificación y observación de productos de digestión, se
preparó un gel de agarosa y agarosa LMP al 1% en tampón TAE 1X (Tris 20 mM, ácido acético
20
10 mM y EDTA 500 µM) con 0,5 μg/ml de bromuro de etidio. Se utilizó como tampón de
muestra una solución compuesta por azul de bromo fenol al 0,25% y glicerol al 30% en agua
destilada. Los geles se corrieron aproximadamente 30 min a 100 V en tampón de corrida TAE 1X
y el DNA se observó por exposición del gel sobre transiluminador UV. Método descrito en
Molecular Cloning (Sambrook y Russell, 2001).
3.2.1.8. Clonamiento del fragmento codificante del receptor V1b de rata en el vector
pGEM-T
El kit comercial sistema de ensayo pGEM®-T Easy (Promega) fue utilizado para obtener un clon
del fragmento codificante del receptor V1b de rata. Este se basa en la actividad de la Taq DNA
polimerasa para agregar una última cola de desoxirribonucleótidos independiente de templado al
extremo 3’ del DNA amplificado, la cual corresponde en un 90% a desoxiadenina en una típica
reacción de amplificación. El vector posee a la vez una cola de poliT en su extremo 3´. El kit
utiliza el vector plasmidial pGEM®-T Easy de 3.018 Kb. La ligación inserto-vector se basa en la
complementariedad de los extremos poliA y poliT. Se siguen las proporciones descritas en el
catálogo para la cantidad de producto de PCR. Según la reacción de ligación se mezclaron 5 µl
del tampón de ligación Rapid 2X T4 DNA ligasa (Tris-HCL 60 mM pH 7.8, MgCl2 20 mM,
DTT 20 mM, ATP 2 mM, polietilen glicol 10%), 50 ng del vector pGEM-T 1 µl, 2 µl del
producto de amplificación, 1U de T4 DNA ligasa en un volumen final de 10 µl. La mezcla fue
incubada durante toda la noche a 4°C.
3.2.1.9. Transformación de células competentes
Método proporcionado por Invitrogen junto a la compra de células competentes (Miller, 1972;
Tratof y Hobbs, 1987; Hanahan, 1983).
Células competentes DH5α, se descongelaron sobre hielo y se incubaron con 3 μl de la mezcla de
ligación por 30 min. La mezcla se calentó a 37ºC por 20 seg y se enfrió en hielo nuevamente por
2 min. Se agregaron 950 μl de medio LB (peptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 10 g/l,
ajustado a pH 7,5) previamente equilibrado a 37°C y las células se incubaron con agitación de
225 rpm por 1 hora. Se centrifugaron las células 5 min a 1500 x g y el precipitado fue
resuspendido en 100 μl de LB.
21
La mezcla de la transformación se sembró en placas LB-Agar (15 g/l) ampicilina (50 μg/ml) para
las transformaciones con los vectores pGEM-T y pcDNA 3.0. En el caso del vector de expresión
pEYFP-N1 se utilizó kanamicina (30 μg/ml). Las placas de cultivo se incubaron toda la noche a
37°C. Método descrito por Hanahan 1988 y modificado en nuestro laboratorio.
3.2.1.10.
Purificación
de
DNA
plasmidial
recombinante
en
pequeña
escala
(minipreparaciones)
Colonias aisladas de una placa LB-ampicilina o de LB-kanamicina fueron inoculadas en 5 ml de
medio LB (peptona 10 g/l , extracto de levadura 5 g/l, NaCl 10 g/l, ajustado a pH 7,5)
conteniendo 50 μg/ml de ampicilina o 30 μg/ml kanamicina y se incubaron a 37°C con agitación
constante durante toda la noche. Un volumen de 1,5 ml del cultivo fue centrifugado a 12000 x g
por 5 min a temperatura ambiente y el precipitado fue resuspendido en 300 μl de una solución
TENS (SDS 10 %, NaOH 10 N, TE 1X (Tris-EDTA) pH 7,5) recién preparado. Luego se
añadieron 150 μl de acetato de sodio 3 M pH 5.4 se mezclaron en vortex y se centrifugó por 2
min a 12000 x g. El sobrenadante se precipitó con 900 μl de etanol 100 % incubando por 30 min
en hielo y centrifugando por 10 min a 12000 x g. Se lavó el precipitado con etanol 70 % y el
precipitado se secó a temperatura ambiente antes de resuspenderlo en 50 μl de agua desionizasa
eséril conteniendo RNasa (100 μg/ml). Método descrito en Molecular Cloning (Sambrook y
Rossell, 2001).
3.2.1.11. Digestión del DNA plasmidial recombinante purificado por minipreparación
Para determinar que colonia obtenida de la transformación presenta el fragmento codificante del
receptor V1b de rata, se realizó una digestión con endonucleasas, usando como templado el DNA
purificado según el método 3.2.1.10.
Una alícuota de 10 µl del DNA plasmidial fue digerido con 10 U de endonucleasas, más 3 µl de
un tampón 10X común para las endonucleasas usadas en un volumen final de 30 µl a 37°C toda
la noche. Se ulitizaron las endonucleasas EcoRI, en el caso del clonamiento en el vector pGEMT, BamH I y Xba I en el caso del vector pcDNA 3.0 para liberar el inserto y con Sal I y Hind III
para el vector pEYFP-N1. Método descrito en Molecular Cloning (Sambrook y Rossell, 2001) y
modificado en nuestro laboratorio.
22
3.2.1.12.
Purificación
de
DNA
plasmidial
recombinante
en
mediana
escala
(midipreparación)
Para la purificación del DNA plasmidial a mediana escala se uso el kit comercial de Promega
“Wirzard plus”. Se cultivó 1 ml de la minipreparación en 100 ml de medio LB-ampicilina (50
µg/ml) o LB-kanamicina (30 µg/ml) a 37ºC toda la noche en agitación. Luego, el cultivo se
centrifugó a 10000 x g por 10 min a 4ºC y se resuspendió el precipitado en 3 ml de una solución
(Tris-HCL 50 mM pH 7.5; EDTA 10 mM pH 8.0 y RNasa A 100 μg/ul). Se añadieron 3 ml de
una solución de lisis (NaOH 200 mM, SDS 1 %), se mezcló por inversión por 5 min.
Posteriormente, se agregaron 3 ml de una solución neutralizante (KAc 1.32 M pH 4.8) y
nuevamente se mezcló por inversión. Se centrifugó el lisado a 14000 x g por 15 min a 4ºC, se
extrajo el sobrenadante y se le agregaron 10 ml de resina purificadora de DNA. Se transfirió la
resina a una minicolumna, se aplicó vacío para empaquetarla y se efectuaron dos lavados de 15
ml cada uno con una solución de lavado (etanol 55 %, KAc 80 mM, Tris-HCL 8.3 mM pH 7.5 y
EDTA 40 µM). Se secó al vacío la columna durante 30 seg y se colocó en un tubo Eppendorf
para ser centrifugada a 10000 x g por 2 min. Finalmente, se agregaron a la columna 300 µl de
agua y se centrifugó 5 min a 10000 x g. A 5 µl del DNA purificado se le midió la absorbancia a
260 nm, y se calculó la concentración considerando que una unidad de absorbancia corresponde a
50 μg/ul de DNA.
3.2.2. Subclonamiento del fragmento codificante de receptor V1b de hipófisis de rata en los
vectores pcDNA 3.0 y pEYFP-N1.
