Determinación de proteínas

PARTE II: REVISIÓN DE MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS Y
ELABORACIÓN DE CURVA ESTÁNDAR DE PROTEÍNA
Objetivos
 Aplicar un método espectrofotométrico para medir la concentración de
una proteína.
 Conocer el manejo de micropipetas y espectrofotómetros.
 Construir curvas de calibración y comprender su importancia.
 Determinar el intervalo de sensibilidad de una curva estándar.
 Comparar el intervalo de sensibilidad de dos métodos para determinar
proteínas
Introducción
El espectrofotómetro es un instrumento ampliamente utilizado en el análisis
cualitativo y cuantitativo de moléculas biológicas. Parte de la identificación de
una molécula se determina por el trazado del espectro de absorción (A en
función de la longitud de onda ) en la región visible y ultravioleta. Mientras que
la cuantificación de la misma se puede realizar de manera directa (si la
sustancia absorbe en alguna región del espectro) o indirecta (por modificación
del compuesto mediante una reacción química).
Leyes que rigen la espectrofotometría
Cuando un haz luminoso de intensidad P0 pasa a través de una solución, parte
de éste se absorbe, por lo tanto la intensidad de la radiación emergente P es
menor al incidente P0. La relación entre ambos se denomina transmitancia, T:
T= P/P0. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (1)
La cantidad de luz absorbida es proporcional al número N de iones o moléculas
capaces de absorber energía; por lo tanto, T disminuye a medida que la
concentración aumenta.
Ley de Lambert y Beer, conocida generalmente como Ley de Beer, considera
que al dividirse la disolución en pequeñas secciones, en cada una de ellas se
absorberá una pequeña cantidad de radiación P, que es proporcional a N.
Tomando en cuenta que N es directamente proporcional a la concentración y
si la longitud por la que pasa el haz de luz (longitud de la celda) es constante,
podemos llegar a la ecuación general:
-log P/ P0= abc . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . (2)
donde:
c es la concentración
b es la longitud de la celda o paso óptico
a es la constante de proporcionalidad llamada absortividad
La absortividad o coeficiente de extinción es una característica propia de
cada especie y depende de la estructura química de ésta. El valor de la
absortividad para un compuesto varía con la longitud de onda. Definiendo que
la relación -log P / P0 es la absorbancia de la solución, la ecuación final que
define a la ley de Beer queda de la siguiente manera:
A= abc . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . (3)
Es importante mencionar que la constante de proporcionalidad a depende de la
longitud de onda por ello se le coloca el superíndice  así como también a la
absorbancia A (ec. 3). Si la concentración se expresa en molaridad, entonces
se denomina a la constante de proporcionalidad coeficiente de absortividad
molar o coeficiente de extinción (). Convencionalmente, el paso de la luz es
de 1 cm, por lo que entonces las unidades de  son cm-1mol-1L. Hay que
destacar que A es adimensional, ya que por definición es un índice.
Una gráfica de absorbancia de una especie en disolución, a una longitud de
onda dada, como una función de su concentración molar, se le llama curva de
calibración o curva estándar. Es una línea recta y de acuerdo a la ecuación 3
la pendiente es b. Conociendo  y la longitud del paso de la luz b, la
concentración de la sustancia en cualquier otra muestra puede ser determinada
usando la Ley de Beer. La cuantificación de la especie debe realizarse a la
longitud de máxima absorción.
Determinación de proteínas
Dos aplicaciones comunes de la determinación de proteínas son: 1) para
reportar la actividad específica de una enzima y 2) para hacer un cargado
homogéneo de proteína en geles de poliacrilamida-SDS. Dado que hay varios
métodos para medir proteínas totales, ¿Cómo se escoge entre estos métodos?
Generalmente se selecciona de acuerdo a su aplicación. Por ejemplo, para el
cálculo de la actividad enzimática, el principal propósito es tener exactitud en
los resultados, mientras que para colocar cantidades iguales de proteína en un
gel de poliacrilamida-SDS, la precisión es más importante.
Cuantificación de proteínas por el método colorimétrico de Lowry. El
ensayo de determinación de proteínas por Lowry es uno de los más usados en
Bioquímica. Cuando a un péptido o proteína en disolución básica se le hace
reaccionar con cobre se forma un compuesto colorido por coordinación entre
los nitrógenos del péptido con el ión metálico. En el método de Lowry el
reactivo de Folin-Ciocalteu (fosfomolibdato.fosfotungstato) se añade para
incrementar la cantidad de color desarrollado. El aumento en el color ocurre
cuando el complejo de cobre tetradentado transfiere los electrones al complejo
fosfomolibdato/ fosfotungstato, reacción que produce una coloración azul que
se lee a 750 nm. La reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu ocurre solamente
con los residuos de tirosina y triptófano de la proteína.
Material y equipo
Celdas de metacrilato grado UV para espectrofotómetro
Tubos de microfuga
1 gradilla para tubos de microfuga
1 caja con puntas de 200 L (amarillas) para micropipeta.
1 caja con puntas de 1000 L (azules) para micropipeta.
1 Micropipeta 10 L
1 Micropipeta 20-200 L
1 Micropipeta 200-1000 L
Vórtex
Espectrofotómetro (por grupo)
Reactivos
 Albúmina de suero bovino o BSA.
 Solución problema de proteínas (los profesores la proporcionarán)
 Disolución de carbonato-tartrato-cobre (CTC). Ver composición en
apéndice.
 10% Dodecilsulfato de sodio (SDS)
 0.8 N NaOH
 H2O
 Reactivo A. Se prepara inmediatamente antes de usarse con partes
iguales de CTC, 10% SDS, 0.8 N NaOH y H2O.
 Reactivo B. Dilución del reactivo de Folin Ciocalteu. 1 volumen de Folin
+ 5 volúmenes de H2O. Guardar en frasco ámbar. Preparar
preferentemente poco antes de usarse.
Desarrollo experimental
Determinación de proteínas por el método de Lowry.
1. Rotular los tubos de vidrio y adicionar los reactivos en el orden que se
indica en la Tabla 1.2. Recuerda: debes mezclar con el vórtex después
de añadir cada una de las disoluciones.
2. Encender el espectrofotómetro, seleccionar la  de 750 nm.
3. Utilizar las celdas de plástico para realizar las mediciones.
4. Ajustar el espectrofotómetro con la disolución del primer tubo de la tabla
(sin BSA).
5. Realizar las lecturas.
6. Llenar la tabla con los datos de absorbancia.
7. Construir la gráficas de absorbancia vs concentración de proteína (g).
8. Calcular la concentración de la proteína en la muestra
Tabla 1.1. Reactivos y cantidades a añadir para realizar una curva patrón de BSA y la determinación de
la concentración de proteínas de una muestra problema, utilizando el método de Lowry para su
determinación.
Tubo
H2O
BSA
Muestra
Reactivo A Reactivo B
A750m
(1mg/mL) Problema*
1
450
Proteína*
(g)


