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Secuencias largas terminales repetidas de los retrovirus:
estructura y función
51.459
Eva Lospitao, África Holguín y Vicente Soriano
Laboratorio de Biología Molecular. Servicio de Enfermedades Infecciosas.
Hospital Carlos III. Instituto de Salud Carlos III. Madrid. España.
Los retrovirus presentan al final de su genoma unas secuencias genéticas características denominadas secuencias terminales repetidas largas (long terminal repeat, LTR) que median la integración del ácido
nucleico viral en los cromosomas de las células huésped. Además, regulan la transcripción de los genes de los retrovirus y, de este modo,
influyen en su virulencia. Existen diferencias en la estructura de las
LTR de los distintos subtipos del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), que podrían explicar las diferencias biológicas entre
ellos y quizá también una distinta progresión de la enfermedad.
tamaño y secuencia la presenta la región U3. La comparación
de estas secuencias ha permitido establecer qué zonas se
conservan en los distintos retrovirus y las funciones en las
que participan (tabla 2). El mantenimiento de todas estas secuencias en los distintos retrovirus, así como la relevancia de
las funciones en las que intervienen, nos sugieren la importancia de las LTR en el ciclo replicativo de estos virus.
Palabras clave: Retrovirus. VIH. LTR. Estructura.
LTR y replicación del VIH-1
Retroviral long terminal repeats: structure and function
Characteristic genetic sequences, named as LTR, are present at the
end of retroviral genomes. They are involved in the integration of viral
nucleic acid into chromosomes of cell host. In addition, LTR modulates the transcription of retroviral genes and, in this form, determine
their virulence. LTR from distinct HIV-1 subtypes show structural differences which may result in distinct biological behaviors and, ultimately, different disease progression.
Key words: Retrovirus. HIV. LTR. Structure.
Reciben el nombre de secuencias terminales repetidas largas (long terminal repeat, LTR) los fragmentos de ácido nucleico que aparecen repetidos en los extremos 3’ y 5’ del
genoma proviral de los retrovirus, constituidos por el material genético viral integrado en el ADN de la célula infectada.
Aparecen en los virus de la familia Retroviridae y están implicadas en la retrotranscripción y replicación viral. Existen
secuencias genéticas específicas de dichos procesos. Hay
diferencias entre LTR de distintos subtipos del grupo M
(main o principal) del virus de la inmunodeficiencia humana
tipo 1 (VIH-1), al que pertenece la mayor parte de los aislados. Actualmente se pueden distinguir 9 subtipos y 14 formas recombinantes intersubtipo (circulating recombinant
forms, CRF), en función de su secuencia genética1.
Estructura de las LTR
La organización de las LTR es distinta en el ARN viral y en
el ADN proviral (fig. 1). Así, en el ARN viral podemos distinguir dos regiones dentro de las LTR: U5 y U3, en el extremo
5’ y 3’, respectivamente, y las secuencias R, que aparecen
en ambos extremos del ARN viral. Sin embargo, el ADN del
provirus presenta en ambos extremos las tres regiones (U5,
R y U3)2 (fig. 1).
Cada retrovirus posee un tamaño de LTR característico, como
se observa en la tabla 1. La mayor variabilidad en cuanto a
Correspondencia: Dr. V. Soriano.
Nueva Zelanda, 54, 4.o B.
28035 Madrid. España.
Correo electrónico: [email protected]
Recibido el 2-12-2002; aceptado para su publicación el 23-4-2003.
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Med Clin (Barc) 2003;121(2):74-7
El VIH-1 presenta un genoma constituido por dos cadenas
de ARN homólogas con polaridad positiva. Este ARN debe
convertirse en ARN de doble cadena para poder integrarse
en el genoma celular. Este proceso se conoce como retrotranscripción. La presencia de las regiones U5 y U3 en los
extremos 3’ y 5’ del ARN integrado del virus, respectivamente, es consecuencia directa del mecanismo de retrotranscripción. Este proceso se lleva a cabo por un complejo
ribonucleoproteico que incluye la retrotranscriptasa inversa
del virus, el genoma ARN viral, los ARNt cebadores y otras
proteínas que participan en el proceso. Una vez terminada
la retrotranscripción, es necesario que el ADN generado se
integre en el genoma celular. De esta forma, la misma maquinaria que utiliza la célula para la producción de sus propias proteínas será empleada por el virus para generar sus
proteínas y el ARN de los nuevos genomas virales. En este
proceso también participan muy activamente las LTR, por
ser las zonas por donde se va a producir la integración.
