peptidos capaces de unirse a las moleculas cd8 sobre los

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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kInt. Cl. : A61K 38/00
11 Número de publicación:
2 136 094
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ESPAÑA
C07K 5/00
C07K 7/00
C07K 4/00
C07K 16/00
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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 92924245.1
kFecha de presentación : 03.11.1992
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 661 985
kFecha de publicación de la solicitud: 12.07.1995
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54 Tı́tulo: Péptidos capaces de unirse a las moléculas CD8 sobre los precursores de CTL.
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73 Titular/es:
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72 Inventor/es: Clayberger, Carol y
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74 Agente: Ponti Sales, Adelaida
30 Prioridad: 08.11.1991 US 791925
THE BOARD OF TRUSTEES OF THE
LELAND STANFORD JUNIOR UNIVERSITY
Office of Technology Licensing,
857 Serra Street, 2nd Floor
Stanford, CA 94305-6225, US
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.11.1999
ES 2 136 094 T3
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
16.11.1999
Aviso:
k
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Krensky, Alan M.
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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 136 094 T3
DESCRIPCION
Péptidos capaces de unirse a las moléculas CD8 sobre los percursores de CTL.
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Campo de la invención
La invención se refiere a composiciones peptı́dicas HLA que afectan la actividad de las células T. Se
proporcionan métodos y composiciones para la modulación de la actividad citolı́tica de los linfocitos T.
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Antecedentes de la invención
Los linfocitos T citolı́ticos (también denominados “linfocitos T citotóxicos”, y abreviados tı́picamente
“CTLs”) son una clase de células T que se adhiere y lisa células diana. La mayorı́a de CTLs se restringen en su actividad directora mediante el reconocimiento, sobre la superficie de la célula diana, de una
molécula del complejo mayor de histocompatibilidad de Clase I (MHC de Clase I) que lleva un antı́geno
asociado. Se cree que la interacción entre el CTL y su diana está mediado por la adhesión de un receptor de célula T (TCR) y un complejo asociado de proteı́nas conocido como “CD3” (se hace referencia
a ambos juntos como el complejo “TCR:CD3”), con un complejo MHC:antı́geno sobre la célula diana.
Los CTLs, que interaccionan con moléculas de MHC de Clase I, poseen frecuentemente otra proteı́na
accesoria denominada “CD8”. Se cree que el CD8 es una glicoproteı́na de superficie de los CTLs que
facilita la interacción entre el complejo TCR:CD3 y el complejo MHC:antı́geno. CD8 se une a una región
sobre la molécula de MHC de Clase I diferente del sitio de unión de TCR:CD3 y aumenta la adhesión.
La molécula CD8 también está implicada en la mediación de la transducción de señal y por otro lado en
la modulación de las respuestas funcionales que acompañan la unión del CTL a su diana.
Una de las funciones primarias del sistema de CTL es destruir las células que están produciendo
antı́genos foráneos, como por ejemplo células infectadas por virus. Sin embargo, los CTLs también están
implicados en la destrucción de células foráneas introducidas a propósito en el cuerpo, como injertos o
transplantes de huéspedes alogénicos. Este proceso, conocido como el “rechazo aloinjerto”, implica la
interacción de los CTLs del huésped con moléculas de MHC foráneas. La aproximación utilizada más
comúnmente para prevenir el rechazo aloinjerto es suprimir el sistema inmune en el receptor; tı́picamente
mediante la utilización de fármacos inmunosupresores. Sin embargo, la utilización de estos fármacos
puede provocar efectos secundarios severos, incluyendo nefrotoxicidad, hipertensión, pérdida de hueso y
linfoma. Otra aproximación ha sido la utilización de anticuerpos contra células T humanas, tales como
OKT3 y OKT4. Sin embargo, se han encontrado problemas con esta aproximación debido a que los
humanos organizan respuestas de anticuerpos contra las proteı́nas, haciéndolas inefectivas.
Continúa existiendo una necesidad substancial de encontrar maneras de controlar el sistema citolı́tico
en un huésped mediante la modulación selectiva de las actividades de las células T. Las mayores mejoras
en el transplante de tejidos pueden obtenerse mediante el desarrollo de terapias más especificas y menos
tóxicas para prevenir el rechazo aloinjerto.
Resumen de la invención
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La presente invención proporciona composiciones que comprenden un péptido que tiene entre aproximadamente 7 y aproximadamente 20 residuos, comprendiendo el péptido una secuencia de aminoácidos
en la cual al menos el 40 % de los residuos son idénticos a los residuos de las posiciones correspondientes
a una secuencia en el dominio α3 de una molécula de MHC de Clase I. El péptido une selectivamente una
molécula CD8 sobre un precursor de linfocito T citolı́tico (CTL) e inhibe la diferenciación del precursor
de CTL en un CTL maduro. La secuencia en el dominio α3 está preferentemente entre el residuo 220
y el residuo 235. Los péptidos comprenden tı́picamente las secuencias DQTQDTE (SEQ. ID N◦ 1) o
EDQTQDTELVETRP (SEQ. ID N◦ 2).
La invención también hace referencia a composiciones farmacéuticas que comprenden un transportador farmacéuticamente aceptable y los péptidos descritos más arriba, ası́ como métodos para modular la
actividad de los CTLs en un paciente. Las composiciones y métodos pueden utilizarse para tratar, por
ejemplo, el rechazo aloinjerto. En estas composiciones el péptido puede comprender un aminoácido D.
Breve descripción de los dibujos
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Las Figs. 1A, 1B, 1C y 1D muestran el efecto de los péptidos de la invención sobre la diferenciación
de CTL, medido mediante análisis de dilución limitante. La diana de la Fig. 1A es HLA-A2-1. La diana
de la Fig. 1B es HLA-B27. La diana de la Fig. 1C es HLA-B27 + el péptido INF-NP. La diana de la
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Fig. 1D es HLA-A2-I.
La Fig. 2 demuestra que los péptidos de la invención no tienen efecto sobre la lisis por CTL maduro.
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La Fig. 3 muestra que los péptidos de la invención no bloquean la proliferación inducida por
aloantı́geno de los linfocitos en reposo de la sangre periférica.
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Se proporcionan métodos y composiciones para modular los efectos de los linfocitos T citolı́ticos. Diferentes clases de moléculas de MHC Clase I, conjuntamente con un antı́geno proteico asociado, son capaces
de unirse a complejos TCR:CD3 sobre los CTLs. Existen regiones variables tanto sobre el TCR como
sobre la molécula MHC de Clase I y están probablemente implicados en la especificidad de la actividad
directora de los CTLs. Tal y como se discute más arriba, la lipoproteina CD8 sobre la superficie del CTL
es una molécula accesoria implicada en la interacción entre los CTLs y sus dianas.
