Superenrrollamiento

ADN y RNA
caracterización y métodos de estudio
Separación por centrifugación
de equilibrio en gradiente de densidad de en CsCl
Separación por centrifugación
de equilibrio en gradiente de densidad de en CsCl
2 DNAs, uno lineal y otro circular, de igual composicion, tienen
distinta densidad??
δ
Electroforesis en gel de agarosa
Buffer: TBE = Tris Borate EDTA o TAE tris Acetato
Concentración: 0.7% a 2%.
0.7% DNA grandes (5–10kb)
2% fragmentos pequeños (0.2–1kb).
Para muy pequenos = polyacrylamide gel
Revelado
Estimación PM con uso de patrones
Superenrrollamiento (ADN circular)
Superenrrollamiento (ADN circular)
Lk (numero de enlace) = Tw + Wr
desenrollo
Tw = número de vueltas de la hélice
Wr = grado de retorcimiento o
superenrrollamiento
Lk define la topología del ADN.
Para acomodar del desenrrollamiento,
el DNA se retuerce -2 vueltas.
El superenrrollamiento (-) (o righthanded) introduce una tensión que
favorece el desenrrollamiento
Tw= 12 vueltas
Wr= 0 vueltas
Lk=12 vueltas
Tw= 14 vueltas
Wr= -2 vueltas
Lk=12 vueltas
Lk solo cambia por ruptura de un
enlace fosfodiester (topoisomerasas)
Los agentes intercalantes (bromuro de etidio) desenrollan el ADN
introducen superenrrollamientos (+)
expuestos diferentes
tiempos a
topoisomerasas
El grado de
superenrrollamiento
afecta la densidad
del ADN
Ni la sedimentación con ClCs ni la electroforesis en gel de
agarosa puede discernir entre ADN superenrollado (+) o (-)
Obtención de DNA plasmídico
 ADN genómico:
lineal (o circular)
gran tamaño
lenta renaturalizacion
menor estabilidad
 ADN plasmídico:
generalmente
circular(superenrrollado)
pequeño tamaño
facil renaturalizacion
mayor estabilidad
Obtención de DNA plasmídico
 ADN genómico:
adherido a la membrana
esencial para la
supervivencia y normal
funcionamiento
 ADN plasmídico:
libre
resistencia a antibióticos,
producción de toxinas,
etc.
Obtención de DNA plasmídico
 Lisis alcalina:
buffer + EDTA (quelante de Ca+2 y Mg+2)
0.2M NaOH + SDS 1% (pH 12.0-12.5)
Ruptura de membrana celular
Desnaturalización selectiva de DNA genómico y proteínas
Lisis de RNA
 Neutralización con alta [sales]:
AcK 3M
Renaturalización y agregado insoluble de DNA genómico
Precipitación de complejos SDS-proteínas K-SDS-membrana y
RNA de alto peso molecular:
Los 3 mayores contaminantes macromoleculares co-precipitan y pueden ser removidos
por ultracentrifugación
EDTA
quelante de iones y desestabilizante de membrana
Obtención de DNA plasmídico
 Concentrado del DNA plasmídico:
Precipitación con alcohol y bajas temperaturas
 Eliminación de sales y electrolitos pequeños:
Lavado con etanol
Electroforesis en gel de agarosa
Detección con bromuro de etidio
Técnicas basadas en la renaturalización
del DNA
Southern blot (DNA)
 Se usan enzimas de restricción para cortar el ADN en pequeños
fragmentos.
 Se realiza una electroforesis en gel de agarosa para separar por tamaño.
 Si algunos de los fragmentos quedaron grandes (> 15 kb), se trata ton HCl
para despurinizar y romperlo en pedazos mas chicos para que sea mas
eficiente la transferencia del gel a la membrana.
 Se trata el gel con NaOH para desnaturalizar el dsADN, esto favorece la
unión a la membrana y destruye cualquier ARN residual
Southern blot (DNA)
 Se coloca una hoja de nitrocelulosa o nylon sobre el gel, presionando. El ADN
con carga (-) se une a la membrana con carga (+)
 Calentar la membrana a 80 °C por 2 horas o exponerla a UV para fijar el ADN.
 Exponer la membrana a la sonda radiactiva o fluorescente para hibridizar.
 Para asegurar la union específica de la sonda, se usa ADN de salmon para
bloquear la superficie de la membrana.
 Se lava la sonda con buffer y se revela la membrana
Southern blot (DNA)
Northen blot (RNA)
Hibridización de ADN
Secuenciación: Método de Sanger (1975)
Secuenciación automática