3.2.2.1. Digestión del fragmento codificante del receptor V1b de hipófisis de rata clonado
en el vector pGEM-T y del vector pcDNA 3.0
Se realizó el subclonamiento del fragmento codificante del receptor V1b de hipófisis de rata
desde el vector pGEM-T al vector pcDNA 3.0 digiriendo aproximadamente 5 μg de cada uno de
los DNA, con 3 µl de tampón común a las endonucleasas (Tris-HCL 50 mM pH 8.0, MgCl2 10
mM, NaCl 50 mM), 10 U de BamH I y Xba I en un volumen final de 30 µl. La mezcla se incubó
toda la noche a 37ºC. Método descrito en Molecular Cloning (Sambrook y Rossell, 2001)
modificado.
23
3.2.2.2. Purificación del DNA
Las digestión del fragmento codificante del receptor V1b y del vector de expresión eucarionte
pcDNA 3.0 fueron fraccionados por medio de una electroforesis en gel de agarosa de baja
densidad al 1% en TAE 1X por 30 min a 100 V. Luego, se cortaron las bandas correspondientes
bajo luz UV de baja intensidad y los fragmentos se purificaron utilizando el kit comercial
QIAEX® II (Qiagen). Posteriormente al trozo de gel se le agregaron 3 volúmenes de una solución
QX1 y 10 µl de la resina purificadora QiaeX II incubando10 min a 50°C para fundir la agarosa y
permitir la unión del DNA a la resina. Se centrifugó a 12000 x g por 30 seg y el sobrenadante fue
removido lavando el precipitado con 500 µl de la solución QX1. Se centrifugó 12000 x g por 30
seg, se lavó nuevamente el precipitado con una solución PE (etanol 100% mas tampón) y se
centrifugó 12000 x g por 30 seg. Luego, se secó el precipitado por 10 a 15 min y finalmente se
eluyó el DNA en 20 µl de agua estéril. Se incubó la muestra a 50 °C por 5 min, se centrifugó a
12000 x g por 2 min y se guardó el sobrenadante que contiene el DNA a -20°C para su posterior
utilización.
3.2.2.3. Amplificación por PCR del fragmento codificante del receptor V1b de rata
Se subclonó el fragmento codificante del receptor V1b de hipófisis de rata desde el vector
pGEM-T al vector pEYFP-N1 por medio de PCR. Para ello se utilizaron partidores específicos de
la
secuencia
del
V1b
de
rata
el
partidor
sentido
V1F
5’CCAAGCTTTCCCTGAAATTCTAACTATGAATTCTG3’ incorporó un sitio de restricción
Hind III y el partidor antisentido V1BpEGFPN1 5’ACGCGTCGACAAAAAGATGCTGGT3’
incorporó un sitio de restricción Sal I y se eliminó al codón de término del receptor V1b, dejando
al receptor V1b y a la proteína amarilla fluorescente (YFP) en el mismo marco de lectura. La
reacción de amplificación utilizó 1 ng pGEM-T/ V1b, tampón de reacción 10 X para Pfu DNA
polimerasa (Tris-HCL 200 mM pH 8,8, KCl 100 mM, MgSO4 20 mM, (NH4)2 SO4 100 mM,
Triton X-100 1 % y BSA 1 mg/ml libre de nucleasas), dNTPs 250 µM, 2,5 U de Pfu turbo DNA
polimerasa (Stratagene) en un volumen final de 50 µl. El programa utilizado consistió en una
primera etapa de denaturación a 95°C seguido por 34 ciclos de 95°C por 1 min, 58°C por 1 min,
68°C por 4 min y una extensión final a 68° por 10 min, finalizando a 4°C.
24
3.2.2.4. Digestión del fragmento codificante del receptor V1b de hipófisis de rata obtenido
por PCR y del vector pEYFP-N1
Las digestiones del fragmento codificante del V1b de hipófisis de rata obtenido por PCR descrito
en el método 3.2.2.3 y del vector pEYFP-N1, se realizaron utilizando aproximadamente 3 µg de
DNA, además de 3 µl de tampón común a las endonucleasas (Tris-HCL 50 mM pH 8.0, MgCl2
10 mM, NaCL 50 mM), 10 U de Hind III y Sal I en un volumen final de 30 µl. La mezcla se
incubó a 37ºC toda la noche. Método descrito en Molecular Cloning (Sambrook y Rossell, 2001).
Posteriormente, los fragmentos codificantes del receptor V1b de vasopresina y del vector pEYFPN1, fueron fraccionados en un gel de bajo punto de fusión, efectuándose la purificación de estos
mediante el método 3.2.2.2.
3.2.2.5. Reacción de ligación del fragmento codificante del receptor V1b de rata al vector
pcDNA 3.0 y pEYFP-N1
La reacción de ligación del fragmento codificante del receptor V1b de rata obtenido por digestión
al pcDNA 3.0 y del fragmento codificante del receptor V1b obtenido por PCR al vector pEYFPN1 se realizó utilizando una razón inserto/vector de 3:1. Para la reacción de ligación se preparó
una mezcla que contenía 30 ng del fragmento codificante, 10 ng del vector pcDNA 3.0 ó pEYFPN1, 1 μl del tampón T4 DNA ligasa 10X (Tris-HCL 500 mM pH 7,5; MgCl2 70 mM, DTT 10
mM y ATP 10 mM), 1U T4 DNA ligasa, en un volumen final de 10 μl. Se incubó a 4 ºC por 24
horas, luego de lo cual se transformaron células DH5α como se describió anteriormente.
Posteriormente se purificó el DNA plasmidial a pequeña y mediana escala como se describió en
3.2.1.10 y 3.2.1.12, obteniendo el fragmento codificante del receptor V1b de hipófisis de rata en
el vector pcDNA 3.0 (V1b/pcDNA 3.0 o V1b nativo) y fusionado a la proteína amarilla
fluorescente en el vector pEYFP-N1 (V1b/ pEYFP-N1 o V1bYFP).
3.2.2.6. Análisis de restricción del plasmidio V1b/pEYFP-N1 y V1b/pcDNA 3.0
El análisis de restricción del plasmidio V1b/pEYFP-N1 (V1bYFP) y del plasmidio V1b/pcDNA
3.0 (V1b nativo) de rata se llevó a cabo digiriendo 1µg de DNA con 10 U de cada endonucleasa,
25
3 µl de tampón común para las enzimas en un volumen final de 30 µl. La mezcla fue incubada
toda la noche a 37°C. Método descrito en Molecular Cloning (Sambrook y Rossell, 2001)
3.2.3. Expresión de los receptores V1b nativo y V1bYFP en células polarizadas MDCK
3.2.3.1. Cultivo celular
Células MDCK fueron cultivadas en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM),
suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado y 1% de antibiótico antimicótico, a 37°C
en una atmósfera húmeda y con 5 % de CO2. Las células fueron subcultivadas cada 3 o 4 días
utilizando tripsina-EDTA (tripsina 0,25%, EDTA 1 mM en PBS pH 8.0) durante 5 a 10 min, a
37°C. Según especificaciones del laboratorio. Método descrito anteriormente por Wozniak y
Limbrid et. al., 1996.
3.2.3.2. Transfecciones estables del receptor V1b nativo y V1bYFP
Se realizaron transfecciones estables del receptor V1b nativo y V1bYFP en células MDCK
utilizando el reactivo de transfección FuGene 6 según especificaciones del fabricante, ocupando
una razón de masa de DNA (µg)/ volumen de FuGene (µl) de 2:3. Se diluyó el FuGene 6 en
medio base DMEM libre de suero completando un volumen de 100 µl y se incubó por 5 min a
temperatura ambiente. Luego, la dilución de fuGene 6 se mezcló con el DNA y se incubó durante
15 min a temperatura ambiente. La mezcla se agregó a una placa de 100 mm de diámetro con
células MDCK cultivadas entre un 50-80% de confluencia. Luego de 48 horas, se inicia la
selección cultivando las células en presencia de 700 µg/ml de geneticina por un período de 2
semanas, al término de las cuales se seleccionaron aquellos clones que incorporaron el DNA
utilizando cilindros de clonamiento. Los clones fueron mantenidos en medio de cultivo con 200
µg/ml de geneticina .
