Código Genético y Traducción

Dogma Central de la Biología Molecular.
Facultad de Química, UNAM
Flujo de la Información Genética
Replicación
1630 Genética y Biología Molecular
Transcripción.
Síntesis de RNA
Código Genético y Traducción
Traducción
Síntesis de
Proteínas
Unidad 7
Comparación de la expresión génica entre eucariontes y procariontes
Eucariontes
Procariontes
Núcleo
Transcripción
Traducción
Transcripción
Código genético:
DNA
-------Æ
Bases
RNAm
-------Æ
Bases
Proteína
-------Æ
Aminoácidos
En DNA y RNA hay 4 bases pero en proteínas:
20 aminoácidos
Combinaciones de bases para determinar un
aminoácido:
Combinaciones de 2 bases: 42 = 16 (no alcanzan!!)
Traducción
Combinaciones de 3 bases: 43 = 64 !! (ahora sobran!!)
Codón: Secuencia de tres bases en el RNAm que
especifica un aminoácido en la secuencia de la
proteína o causa la terminación de la traducción.
1
Nirenberg y Matthaei descifraron el código genético usando un lisado de
E. coli para sintetizar proteínas in vitro al cual le agregaban RNAm
sintético poli-U, poli-A, poli-CA.....
61 codones determinan aminoácidos 3
codones son “non-sense” y funcionan
como señales de término (stop) de la
traducción
Código Genético
Segunda posición
RNA
Primera
posición
Proteína
Solamente 61 de las 64 combinaciones posibles codifican para
aminoácidos
Solamente Met y Trp están determinados por un codón.
Codones sinónimos:
Para muchos aminoácidos determinados por mas de un codón, las
2 primeras bases no varían y solamente hay cambio en la 3a
posición.
¿Qué característica común tiene esa 3a base en los aminoácidos
determinados por dos codones?
18 de los 20 aminoácidos están determinados por más de un
codón. El código genético es redundante.
El código genético está altamente conservado
filogenéticamente.
De hecho, por muchos años, se consideró que era UNIVERSAL,
hasta que se encontraron las excepciones que son mínimas.
La mayor parte de estas excepciones se identificaron en los
genomas mitocondriales y en algunos protozuarios.
Codón
Código
genético
Excepción
Genoma
Esta propiedad minimiza los efectos de alguna mutación.
AGA/ AGG
Arg
Ser
Mitocondria animal
Sustitución por transición en el que hay un cambio de una
purina por otra purina.
CGG
Arg
Trp
Mitocondria plantas
UAA/ UAG
Término
Glu
Nuclear protozuarios
UGA
Término
Trp
Micoplasma
AAG -Æ AAA
2
Para los aminoácidos determinados por mas de un codón, estos no son
usados con la misma frecuencia.
En el proceso de traducción participan los RNAt, RNAr y RNAm.
Estructura de un RNAm maduro.
UAA
UAG
AUG
Codones de
término
Para los aminoácidos determinados por mas de un codón, estos no son
usados con la misma frecuencia.
Marco de lectura abierto (Open Reading Frame)
Marco de Lectura 1
UGA
Región codificante
Cola de Poli-A
La misma
secuencia de
RNAm.
Marco de Lectura 2
CAP
Tres secuencias de
polipéptidos
distintas!!!
Marco de Lectura 3
Región 5’ no traducida
Región 3’ no traducida
5’-UTR
3’-UTR
Solamente uno de los marcos de lectura es el correcto para la
traducción.
¿Cómo es reconocido este marco por el aparáto traduccional?
3
El codón del RNAm es reconocido por la secuencia
anticodón del RNAt
Hipótesis del “bamboleo” (wobble)
Debido a que el código genético es redundante:
• Algunos aminoácidos están determinados por 6 codones
• Algunos aminoácidos están determinados por 4 codones
• Algunos aminoácidos están determinados por 3 codones
• Algunos aminoácidos están determinados por 2 codones
Algunos codones que determinan al mismo aminoácido son
reconocidos por el mismo RNAt
5’
C
G
C
3’
RNAm
La interacción ocurre por apareamiento de bases complementarias.