TABLA 1
Tamaño del genoma de distintos retrovirus
y de las regiones U3, U5 y R de las secuencias terminales
repetidas largas (LTR)
Virus
RNA Genómico (nt)
U3 (pb)
R (pb)
U5 (pb)
LTR (pb)
RSV
MLV
HIV-1
HTLV-1
HFV
9.300
8.300
9.200
8.500
11.200
230
450
450
350
910
20
70
100
230
190
80
80
80
220
160
330
600
630
800
1.260
Pb: pares de bases; nt: nucleótidos; RSV: virus respiratorio sincitial; MLV: virus de la leucemia de Moloney; VIH-1: virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1; HTLV-1: virus de
la leucemia T tipo 1; HFV: virus humano foamy.
TABLA 2
Secuencias conservadas en las secuencias terminales
repetidas largas (LTR) de los retrovirus y procesos
en los que intervienen
Secuencia conservada
Localización
Función
TG-AC
CCAAT
G/CT/AAT/AT/ATAAG
G
CA
AA/GTAAA
TTGT
Inicio y final LTR
U3 (75 pb antes de R)
U3 (23 pb antes de R)
Inicio de R
Final de R
20 pb antes de la unión R-U5
U5 (25 pb después del final
de R)
Integración
Inicio de transcripción
Inicio de transcripción
Poliadenilización
Poliadenilización
Poliadenilización
Terminación de
transcripción
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ARN viral VIH-1 ( no integrado)
R
U5
U3
R
100
80
450
100
Extremo 5’
Extremo 3’
ADN proviral VIH-1 (integrado)
Fig. 1. Esquema de la estructura de
las secuencias terminales repetidas
largas (LTR) del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1).
Se indican los pares de bases de
cada región.
U3
R
450
U5
U3
100 80
Extremo 5’
AATCCAAT
AT
CA
TC
AA
Núcleo o core
TAPS
TBP
AATCCAAT
IIE
ARN polimerasa
U5
100 100
Extremo 3’
cipan los elementos de control, la secuencia promotora (región que contiene el lugar de iniciación para la síntesis del
ARN), RNA polimerasa II (se une al promotor) y factores de
transcripción (fig. 2)3. El promotor, localizado en la LTR del
extremo 5’ del ADN proviral, contiene la secuencia TATAA,
denominada TATA box. A ésta se unen las proteínas de
unión a TATA (TBP), y otras que finalmente reclutan la ARN
polimerasa II al complejo de transcripción. A la zona activadora (enhancer) (fig. 2) se unen los distintos factores proteicos que regulan la transcripción. La LTR del extremo 3’
dará lugar a la región que se poliadeniliza y codifica para la
proteína viral nef4 (fig. 3).
Activador
Factores
reguladores
de la
transcripción
R
450
TATA
IH
Sitios de unión a factores de transcripción en LTR
Promotor
Fig. 2. Esquema del inicio de la transcripción. (Tomado de Coffin et al 3.)
LTR y transcripción del VIH-1
La transcripción es el proceso por el cual el ADN proviral es
convertido en ARN. Posteriormente, éste puede ser traducido a proteínas, o bien constituir nuevos genomas virales. En
este proceso se emplea la maquinaria celular, en que parti-
En la región U3 de la LTR del ADN proviral, a la que se van
a unir la mayor parte de los factores de transcripción, se
pueden distinguir tres zonas: el núcleo (core), el activador
(enhancer) y la zona reguladora (NRE) (fig. 4). En el núcleo
se encuentran: a) la caja TATA, que une las proteínas TBP
que reclutan a la ARN polimerasa II, y b) los sitios SP1, que
unen distintos factores de transcripción de la familia SP1. El
activador es la zona que contiene los sitios para la unión a
la proteína celular que activa la transcripción de NF-κB (nuclear factor kappa B) y factores relacionados. En la zona reguladora existen secuencias específicas para la unión de
Fig. 3. Genoma del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1)
en el que se muestra la superposición de la secuencia terminal repetida larga (LTR) del extremo 3’ y la
región de ADN que codifica para la
proteína viral nef.