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A diferencia del TCR, la molécula CD8 es generalmente invariable en las especies animales. Los
residuos 215 a 239 del dominio α3 de las moléculas de MHC de Clase I están altamente conservados, con
sólo cuatro diferencias entre las moléculas de rata y humanos.
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LTWQL
LTWQR
NGEDL
DGEDO
TQDME
TQDTE
LVETR
LVETR
PAGDG
PAGDG
Tal y como se describe más abajo, los polipéptidos que comprenden porciones de esta región altamente
conservada, incluyendo por ejemplo el 14-mer EDQTQDTELV ETRP (SEQ. ID. N◦ 2) (correspondiente
a los residuos 222-235), se utilizan para modular las interacciones entre los CTLs y sus dianas.
Una modulación preferida de la función CTL es la inhibición de la diferenciación de los CTLs. Los
CTLs maduros se diferencian de los “pre-CTLs” presentes en la sangre y tejidos linfáticos periféricos.
Los pre-CTLs prácticamente han llevado a cabo la maduración tı́mica y son especı́ficos para un antı́geno
foráneo particular pero carecen de la función citolı́tica. La primera etapa en la diferenciación o “activación” es la unión del pre-CTL a un antı́geno foráneo. Esta interacción con un antı́geno foráneo hace
que el CTL responda a las citocinas, que están implicadas en la terminación del proceso de diferenciación.
El término “diferenciación”, tal y como se utiliza aquı́, abarca el proceso de maduración de un pre-CTL
a un CTL maduro. La presencia de CTLs maduros puede detectarse de varias maneras, tal y como se
describe más abajo. Se detectan tı́picamente por su capacidad de lisar células presentadoras de antı́geno
apropiadas. Para una discusión de los acontecimientos implicados en la diferenciación, ver, por ejemplo,
Abbas, A., et al., Cellular and Molecular Immunology, W.B. Saunders (1991).
Polipéptidos adecuados para utilizar en la presente invención pueden obtenerse de varias maneras.
Convenientemente, pueden sintetizarse por técnicas convencionales empleando sintetizadores automáticos,
tales como el Beckman, Applied Biosystems, o otros sintetizadores de péptidos accesibles comúnmente
utilizando protocolos bien conocidos. Además pueden sintetizarse manualmente utilizando técnicas bien
conocidas en el estado de la técnica. Ver, por ejemplo, Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis,
Rockford, IL., Pierce, 2a
¯ Ed. (1984).
Alternativamente, pueden clonarse y expresarse secuencias de ADN que codifican una proteı́na que
comprende el péptido particular, para proporcionar el péptido. Se dispone de células que comprenden
diferentes genes de MHC, por ejemplo, pueden obtenerse fácilmente a partir de la American Type Culture
Collection -Colección Americana de Cultivos Tipo- (“Catalogue of Cell Lines and Hybridomas” -Catálogo
de Lı́neas Celulares e Hibridomas-, 6a
¯ edición (1988), Rockville, Maryland, U.S.A. Por ejemplo, pueden
utilizarse técnicas estándar para analizar librerı́as de ADNc para identificar secuencias que codifican las
secuencias deseadas (ver, Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (Clonaje MolecularUn Manual de Laboratorio), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Por
ejemplo, pueden producirse proteı́nas de fusión (aquellas que consisten en todas o parte de las secuencias
de aminoácidos de dos o más proteı́nas) mediante técnicas de ADN recombinante. Además, utilizando
técnicas de mutagénesis in vitro, una proteı́na no relacionada puede mutarse para comprender las secuencias de unión CD8 apropiadas.
Las glicoproteı́nas MHC de Clase I de un gran número de fuentes naturales pueden aislarse con3
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venientemente también utilizando técnicas de purificación de proteı́nas estándar. Los péptidos pueden
purificarse mediante cualquiera de un gran número de técnicas conocidas, incluyendo, por ejemplo, la
cromatografı́a lı́quida de alta prestación (HPLC “High-performance Liquid Chromatography”) de fase
reversa, cromatografı́a de intercambio iónico o de inmunoafinidad, la separación por tamaño o la electroforesis (ver, en general, Scopes, R., Protein Purification -Purificación de Proteı́nas-, Springer-Verlag,
N.Y. (1982).
Aunque en la presente invención se prefieren los fragmentos peptı́dicos relativamente cortos, en ciertos casos puede ser deseable utilizar péptidos más largos (mayores de aproximadamente 30 residuos) que
comprendan las secuencias descritas aquı́. Tal y como se utiliza aquı́, un “polipéptido” o “péptido” es
una cadena molecular de residuos unidos mediante enlaces peptı́dicos (o miméticos de enlace peptı́dico).
El término también engloba moléculas proteicas (por ejemplo proteı́nas de fusión) o porciones de las
mismas, que incluyen secuencias de unión CD8. El término “residuo” se refiere a un aminoácido (D- o
L-) o aminoácido mimético de aminoácido incorporado en un polipéptido o péptido mediante un enlace
peptı́dico o mimético de enlace peptı́dico. Un mimético de enlace peptı́dico de la invención incluye modificaciones del esqueleto peptı́dico bien conocidas por los expertos en la técnica. Dichas modificaciones
incluyen modificaciones del nitrógeno amı́dico, del carbono-α, del carbonilo amı́dico, la substitución completa del enlace amı́dico, extensiones, delecciones o entrecruzamientos de esqueleto. Ver, en general,
Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins (Quı́mica y Bioquı́mica de
Aminoácidos, Péptidos y Proteı́nas), Vol. VII (Weinstein ed., 1983). Se conocen varias modificaciones
del esqueleto peptı́dico, que incluyen, Ψ[CH2 S], Ψ[CH2 NH], Ψ[CSNH2 ], Ψ[NHCO], Ψ[COCH2 ] y Ψ[(E)
o (Z) CH=CH]. La nomenclatura utilizada más arriba, sigue la sugerida por Spatola, más arriba. En
este contexto, Ψ indica la ausencia de enlace amı́dico. La estructura que substituye el grupo amida se
especifica entre paréntesis.
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Un “mimético de aminoácido” tal y como se utiliza aquı́ es una estructura diferente de un aminoácido
presente de forma natural que conformacionalmente y funcionalmente sirve como substituto de un
aminoácido en un péptido de la presente invención. Dicha estructura sirve como substituto de un residuo
de aminoácido si no interfiere con la capacidad del péptido de unirse a CD8. Los miméticos de aminoácidos
pueden incluir aminoácidos no proteicos, tales como β-γ-δ-aminoácidos, β-γ-δ-iminoácidos (tales como
el ácido peridin-4-carboxı́licos) ası́ como algunos derivados de L-α-aminoácidos. Varios miméticos de
aminoácidos adecuados, que son conocidos por el experto en la técnica, incluyen la ciclohexilalanina,
el ácido 3-ciclohexilpropiónico, la L-adamantilalanina, el ácido adamantilacético y similares. Morgan y
Gainor describen miméticos de péptidos adecuados para los péptidos de la presente invención en Ann.