Esto implica que hay
apareamientos de bases tipo
Watson-Crick para las dos
primeras posiciones del codón,
pero no para la tercera.
Las dos moléculas de RNA son antiparalelas.
Hipótesis del “bamboleo” (wobble)
La inosina es
una purina
que forma
interacciones
débiles con
C, U, A
5’
C
G
I/U
C
Los RNAt son las moléculas adaptadoras (traductoras) que
decodifican la información en el RNAm acarreando al
aminoácido correspondiente.
3’
RNAm
Muchos RNAt tienen inosina en la posición 5’ del anticodón
4
Función de los RNAt
RNAt + Aminoácido --Æ Aminoacil RNAt
Estructura Secundaria
del RNAt
La reacción ocurre en dos etapas:
1. Activación del aminoácido: Formación del aminoacil adenilato
Aminoácido + ATP Æ Aminoácido-AMP + PPi
Asa D – Brazo D
* El brazo variable (3- 21
nts) puede formar un tallo de
hasta 7 pb.
Brazo T. Tallo de 4-5 pb
R
*
Se forma el aminoacil adenilato que tiene un enlace de alta energía.
La hidrólisis del pirofosfato inorgánico que se produce genera energía
para la reacción.
2. Formación del aminoacil-RNAt
Aminoacil adenilato + RNAt Æ Aminoacil-RNAt
+ AMP
Aminoacil RNAt sintetasas
A pesar de que catalizan la misma reacción, estas enzimas
pueden ser muy diferentes.
Algunas son monómeros, dímeros y tetrámeros.
La misma enzima
realiza los dos pasos
de la reacción.
Tiene sitios de unión
para:
• el aminoácido
• ATP
• RNAt
El aminoácido se une al extremo 3’-OH
del RNAt. En el brazo aceptor.
5
Aminoacil RNAt
sintetasas.
La síntesis de proteínas se lleva a cabo en los
ribosomas
Reconocen secuencias en la
región interna del RNAt.
Tienen muy alta especificidad
pues distinguen entre 40 RNAt
que tienen una estructura similar,
solamente con algunos cambios
en la secuencia de bases.
Reconocen elementos de
identidad en el RNAt que
incluyen:
2.76 x 106 Da
• Región anticodón
• Pares de bases en el tallo
aceptor.
El ribosoma procarionte se puede disociar en dos subunidades.
Cada una de éstas se compone de RNAr y muchas proteínas
La estructura de los ribosomas se resolvió por cristalografía de rayos X
Estructura de los Ribosomas. Los ribosomas son ribozimas que
1. Decodifican la información genética y 2. Polimerizan los aminoácidos.
Aseguran que la síntesis de proteínas ocurra progresivamente y con alta
especificidad. Una bacteria en fase exponencial tiene aprox. 105 ribosomas.
Subunidad Pequeña 30S
Lectura de los codones
Premio Nobel de Química 2009
21 proteínas + RNAr 16S
Subunidad Grande 50S
Polimerización de
Aminoácidos
31 proteínas + RNAr 23S y 5S
6
Sitio de unión al ribosoma
El codón que marca el inicio de la traducción es AUG que codifica
para el aminoácido metionina
En los RNAm procariontes hay una secuencia altamente
conservada que está entre 8 y 13 nts del codón de inicio.
Esta secuencia es rica en purinas y el consenso es:
5’- UTR
5’
5’-AGGAGGU-3’
Esta secuencia se aparea por interacciones de puentes de
hidrógeno con la secuencia 3’-UCCUCCA-5’ que se encuentra
en el RNAr 16S de la subunidad pequeña del ribosoma.
En procariontes, el codón de
inicio AUG codifica para
formil metionina:
En eucariontes, el codón de
inicio AUG codifica para
metionina:
Se llama Secuencia de Shine-Dalgarno o sitio de unión al
ribosoma. Sirve para posicionar de manera correcta al RNAm
en el ribosoma con respecto al codón de incio.
