I+D EMPRESAS I IDT BIOLOGIKA Métodos usados para diagnosticar las infecciones por Escherichia coli Verena Gotter International Technical Service of IDT Biologika [email protected] Las infecciones por Escherichia coli son muy comunes en los cerdos. Esto no es ninguna sorpresa, ya que E. coli forma parte de la flora intestinal. Sin embargo, los cerdos pueden enfermar cuando aumenta el número de E. coli patógenas en la microbiota normal del intestino. Se calcula que anualmente mueren unos 10 millones de cerdos debido a este tipo de infecciones. Los signos clínicos observados dependen en gran medida del tipo de E. coli, pero pueden incluir: diarrea, anorexia, letargo, edemas de la frente, párpados y garganta, así como trastornos del sistema nervioso central tales como la ataxia o convulsiones tónico-clónicas. También puede producirse la muerte súbita sin signos clínicos previos. Otro factor que afecta a la forma de manifestarse una infección por E. coli es la edad del cerdo. Este artículo se centrará en las infecciones en el periodo posdestete. Los patotipos ETEC y STEC/VTEC son los que principalmente causan enfermedades en los cerdos después del destete. Los investigadores creen que alrededor del 50 % de las muertes debidas a infecciones por E. coli son causadas por ETEC. En cuanto a VTEC y STEC, la prevalencia varía entre países, pero diferentes estudios han mostrado rangos que se sitúan entre el 11 y el 75 %. En estos dos grupos, E. coli tiene diferentes tipos de factores de adhesión y toxinas. ETEC tienen factores de adhesión y toxinas que causan diarrea, mientras que STEC/VTEC producen principalmente la llamada shigatoxina (o verotoxina), que es la causa de la enfermedad de los edemas (ED). DIAGNÓSTICO Los signos clínicos de una infección con ETEC o STEC/VTEC son diversos e inespecíficos. El diagnóstico diferencial de enfermedades infecciosas para la diarrea (en cerdos destetados) incluye, por ejemplo, Salmonella spp., Lawso- nia intracelluralis, Brachyspira hyodysenteriae y Brachyspira pilosicoli. En cuanto a los otros signos, tales como los trastornos del sistema nervioso central, estos también pueden ser causados por Streptococcus suis, Haemophilus parasuis, enterovirus o teschovirus porcinos y virus de la enfermedad de Aujeszky; por citar sólo los más comunes. Y, por supuesto, también hay numerosas fuentes no infecciosas que pueden causar los mismos signos clínicos, como la alimentación con colza, la intoxicación por sal, vitamina E/selenio o el estrés debido a bajas condiciones de alojamiento (espacio en el corral, temperatura, número de cerdos por comedero, etc.). Por esta razón, el diagnóstico es tan importante. Aunque el profesional veterinario puede hacer una suposición sobre cuál es la posible causa de la enfermedad basándose en los diferentes signos clínicos y la historia de la explotación, realmente no sabe cuál es la causa principal hasta que no ha hecho algunas pruebas más. Como se menciona anteriormente, hay muchos tipos diferentes de E. coli. La diferenciación y la clasificación han cambiado a lo largo de los años, ya que con las nuevas técnicas moleculares se han podido establecer perfiles más precisos. Casi diariamente se descubren nuevos detalles y las antiguas clasificaciones pierden rápidamente su validez. En la actualidad, E. coli se clasifica según los factores de adhesión con los que se adhieren a los enterocitos del intestino y las toxinas que producen. Esto se llama patotipo. Los patotipos definidos en la actualidad son: ■ E. coli enterotoxigénica (ETEC). ■ E. coli enteropatogénica (EPEC). ■ E. coli productora de shigatoxina o verotoxina (STEC o VTEC). ■ E. coli patógena extraintestinal (ExPEC). 