8.7_Cortés Torresx_ Bonilla Zea

DISTRIBUCIÓN DIFERENCIAL Y REGIONAL DEL TRANSPORTADOR
SNAT5 DURANTE LA ONTOGENIA DEL SISTEMA NERVIOSO DE RATA
Cortés-Torres M. C, Bonilla-Zea M., Moreno-Layseca P., Escobar-Cabrera J.,
Rodríguez-Torres A., Berumen-Segura L., García-Alcocer G.
Unidad de Investigación Genética / Facultad de Química, Universidad
Autónoma de Querétaro.
RESUMEN
La glutamina es un aminoácido neutro, que se sintetiza en las células gliales, a
partir del glutamato, el cual es recapturado de la sinapsis, a través del ciclo
glutamato-glutamina, reponiéndose así el reservorio del neurotransmisor
(glutamato) en la neurona. En este sentido, una molécula esencial para el
mantenimiento e integridad neuronal es el transportador de glutamina SNAT5,
el cual en la rata adulta transfiere la glutamina glial a las neuronas
glutamatérgicas para que pueda llevarse acabo la sinapsis. Por ello, a partir de
2005 se le ha establecido una importante conexión entre éste transportador y
el tratamiento de enfermedades como la esquizofrenia o el Alzheimer. En este
trabajo se pretendió conocer la presencia del transportador SNAT5 durante la
ontogenia, que pueda dar pauta, a explorar la posible participación de la
glutamina en la diferenciación celular, para ello, se estudió la distribución
regional y diferencial del transportador de glutamina SNAT5, en cortes
coronales de encéfalos de ratas embrionarias E14, E16, y E18 y post-natales
P0, P7, P12, P21 y P60 por inmunohistoquímica. Los resultados indican la
presencia del transportador en la corteza, aunque solo se observó la marca en
embriones E14, E18 y en post-natal 7. Sin embargo en otra región como el
hipotálamo, la marca fue observada en los encéfalos embrionarios estudiados y
en encéfalos postnatales P0 y P7. Los resultados obtenidos son los primeros
que se conocen del transportador SNAT5, durante la ontogenia de rata, por lo
que es de suma importancia, explorar tanto la participación de la glutamina, en
la diferenciación celular, como las células que están presentes, en la
distribución diferencial observada en los resultados de esta investigación.
INTRODUCCIÓN
La glutamina es un aminoácido neutro que está codificado en el ARN
mensajero como “CAA” o “CAG”, cuya estructura presenta dos cadenas
nitrogenadas (un grupo amida y otro amino). Este aminoácido esta involucrado
en numerosas vías metabólicas en distintos órganos y sistemas (Bonet et al.,
2007), entre ellos se encuentra el denominado sistema N, cuyo papel es
importante en el aporte de glutamina a las neuronas como precursor de la
síntesis de glutamato, éste es el principal neurotransmisor excitador dentro del
sistema nervioso central, en donde se ha establecido su implicación en
aspectos relevantes al funcionamiento normal del cerebro tales como la
cognición, la memoria y el aprendizaje.
El aporte de glutamina al sistema nervioso es regulado mediante el ciclo
glutamato-glutamina entre células gliales y neuronas. En este ciclo los
transportadores de alta afinidad recapturan gran parte del glutamato liberado
durante la sinapsis introduciéndolo en las células gliales, las cuales lo
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convertirán en glutamina gracias a la enzima glutamina sintetasa. Finalmente,
la glutamina es devuelta a las neuronas glutamatérgicas y también a las
GABAérgicas donde puede ser transformada a glutamato, reponiendo así el
reservorio de neurotransmisor en las neuronas y completando el ciclo
glutamato-glutamina. Por tanto en este ciclo son necesarios al menos dos
transportadores adicionales, uno en las células gliales con capacidad para
exportar glutamina al espacio extracelular, y otro neuronal con capacidad para
recapturar esta glutamina para la neurona.
La familia
de los transportadores SNAT (Synaptic neutral aminoacid
transporter), tienen la capacidad de catalizar estos pasos. Entre estos se
encuentra el transportador de baja afinidad SNAT5 (González, 2007), el cual
regula la recaptura de glutamina mediante el cotransporte Na +/aminoácidos e
intercambiando H+ (Mackenzie, et al., 2003). En estudios recientes se ha
demostrado
que SNAT5 no
se
encuentra
en
las
terminales
glutamatérgicas, sino en la membrana de los astrocitos que envuelven a
las sinapsis excitadoras, ésta situación parece adecuada para intervenir en
la salida de glutamina desde las células de la glía en dirección a las neuronas.
Recientemente se ha establecido una importante conexión entre este
transportador y el tratamiento de enfermedades como la esquizofrenia (Javitt,
et al., 2005). El esclarecimiento de los mecanismos moleculares por los que
actúan estos transportadores de baja afinidad podría ayudar a identificar
nuevas dianas terapéuticas y el desarrollo de nuevos fármacos, así como
conocimiento básico importante para el desarrollo del sistema nervioso.