Rents. Med. Chem. 24:243-252 (1989).
Ası́, varios análogos conformacionales de las secuencias de aminoácidos en el dominio α3 identificado
más arriba pueden utilizarse para modular la función de los CTLs. La capacidad de los análogos de
unirse a CD8 y modular la función CTL puede analizarse en los ensayos descritos más abajo. Tal y
como se utiliza aquı́, los “análogos conformacionales” son moléculas que tienen una organización espacial
o polar suficientemente similar a las secuencias de aminoácidos del dominio α3 para que tenga lugar la
unión especı́fica de la molécula CD8. Al igual que otras interacciones de unión especı́ficas, el reconocimiento incluirá tı́picamente asociaciones no covalentes reversibles tales como la atracción electrostática,
fuerzas de Van der Waals y enlaces de hidrógeno. Los análogos conformacionales de la invención pueden
consistir enteramente en residuos de aminoácidos diferentes de aquellos encontrados en la secuencia A3.
Alternativamente, pueden comprender cualquiera entre varios miméticos de aminoácidos unidos mediante
miméticos de enlace peptı́dico.
Los péptidos y sus análogos comprenden tı́picamente al menos aproximadamente 7 residuos y más
preferentemente al menos aproximadamente 13 residuos. Preferentemente, no excederán de 30 residuos
y, más preferentemente, no excederán de aproximadamente 20 residuos.
Los péptidos o polipéptidos de la invención pueden modificarse de varias maneras siempre que comprendan una secuencia substancialmente homóloga a una secuencia en el dominio α3 de una molécula
de MHC de Clase I. Tal y como se utiliza aquı́, “substancialmente homólogo” significa que el porcentaje
de residuos idénticos en posiciones correspondientes en las dos secuencias es al menos aproximadamente
del 40 %, normalmente aproximadamente del 75 %, y preferentemente aproximadamente del 95 % o más.
Dos residuos se consideran idénticos si los residuos son los mismos (isómeros D- y L- de un aminoácido
particular se consideran que son el mismo residuo) o si un residuo es un mimético del otro, tal y como se
define más arriba.
Los péptidos modificados y otros análogos conformacionales pueden ensayarse en cuanto a su activi4
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dad biológica de diferentes maneras. Si la función CTL a modular es la diferenciación en CTLs maduros,
los ensayos implican tı́picamente la detección de CTLs maduros mediante su capacidad de lisar células
presentadoras de antı́genos apropiadas. Los ensayos en un protocolo ejemplar descrito más abajo, implican un análisis de dilución limitante para medir los efectos de péptidos añadidos sobre la diferenciación
de CTLs en un ensayo in vitro utilizando linfocitos de sangre periférica.
La capacidad de los péptidos de modular la actividad CTL in vitro puede correlacionarse entonces
con la capacidad de afectar la respuesta inmune in vivo. La actividad in vivo se ensaya tópicamente
utilizando modelos animales adecuados como por ejemplo ratas. La secuencia del dominio α3 de rata es
conocido y, tal y como se discute más arriba, la secuencia del residuo 215 al 239 es bastante similar al de
la secuencia humana. Para ensayar el efecto de los péptidos sobre el rechazo aloinjerto, por ejemplo, las
células alogénicas pueden introducirse en un animal a continuación de la administración de varias concentraciones de los péptidos HLA y de controles adecuados. Los controles pueden incluir, por ejemplo,
péptidos sintéticos que contengan los mismos residuos que los péptidos test, pero colocados al azar. La
respuesta inmune a las células alogénicas puede medirse mediante, por ejemplo, un ensayo de dilución
limitante, tal y como se describe más abajo.
También pueden utilizarse modelos animales para ensayar directamente la capacidad de los péptidos
de inhibir el rechazo aloinjerto. Por ejemplo, los péptidos pueden administrarse a los animales a varios
tiempos antes de la introducción del tejido alogénico, y se puede monitorizar el rechazo de injerto de los
animales. También puede llevarse a cabo el análisis en primates utilizando, por ejemplo, monos ninomolgus. Los métodos adecuados para llevar a cabo el transplante y monitorizar el rechazo de injerto son bien
conocidos por los expertos en la técnica (ver, por ej., Hislop et al., J. Thorac. Cardiovasc. 100:360-370
(1990)).
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Las secuencias se modifican convenientemente de varias maneras dependiendo del objetivo final. Por
ejemplo, también puede investigarse el efecto de las substituciones puntuales de aminoácidos utilizando
D-aminoácidos o miméticos de aminoácidos. Entonces pueden identificarse las substituciones de residuos
que conducen a una afinidad de unión aumentada de los péptidos. Los ensayos de la presente invención se
utilizan convenientemente para identificar péptidos que tienen una afinidad aumentada por las moléculas
CD8 utilizando, por ejemplo, ensayos de competencia para determinar las concentraciones de los péptidos
requeridas para producir un 50 % de inhibición de la unión entre CD8 y la molécula MHC apropiada.
Un dominio de unión núcleo puede identificarse haciendo series de péptidos relacionados que difieren
del péptido tipo nativo en una o más substituciones, adiciones o deleciones de residuos utilizando técnicas
bien conocidas en el estado de la técnica. El efecto de las substituciones sobre la unión puede analizarse,
utilizando por ejemplo, un ensayo de dilución limitante o un ensayo de competición con péptidos no substituidos. Por ejemplo, una descripción de varias mutaciones puntuales en genes que codifican el dominio
α3 por Salter, R.D., et al. (Nature, 345:41 (1990)), pone en evidencia que varios clusters de residuos
están implicados en la interacción con CD8. Un cluster incluye las posiciones 223-229, que forman un
lazo expuesto entre las hebras 3 y 4 del dominio α3. La secuencia desde las posiciones 220-232, que
incluye el lazo expuesto, no contiene residuos básicos, contiene 6 residuos ácidos (220, 222, 223, 227, 229
y 232) y está altamente conservada. Un segundo cluster implica los residuos 233 y 235, que están en la
cuarta hebra de la lámina plegada β. La treonina en posición 233 está sobre la superficie expuesta del
dominio α3, e incluso cambios bastante conservativos, a alanina o isoleucina por ejemplo, pueden afectar
directamente la unión a CD8. Un tercer cluster implica las posiciones 245 y 247, que están localizadas
sobre la quinta hebra de la lámina plegada β detrás de los residuos que confeccionan el primer cluster
descrito más arriba.