3.2.4. Western-blot
3.2.4.1. Extracto total de células
Células MDCK y MDCK V1bYFP fueron cultivadas en placas de 100 mm de diámetro, luego de
lo cual se estimuló por 24 h con 20 mM butirato de sodio. Finalizado este período las células
26
fueron lavadas 3 veces con PBS 1X frío (4°C) durante 5 min (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM,
Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 2 mM) y que contenía los siguientes inhibidores de proteasas PMSF 1
mM, aprotinin 1 µg/ml y leupeptin 1 µg/ml. Luego, las células fueron cosechadas con espátula y
traspasadas a un tubo Eppendorf lavando la placa con 250 µl de PBS 1X/ inhibidores de
proteasas. Esta mezcla es homogenizada 2 a 5 veces con jeringa y sonicada con 10 pulsos a 40 de
amplitud. Finalmente se midió la concentración de proteínas utilizando el método de Bradford
(1976), midiendo la absorbancia a 595nm.
Posteriormente se centrifugó la muestra por 5 min a 12000 x g y el precipitado fue resuspendido
en 250 µl de tampón de muestra 5% SDS (Tris-HCL 0,5 M pH 6,8 1,25 ml, glicerol 98% 2,5 ml,
SDS 10% 5 ml, azul de bromo fenol 0.5% 0,2 ml, en un volumen final de 10 ml).
3.2.4.2. Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Se realizó una elecrtoforesis según el método de Laemmli (1970) de tampón discontinuo con
algunas modificaciones.
Las muestras de proteínas preparadas según el método 3.2.4.1 fueron resuspendidas en tampón de
muestra, DTT 100 mM, a una concentración final de 75 µg de proteínas totales. Las muestras
fueron calentadas durante 1 h a 37°C y cargadas al gel. Se prepararon minigeles de 1,5 mm de
espesor de acuerdo al siguiente protocolo: Gel separador al 10%: 2,5 ml tampón inferior (TrisHCL 1,5 M, pH 8,8), 3,3 ml acrilamida 30% (acrilamida 29.2% y bisacrilamida 0.8%), 4,1 ml
agua destilada, 100 µl persulfato de amonio al 10%; 15 µl Temed; 100 µl SDS 10%. Gel
espaciador 4%: 1,25 ml tampón superior (Tris-HCL 0,5 M, pH 6,8), 650 µl acrilamida 30 %
(acrilamida 29.2% y bisacrilamida 0.8%), 3,05 ml agua destilada, 100 µl persulfato de amonio al
10%, 10 µl Temed, 100 µl SDS 10%.
Se utilizó tampón de corrida (Tris base 25 mM, glicina 50 mM y SDS 0,1%). Para facilitar la
observación de la corrida se utilizó un estándar de marcadores moleculares preteñido (Winkler).
Una vez cargadas las muestras se realizó la corrida a 200 V por 1 h.
3.2.4.3. Transferencia de proteínas
27
Se realizó una transferencia de proteína según el método de Towbin (1979) modificado. Las
proteínas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa de 0,22 µm de diámetro de poro,
la membrana fue equilibrada junto con el gel durante 15 min en tampón de transferencia (Tris 48
mM, glicina 39 mM y metanol al 20%). La transferencia se realizó a 250 mA durante 3
h.Posteriormente, se efectuó el bloqueo de la membrana durante 1 h en una solución que contenía
PBS 1X, leche descremada 5% y Tween -20 0,3%.
El gel se tiñó por 5 min con una solución de azul de Coomassie R-250 al 0,1% en metanol 50% y
ácido acético 5%. El colorante no unido a las proteínas es retirado mediante lavados con una
solución de ácido acético 7,5 % y metanol 5 % durante 3 h aproximadamente.
3.2.4.4. Inmunodetección
Finalizado el bloqueo se lavó la membrana con PBS 1X tres veces por 5 min y se incubó con el
primer anticuerpo (anti-GFP 1:4000) en PBS 1X, leche descremada 5% y Tween-20 0,3%,
durante 1 h a temperatura ambiente con agitación constante.
Luego, se lavó la membrana 3 veces durante 5 min en PBS 1X, leche descremada 5% y Tween20 0,3% y se incubó con el segundo anticuerpo respectivo conjugado a peroxidasa diluido en
PBS 1X, leche descremada 5% y Tween-20 0,3% (1:50000 GAR-HRP) por 1 h a temperatura
ambiente y agitación constante.
Finalmente se lavó la membrana 3 veces durante 5min con una solución PBS 1X y Tween-20
0,3% y se reveló usando el método de quimioluminiscencia Super Signal®West Dura Extended y
película KodaK BioMax ML.
3.2.5. Ensayos de saturación.
Se cultivaron líneas estables de células MDCK, obtenidas de la transfección con el DNA
plasmidos V1b/pcDNA 3.0 y V1b/pEYFP-N1 a confluencia en placas de 24 pocillos durante 15
días. Luego de lo cual se estimuló por 24 h con 20 mM butirato de sodio.
Pasado los 15 días las células fueron lavadas 3 veces con D-PBS pH 7,4 (NaCl 137 mM, KCl 2,7
mM, MgCl2 10 mM, CaCl2 1 mM, Na2HPO4 10mM, KH2PO4 2mM, glucosa 0,5 g/ml, BSA 0,2
28
g/ml) y se incubaron durante 3 h en hielo con [3H]AVP 0.25, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0, 10.0 nM, con o sin
AVP no marcada 2µM en un volumen de 200µl de D-PBS frío. La unión se detuvo eliminando la
solución y el ligando unido debilmente y no unido fue removido lavando 3 veces con D-PBS frío.
Luego, las células se soltaron con 500µl de NaOH 1 N y se incubó durante 30 min a 37ºC, para
posteriormente agregarles 4 ml de mezcla de centelleo (POPOP 274µM, POP 18mM en Tritón X100 25 %, tolueno 75%). Se midió la reactividad en un contador de centelleo líquido. La unión
específica de definió como la unión total ([3H] AVP) menos la unión no específica ([3H] AVP y
AVP no marcada en exceso). Todo por triplicado. Método implementado por Ventura et.
al.,1999.
3.2.6. Movilización de calcio
Se cultivaron líneas estables de células MDCK, obtenidas de las transfecciones con los DNA
plasmidial V1b/ pcDNA 3.0 y V1b/pEYFP-N1 y células A-10 a 70% de confluencia en placas de
100 mm de diámetro. Estas fueron estimuladas con butirato de sodio 20 mM durante 24 h.
Posteriormente, fueron soltadas con 2 ml de tripsina por 2 a 4 min y espátula, completando un
volumen final de 10 ml con DMEM completo. Se calculó el número de células tomando 25 µl de
la mezcla a la que se le agregó 75µl de colorante Azul de Tripan, 12 µl de esta mezcla se
colocaron en una cámara de Neubauer para el conteo de células.
Paralelamente, se centrifugaron 10 ml de células a 1500 x g por 5 a 10 min y se resuspendió el
precipitado en tampón fisiológico (NaCl 140 mM, KCl 4 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 1 mM,
Na2HPO4 1 mM, glucosa 5 mM, HEPES 20 mM, pH 7,4, probenecid 1 mM, BSA 1 mg/ml), para
obtener una concentración de 107 células/ml. Luego las células fueron incubadas con Fura 2, 2
mM, por 30 min a temperatura ambiente y posteriormente fueron lavadas 2 veces con tampón
fisiológico.