Formación del complejo de iniciación
• Ensamblaje del ribosoma en el RNAm
• Se requiere de:
–
–
–
–
–
Subunidad pequeña del ribosoma
Subunidad grande del ribosoma
RNAm
Aminoacil-RNAt (formil-Met)
Factores de iniciación (IF)
• IF1 e IF3 => se unen a la subunidad 30S y
previenen la unión de 50S en ausencia de
RNAm
• IF2-GTP ayudan a la unión del aminoacil-RNAt
de iniciación
Formación del complejo de
Iniciación.
Los factores IF1 e IF3 se unen a la
subunidad 30S del ribosoma y previenen
la unión de la subunidad 50S
En procariontes, el
codón de inicio es
reconocido por un
aminoacil-RNAt que
acarrea formil-Met
RNAt
El grupo formilo se añade después de la carga del RNAt, por una
enzima (transformilasa) que usa formiltetrahidrofolato.
Solamente el RNAtf-Met se usa para formar el complejo de iniciación.
Todos los demás aminoacil-RNAt requieren que el ribosoma esté
completamente ensamblado.
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Formación del complejo
de Iniciación.
Fase de elongación
• Factores de elongación EF
– EF-Tu / EF-Ts/ EF-G
• Aminoacil-RNAt del resto de los aminoácidos.
• GTP
• Complejo de Iniciación
La unión de AA-RNAt(fMet) al codón de
inicio es un proceso dependiente de la
hidrólisis de GTP. El IF2 se une a GTP
acompaña al AA-RNAtf-Met
La fase de elongación se divide en tres etapas
¾ Ocupación del sitio aminoacil
¾ Formación del enlace peptídico
¾ Translocación
Al disociarse IF1, se une la subunidad
50S del ribosoma.
Queda formado el complejo de iniciación.
En el ribosoma se pueden distinguir tres sitios E, P y A, de los
cuales el sitio P y A pueden ser ocupados por AA-RNAt
FASE DE ELONGACION
Ocupación del sitio Aminoacil por el siguiente AA-RNAt
Sitio P (Peptidil) del
ribosoma
Thr
EF-Tu
GTP
GDP
5'
Sitio A (Aminoacil) del
ribosoma
El AA-RNAtf-Met ocupa el sitio Peptidil en el ribosoma.
AUG
P
Sitio P (Peptidil)
ACA
A
Sitio A (Aminoacil)
3'
EF-Ts
EF-Ts regenera el GTP
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Mecanismo de Formación del Enlace Peptídico
FASE DE ELONGACION
Formación del enlace peptídico
Thr
5'
AUG
P
El grupo amino del AA-RNAt
del sitio A está bien
posicionado para atacar el
enlace éster entre el RNAt
que ocupa el sitio P y el
aminoácido.
ACA
El grupo amino del AA-RNAt del sitio A está bien posicionado
para atacar el enlace éster entre el RNAt que ocupa el sitio P el
aminoácido que acarrea.
3'
A
Mecanismo de Formación del Enlace Peptídico
Mecanismo de Formación del Enlace Peptídico
El intermediario se cierra para
formar el enlace peptídico y liberar
al RNAt que está ocupando el sitio P
Se forma un intermediario
tetraédrico que es estabilizado
por la peptidil transferasa.
Intermediario tetraédrico
9
El centro de peptidil
transferasa se encuentra en
el RNA ribosomal 23S con
participación de algunas
proteínas de la subunidad
grande del ribosoma.
Thr
Es una ribozima que
acomoda a los sustratos
estereoquímicamente para
facilitar la formación del
enlace peptídico.
5'
AUG
P
ACA
3'
A
El sitio P queda vacío.
El ribosoma provee la estereoquímica adecuada para la formación
de un enlace peptídico, así como la guía para la translocación del
sitio A al sitio P y los medios geométricos adecuados para la
catálisis mediada por el sustrato.
El centro catalítico
responsable de la
actividad de la peptidil
transferasa se
encuentra altamente
conservado
filogenéticamente.
Elongación
Translocación
El sitio catalítico del ribosoma, llamado CENTRO DE
PEPTIDIL TRANSFERASA (CPT) está situado en una
región simétrica altamente conservada:
Thr
EF-G
5'
3'
P
Esta arquitectura le permite al CPT reacomodarse cuando se une
el sustrato.