Aparte de las modificaciones que afectan la interacción con CD8, los péptidos y sus análogos pueden
modificarse para alterar, por ejemplo, su estabilidad in vivo. Por ejemplo, la inclusión de uno o más
D-aminonácidos en el péptido aumenta tı́picamente la estabilidad, particularmente si los residuos de Daminoácidos están substituidos en uno o dos extremos de la secuencia peptı́dica. La estabilidad puede
ensayarse de diversas maneras, por ejemplo midiendo la vida media de las proteı́nas durante la incubación con peptidasas o plasma humano o suero. Se han descrito varios de dichos ensayos de estabilidad
de proteinas (ver, por ejemplo, Verhoef et al., Eur. J. Drug Metab. Pharmacokin. 11:291-302 (1986)).
Los péptidos pueden modificarse también mediante la unión a otras moléculas. Por ejemplo, pueden
introducirse diferentes grupos N o C-terminales para alterar las propiedades fı́sicas y/o quı́micas de la
molécula. Dichas alteraciones pueden utilizarse para afectar, por ejemplo, la adhesión, la estabilidad, la
accesibilidad biológica, la localización o la detección de las moléculas. Puede unirse una amplia variedad
de marcas con objetivos de diagnóstico, a los extremos, las cuales pueden proporcionar, directa o indi5
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rectamente, una señal detectable. Ası́, los péptidos de la presente invención pueden modificarse de varias
maneras para varios propósitos finales reteniendo todavı́a la actividad biológica.
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Pueden introducirse varios sitios reactivos en los extremos para la unión a partı́culas, substratos
sólidos, macromoléculas y similares. Por ejemplo, una estructura amino interna de una cadena creciente
unida a un substrato sólido con los grupos laterales intermedios protegidos, puede conjugarse con ácido
metilditiobenzoico (MDTB). El grupo mercaptano libre puede utilizarse entonces para conjugarse con
olefinas activadas. Ası́, proteı́nas tales como la albúmina del suero, la hemocianina de lapa en forma
de ojo de cerradura, la β-globulina bovina, o similares, pueden conjugarse con el péptido para provocar
que un inmunógeno produzca anticuerpos hacia el péptido para utilizar en inmunoensayos, para cromatografı́a de afinidad, o similares. Alternativamente, el péptido puede unirse a otro polipéptido mediante
la preparación de una secuencia de ADN que tiene el péptido en el extremo N-terminal, C-terminal o
interno en la proteı́na, de manera que se proporciona una proteı́na de fusión que incluye el péptido de
unión de interés. De esta manera, pueden producirse proteı́nas de fusión que tienen actividad enzimática,
la cual puede ser modulada por macromoléculas.
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Los péptidos de la invención pueden utilizarse para modular la actividad CTL en un huésped de
mamı́fero, preferentemente en un humano. En una realización, los péptidos pueden utilizarse para inhibir
la diferenciación de los precursores de CTL en CTLs maduros como una aproximación para inhibir el
rechazo aloinjerto.
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La diferenciación de los CTLs puede ensayarse utilizando un análisis de dilución limitante (LDA), tal
y como se describe en un ejemplo más abajo. Dado que los péptidos son más selectivos y generalmente
menos tóxicos que los agentes inmunomoduladores convencionales, será menos probable que provoquen
efectos laterales frecuentemente observados con los agentes convencionales. Además, debido a que los
péptidos corresponden a secuencias de proteı́nas humanas, es menos probable que provoquen respuestas inmunológicas tales como las observadas con la utilización de anticuerpos anti-CD3 murinos. Los
péptidos de la presente invención pueden combinarse también con estos agentes terapéuticos convencionales, y pueden utilizarse para disminuir la dosis de dichos agentes a niveles bajo aquellos asociados a
efectos laterales.
Una utilización relacionada para la presente invención es modular la respuesta inmune implicada en
la enfermedad del “injerto frente a huésped” (GVHD “Graft Versus Host Disease”). La GVHD es una
enfermedad potencialmente fatal que ocurre cuando células inmunológicamente competentes se transfieren a un receptor alogénico. Si las células inmunocompetentes del donante no están activadas por
el huésped receptor (en un individuo inmunosuprimido, por ejemplo), entonces estas células donantes
pueden atacar tejidos en el receptor. Los tejidos de la piel, el epitelio del intestino e hı́gado son dianas
frecuentes y pueden ser destruidos durante el curso de la GVHD. La enfermedad presenta un problema
especialmente severo cuando se está transplantando tejido inmune, tal como en el transplante de médula
ósea; pero también se ha descrito GCHD menos severa en otros casos, incluyendo los transplantes de
corazón e hı́gado. Aplicada en el contexto de la GVHD, los péptidos de la presente invención se utilizan
para bloquear el dominio de unión sobre las moléculas de CD8 de los CTLs donantes, interfiriendo ası́
con su capacidad de lisar células diana en el huésped.
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La utilidad de los péptidos de la presente invención no se limita a agentes terapéuticos para el rechazo
aloinjerto y la enfermedad de injerto frente a huésped. Por ejemplo, la presente invención también es
útil en cualquier circunstancia en la cual sea deseable bloquear o modular la interacción entre CD8 y
moléculas de MHC de Clase I tales como respuestas alérgicas, respuestas autoinmunes y similares.
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Además, la presente invención es útil para prevenir una respuesta inmune en el contexto de ciertas
terapias génicas somáticas. Aunque la terapia génica puede implicar la corrección de las propias células
de un individuo, y por tanto no presenta el mismo problema que el rechazo aloinjerto (en el cual están
implicadas moléculas de MHC foráneas), la expresión de proteı́nas foráneas puede desencadenar una
respuesta inmune mediada por CTL que podrı́a poner en peligro el tratamiento. En el contexto de la
terapia génica, las propias células del individuo podrı́an modificarse para permitir la producción de una
nueva proteı́na de manera que se corrija, por ejemplo, un error innato del metabolismo que resulte en la
pérdida o modificación de una proteı́na esencial. La aproximación puede fallar si los CTLs del receptor
reaccionan contra las células que expresan la nueva proteı́na. La presente invención es útil para inhibir
este reconocimiento mediante la interferencia con la interacción entre CD8 y la molécula de MHC que
presenta el antı́geno “foráneo”.
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Los péptidos de la presente invención pueden utilizarse también para dirigir los CTLs. En este conte6
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xto, los péptidos se conjugan tı́picamente con otra molécula. Por ejemplo, los péptidos pueden unirse a
liposomas que contengan agentes inmunosupresores particulares, a un anticuerpo monoclonal o inmunoglobulina, o a citotoxina u otros moduladores de actividad celular, de manera que la unión del conjugado
al CTL provoque una alteración del CTL.
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Por ejemplo, son bien conocidas en el estado de la técnica varias toxinas proteicas, incluyendo la
ricina, la difteria, la gelonina, la toxina de Pseudomonas y la abrina. Los agentes terapéuticos incluyen,
por ejemplo, ladoxorubicina, la duanorubicina, el metotrexato, la citotoxina y ARN antisentido. También
pueden utilizarse antibióticos. Además, pueden utilizarse radioisótopos tales como ytrio-90, fósforo-32,
plomo-212, yodo-131 o paladio-109. La radiación emitida destruye las células T diana.
