Cromatografía de Líquidos de Alto Rendimiento
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De los orígenes a la actualidad http://depa.fquim.unam.mx/amyd/docs.php?curso=206 Técnica Instrumental La herramienta analítica de mayor importancia Componentes básicos C Horno Fase móvil Control de flujo Introducción de muestra Columna Detección Registro y proceso PROCESO CROMATOGRAFICO La fase móvil fluye a lo largo del lecho cromatográfico en contacto con la fase estacionaria. COLUMNA º º ºº º º º º ºº ºº ºº ºº º º ºº º ººº ºº ºº º º º º º ºº º º º º ºº ºº º º ºº º º º º ººº ºº ºº ºº º º ººº ºº ººº ººº ººº ºº ººº ºº ºººº ººº ºººº ºº ºº ºº º º º º º ºººº ºº º º º º ºº º º ºº ººº º º º º º º º º º º º º ººFASE FASE MÓVIL º ºº ºº ºº ºº ºº º º º ººº ºº ººMÓVIL ºº º º º º ººº º º º º º º FASE MÓVIL º º º º ºº ººº ºº º ºº º ºººº ºººº ºººº ºººº ºº ººº ºººººº ºº ººººº ººº ºººº º ºº º º º º º º º º º º º ºº º º º º º º ºº º º º º º º º º ºº ºº º º º º º ºº ºº ºººº ººº ºº º º ºº ºº ºººº ºº ºººº ºº º º º º COLUMNA PROCESO CROMATOGRAFICO La fase móvil fluye, arrastrando consigo los solutos. Los solutos se reparten entre ambas fases Fase estacionaria Muestra Fase móvil PROCESO CROMATOGRAFICO AL ALIMENTAR LA MUESTRA AL SISTEMA, LOS SOLUTOS SE REPARTEN ENTRE LAS DOS FASES. Fase móvil t0 Fase móvil t0 Fase estacionaria Fase estacionaria PROCESO CROMATOGRAFICO LAS MOLECULAS DE SOLUTO EN FASE ESTACIONARIA SE ESTANCAN LAS MOLECULAS EN FASE MOVIL AVANZAN CON ELLA Fase móvil t1 Fase móvil t1 Fase estacionaria Fase estacionaria PROCESO CROMATOGRAFICO LA VELOCIDAD DEL SOLUTO VARIA INVERSAMENTE CON LA AFINIDAD POR LA FASE ESTACIONARIA. F. móvil F. estacionaria SEPARACION DE SOLUTOS LOS COMPONENTES CON CONSTANTES DE REPARTO DIFERENTES SE SEPARARÁN. Fase móvil t0 Fase estacionaria SEPARACION DE SOLUTOS Fase móvil t1 Fase estacionaria Fase móvil t2 Fase estacionaria Fase móvil t3 Fase estacionaria Dimensiones de la Columna L = Largo de columna (cm, mm) dc = diámetro interno (mm, µm) df = espesor de película de fase (µm) dp = diámetro de partícula (µm) Vo = volumen muerto (ml) Velocidad y flujo de fase Flujo = F = gasto en volumen del eluyente por unidad de tiempo, medido a la salida de la columna y a temperatura ambiente (ml/min) Velocidad de fase móvil = u = distancia media recorrida por la fase movil en una unidad de tiempo (cm/seg) F π r 2φ ⋅ u = Tiempo Muerto (t0) El tiempo que tarda en eluir un soluto que no interacciona con la fase estacionaria. El tiempo que se necesita para renovar totalmente la fase móvil de la columna. to = Vo / Fo TIEMPO DE RETENCIÓN tr = Tiempo transcurrido al momento de eluir el máximo de concentración del soluto. Vr = volumen de retención = volumen de fase móvil gastado al momento de eluir el máximo de concentración del soluto. Vr = tr Fo TIEMPO DE RETENCIÓN señal tr to tiempo Constante de Reparto Equilibrio de reparto: Solutofm ⇐⇒ Solutofe K= Soluto