La medición de calcio intracelular se realizó en un espectroflurímetro a 37°C, colocándose en una
cubeta de cuarzo 2 ml de la mezcla a una concentración de 107 células/ml. Se utilizó una medida
raciométrica de la fluorescencia emitida por el agente quelante unido al calcio, utilizando dos
longitudes de onda de excitación 340 nm y 380 nm y una longitud de emisión de 509 nm. La
razón entre la intensidad de emisión y de la excitación a 340 y 380 nm fue calculada cada 0,6 seg.
29
Establecida la línea basal en experimentos individuales se agregó arg8AVP 100 nM, ATP 100
µM y digitonina 1%, esta ultima como control positivo de la incorporación del agente quelante a
la célula y el ATP como control de la viabilidad celular en MDCK. Método anteriormete descrito
por Preisser et. al., 1999.
3.2.7. Microscopía confocal
3.2.7.1. Distribución subcelular del receptor V1bYFP
Células MDCK-V1bYFP fueron cultivadas a 100% de confluencia durante 2 semanas en placas
de 35 mm de diámetro que contenían cubreobjetos con polilisina. Luego fueron estimuladas con
butirato de sodio 20 mM durante 24 h. Posteriormente, las monocapas fueron lavadas dos veces
con PBS 1X pH 7,4 (NaH2PO4 1.33 mM, NaCl 15 mM) y fijadas en PBS-Paraformaldehido 4%
por 20 min a temperatura ambiente. Finalmente, fueron montadas en portaobjetos con medio de
montaje para preparaciones fluorescentes (DAKO) para su posterior observación en un
microscopio confocal utilizando una longitud de onda de excitación de 488 nm y de emisión de
505 nm. Método anteriormente descrito por Campos et. al., 2001.
3.2.7.2. Internalización del receptor V1bYFP
Se cultivaron células MDCK-V1bYFP en cubreobjetos con polilisina colocados dentro de placas
de 35mm de diámetro. Luego de dos semanas de cultivo a 100% de confluencia fueron
estimuladas con butirato de sodio 20 mM durante 24 h. Posteriormente, las células se estimularon
con AVP 100 nM por 60 min posterior a los cuales se realizó la fijación y el montaje de las
muestras como se describió anteriormente en el método 3.2.7.1. Método anteriormente descrito
por Campos et. al., 2001.
30
4. RESULTADOS
4.1. Clonamiento del fragmento codificante del receptor V1b de
hipófisis de rata
4.1.1. Obtención de RNA total de hipófisis de rata
Con el objetivo de clonar el fragmento codificante del receptor V1b de hipófisis de rata se realizó
la extracción del RNA según lo descrito en el método 3.2.1.1. Luego se realizó una electroforesis
en gel 1,2 % conteniendo formaldehído 2,2 M con el propósito de determinar la integridad del
RNA (fig. 1). Se pudo observar claramente las bandas correspodientes a los RNA ribosomales 28
S, 18 S comprobándose así la integridad del RNA obtenido.
4.1.2. Amplificación del fragmento codificante del receptor V1b de hipófisis de rata
La secuencia completa del fragmento codificante del receptor V1b de hipófisis de rata fue
amplificada mediante PCR, utilizando como molde el cDNA sintetizado en el método 3.2.1.4.
(fig. 2). La figura muestra en el carril 2 una banda de aproximadamente 1300 pb que corresponde
al fragmento codificante del receptor V1b de vasopresina. El carril 3 muestra el control negativo
realizado en las mismas condiciones descritas en métodos 3.2.1.5 pero sin cDNA
FIGURA 1. Electroforesis de RNA total de hipófisis de rata. Electroforesis en gel de agarosa
al 1,2 % con formaldehído 2,2 M en tampón MOPS 5X, teñido con bromuro de etidio 2 μg/ml.
Fueron cargados 20 μg de RNA total de hipófisis de rata. Las flechas indican los RNA
ribosomales 18S y 28S.
31
FIGURA 2. Amplificación por PCR del fragmento codificante del receptor
V1b de
vasopresina de hipófisis de rata. Electroforesis en gel de agarosa al 1 % en TAE 1X, teñido con
bromuro de etidio 2 μg/ml. Carril 1. Estándar de tamaño molecular 1Kb DNA ladder. Carril 2.
producto de amplificación del fragmento codificante del receptor V1b de hipófisis de rata. Carril
3. Control negativo.
32
4.1.3. Alineamiento de la secuencia nucleotídica y aminoácidica deducida.
Los productos de amplificación fueron clonados en el vector pGEM-T de Promega según el
procedimiento descrito en el método 3.2.1.8 y secuenciados en el laboratorio de Dr Navarro
Galveston USA, en ambos sentidos por el método didesoxi, usando los partidores Sp6 y T7. La
secuencia deducida fue alineada con dos secuencia publicadas en la red para el receptor V1b de
vasopresina denominadas por su número de acceso como d45400 y U27322 (fig.3).
De acuerdo a este análisis, se puede ver que el alineamiento nucleotídico de la secuencia del
receptor V1b clonado, es idéntico a la secuencia U27322 (Lolait et. al., 1995) a excepción de los
nucleótidos 197 y 198 los cuales producen un cambio aminaácidico codificando para una prolina
en lugar de una arginina. Por el contrario, difiere de la secuencia d45400 en una zona de 12
nucleótidos que se encuentran marcados de color amarillo. La secuencia nucleotídica U23722 y
33
por ende la secuencia clonada codifican para una proteína de 421 aminoácidos a diferencia de la
secuencia d45400 que codifica para una proteína de 425 aminoácidos.
El alineamiento de la secuencia aminoácidica deducida para el receptor V1b clonado, con las
secuencias d45400 descritas por Saito y colaboradores en 1995 y la secuencia U27322 de Lolait y
colaboradores en 1995, se muestra en la fig. 4. Como se observa en ésta figura, al comparar las
secuencias aminoacídicas del receptor V1b de vasopresina clonado en nuestro laboratorio con la
secuencia publicada U27322, estos resultan ser idénticos, a excepción del aminoácido 66 reflejo
del cambio nucleotídico observado anteriormente y difieren en 4 aminoácidos con la secuencia
d45400, lo que es reflejo de las diferencias observadas en la secuencia nucleotídica. Esta
delección se ubica en el tercer loop intracelular de la proteína, sin embargo, la delección de estos
cuatro aminoácidos no altera el marco de lectura de la proteína. Al analizar la secuencia
aminoacídica, se encontraron también dos motivos de dileucina ubicados en el extremo carboxilo
terminal del receptor, los cuales se han descrito como señales de destinación basolateral.
FIGURA 3. Alineamiento de la secuencia nucleotídica para el receptor V1b de vasopresina
clonado con las secuencias descritas por Saito y colaboradores en 1995 (d45400) y la de
Lolait y colaboradores en 1995 (U27322): Los nucleótidos marcados en azul corresponden a
diferencias entre una de las dos secuencias de la base de datos y los nucleótidos en rojo a
diferencias entre las secuencias publicadas en la base de datos y la clonada en nuestro laboratorio.
X representa un nucleótido no determinado en la secuenciación. La zona marcada de color
amarillo corresponde a una delección de 12 nucleótidos.
34
35
36
FIGURA 4. Alineamiento de la secuencia aminoacídica del receptor V1b de vasopresina
clonado, comparado con la secuencias descritas por Saito y colaboradores en 1995 (d45400)
y la de Lolait y colaboradores en 1995 (U27322). En amarillo se destaca la delección de 4
aminoácidos. En celeste se destacan las señales de distribución basolateral, en azul los
aminoácidos que difieren entre las secuencias publicadas y en rojo aminoácido no determinado
reflejo de la secuencia nucleotídica.
37
4.2. Subclonamiento del fragmento codificante del receptor V1b de
hipófisis de rata en los vectores pcDNA 3.0 y pEYFP-N1
Se realizó el subclonamiento del fragmento codificante del receptor V1b de vasopresina de
hipófisis de rata en los vectores, pcDNA 3.0 y pEYFP-N1 como se describe en el método 3.2.2.