Los péptidos de la presente invención pueden utilizarse también para marcar linfocitos T citotóxicos.
El marcaje de los CTLs, que puede ser útil para propósitos de diagnóstico, puede conseguirse mediante la
unión al péptido de cualquiera entre una gran variedad de marcas conocidas. Después de la exposición del
péptido marcado a los CTLs, los CTLs marcados pueden detectarse directamente o bien indirectamente.
Por ejemplo, pueden unirse agentes fluorescentes, enzimas u otras moléculas detectables a los péptidos
de la presente invención. Estas moléculas detectables pueden unirse directamente al péptido modulador
de CTL o indirectamente a través de otras moléculas. Por ejemplo, la biotina introducida en el péptido
se unirá a continuación a un conjugado de avidina con enzimas o agentes fluorescentes. El marcaje fluorescente puede ser útil, por ejemplo, al permitir que los CTLs sean detectados en un clasificador celular
activado por fluorescencia (FACS, “Fluorescence Activated Cell Sorter”). Puede emplearse una gran variedad de marcas, tales como radionúcleos (por ejemplo, radioisótopos emisores γ, tales como tecnecio-99
o indio-111), agentes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceina), enzimas, substratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, compuestos quimioluminiscentes, compuestos bioluminiscentes,
etc. Los expertos medios en la técnica conocerán otras marcas adecuadas para unir a los complejos o
serán capaces de determinar dicha experimentación de utilización rutinaria. La unión de estas marcas se
consigue utilizando técnicas estándar comunes para los expertos medios en la técnica.
Las utilizaciones in vitro incluyen aplicaciones de diagnóstico, aislamiento o marcaje de células especı́ficas y similares. Por ejemplo, los péptidos de la presente invención pueden utilizarse para ensayar
inhibidores potenciales de interacciones MHC-células T. Se Los inhibidores potenciales pueden ensayarse
por su capacidad de inhibir la unión de los péptidos a CD8 aislado.
El marcaje de CTLs in vivo puede ser útil, por ejemplo, para monitorizar la presencia y concentración
de los CTLs en localizaciones particulares en el organismo. Para imágenes de diagnóstico in vivo, los
radioisótopos se utilizan tı́picamente de acuerdo con técnicas bien conocidas. Los radioisótopos pueden
unirse a la proteı́na o péptido bien directamente o indirectamente utilizando grupos funcionales intermedios que eran bien conocidos por los expertos en la técnica en el momento en que se depositó la solicitud
original. Por ejemplo, agentes quelantes tales como ácido dietilentriaminpentacético (DTPA) y ácido etilendiamintetraacético (EDTA) y moléculas similares se han utilizado para unir proteı́nas a radioisótopos
de iones metálicos.
Los péptidos pueden marcarse también con un isótopo paramagnético para propósitos de diagnóstico
in vivo, como la obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI) o resonancia de spin electrónica
(ESR), ambas bien conocidas en el momento en que se depositó la solicitud original. Por ejemplo, estas técnicas y técnicas relacionadas se han utilizado en el diagnóstico de enfermedades reumáticas (ver,
Namey, en Textbook of Rheumatology (Libro de texto de reumatologı́a), Kelley et al. (eds.) Saunders,
Philadephia, 1985). En general, puede utilizarse cualquier método convencional para visualizar la imagen
de diagnóstico. Habitualmente los radioisótopos emisores de radiación gamma y positrón se utilizan para
imagen de cámara y los isótopos paramagnéticos se utilizan para MRI. Ası́, los péptidos de la presente
invención pueden utilizarse para monitorizar el curso de la mejora de una respuesta autoinmune en un
individuo. Midiendo el aumento o descenso del número de CTLs es posible determinar si es efectivo un
régimen terapéutico particular con el objetivo de mejorar la actividad CTL nociva.
Los péptidos son útiles particularmente en aplicaciones terapéuticas. Las composiciones farmacéuticas
de la invención son adecuadas para utilizar en varios sistemas de distribución de fármacos. Para una breve
revisión de los métodos actuales de distribución de fármacos, ver, Langer, Science 249:1527-1533 (1990).
Preferentemente, las composiciones farmacéuticas se administran parenteralmente, es decir, intraarticularmente, intravenosamente, subcutáneamente o intramuscularmente.
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Los péptidos de la invención pueden unirse a un liposoma o a una membrana lipı́dica de doble capa o
encapsularse en un liposoma. Se dispone de varias técnicas para unir un péptido o proteı́na a un lı́pido,
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particularmente un fosfolı́pido, para proporcionar la presencia del péptido o proteı́na sobre la superficie
del liposoma. Puede utilizarse fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, u otro lı́pido con un agente de unión
bifuncional, tal como MBSE, glutaraldehido, ácido metilditiobenzoico o similares.
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La formación de liposomas con proteı́nas conjugadas es bien conocida. La carga de un liposoma es un
determinante importante en la eliminación de liposomas de la sangre, siendo recogidos los liposomas cargados negativamente más rápidamente por el sistema retı́culoendotelial (Juliano, Biochem. Biophys. Res.
Commun. 63:651 (1975)) y teniendo ası́ vidas medias más cortas en la corriente sanguı́nea. Los liposomas
con vidas medias de circulación prolongadas son tı́picamente deseables para utilizaciones terapéuticas y
de diagnóstico. Por ejemplo, se prefieren particularmente los liposomas que pueden mantenerse a partir
de 8, 12 o hasta 24 horas en la corriente sanguı́nea.
Tı́picamente, los liposomas se preparan con aproximadamente 5-15 moles por ciento de fosfolı́pidos
cargados negativamente, tales como el fosfatidilglicerol, la fosfatidilserina o el fosfatidilinositol. Los fosfolı́pidos cargados negativamente añadidos, tales como el fosfatidilglicerol, sirven también para prevenir
la agregación espontánea de liposomas y para minimizar por tanto el riesgo de formación de agregados
liposomales de tamaño insuficiente. Los agentes que hacen más rı́gida la membrana, tales como la esfingomielina o un fosfolı́pido neutro saturado, a una concentración de al menos aproximadamente el 50 por
ciento, y 5-15 mol por ciento de monosialilgangliósido, pueden proporcionar una circulación aumentada
de la preparación liposómica en la corriente sanguı́nea, tal y como se describe de forma general en la
patente U.S. N◦ . 4.837.028.