METODOLOGÍA
Ratas Sprague Dawley embrionarias de 14, 16 y 18 días de gestación, así
como ratas post-natales de 0, 7, 12, 21 y 60 días se sacrificaron para obtener
los encéfalos que fueron fijados con paraformaldehido al 4%. Una vez fijados
se sumergieron en sacarosa para crioprotegerlos y posteriormente se
realizaron cortes de 12 micras en un crióstato Leica.
Los cortes fueron sometidos a inmunohistoquímica para lo cual se lavaron tres
veces con PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente; enseguida se
sometieron a 2 bloqueos, el primero de ellos empleando una solución de
peróxido de hidrógeno al 1% por una hora con el fin de inactivar la actividad
endógena de las peroxidasas, el segundo utilizando una solución de leche
descremada sin grasa (BIO-RAD) al 3% en buffer PBT por 2 horas con la
intención de bloquear sitios de unión inespecíficos. Después de cada bloqueo
los cortes se lavaron tres veces con PBT durante 10 minutos y se aplicó el
anticuerpo policlonal primario SNAT5 producido en guinea pig con el que se
incubó toda la noche a 4°C.
Al segundo día, se retiró el anticuerpo policlonal primario y se lavaron los cortes
tres veces con PBT durante 10 min. Luego se incubaron con el anticuerpo
policlonal secundario antiguinea pig acoplado a peroxidasa y se revelaron con
una solución de 3,3´-diaminobencidina (DAB) y peróxido de hidrógeno en buffer
PBS. Terminado este procedimiento se montaron las laminillas con glicerol y
observaron los cortes para su análisis.
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RESULTADOS
En este trabajo se pretendió conocer la presencia del transportador SNAT5
durante la ontogenia, que pueda dar pauta, a explorar la posible participación
de la glutamina en la diferenciación celular, para ello, se estudió la distribución
regional y diferencial del transportador de glutamina SNAT5, en cortes
coronales de encéfalos de ratas embrionarias E14, E16, y E18 (figura 2) y
postnatales P0, P7, P12, P21 y P60 (figura 1) por inmunohistoquímica. Los
resultados indican la presencia del transportador en la corteza en embriones
E14, E18 y en post-natal 7. Sin embargo en otra región como el hipotálamo, la
marca fue observada en los encéfalos embrionarios estudiados y en encéfalos
postnatales P0 y P7.
A
B
C
D
E
FIGURA 1: FOTOMICROGRAFÍAS DE LA INMUNOTINCIÓN EN CORTES
CORONALES DE ENCÉFALOS DE RATAS POSTNATALES SPRAGUE
DAWLEY. A) En los cortes control y blanco de las inmunohistoquímicas de
encéfalos de rata no se presentó señal inmunorreactiva. B) Se observa la
corteza cerebral de una rata postnatal P0, en la cual no hubo señal
inmunorreactiva para SNAT5. C) Se observa el hipotálamo de una rata postnatal P0, en el cual se observa señal inmunorreactiva para SNAT5. D)
Resultados de la corteza cerebral de una rata postnatal P7, en la cual hubo
inmunotinción. E) Se observa el hipotálamo de un encéfalo postnatal P7, en el
que hubo inmunotinción para SNAT5.
A
B
C
D
E
FIGURA 2: FOTOMICROGRAFÍAS DE LA INMUNOTINCIÓN EN CORTES
CORONALES DE ENCÉFALOS DE RATAS EMBRIONARIAS SPRAGUE
DAWLEY. A) En la corteza cerebral de encéfalos embrionarios E14 se observó
señal inmunorreactiva para SNAT5. B) Se observa el hipotálamo de una rata
embrionaria E14, en el que hubo inmunotinción para SNAT5. C) En la corteza
cerebral de encéfalos embrionarios E16, no se presentó señal inmunorreactiva.
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D) En el hipotálamo de encéfalos embrionarios E16, se encontró inmunotinción
para SNAT5. E) En la corteza cerebral de encéfalos embrionarios E18 se
observó marca inmunorreactiva.
CONCLUSIONES
El transportador de glutamina SNAT5 se presenta en las regiones de la corteza
cerebral e hipotálamo durante la ontogenia del sistema nervioso de rata. Sin
embargo, la señal inmunorreactiva para la corteza solo se observó en
embriones de 14 y 18 días y en encéfalos de ratas postnatales de 7 días. En la
zona del hipocampo la marca inmunorreactiva para SNAT5, se presentó en los
encéfalos embrionarios que fueron estudiados y en encéfalos postnatales de
P0 y P7 días. Los resultados de este trabajo son importantes por el aporte de
nuevo conocimiento al desarrollo del sistema nervioso.
BIBLIOGRAFÍA
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Javitt, D. C., Duncan L., Balla, A., Sershen, H. 2005. Inhibition of system Amediated glycine transport in cortical synaptosomes by therapeutic
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