Con motivo de comprobar la correcta construcción del plasmidio V1b/pcDNA 3.0 y V1b/pEYFPN1, se realizó un análisis de restricción del DNA plasmidial purificado, utilizando el método
descrito en 3.2.2.6 el cual se observa en las figuras 5 y 6.
Como se observa en la figura 5, la digestión del pasmidio V1b/pcDNA 3.0 con las endonucleasas
BamH I y Xba I (carril 7), permitió observar la liberación del fragmento codificante del receptor
V1b de vasopresina de aproximadamente 1300 pb. Cuando se realizó la digestión con la
endonucleasa Sma I (carril 2) se observó la liberación de un fragmento de aproximadamente 1600
38
pb. En cambio cuando se usó la endonucleasa Kpn I (carril 3) se observó la liberación de un
fragmento de aproximadamente 400 pb. Al digerir con las endonucleasas Sma I y Apa I (carril 4)
se observó la liberación de 3 fragmentos de aproximadamente 1000, 500 y 200 pb. Al usar la
endonucleasa Apa I (carril 5) se observó la liberación de un fragmento de aproximadamente 700
pb. Al utilizar Sma I y Kpn I (carril 6) se observó la liberación de 3 fragmentos de
aproximadamente 1600, 400 y 300 pb.
FIGURA 5.
Electroforesis en gel de agarosa al 1,2 % del análisis de restricción del
plasmidio V1b/pcDNA 3.0. Carril 1: Estándar de tamaño molecular de 1Kb DNA ladder. Carril
2: Digestión con SmaI. Carril 3: Digestión con Kpn I. Carril 4: Digestión con Sma I y Apa I.
Carril 5: Digestión con Apa I. Carril 6: Digestión con Sma I y Kpn I. Carril 7: Digestión con
BamH I y Xba I.
Como se observa en la figura 6, la digestión del plasmidio V1b/pEYFP-N1 con las endonucleasas
Hind III y Sal I (carril 6), permitió observar la liberación del fragmento codificante del receptor
V1b de vasopresina de aproximadamente 1300 pb. Al utilizar las enzimas EcoRI y Not I (carril 7)
39
se observó la liberación de un fragmento de aproximadamente 2000 pb correspondiente al
fragmento codificante del receptor V1b de vasopresina acoplado a la proteína amarilla
fluorescente, lo que indica que la secuencia nucleotídica que codifica para el receptor ha sido
insertado correctamente en el vector pEYFPN1. Con la endonucleasa Not I (carril 8) se observó
la linearización del plasmidio de aproximadamente 6000 pb. La digestión con la enzima Sma I
(carril 2), permitió observar la liberación de un fragmento de aproximadamente 500 pb. Con la
endonucleasa Apa I (carril 3) se observa la liberación de un fragmento de aproximadamente 700
pb. La digestión con las endonucleasas Sma I y Apa I (carril 4), permitió observar la liberación de
dos fragmentos de aproximadamente 200 y 500 pb. Finalmente con las endonucleasas Sma I y
Kpn I (carril 5), se observa la liberación de dos fragmentos de aproximadamente 500 y 400 pb.
FIGURA 6.
Electroforesis en gel de agarosa al 1,2% del análisis de restricción del
plasmidio V1b/pEYFP-N1. Carril 1: Estándar de tamaño molecular de 1Kb DNA ladder. Carril
2: Digestión con SmaI. Carril 3: Digestión con ApaI. Carril 4: Digestión con SmaI y ApaI. Carril
5: Digestión con SmaI y KpnI. Carril 6: Digestión con SalI y HindIII. Carril 7: Digestión con
EcoRI y NotI. Carril 8: Digestión con NotI.
40
4.3. Transfecciones estables en células MDCK.
Se realizaron transfecciones estables del receptor V1b/pcDNA 3.0 (V1b nativo) y V1b/pEYFPN1 (V1bYFP) en células MDCK como se describe en el método 3.2.3.2.
Para determinar la concentración de geneticina necesaria para obtener muerte celular, se realizó
una curva de sensibilidad al antibiótico en células MDCK sin transfectar. Se determinó que la
concentración necesaria para obtener muerte celular era de 700 µg/ml.
Luego de 2 semanas de selección y aislamiento individual de los clones, se pudo observar
mediante microscopía de fluorescencia que la transfeccion con el receptor V1bYFP produjo
clones con distinta intensidad de fluorescencia. Se seleccionó el clon que presentó una mayor
intensidad de fluorescencia para los experimentos posteriores.
4.4. Expresión del receptor V1b de vasopresina
Con el propósito de determinar la expresión del receptor V1b/pEYFPN1 (V1bYFP) en las células
MDCK transfectadas establemente, se realizó un Western blot según el método descrito en 3.2.4
(fig 7).Como se observa en ésta figura, la transfección estable de células MDCK con el receptor
V1b fusionado a YFP resulta en un doblete de aproximadamente 76 kDa. Se aprecia también una
banda de menor masa molecular, aproximadamente 60 kDa, que puede ser atribuida a un
producto de degradación o proteína inmadura.
FIGURA 7. Expresión del receptor V1b de vasopresina. Se fraccionaron 75 µg de extracto
total de células en un gel SDS-PAGE al 10%. A. Células MDCK. B. Células MDCK V1bYFP.
La detección se realizó utilizando el anticuerpo anti-GFP (una dilución 1:4000) y el revelado
mediante quimioluminiscencia.
41
4.5. Ensayo de saturación
Se realizaron ensayos de saturación en células transfectadas establemente con el plasmidio
V1b/pcDNA 3.0 (MDCK V1b nativo) y V1b/pEYFP-N1 (MDCK V1bYFP), a diferentes
concentraciones de [3H]AVP con un exceso de AVP no marcada para determinar la unión no
específica, según el procedimiento descrito en métodos 3.2.5.1.
En la figura 8.A se observan los resultados obtenidos para la curva de saturación de las células
MDCK V1b. El análisis de Scatchard de estos datos muestra una constante de afinidad KD para
AVP de 6,19 nM para el receptor nativo (Tabla 1).
En la figura 8.B se muestran los resultados obtenidos para la curva de saturación de las células
MDCK V1bYFP. El análisis de Scatchard de estos datos muestra una constante de afinidad K D
para AVP de 3,75 nM para la proteína de fusión V1bYFP (Tabla 1).
42
FIGURA 8. Curva de saturación para [3H]AVP en células MDCK V1b y MDCK V1bYFP.
Células MDCK expresando establemente el receptor V1b nativo (A) y el receptor V1bYFP (B)
fueron cultivadas a confluencia en una placa de 24 pocillos durante 15 días. El ensayo de
saturación fue realizado con concentraciones crecientes de [3H]AVP con o sin 2 µM de AVP no
marcada. La unión específica es mostrada.
TABLA I. Análisis de Scatchard realizado en células MDCK V1b y MDCK V1bYFP.
MDCK V1b
MDCK V1bYFP
KD (nM)
6,19+ 0,08
3,75 + 0,11
Se muestran las constantes de disociación obtenidas mediante el análisis de Scatchard para
células MDCK transfecatas establemente con el V1b nativo y el V1bYFP.
4.6. Movilización de calcio
Se realizaron ensayos de movilización de calcio en células A-10, MDCK y células transfectadas
establemente con el plasmidio V1b/pcDNA 3.0 (MDCK V1b nativo) y V1b/pEYFP-N1 (MDCK
V1bYFP), según el procedimiento descrito en métodos 3.2.6 (fig. 9)
43
En la figura 9.A se muestra la realización de un ensayo control en células A-10 que expresan
endógenamente el receptor V1a de vasopresina con el fin de comprobar que la medida
raciométrica utilizada para medir calcio fuera confiable. Como se puede observar AVP es capaz
de aumentar el calcio citoplasmático y al ser permeabilizar las células con digitonina una gran
cantidad de calcio ingresa a la célula. Por lo tanto la medida raciométrica es confiable.