Adicionalmente, la suspensión liposómica puede incluir agentes protectores de lı́pidos, que protegen
lı́pidos contra los radicales libres y los daños peroxidativos de lı́pidos durante el almacenamiento. Se
prefieren atrapadores de radicales libres lipofı́licos, tales como el alfatocoferol y quelantes especı́ficos de
hierro solubles, tales como la ferrioxianina.
Se dispone de diferentes métodos para preparar liposomas, tal y como se describe en, por ejemplo,
Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), patente U.S. Nos. 4.235.871, 4.501.728,¡ y
4.837.028. Un método produce vesı́culas multilamelares de tamaños heterogéneos. En este método, los
lı́pidos que forman las vesı́culas se disuelven en un disolvente o sistema disolvente orgánico adecuado y
se secan al vacı́o o mediante un gas inerte para formar una capa lipı́dica fina. Si se desea, la capa puede
redisolverse en un disolvente adecuado, por ejemplo butanol terciario y después liofilizarse para formar
una mezcla lipı́dica más homogénea que está en una forma tipo polvo mucho más fácil de hidratar. Esta
capa está recubierta por una solución acuosa del fármaco dirigido y el componente dirigido y se permite que se hidrate, tı́picamente sobre un perı́odo de 15-60 minutos con agitación. La distribución de
tamaño de las vesı́culas multilamelates resultantes puede cambiarse a tamaños más pequeños hidratando
los lı́pidos bajo condiciones de agitación más vigorosas o añadiendo detergentes solubilizantes tales como
deoxicolato.
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El medio de hidratación contiene el fármaco o péptidos dirigidos de la invención a una concentración
que se desea en el volumen interior de los liposomas en la suspensión de liposomas final. Tı́picamente, el
fármaco o péptido está en una concentración entre 10-100 mg/ml en una solución salina tamponada.
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A continuación de la preparación de los liposomas, se puede dar tamaño a los liposomas para conseguir
un rango de tamaños deseado y una distribución relativamente estrecha de tamaños de liposoma. Un
rango de tamaños preferido es aproximadamente 0,2-0,4 micrones, que permite que la suspensión de liposomas se esteriliza por filtración a través de un filtro convencional, tı́picamente un filtro de 0,22 micrones.
El método de esterilización del filtro puede llevarse a cabo sobre una base de elevado rendimiento si a los
liposomas se les ha reducido el tamaño hasta 0,2-0,4 micrones.
Se dispone de varias técnicas para dar tamaño a los liposomas hasta un tamaño deseado. Un método
para dar tamaño se describe en la patente U.S. N◦ 4.737.323, incorporada aquı́ como referencia. Sonicar
una suspensión de liposomas mediante un baño o una sonicación de sonda provoca una reducción de
tamaño progresiva hasta vesı́culas unilamelares pequeñas menores de aproximadamente 0,05 micrones en
tamaño. La homogenización es otro método que se basa en la energı́a de cizalla para fragmentar liposomas grandes en liposomas más pequeños. En un procedimiento tı́pico de homogenización, las vesı́culas
multilamelares se recirculan a través de un homogenizador de emulsión estándar hasta que se observan
tamaños de liposomas seleccionados, tı́picamente entre aproximadamente 0,1 y 0,5 micrones. En ambos métodos, la distribución de tamaños de partı́cula puede monitorizarse mediante la discriminación de
tamaño de partı́cula por rayo láser convencional.
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La extrusión de liposomas a través de una membrana de policarbonato de poro pequeño o una membrana de cerámica asimétrica es también un método efectivo para reducir el tamaño de los liposomas
hasta una distribución de tamaños relativamente bien definidos. Tı́picamente, la suspensión se cicla a
través de la membrana una o más veces hasta que se consigue la distribución de tamaños de liposomas
deseada. Los liposomas pueden ser extrusionados a través de membranas de poro pequeño succesivas,
para conseguir una reducción gradual del tamaño de liposoma.
Incluso bajo los métodos de encapsulación más eficientes, la suspensión de liposomas de tamaño inicial
puede contener hasta un 50 % o más de fármaco en forma libre (no encapsulada).
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Se dispone de varios métodos para eliminar el compuesto no atrapado de una suspensión de liposomas.
En un método, los liposomas en la suspensión se sedimentan mediante centrifugación a alta velocidad,
dejando el compuesto libre y liposomas muy pequeños en el sobrenadante. Otro método implica concentrar la suspensión mediante ultrafiltración, después resuspender los liposomas concentrados en un medio
de recambio. Alternativamente, puede utilizarse la filtración en gel para separar partı́culas de liposomas
grandes de moléculas de soluto.
A continuación del tratamiento anterior, la suspensión de liposomas se lleva a la concentración deseada para utilizar en la administración intravenosa. Esto puede implicar resuspender los liposomas en un
volumen adecuado de medio de inyección, donde los liposomas se han concentrado, por ejemplo mediante
centrifugación o ultrafiltración, o concentrar la suspensión, donde la etapa de retirada del fármaco ha
aumentado el volumen de la suspensión total. Entonces se esteriliza la suspensión mediante filtración,
tal y como se ha descrito más arriba. Los liposomas que comprenden los péptidos de la invención pueden
administrarse parenteralmente o localmente en una dosis que varı́a de acuerdo con, por ejemplo, la forma
de administración, el fármaco que está siendo distribuido, la enfermedad particular a tratar, etc.
La dosis terapéutica de los péptidos de la presente invención variará de acuerdo con, por ejemplo,
la utilización particular para la cual se hace el tratamiento, la forma de administración de los péptidos,
la salud y condición del paciente, y el juicio del fisiólogo que receta. Por ejemplo, para la prevención
de rechazo de aloinjerto con un péptido de la presente invención, la dosis será tı́picamente del rango de
aproximadamente 50 µg a aproximadamente 2.000 mg por dı́a, preferiblemente de aproximadamente 5
mg a aproximadamente 700 mg por dı́a, para un paciente de 70 kg.
Los péptidos de la presente invención, aislados o como conjugados, pueden prepararse como formulaciones en medios farmacéuticamente aceptables, por ejemplo solución salina, PBS, y glucosa, generalmente
a una dosis farmacológicamente efectiva, las concentraciones de los cuales se determinará empı́ricamente
de acuerdo con procedimientos convencionales para el objetivo particular. Los aditivos pueden incluir
agentes bactericidas, estabilizantes, tampones o similares. La cantidad administrada al huésped variará
dependiendo de qué se está administrando, del objetivo de la administración, por ejemplo profilaxis o
terapia, de si se desea inhibición o activación, del estado del huésped, de la forma de administración y
similares. Para aumentar la vida media del péptido de la invención o de los conjugados de la invención,
los péptidos pueden encapsularse, introducirse en el lumen de los liposomas, preparados como un coloide o pueden emplearse otras técnicas convencionales, las cuales proporcionan un tiempo de vida de los
péptidos extenso.