78 n SUIS Nº 111 Octubre 2014 Suis CLASIFICACIÓN Es importante realizar una necropsia completa. I+D EMPRESAS I IDT BIOLOGIKA Tabla 1. Muestras para cultivo bacteriano y PCR. Tipo de muestra Análisis Para diagnosticar/excluir Cerebro Cultivo bacteriano Todas las bacterias Médula espinal craneal (2-3 cm) PCR Enterovirus/teschovirus porcino Tonsilas (2-3 cm) PCR Virus de la enfermedad de Aujeszky Ganglio linfático mesentérico (2-3 cm) Cultivo bacteriano E. coli Yeyuno distal (2-3 cm) Cultivo bacteriano E. coli Según los signos clínicos observados, se tomarán las muestras y se realizará el procedimiento de diagnóstico más adecuado. En un caso de diarrea tiene sentido tomar muestras de heces. Estas deben de ser de cerdos con afección aguda, tomadas directamente del recto y no del suelo del corral. En los cerdos más pequeños, es posible tomar muestras con hisopos. El número de muestras que se recoge depende de la prevalencia de la enfermedad y del número total de animales de la misma edad. Hay tablas en las que se ha precalculado cuántas muestras hay que tomar en función de la prevalencia y el tamaño del grupo (Cannon y Roe, 1982). Sin embargo, en términos generales, no se debe tomar menos de 10 muestras. Se recogen muestras e hisopos de heces para cultivo, pero no deben ser más de tres muestras individuales en un pool. Necropsia e histopatología Si hay otros signos clínicos además de la diarrea, el diagnóstico es un poco más difícil, debido a que las bacterias o los virus que causan la enfermedad generalmente no se encuentran en las heces. En estos casos, se debe realizar la necropsia de los cerdos afectados. Esta se puede realizar a los animales que murieron debido a la enfermedad o practicar la eutanasia de los que presenten signos clínicos típicos. De cualquier manera, con el fin de obtener los mejores resultados, los cerdos no deberían llevar muertos más de cuatro horas (dependiendo de la temperatura exterior). Es importante realizar una necropsia completa, no sólo de los órganos que se consideran más relevantes. Además, es crucial no contaminar las muestras. Por esto, las necropsias deben tener lugar en un ambiente limpio, y todas las herramientas (cuchillos, tijeras, fórceps), así como los Vit Kovalcik/shutterstock.com Toma de muestras Los investigadores buscan una PCR que pueda realizarse directamente sobre heces u otras muestras. contenedores de la muestra, deben ser estériles. Hay que utilizar diferentes herramientas y contenedores para cada cerdo y los hisopos deben tener medio Amies. Idealmente, se debe comenzar por la cabeza del animal y continuar en dirección a la cola. De esta manera se asegura que las muestras tomadas en el intestino no contaminan otras muestras. La tabla 1 enumera las muestras que se pueden tomar para cada análisis. Si no es posible tomar muestras de órganos, también se pueden cortar y abrir los ganglios linfáticos, o el yeyuno, y tomar un hisopo de ellos. Ni los hisopos ni las muestras de órganos se deben mezclar, ni siquiera si son del mismo cerdo, porque esto puede falsear los resultados. Durante la necropsia deben buscarse las lesiones macroscópicas típicas asociadas a la enfermedad de los edemas, que son los edemas del tejido subcutáneo de la frente, los párpados, la vesícula biliar y del mesenterio del colon. Sin embargo, puede que ninguno de estos signos estén presentes, porque la presencia de edemas depende del tiempo que el cerdo llevaba enfermo antes de morir y lo pronto que se le practicó la necropsia. Por lo tanto, es recomendable tomar muestras de cerebro, médula espinal craneal, ganglios linfáticos mesentéricos y yeyuno distal para realizar un análisis histopatológico. Si es posible, se debe poner en formol al 10 % el cerebro entero y 3-4 cm de las otras muestras. Las diferentes muestras del mismo animal se pueden poner en un recipiente, que debe cubrirse con formol. La histopatología es importante porque ayuda a clarificar el diagnóstico si las lesiones de una patología general son inespecíficas, y también para juzgar la relevancia de los resultados del cultivo bacteriano y PCR. Si es posible, se debe realizar la necropsia de 4 o 5 cerdos y tomar, al menos, tres Tabla 2. Lista de los factores de adhesión y las toxinas más comunes. Patotipo Factores de adhesión Toxinas ETEC F4, F18, AIDA, Eae STa, STb, LT, Stx (VT), EAST-1, hemolisina a STEC/VTEC F18, AIDA, Eae Stx2e (VT2e), EAST-1, hemolisina a SUIS Nº 111 Octubre 2014 n 79 I+D EMPRESAS I IDT BIOLOGIKA