En la figura 9.B se observa el resultado de la movilización de calcio en células MDCK
estimuladas con AVP 100 nM, ATP 100 µM y digitonina 1%. En él se puede observar que al
estimular las células con ATP un control de la integridad celular, se generó un aumento del calcio
intracelular. Por el contrario al estimular las células con AVP estas no son capaces de aumentar el
calcio intracelular. Al permeabilizar las células con digitonina se aprecia que una gran cantidad
de calcio ingresa a la célula. Por lo tanto estas células no presentan receptores del tipo V1.
En la figura 9.C se observa el resultado de la movilización de calcio en células MDCK
transfectadas establemente con el receptor V1b nativo (V1b/pcDNA 3.0), estimuladas con AVP
100 nM, ATP 100 µM y digitonina 1%. Como se observa las células MDCK que expresan
establemente el receptor V1b nativo fueron capaces de aumentar calcio intracelular al estímulo
con AVP y ATP. Esto indica que el receptor tipo V1b de vasopresina se encuentra en las células
transfectadas con el plasmidio V1b/pcDNA 3.0 y es capaz de responder frente al estímulo
hormonal.
En la figura 9.D se observa el resultado de la movilización de calcio en células MDCK
transfectadas establemente con el receptor V1b acoplado a proteína amarilla fluorescente
(V1b/pEYFP-N1 o V1bYFP), estimuladas con AVP 100 nM, ATP 100 µM y digitonina 1%.
Como se observa las células fueron capaces de aumentar calcio intracelular frente al estímulo con
AVP y ATP y aumentar el calcio intracelular al permeabilizar con digitonina. Esto nos indica que
el receptor V1b de vasopresina se encuentra presente en las células transfectadas con el plasmidio
V1b/pEYFP-N1 y es capaz de responder al estímulo hormonal.
FIGURA 9.
Movilización de calcio en células A-10, MDCK, MDCK V1b y MDCK
V1bYFP. Las células fueron incubadas en tampón fisiológico conteniendo Fura 2, 2 mM y
estimuladas con AVP 100 nM, ATP 100 μM y digitonina 1%, al tiempo que se registraban los
44
cambios en la razón de fluorescencia en un espectrofluorímetro. A. Células A-10. B. Células
MDCK. C. Células MDCK transfectadas establemente con el receptor V1b. D. Células MDCK
transfectadas establemente con el receptor V1bYFP.
4.7. Distribución subcelular del receptor V1bYFP
Se realizó el estudio de localización subcelular del receptor V1bYFP utilizando microscopía
confocal como se describe en 3.2.7.1 (fig.10). En está figura se puede observar mediante
microscopía confocal que la localización del receptor V1b acoplado a proteína amarrilla
fluorescente presenta una distribución a nivel de la membrana plasmática y pequeñas vesículas
distribuidas por toda la célula. Al mismo tiempo, se puede apreciar por medio del plano Z (cortes
transversales y longitudinales de las células) que el receptor V1bYFP presenta una distribución
basolateral.
45
4.8. Internalización del receptor V1bYFP
Con el objetivo de determinar si el receptor V1bYFP es capaz de internalizarse mediante el
estímulo con vasopresina, se realizó el siguiente estudio según lo descrito en el método
3.2.7.2.(figura 11). En esta figura se observa mediante microscopía confocal, que existe un
desplazamiento de la fluorescencia desde la membrana hacia el citoplasma celular cuando las
células fueron estimuladas con AVP 100 nM por 1h. Está fluorescencia podría estar ubicada en
vesículas.
FIGURA 10.
Localización subcelular del receptor V1bYFP en células MDCK:Células
MDCK expresando establemente el receptor V1b de vasopresina fusionado a YFP, fueron
cultivadas a confluencia durante 15 días y estimuladas con butirato de sodio 20 mM durante 24 h
y observadas usando microscopía confocal. Series de imágenes fueron logradas a intervalos de
0,5 µm. El plano XY (en el centro) muestra la distribución del receptor V1bYFP tanto en la
superficie como en el interior de la célula. El plano Z que se encuentra sobre y al lado derecho
del plano XY muestra que el receptor acoplado a YFP esta ubicado en el dominio basolateral de
la célula.
46
FIGURA 11.
Internalización del receptor V1bYFP. Células MDCK transfectadas
establemente con el receptor V1b fusionado a YFP, fueron cultivadas a confluencia durante 12
días y estimuladas con butirato de sodio 20 mM durante 24 h. Luego se estimularon con AVP
100 nM por 1 hora y posteriormente fueron fijadas con paraformaldehído 4%. A: MDCK
V1bYFP sin AVP. B: MDCK V1bYFP estimuladas con AVP 100 nM, 1h.
47
5. DISCUSION
Un modelo ampliamente utilizado en el estudio del correcto tráfico de proteínas de membrana es
la célula epitelial polarizada (Rodriguez-Boulan, 1999). La membrana plasmática de las células
epiteliales polarizadas presenta un dominio apical y uno basolateral. Cada polo está compuesto
por distintos tipos de proteínas y lípidos, permitiéndole de este modo cumplir diversas funciones
biológicas (Lipardi et. al., 2002 y Roush et. al., 1998). El mantenimiento de la asimetría de las
proteínas en los distintos dominios de membrana es responsabilidad del continuo tráfico de las
proteínas recién sintetizadas desde el trans-Golgi network (TGN) a la membrana plasmática. Este
tráfico puede ocurrir a través de una vía directa y otra indirecta. En la vía directa las proteínas
recién sintetizadas son transportadas desde el TGN a uno de los dominios de membrana ya sea
apical o basolateral. Un ejemplo es lo que ocurre con los receptores α2A y α2C adrenérgicos, que
son distribuidos directamente a la membrana basolateral (Keefer et. al., 1994; Wozniak et. al.,
1996). Por el contrario, en la vía indirecta o transcitosis, las proteínas son primero enviadas desde
el TGN a un dominio desde el cual son endocitadas y transportadas a la superficie opuesta. Es el
caso del receptor de polinmunoglobulinas (pIgR) éste es internalizado desde el dominio
basolataeral y transportado al domino apical (Lipardi et. al., 2002; Kéller et. al., 1997 y Sarnataro
et. al., 2000).
En el caso particular de los receptores de vasopresina, se ha establecido que los receptores V1a
(Campos et. al., 2001) y V2 (Schülein et. al., 1998 y Andersen-Beckh et. al., 1999) de
vasopresina se localizan en la membrana basolateral de células polarizadas. Es por ello, que como
objetivo general de esta tesis se ha considerado de interés estudiar la distribución subcelular del
receptor V1b de hipófisis de rata en células epiteliales polarizadas (MDCK).
Con el fin de estudiar la localización del receptor V1b de vasopresina en células epiteliales
polarizadas (MDCK), se realizó el clonamiento del fragmento codificante del receptor V1b de
vasopresina desde hipófisis de rata. Al analizar la secuencia obtenida del clonamiento, esta
resultó ser idéntica a la secuencia publicada en la red para el V1b denominada U27322 (Lolait et.
al., 1995) a excepción de los nucleótidos 197 y 198 los cuales producen un cambio aminaácidico
48
codificando para una prolina en lugar de una arginina, sin embrago éste cambio aminoácidico no
altera las propiedades funcionales de la proteína como se discute mas adelante. U27322 presenta
una delección de 12 nucleótidos respecto a la secuencia d45400 (Saito et. al., 1995) entre los
nucleótidos 763-774. Saito y colaboradores describen ésta delección como un artefacto del PCR,
debido a que esta secuencia formaría parte de un palindrome natural (repeticiones invertidas),
constituyendo un asa que podría dar como resultado la síntesis de un cDNA sin este fragmento.