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Las composiciones farmacéuticas están destinadas a al administración parenteral, tópica, oral o local,
por ejemplo en forma de aerosol o transdérmicamente, para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico.
Las composiciones son adecuadas para utilizar en diferentes sistemas de distribución de fármacos. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas se administran parenteralmente, es decir, intravenosamente.
Ası́, la invención proporciona una composición para la administración parenteral que comprende un
péptido inmunomodulatorio disuelto o suspendido en un transportador aceptable, preferentemente un
transportador acuoso, por ejemplo, agua, agua tamponada, un 0,4 % de solución salina, un 0,3 % de
glicina, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de
esterilización convencionales, o pueden filtrarse de manera estéril. Las soluciones acuosas resultantes
pueden empaquetarse para utilizar tal cual, o liofilizadas, combinándose la preparación liofilizada con
un transportador acuoso estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener substancias auxiliares farmacéuticamente aceptables tal y como se requiere para aproximarse a las condiciones
fisiológicas, tales como ajustar el pH y agentes tamponantes, agentes ajustadores de la tonicidad, agentes
humidificantes, detergentes y similares, por ejemplo, acetato sódico, lactato sódico, cloruro sódico, cloruro
potásico, cloruro cálcico, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, etc.
La concentración de péptidos inmunomoduladores en las formulaciones farmacéuticas puede variar
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ampliamente, es decir, desde menos de aproximadamente el 0,01 %, habitualmente al 5 % o al menos
aproximadamente el 5 % hasta tanto como del 50 al 75 % en peso, y se seleccionará primariamente por
volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo de administración particular seleccionado.
Ası́, una composición farmacéutica tı́pica para infusión intravenosa puede contener 250 ml de solución de
Ringer estéril y 10 mg de péptido.
Para composiciones sólidas, pueden utilizarse transportadores sólidos no tóxicos convencionales, que
incluyen, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato magnésico, sacarina
sódica, talco, celulosa, glucosa, sucrosa, carbonato magnésico y similares. Para la administración oral,
una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable se forma incorporando cualquiera de los excipientes empleados normalmente, tales como los transportadores previamente enumerados, y generalmente un
10-95 % de ingrediente activo, es decir, uno o más péptidos de la invención, preferiblemente un 25-75 %.
Para la administración en forma de aerosol, los péptidos inmunomoduladores se administran preferentemente en forma finamente dividida junto con un surfactante no tóxico convencional y un propulsor
adecuado. Porcentajes tı́picos de péptidos son un 0,01-20 % en peso, preferentemente un 1 %-10 %; y de
surfactante un 0,1 %-20 % en peso, preferentemente un 0,25-5 %.
Bajo ciertas circunstancias pueden combinarse dos o más péptidos de la invención para formar un
“cocktail” de péptidos para una eficacia aumentada. Los péptidos de la invención pueden utilizarse
también conjuntamente con otros agentes activos farmacéuticamente. Por ejemplo, pueden utilizarse
conjuntamente con los péptidos otros agentes inmunosupresores tales como anticuerpos hacia el dominio
α3 (por ejemplo, tal y como se describe en Ozato et al., más arriba), antı́genos de células T (por ejemplo,
OKT4 y OKT3), globulina antitimocito, ası́ como agentes quimioterapéuticos tales como la ciclosporina,
los glucocorticoides, la azatioprina, la prednisona y similares.
Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración pero no limitación.
Ejemplos
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1. Sı́ntesis de péptidos inmuno-moduladores
35
Se preparó un péptido sintético correspondiente a los residuos 222-235 del dominio α3 de las moléculas
de HLA de clase I (que tienen la secuencia EDQTQDTELVETRP (SEQ. ID N◦ 2) y designadas como
HLAI.222-235) mediante técnicas de sı́ntesis de péptidos estándar, tal y como se describe por ejemplo,
en Merrifield, Science 232:341-347 (1986), Barany y Merrifield, The Peptides (“Los Péptidos”), Gross
y Meienhofer, eds., N.Y., Academic Press, pág. 1-284 (1979); y Stewart y Young, Solid Phase Peptide
Synthesis,(“Sı́ntesis de Péptidos en Fase Sólida”) Rockford, IL., Pierce, 2nd Ed. (1984).
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2. Inhibición de la activación de CTL aloreactiva y especı́fica de virus
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El péptido preparado según el Ejemplo 1 se utilizó para reducir la diferenciación de los CTLs maduros
de los precursores de CTL, tal y como se determinó mediante análisis de dilución limitante (LDA). El
procedimiento del ensayo se describe en Salter et al., más arriba. Brevemente, se aislaron linfocitos de la
sangre periférica de donantes humanos normales por centrifugación sobre Ficoll-Hypaque y se cultivó al
número indicado con 3x103 de células EBV (HLA-A2,B27)irradiadas (10.000 R). Para la enumeración de
CTLs especı́ficos de gripe, se añadieron 5 mg/ml del péptido de la nucleoproteı́na de la gripe (“INF-NP”)
a cada cultivo. Para una descripción de las células de HLA B27 y del péptido INF-NP, ver, Huet et al.,
Int. Immunol., 2:311-316 (1990). Se constituyeron veinticuatro réplicas para cada punto. Los cultivos
se suplementaron con 200 mcg/ml de HLA.222-235 (O) o el péptido HLA A2.1 60-84 (X) y se incubaron
durante 7 dı́as. Se analizaron alı́cuotas duplicadas para la lisis de HLA-A2.1 CIR o HLA-B27 CIR en
un ensayo de 4 horas. Para los CTLs especı́ficos para gripe, se añadieron 2 mg/ml de INF-NP 383-394
al ensayo de citotoxicidad. La frecuencia del precursor de CTL se determinó tal y como se describe en
Salter et al. más arriba.
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Tal y como se muestra en las Figuras 1A, 1B y 1C, el péptido HLAI.222-235 bloqueó efectivamente la
generación de CTL tanto para las respuesta alogénica como para la respuesta especı́fica de gripe, mientras
que el HLA A2.I 60-84 no fue efectivo. Estos resultados indican que la interacción de CD8 con MHC de
Clase I es crı́tico para la activación y la diferenciación de células T CD8+ en reposo. Estos descubrimientos sugieren además que las células de memoria en reposo son tan dependientes de CD8 como las
células “naive”, dado que tanto las respuestas de “recall” (especı́fica de gripe) y “naive” (aloespecı́fica)
son inhibidas por el péptido HLAI.222-265.
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Tı́picamente se lleva a cabo una curva dependiente de dosis para determinar la concentración óptima
de los péptidos inmunomoduladores para un uso particular. En este ejemplo, se determinó el efecto de
varias concentraciones del péptido HLAI.222-235 sobre la generación de CTLs especı́ficos para HLA-A2.1.