}
Superposición
gag
rev
vif
nef
tat
LTR
5’
LTR
3’
pol
vpr
vpu
env
TAR
NF
AT-1
NF-κB
USF-1
RBE III
SP1
U3
ARN
CAJA
TATA
GR
Zona reguladora (+/–)
NRE
Ets
TCF-1
R
U5
ADN
AP2
Enhancer
(+)
Núcleo
Core
Fig. 4. Esquema de sitios de unión a factores de transcripción en las secuencias terminales repetidas largas (LTR) del virus de la inmunodeficiencia humana
tipo 1 (VIH-1).
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Región TAR
Complejo
iniciación
ARN (Pol II)
ARN
Tat
+1
ADN
proviral
lación de la transcripción sea un proceso complejo. De hecho, se dan diferentes grados de transcripción, en función
del gen a transcribir y del entorno celular específico.
Hasta aquí nos hemos referido a la regulación en cis, es decir, aquella que ocurre por la unión de proteínas a las secuencias específicas existentes en la LTR del ADN proviral.
Sin embargo, además de este tipo de regulación, existe la
regulación en trans, producida al unirse la proteína viral Tat6
a una zona del ARN naciente TAR7 en el proceso de transcripción (fig. 5).
+44
NF-BSP-I TATA
LTR y subtipos del VIH-1
U3
R
Fig. 5. Regulación en trans (Tat-TAR) en el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1).
CFR
VIH-2
VIH
A
B
C
D
E
F
G
M
VIH-1
N
A
B
C
D
E (A/E)
F
G
H
I (A/G/H/K)
J
K
L (?)
01-AE
02-AG
03-AB
04-cpx
05-DF
06-cpx
07-BC
08-BC
09 No publicado
10-CD
11-cpx
12-BF
13-cpx
14-BG (España y Portugal)
15-AEB
O
Fig. 6. Clasificación genética de los subtipos del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
muchas proteínas que modulan la transcripción. Aunque
inicialmente se pensó que dichos factores reguladores aumentaban el nivel de transcripción, hoy sabemos que existen no sólo factores de regulación positiva sino también de
regulación negativa.
La figura 4 muestra algunos de los sitios de unión a factores
reguladores. Hay una gran cantidad de secuencias conservadas y muchas de las proteínas que se unen a ellas5. Todo
esto, unido a la existencia de determinados factores de
transcripción en tipos celulares distintos, hace que la regu-
Ya se ha señalado que existen 9 subtipos (A, B, C, D, F, G,
H, J y K) y hasta 14 formas recombinantes dentro del grupo
M del VIH-1 (fig. 6). Por tanto, cabe preguntarse si la estructura y las secuencias específicas de unión a proteínas
reguladoras son iguales en todos ellos o si, por el contrario,
existen diferencias características de subtipo. En caso de
existir, habría que plantearse qué repercusión tienen éstas
en la transcripción de estos subtipos, y si confieren propiedades biológicas características en alguno de ellos. Para
contestar a todas estas preguntas se han secuenciado y
comparado las LTR de distintos subtipos del VIH-1, midiéndose los valores transcripcionales de las distintas LTR. A
continuación se resumen las diferencias más significativas
que se han encontrado.
El estudio de la zona reguladora (NRE) en la región U3 (fig.
4) ha permitido establecer la presencia de secuencias conservadas específicas de subtipo (tabla 3). En esta región se
encuentra la secuencia de unión a la proteína USF (fig. 4),
que regula la transcripción8. Esta secuencia parece presentar también diferencias específicas de subtipo9,10. La zona
de unión a la proteína RBE III, localizada también en la región NRE, está muy conservada en todos los subtipos, aunque el subtipo F presenta una duplicación parcial.