Por otra parte, Lolait y colaboradores determinaron mediante Northern blot, la existencia de dos
mRNA de aproximadamente 37 y 32 Kb. Estudios de Southern blot han determinado la existencia
de un sólo gen para el receptor V1b de vasopresina, por lo cual, la existencia de estos dos
mRNAs y por ende, de las dos secuencias U27322 y d45400 encontradas para el V1b podrían ser
atribuidas al uso de un splicing alternativo del mRNA precursor. Este hecho no es extraño, ya que
se sabe que el receptor V2 de vasopresina sufre un splicing alternativo que genera dos isoformas
para este receptor denominadas V2a y V2b (Añazco, 2002, Sarmiento et. al., 2004). Además, el
análisis de secuencia, indicó la existencia de mutaciones en los nucleótidos 75 y 646 para las
secuencias descritas U27322 y d45400, el nucleótido 75 en la secuencia d45400 codifica para una
serina mientras que para la secuencia U27322 codifica para una treonina. Una mutación en el
nucleótido 1134 en la secuencia clonada fue encontrada, no obstante, éste no origina un cambio
en la secuencia aminoacídica.
La secuencia del V1b clonado codifica para una proteína de 421 aminoácidos, a diferencia de la
secuencia d45400 que codifica para una proteína de 425 aminoácidos. La delección de estos 4
aminoácidos ubicados en el tercer dominio intracelular no altera el marco de lectura de la
proteína.
Cuando se expresó establemente el receptor V1b clonado como proteína de fusión a la proteína
amarilla fluorescente y se analizó por medio de Western blot usando anti-GFP que reacciona en
forma cruzada con todas las variantes de proteínas fluorescentes, se encontró un doblete de
aproximadamente 76 kDa. Este masa molecular esta de acuerdo con la masa que debería tener la
proteína de fusión de la YFP (30 kDa) y el receptor V1b (46 kDa). Si bien no se esperaba que
éste fuera un doblete, éste podría ser explicado debido a que la proteína se encuentra en distintos
estados de glicosilación. En efecto, el receptor V1b tiene un sitio de N-glicosilación. Además, se
49
encontró una banda de aproximadamente 60 kDa, la cual podría ser atribuida a una degradación
de la proteína extraída o bien una proteína inmadura, no glicosilada, similar a lo que se observa
en el receptor V2 (Oksche et. al., 2002).
Para determinar si el receptor expresado como proteína de fusión es funcional se realizaron
ensayos de saturación con AVP tritiada para el receptor V1b nativo y para el fusionado a la
proteína amarilla fluorescente establemente transfectados en células MDCK y se determinaron las
constantes de afinidad (KD) mediante el análisis de Scatchard.
Para unión de AVP al receptor V1b nativo se obtuvo una KD de 6,19+0,08 nM. Este valor es un
orden de magnitud mayor (KD de 0,63 nM) que aquel obtenido para esta misma isoforma por
Lolait y colaboradores (Lolait et. al., 1995). En cambio para la proteína de fusión se obtuvo una
KD para AVP de 3,75+0,11 nM. Las diferencias encontradas entre el receptor nativo y el
fusionado a YFP no son estadísticamente significativas. Sin embargo, la diferencia entre el nativo
y el descrito en la literatura a pesar que son estadísticamente significativas, son variaciones
usuales encontradas cuando se realizan ensayos de unión, y especialmente, si no han sido
realizadas en las mismas condiciones experimentales uno de ellos es el de haber realizado estos
ensayos en cultivos primarios de células.
Para determinar si el receptor unido a la proteína fluorescente es funcional se realizaron ensayos
de movilización de calcio como respuesta a la incubación de las células con AVP y se
compararon los resultados con aquellos originados por el receptor nativo.
Células MDCK que expresan establemente el receptor V1b fueron capaces de incrementar el
calcio intracelular en respuesta al estímulo con AVP 100 nM lo cual confirma la existencia de un
receptor de vasopresina tipo V1. Se obtuvo un tiempo de latencia para AVP de 3,2 seg y un
tiempo de recuperación de 42 seg. Previamente, se ha descrito para el receptor V1b de rata
clonado desde médula adrenal un tiempo de latencia de 15-20 seg y un tiempo de recuperación de
3-4 min (Grazzini et. al., 1996). Por otra parte, para el receptor V1a se ha descrito un tiempo de
latencia de 1 seg y un tiempo de recuperación de 2 min 40 seg (Campos et. al., 2001) lo que nos
indica que los tiempos obtenidos de latencia y recuperación son menores a los descrito en la
literatura para el receptor identificado en la médula adrenal, esto probablemente dado por el
50
hecho que estos estudios se realizaron a partir de cultivo primario de células, mientras que en
nuestro caso el receptor es expresado establemente en la línea celular de riñón de perro (MDCK).
Para el receptor V1bYFP expresado establemente en células MDCK, se estableció que frente al
estímulo con AVP éstas fueron capaces de incrementar el calcio intracelular, obteniendo un
tiempo de latencia para AVP de 1,6 seg y un tiempo de recuperación de 1 min con 26 seg. Por
otra parte, para el receptor V1aGFP se ha descrito un tiempo de latencia de 1 seg y un tiempo de
recuperación de 1 min, 30 seg (Campos et. al., 2001) lo que indica que los tiempos encontrados
para los receptores V1 acoplados a proteína fluorescente son similares.
Además, el tiempo de latencia encontrado para el V1b nativo fue mayor que el determinado para
el V1bYFP, mientras que el tiempo de recuperación determinado para el V1b nativo fue menor al
encontrado para el V1bYFP. Esto podría indicar que la fusión del receptor V1b a YFP
favorecería la unión del receptor a la hormona, debido a un plegamiento que permitiría que los
aminoácidos que intervienen en la unión de la hormona al receptor se encuentren más expuestos,
favoreciendo la unión y por ello una respuesta más rápida y de mayor duración frente al estímulo
hormonal.
Posteriormente, se estudió la segregación y destino celular de receptor V1b en células epiteliales
polarizadas. Se escogió a este tipo celular dado que este modelo ha sido ampliamente utilizado en
estudios del tráfico y localización de GPCRs, en especial de los receptores de vasopresina V1a y
V2 (Campos et. al., 2001; Shülein et. al., 1998 y Schülein et. al., 2001).
Para realizar este estudio se cultivaron células MDCK establemente transfectadas con el receptor
V1bYFP durante 15 días a 100% de confluencia, requisito fundamental para la obtención de la
diferenciación de los compartimentos apical y basolateral en células epiteliales polarizadas. El
análisis a través de microscopía confocal pudo establecer que la fluorescencia se ubicaba a nivel
de la membrana plasmática en el plano XY. Se observó también fluorescencia en el interior de la
célula, confinada en gránulos, presumiblemente representando parte del tráfico del receptor a la
membrana celular. Por otra parte, el plano Z (correspondiente a los cortes transversales y
longitudinales), muestran que la fluorescencia se encuentra confinada a la membrana basolateral
de la célula y en su mayoría específicamente a la membrana lateral. Estos resultados son bastante
51
particulares puesto que no existen barreras que separen la membrana basal de la lateral. Una
posible explicación podría ser que en cultivo las células se adhieren fuertemente a la placa,
contrario a lo que sucede con su sustrato natural, expresando una mayor cantidad de proteínas
que interviene en la unión de la célula a la matriz (placa) lo que impediría de esta forma que el
receptor se fluya hacia el subdominio basal (Andersen-Beckh et. al., 1999). Otra posible
explicación a este fenómeno tiene relación con un efecto óptico puesto que en la parte lateral de
la célula existen dos membranas celulares yuxtapuestas a diferencia de lo que ocurre en el
subdomino basal donde existe solo una membrana. La distribución basolateral presentada por el
receptor V1b coincide con la localización encontrada para los receptores de vasopresina V2 y
V1a (Schülein et. al., 1998; Andersen-Beckh et. al., 1999 y Campos et. al., 2001) y para los
receptores α2A y α2C adrenérgicos (Keefer et. al., 1993), al estar fusionados a proteína verde
fluorescente.