El péptido HLAI.222-235 a 200 (O) 100 (x), 50 (♦), o 25 ( ) mg/ml); o el INF NP 383-394 ( ) a 200
mg/ml) se añadió al inicio del séptimo dı́a del cultivo de dilución limitante tal y como se describe más
arriba. Ası́, la inhibición en este sistema era dosisdependiente, con un bloqueo esencialmente completo a
200 mg/ml (Figura 1D).
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3. Efecto de la adición de péptidos en diferentes estadios durante el cultivo
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En el Ejemplo 2, el péptido se añadió al principio del cultivo de 7 dı́as; pero también es posible
añadir el péptido inmunomodulador algo antes o después de la exposición a las células estimuladoras. Se
comparó el efecto de añadir el péptido al inicio del cultivo de 7 dı́as y 24 y 48 horas después del inicio.
Los ensayos se llevaron a cabo tal y como se ha descrito más arriba.
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La reducción máxima de la frecuencia del precursor de CTL se observó cuando el péptido HLAI.222235 se añadió al inicio del cultivo de 7 dı́as (frecuencia de pCTL: 1/33,723 para HLAI.222-235 respecto
1/10,999 para el control); se demostró la inhibición intermedia cuando el péptido se añadió 24 horas
después (frecuencia de pCTL:I/II,862). La reducción de la frecuencia del precursor de CTL era especı́fica
de secuencia, dado que los péptidos preparados de forma similar (HLA-A2.I 60-84 y INF NP) no tuvieron
ningún efecto.
4. Efecto del péptido HLA sobre las células maduras
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También es posible ensayar el efecto de los péptidos sobre un efector de CTLs maduro. El péptido
HLAI.222-235 no tuvo efecto sobre los CTLs cultivados que eran dependientes de CD8 o independientes
de CD8 (Figura 2), tal y como se juzga por la inhibición de la lisis en un ensayo de citotoxicidad estándar
de 4 horas, indicando que la interacción CD8-Clase I juega un papel menos crı́tico para los CTL maduros
activados o que la confirmación de la molécula de CD8 sobre los CTLs cultivados altera el sitio de unión
del péptido HLAI.222-235.
5. Efecto del péptido HLA sobre las respuestas proliferativas primarias a aloantı́geno y mitógeno
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Tal y como se muestra en la Figura 3, el péptido HLAI.222-235 no bloquea la proliferación inducida
por aloantı́geno del PBL en reposo. Se cocultivaron PBLs (5x105 ) de un donante normal con 2x103 de
células EBV. En algunos casos los PBLs se aislaron primero de células CD4+ ( , ♦) o de células CD8+
4
4
4 , 4) mediante el paso a través de placas recubiertas de anticuerpos anti-CD4 o anti-CD8. El aisla(4
•
miento fue eficiente en un porcentaje >95 %, tal y como se juzga por el análisis FACS. En algunos casos
( , ), los cultivos de células aisladas de CD4 se suplementaron con medio condicionado con células T. El
péptido HLAI.222-235 se añadió al inicio del cultivo a la concentración indicada. Después de 6 dı́as, se
añadió 1 mg/l de H-timidina a cada pozo, y los cultivos se recogieron 16 horas después.
Los ejemplos anteriores demuestran la capacidad de los péptidos de la presente invención de inhibir
la diferenciación de los precursores de CTLs. La invención se ha descrito en estos ejemplos y en la descripción anterior en detalle a efectos de claridad y comprensión. Sin embargo, será evidente que pueden
practicarse algunos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Listado de secuencias
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(1) INFORMACION GENERAL:
(i) SOLICITANTE: The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University
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(ii) TITULO DE LA INVENCION: Péptidos con el dominio de unión CD8
(iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 2
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(iv) DIRECCION PARA CORRESPONDENCIA:
(A) A QUIEN SE HA DE DIRIGIR: Bertram I. Rowland
(B) CALLE: 4 Embarcadero Center, Suite 3400
(C) CIUDAD: San Francisco
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(D) ESTADO: California
(E) PAIS: USA
(F) CODIGO POSTAL: 94111
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(v) FORMATO PARA LECTURA POR ORDENADOR:
(A) TIPO DE SOPORTE: Disco flexible
(B) ORDENADOR: IBM PC compatible
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
(D) PROGRAMA: PatentIn #1.0, Versión #1.25
(vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
(A) NUMERO DE SOLICITUD:
(B) FECHA DE PRESENTACION:
(C) CLASIFICACION:
(viii) INFORMACION SOBRE EL AGENTE/REPRESENTANTE:
(A) NOMBRE: Rowland, Bertram I.
(B) NUMERO DE REGISTRO: 20.015
(C) NUMERO DE ACTA/REFERENCIA: FP-56849-PC/BIR
(ix) INFORMACION PARA TELECOMUNICACIONES:
(A) TELEFONO: (415) 781-1989
(B) TELEFAX: (415) 398-3249
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA N◦ 1:
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(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 7 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGIA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
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(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: Sec. n◦ 1:
Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu
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(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA N◦ 2:
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 14 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGIA: Lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: péptido
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(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: Sec. n◦ 2:
Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro
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REIVINDICACIONES
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1. Composición que comprende un péptido de 7 a aproximadamente 20 residuos de aminoácidos en
longitud, comprendiendo dicho péptido una secuencia de aminoácidos en la cual al menos un 40 % de los
residuos son idénticos a los residuos en las posiciones correspondientes en una secuencia en el dominio α3
de una molécula de MHC de Clase I, donde el péptido une una molécula de CD8 sobre un precursor de
linfocito T citolı́tico (CTL) y afecta la diferenciación del precursor de CTL en un CTL maduro.
2. Composición según la reivindicación 1, donde dicha secuencia en el dominio α3 de la molécula de
MHC de Clase I está entre el residuo 220 y el residuo 235.
3. Composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el nivel de identidad es al menos
del 75 %.
15
4. Composición según la reivindicación 1, donde el péptido se selecciona entre el grupo que consiste
en la SEQ ID N◦ 1 y la SEQ ID N◦ 2.
5. Composición farmacéutica que comprende un transportador farmacéuticamente aceptable y un
péptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
20
25
6. Composición según la reivindicación 5, que comprende además un agente inmunosupresor.
7. Composición para utilizar en la modulación de la actividad de los CTLs en un paciente que comprende una dosis terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica según la reivindicación 5 o
la reivindicación 6.
8. Composición para utilizar en la inhibición de la diferenciación de un precursor de linfocito T citolı́tico (CTL) en un CTL maduro especı́fico para un antı́geno foráneo, comprendiendo dicha composición
la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y un transportador farmacéuticamente efectivo.
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9. Utilización de una composición tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones
precedentes para la preparación de un medicamento para inhibir la diferenciación de un precursor de
linfocito T citolı́tico (CTL) en un CTL maduro especı́fico para un antı́geno foráneo.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
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