fe Soluto fm Cociente de las concentraciones del soluto. Soluto en la fase estacionaria entre soluto en fase móvil Ecuación de la Retención Vr = Vo + KVe El volumen de retención de un soluto es la suma de las contribuciones del tiempo que estuvo en fase móvil (Vm) y en fase estacionaria (KVe). Vr − Vo K= Ve Tiempo de Retención Corregido tr′ señal tr to tiempo Factor de Capacidad Cociente de la cantidad de soluto en fase estacionaria entre la cantidad en fase móvil. k′ = nsolutofe nsolutofm FACTOR DE CAPACIDAD tr tr′ señal tr′ tr − to k′ = = to to to tiempo Factor de Capacidad Ve tr − to k′ = K = Vo to Medida de la retención del soluto. Indica que tan lejos del tiempo muerto eluye este. Area Altura Area y Altura del Pico tiempo wb Altura w0.5 ½ Altura señal Ancho del Pico tiempo En mediciones manuales w0.5 es mucho mas preciso que wb PLATO TEORICO Definición más conocida: tiempo w0.5 wb Altura tr N = 16 wb 2 ½ Altura señal tr PLATO TEORICO Varias fórmulas: 2 2 w0.5 tiempo wb Altura tr tr t r = N 16 = 5.545= 2π Area wb w0.5 Altura 2 ½ Altura señal tr Altura del Plato Teórico H = Altura equivalente a un plato teórico. L H= N L H Eficiencia Cromatográfica H mide la eficiencia de la columna cromatográfica. Entre mas pequeño sea H, el sistema es más eficiente. ( mayor número de platos teóricos por metro. Para una misma longitud se logra mayor poder de separación con una menor H. Señal Separación de Solutos tiempo tr,2 ′ tr,1 ′ α= t´ r ,2 t´ r ,1 to wb,1 wb,2 SELECTIVIDAD K2 k2′ tr ,2 - t0 α= = = ≥1 K1 k1′ tr ,1 - to La selectividad muestra las diferencias de afinidad por los solutos de las fases involucradas. Indica el potencial de separación de esos solutos en el sistema, pero no mide la separación real. tr,1 Rs = tr,2 (tr ,2 − tr ,1 ) 1 (w + w ) b,2 2 b,1 wb,1 wb,2 RESOLUCIÓN Rs = 0.8 Rs = 1.0 Rs = 1.5 Rs = 2.0 RESOLUCIÓN Tres son los factores que influyen en la resolución cromatográfica: eficiencia: retención, k′ Rs = 1 + k′ selectividad α − 1 a N 4 y retención selectividad eficiencia RESOLUCIÓN Solo controlando la retención ... ... la selectividad ... ... y la eficiencia ... ... se logra una buena separación. RESOLUCIÓN Y RETENCIÓN 90% 75% Rs 0 2 3 4 6 8 k´ 10 RESOLUCIÓN Y SELECTIVIDAD Rs Zona de trabajo usual 0 2 4 6 8 α 10 RESOLUCIÓN Y EFICIENCIA 3.2 x Rs 1.4 x x 0 20,000 N1 40,000 2N1 60,000 N 80,000 10 10 N1 RESOLUCIÓN Y EFICIENCIA A mayor nímero de platos teóricos, mejor separación. La separación mejora apreciablemente solo si el aumento en N es de varios ordenes de magnitud. Los aumentos pequeños no son importantes, p. ej. duplicar el largo de columna duplica el tiempo de análisis y solo mejora en 40% la resolución. Las mejoras notables solo se logran mejorando las técnicas cromatográficas. Tiempo total de análisis y resolución 2 s tt = 16 R α α − 1 2 3 (1 + k′) H 2 u k ′ ( ) ANÁLISIS MAS RÁPIDOS SI: Rs pequeña, como se busca separar : 1.5 ≤ Rs ≤ 2. α >> 1. k´ chica, para separar : 3 ≤ k´ ≤ 6. Se logran altas eficiencias (H pequeño) a velocidades altas de fase móvil. Eficiencia Cromatográfica H = f (ensanchamiento de la banda) H =L N H = A + B + C ⋅u u A multicanales B difusión = C = resistencia a la transferencia de masa Efecto Multicanales y/o Eddy A = 2λ d p Difusión axial B 2γ Dm = u u Transferencia de masa en la FM “movimiento” Ensanchamiento de banda k ′ ta ⋅ u He = 2 ′ 1 + k De 2 Transferencia de masa en la FE la Transferencia de masa en fase móvil Ωd u Cm ⋅ u = Dm 2 p Transferencia de masa 2 ′ − + 1 θ k d ( ) pu 2 H sm = 30 (1 − θ )(1 + k ′ ) yDM 2 Transferencia de masa en la FM “estancada” Ecuación de Van Deemter (1 − θ + k ′ ) d p2u 2γ Dm k ′ ta ⋅ u Ωd u H =2λ d p + + 2 + + 2 ′ u k D D + 1 30 (1 − θ )(1 + k ′ ) yDM e m 2 H = A + B + C ⋅u u 2 p 2 Efecto del diámetro de partícula Digestión de enolasa. Efecto del tamaño de partícula en N y ∆P Columnas Tubo de acero inoxidable, vidrio o capilar de sílice fundida Dimensiones Longitud: 25 a 300 mm Diámetro: 25 µm a 100 mm Tamaño de partícula: 1.7 a 10 µm Tipos de CL • Cromatografía de intercambio iónico • Adsorción: líquido-sólido • Partición: líquido-líquido – Cromatografia en fase normal – Cromatografia en fase inversa • Cromatografia de exclusión por tamaño Empaques de UHPLC Images of current 1.9um particles Cromatografía de fase inversa FE Sílica químicamente modificada con grupos no-polares: hidrocarburos saturados: C18 octadecil, C8 octil, tetrametil, C2 dimetl FM Mezclas: agua/disolventes orgánicos H2O +(CH3OH, THF, CH3CN) C4 Cromatografía de fase inversa Efecto solvofóbico fuerte: Parte apolar de la molécula del soluto es mayor % C en la FE es mayor Polaridad de la FM es alta (mayor % de H2O) Fase móvil Disolventes grado cromatográfico Agua de 18 mΩ Baja viscosidad No vólatil Miscibilidad Filtrada Sin oxígeno disuelto (degasificada) Fuerza del eluyente Viscosidad del eluyente Análisis Isocrático Fase inversa, 10% CH3CN Análisis Isocrático Fase inversa, 80% CH3CN Análisis Isocrático Fase inversa, 50% CH3CN Análisis por gradiente Gradiente exponencial de acetonitrilo ∂T ∂t Elución por gradiente Detectores Indice de refracción Ultravioleta-Visible Fluorescencia Electroquímico Radioactividad Infrarrojo Espectrómetro de masas Proteínas por 2D nano UPLC Cromatogramas de digestión de E. Coli Fabricantes de Equipo HPLC • • • • • • • • • • Agilent Technologies Beckman Coulter Cecil Instruments Dionex Corp Hitachi PerkinElmer, Inc. Shimadzu Scientific Instruments Thermo Fisher Scientific Varian, Inc. Waters Corporation Columnas para HPLC • • • • • • • • • • • • • • • • Agilent Technologies AkzoNobel Beckman Coulter Dionex Corp Merck KGaA Micro-Tech Phenomenex SGE Analytical Science Shimadzu Scientific Instruments Shodex Sigma-Aldrich Thermo Fisher Scientific Tosoh Corporation Varian, Inc. Waters Corporation W. R. Grace and Company (Vydac)