En la región del núcleo (core) de la LTR se localizan la caja
TATA y tres sitios de unión a SP-1, los cuales aparecen en todos los subtipos, aunque con una elevada variabilidad genética. Esto sugiere que podría haber una unión específica a distintos factores dentro de la familia SP-1. En cuanto a la caja
TATA (situada en la posición –28 en todos los subtipos), el
subtipo E presenta una mutación, de forma que la secuencia
TATAA cambia a TAAAA. Además, este subtipo presenta en la
posición –136 la secuencia correspondiente a una caja TATA
convencional. Ciertos experimentos de mutagénesis dirigida
han demostrado que la única caja funcional que une TBP y
recluta la ARN polimerasa II es la caja de la posición –2811.
En la región activadora se han encontrado diferencias en el
número de sitios NF-κB en los distintos subtipos12,13. Esto
condiciona la activación por el factor de necrosis tumoral
TABLA 3
Diferencias en las secuencias terminales repetidas largas (LTR) de distintos subtipos del virus de la inmunodeficiencia
humana tipo 1 (VIH-1)
Secuencia
TATA-136
Secuencia
TATA-28
(Caja TATA)
F
No
No
No
No
Sí
No funcional
No
Sí
Sí
Sí
Sí
No
Funcional
Sí
G
No
Sí
Suptipo
A
B
C
D
E
RBE III
AP1
N.O de sitios
NF-κB
Aumento
de la transcripción
en presencia
de TNF-α (veces)
TAR
Conservado
2
No
1
No
1
2
2
3
2
1/GABP
2,5-3
2,5-3
3,4
2,5-3
1,5
Deleción 1 nt
–
–
–
Deleción 1 nt
No
No
CG (Pu)ACA
TTTGAACAAAG
CGAAAACACATA
1 + duplicación
parcial
1
2
2,5-3
–
No
2
2,5-3
–
No
Secuencia
característica
en la región NRE
Nt: nucleótido.
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alfa (TNF-α), el factor que promueve la producción de NFκB en la célula. Así, tras la adición de TNF-α a células infectadas con distintos subtipos del VIH-1, la actividad transcripcional aumenta en los subtipos con mayor número de
sitios NF-κB14,15. Es decir, la transcripción en estos subtipos
es más inducible por TNF-α (tabla 3). El subtipo E presenta
un sitio mutado para NF-κB, de forma que no une NF-κB
sino GABP (GA-binding protein), un factor modulador de la
transcripción. El número de sitios de unión al factor regulador AP1, localizado en la región activadora, también varía
en los distintos subtipos del VIH-1.
Existen también diferencias en la región TAR de los distintos
subtipos del VIH-1, principalmente en los subtipos E16 y A.
Estos presentan la deleción de un nucleótido, lo que modifica el tamaño de uno de los bolsillos que se generan en la
estructura secundaria de su ARN. En presencia de Tat (proteína viral que se une a TAR), todos los LTR de distintos
subtipos presentan una actividad transcripcional similar.
Además, dicha actividad es mucho mayor que la que se
produce en su ausencia10. Cuando no existe Tat para transactivar, es decir, en condiciones basales, parecen apreciarse algunas diferencias en el grado transcripcional de los distintos subtipos, pero sólo en determinados tipos celulares.
Así, por ejemplo, los subtipos E, A y C presentan mayor actividad que el subtipo B en líneas celulares de linfocitos T.
Hasta aquí hemos descrito la existencia de diferencias en la
secuencia de las LTR en los distintos subtipos del VIH-1, y
cómo muchas de ellas son características de subtipo (tabla
3). De todos ellos, el que presenta una arquitectura más diferenciada es el subtipo E16,17, muy extendido en el sudeste
asiático18. Este subtipo no es tan estimulable por TNF-α
como el resto y presenta, además, cambios en la secuencia
de TAR que no impiden el reconocimiento de la proteína Tat
del subtipo B. Todo ello sugiere que el subtipo E podría tener
algún cambio capaz de otorgarle una estrategia alternativa al
control de la transcripción18. Esta opción podría estar mediada por cambios genéticos en la caja TATA, en TAR o en los
sitios de unión a SP1.
Se requieren más estudios para establecer las bases por las
cuales se regula la transcripción en los distintos subtipos
del VIH-1. Este tipo de análisis es crucial, considerando que
los factores virales genéticos determinan, al menos en parte, el curso de la enfermedad por el VIH-1.
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