identifica E. coli por sus antígenos. Este método se denomina aglutinación en portaobjeto o serotipificación. El resultado es el serotipo y se enumerará, por ejemplo, como O139: K82. Suis PCR Toma de muestras con hisopo directamente del recto de un lechón. de esas muestras para su análisis. Estas deben ser sólo de los cerdos que no murieron por otras causas obvias, como la torsión del intestino. Las muestras se deben refrigerar (pero no congelar) y llevar lo más rápidamente posible al laboratorio más próximo. A su llegada, es necesario proporcionar al laboratorio una historia clínica completa (prevalencia de animales afectados, duración de la enfermedad, tratamientos previos, etc.), qué signos clínicos específicos presentaban los animales de las muestras que se tomaron, así como la presunta causa etiológica. Asimismo, hay que informar al laboratorio sobre qué patógenos deberían analizarse y con qué método deberían hacerlo. Esto es importante, ya que hay varios métodos para identificar un patógeno, que pueden ser muy diferentes según la sensibilidad, la especificidad y el coste. Sólo si el laboratorio cuenta con toda la información o antecedentes puede realizar el 80 n SUIS Nº 111 Octubre 2014 análisis adecuado para posteriormente aconsejar sobre el método a utilizar. Cultivo Cuando se sospecha de infección por ETEC o STEC/VTEC, el primer paso del análisis es el cultivo bacteriano. Después de esto, se puede identificar E. coli mediante la determinación de los factores de adhesión y las toxinas. Las más comunes se enumeran en la tabla 2. Sin embargo, esta lista puede estar sujeta a cambios cuanto más se conoce sobre ETEC, STEC/VTEC. Los factores de adhesión nombrados en esta lista son principalmente fimbrias (F). La primera clasificación de E. coli está basada en la combinación de antígenos fimbriales, somáticos (O), capsulares (K) y flagelares (H). Esto se hizo poniendo algunas colonias de E. coli en un portaobjetos y mezclándolas con suero que tenía anticuerpos específicos. Cuando se produce la aglutinación, se Durante muchos años, el diagnóstico ha dependido de este método, que se ha considerado una forma barata y fácil de identificación de E. coli. Con la aparición de la biología molecular, sin embargo, se ha hecho evidente que muchas E. coli no se pueden identificar de esta manera, ya que no tienen los antígenos que están presentes en los antisueros comunes. Por lo general, sólo la E. coli que muestra hemólisis en el hemocultivo se somete a la serotipificación, porque todas las cepas de E. coli más comunes muestran esta característica particular. Sin embargo, investigaciones recientes han demostrado que las cepas no hemolíticas pueden producir las toxinas que causan la enfermedad. Por lo tanto, hoy en día la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se considera una técnica para identificar E. coli. Este método muestra los genes que tiene la cepa de E. coli. Se prueban muchos factores de adhesión y toxinas diferentes; por lo general más de los que se analizan por serotipificación. Otra ventaja es que el método puede ser rápidamente actualizado cuando se identifican nuevos factores. Sin embargo, la PCR es más costosa que la serotipificación y más difícil de manejar, por lo que no todos los laboratorios la ofrecen. Actualmente, se sigue realizando PCR a partir de cepas de E. coli cultivadas, pero los investigadores están trabajando en una PCR que pueda realizarse directamente sobre heces u otras muestras. Esta sería otra gran ventaja, ya que a menudo no es posible que crezca E. coli cuando los cerdos han sido tratados previamente con antibióticos. CONCLUSIÓN Cuando se finalizan los diferentes análisis (necropsia, histopatología, cultivo, PCR, etc.), y se ponen en común con el historial de la explotación y las observaciones de campo, ya se tiene lo necesario para hacer un diagnóstico adecuado. La veracidad de estos diagnósticos se basa en pruebas sólidas. Las medidas que se adopten a partir de entonces, bien sean terapéuticas o profilácticas, serán las más sostenibles en la lucha contra la enfermedad.