Además, se realizaron estudios de internalización del receptor V1bYFP en células MDCK
mediante microscopía confocal, permitiendo observar la internalización como el desplazamiento
de la fluorescencia en forma de gránulos desde la membrana hacia el citoplasma, luego de la
incubación con AVP 100nM durante 1 h. En las células control (sin estímulo) pudo observarse la
presencia de pequeñas vesículas o gránulos al interior de la célula, que podrían ser atribuido a una
alta expresión del receptor debido a la inserción de una o más copias del fragmento codificante
del receptor V1b en el DNA genómico. Otra explicación podría ser que estos gránulos o vesículas
son parte de una vía lenta de degradación del receptor. La presencia de gránulos antes de la
estimulación con hormona también ha sido observada previamente para el receptor M2
muscarínico, determinándose que alrededor de un 40% del receptor es retenido intracelular
(Roseberry y Hosey, 1999).
Por lo tanto, podemos concluir que la fusión del receptor V1b de vasopresina a la proteína
amarilla fluorescente (YFP), en general, no alteraría las propiedades funcionales del receptor, en
cuanto a su capacidad de unión a la hormona, activación de su vía de transducción de señales y su
capacidad de responder frente al estímulo hormonal, internalizando al receptor para ser
degradado o reciclado para volver a la membrana. Por esta razón, el uso de YFP es un adecuado
sistema para el estudio del tráfico y distribución del receptor V1b.
52
La localización de los receptores GPCRs en la superficie celular es regida por dos mecanismos
predominantes: la distribución del receptor a un sitio en particular y la retención en este sitio. La
adecuada localización del receptor permite el acceso a su ligando y la posterior activación de su
mecanismo de transducción de señal. La importancia funcional de la localización de GPCRs está
dada porque al presentarse defectos en estos mecanismos se producen ciertas patologías. Tal es el
caso de la diabetes insípida nefrogénica, producida por la retención del receptor V2 en
compartimentos intracelulares (Tan et. al., 2004).
Se han realizado numerosos estudios de tráfico y distribución subcelular de GPCRs utilizando
como modelo células epiteliales polarizadas, un ejemplo de ello son los receptores α2A (Keffer y
Limbrird, 1993), α2B,, α2C adrenérgico (Woznaok y Limbird, 1996), al igual que el receptor de la
hormona estimulante de la tiroide (TSH), el receptor de la hormona folículo estimulante (FSH) y
el receptor de la hormona luteinizante LH (Beau et. al., 1997), todos los cuales se expresan en el
dominio basolateral de la célula.
Se han identificado señales de distribución apical y basolateral, sin embargo, la correcta
distribución de las proteínas de membrana parece depender del correcto balance entre las señales
apicales y basolaterales (Nelson y Yeaman, 2001; Matter y Mellaman, 1994).
El transporte de las proteínas hacia la superficie basolateral es mediado por señales
citoplasmáticas. Aunque estas señales son variables, ellas pueden ser clasificadas dentro de tres
grupos. El primero depende de un residuo crítico de tirosina ubicado en una larga cadena de
aminoácidos hidrofóbicos como: YXXØ o NPX(n)Y ( Y=Tyr, N=Asn, P=Pro, X= cualquier
aminoácido, Ø= cualquier
aminoácido con un grupo hidrofóbico). Estas señales han sido
envueltas en el tráfico de numerosas proteínas de uno y múltiples dominios de transmembrana
(Bonifacino y Dell’angelica, 1999). Además, el motivo YXXØ es importante en la mediación de
la endocitosis vía clatrina (Bonifacino y Dell’angelica, 1999). La importancia de este motivo se
ha establecido en algunos receptores de un dominio de transmembrana, tal como el receptor de
baja densidad de lipoproteínas (LDL) y el receptor de transferrina, los cuales interactúan con
proteínas adaptadoras AP a través del motivo YXXØ, las que les permiten alcanzar la membrana
basolateral de las células epiteliales polarizadas (Ohno et. al., 1999; Folch et. al., 1999). Por otro
lado NPX(n)Y cumple diversos roles en la mediación de la internalización y distribución de los
53
receptores de uno o múltiples dominios de transmembrana. Mutaciones en este motivo causan
diferentes efectos en los GPCRs como: alteraciones en el tráfico, unión a ligando, acoplamiento o
internalización del receptor, sugiriendo una importancia estructural de este motivo en la proteína.
El segundo tipo de dominio de distribución basolateral son los motivos di-leucina (L-L o LXL,
donde L= Leu), que participan en diversas funciones como internalización y tráfico de proteínas
(Hunzike y Fumey, 1994; Mirande et. al., 2001). El receptor V2 de vasopresina, por ejemplo,
contiene un motivo di-leucina inmediatamente después de una di-cisteína. Mutaciones en estos
sitios han podido establecer que participan en la maduración del receptor V2 en el RE/Golgi
(Schülein et. al., 1998). Contrariamente a lo encontrado en el receptor V2, mutaciones en los
motivos di-leucinas de los receptores β2-AR adrenérgicos (Gabilondo et. al., 1997) y V1a de
vasopresina no alteran la distribución del receptor hacia la superficie celular. Se encontró que
para el receptor V1a de vasopresina este motivo no es requerido en el adecuado tráfico a la
superficie, para la señalización de calcio o para la desensibilización heteróloga, pero podría
corresponder a una secuencia de reconocimiento para su internalización (Preisser et. al., 1999). El
efecto de los motivos di-leucina en el tráfico podría estar relacionado con la mediación de la
endocitosis y reciclamiento, su tiempo de vida media en la célula y el tipo de GPCRs.
Al tercer grupo de señales de distribución basolateral pertenecen todas aquellas señales que
presentan un grupo de residuos ácidos o una combinación de elementos, que aún no se
encuentran bien definidos. Tal es el caso del receptor α2A-Adrenérgico, el cual presenta señales no
contiguas ubicadas dentro de los dominios de transmembrana que permiten que el receptor se
distribuya en la superficie basolateral (Saunders et. al., 1998). Estudios recientes han mostrado la
presencia de señales de distribución basolateral en el segundo dominio intracelular del receptor
V2, prevaleciendo frente a las señales apicales encontradas en el carboxilo terminal (Hermosilla y
Shülein, 2001).
Al analizar la secuencia aminoácidica del receptor V1b de vasopresina clonado, se pudo
establecer la existencia de dos motivos Leu-Leu ubicados en el extremo carboxilo terminal del
receptor que podrían participar en su distribución basolateral. Comparando el extremo carboxilo
terminal del receptor V1b con el receptor V1a y V2 encontramos un motivo di-leucina que podría
corresponder a la secuencia consenso para la localización en membrana basolateral. Por otra
54
parte, se determinó la presencia de un motivo NPXnY en el séptimo dominio de transmembrana
de los receptores V1b, V1a y V2. Se ha descrito la participación de este en la endocitosis mediada
por clatrina. Estudios en el receptor V2 involucran a éste motivo en la downregulation vía
internalización mediada por clatrina (Bouley et. al., 2003).
En el futuro sería interesante establecer si el motivo di-leucina que se encuentra presente en los
receptor V2, V1a y V1b, corresponde a una secuencia consenso en la distribución basolateral de
estos receptores o si existen otras señales distintas involucradas en el proceso, tal como el
segundo loop intracelular del receptor V2.
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