A
La translocación es mediada por el factor EF-G, guíado por la
hidrólisis de GTP
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Terminación.
El ribosoma llega al codón de término del
marco de lectura del RNAm
Elongación
Ruptura del enlace
éster
Factor de liberación o de
terminación (RF)
Thr
Translocación
EF-G
5'
3'
P
Los codones UAA, UAG y UGA
no son reconocidos por ningún
RNAt
A
El RNAt que acarrea a la cadena polipeptídica creciente ahora ocupa el
sitio P. El sitio A queda desocupado para el siguiente AA-RNAt según el
codón que está posicionado en el sitio A.
El mecanismo que se ha propuesto para la liberación se basa en la
semejanza estructural entre un AA-RNAt y los factores de liberación.
UAA (codón de término)
“STOP”
RF1=> UAA y UAG / RF2 => UAA y UGA
Polisomas. Un solo RNAm puede ser traducido por varios
ribosomas de manera simultánea.
El factor de liberación se une al sitio A del ribosoma y acarrea una
molécula de agua a la región de elongación de la cadena
polipeptídica.
H
O
H
La actividad de peptidil transferasa emplea
esa molécula de agua para romper el enlace
éster y liberar al polipéptido.
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La investigación sobre la estructura de los ribosomas tiene aplicaciones
prácticas pues muchos antibióticos tienen actividad sobre la síntesis de
proteínas de procariontes.
Varios inhibidores de la síntesis de proteínas se han usado como
antibióticos:
Los antibióticos actúan por mecanismos diversos, pero basados en una
estrategia común que es la de coincidir con los centros críticos de la
función de los ribosomas.
Estreptomicina
Inhibe la iniciación y causa una lectura incorrecta
del RNAm (Procariontes)
Tetraciclina
Se une a la subunidad 30S del ribosoma e inhibe
la unión del aminoacil-RNAt (Procariontes)
Una de las claves para que un antibiótico sea útil es que se unan con
mayor afinidad a los sitios de los ribosomas procariontes.
Cloramfenicol
Inhibe a la peptidil transferasa (Procariontes)
Eritromicina
Se une a la subunidad 50S e inhibe la
translocación (Procariontes)
Puromicina
Causa terminación prematura de la traducción.
Actúa como análogo estructural del aminoacilRNAt
Cicloheximida
Inhibe a la peptidil transferasa (Eucariontes)
Origen de los ribosomas. (Protoribosoma)
Un vestigio de un aparato de RNA con capacidades de ribozima forma parte del
ribosoma.
Posible existencia de una maquinaria prebiótica a partir de un
oligonucleótido que adquirió una estructura secundaria dada y que posiblemente
se dimerizó para formar una hendidura química que permitiera la formación del
enlace peptídico.
ANTIBIÓTICO
ACCIÓN
Traducción en Eucariontes.
Los ribosomas en
eucariontes son más
grandes y están
formados por un número
mayor de proteínas que
los ribosomas
procariontes.
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La principal diferencia en la traducción entre procariontes y
eucariontes radica en la fase de iniciación.
En eucariontes hay varios factores de iniciación que se pueden
clasificar por su función:
Los RNAm eucariontes carecen de una secuencia consenso de
unión al ribosoma (Shine-Dalgarno).
eIF6, eIF3, eIF4C que se unen a las subunidades del ribosoma.
Hipótesis del “scanning” o barrido.
eIF2, eIF2B que acarrean al AA-RNAt iniciador
eIF4(A,B,E,F) que se unen a la estructura del cap en el extremo
5’ del RNAm
La subunidad 40S del ribosoma se une al extremo 5’ del RNAm
y hace un barrido hasta encontrar el codón AUG. La subunidad
40S
Este codón se debe encontrar en el contexto correcto que es:
5’-CCRCCAUGG-3’
El proceso de elongación es similar a los procariontes y la
actividad de peptidil transferasa se encuentra en....
El proceso de terminación es similar al de los procariontes y se
reconocen los mismos codones de término:
UAA
UAG
UGA
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