500 L
250 L
5 L

500 L
250 L
10 L

500 L
250 L
15 L

500 L
250 L
20 L

500 L
250 L
25 L

500 L
250 L
30 L

500 L
250 L
35 L

500 L
250 L

25 L
500 L
250 L

50 L
500 L
250 L
2
445
L
3
440
L
4
435
L
5
430
L
6
425
L
7
420
L
8
415
L
9
425
Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos
L
L
10
400
L
* La muestra problema la prepararán y entregarán los profesores.
** Calcular la cantidad de proteína que contiene cada tubo de acuerdo a los L que se añadieron del
estándar de BSA. Y en el caso de la muestra problema utilizando los datos de la regresión de la
curva estándar generada.
Cuestionario
1. Explica qué tipo de factores contribuyen en la desviación de la línea
recta al graficar la absorbancia contra concentración (desviaciones a la
ley de Beer).
2. ¿cuáles son los principales métodos colorimétricos usados en la
determinación de proteínas?
3. ¿Qué sustancias pueden interferir con la determinación de proteínas por
Lowry?
4. Investiga cual de los siguientes métodos es más sensible y menos
costoso para determinar la concentración de proteínas de una muestra:
Lowry, Absorbancias 280 nm y Bradford.
5. De acuerdo a tus resultados, ¿cuál es el intervalo en el que se podría
determinar la concentración de una proteína en una muestra utilizando la
curva estándar de determinación de proteínas por Lowry? Da una
explicación.
6. ¿Cuáles son las aplicaciones en general de una curva de calibración o
estándar?
Referencias
 Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. 1982. Molecular cloning a laboratory
manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY.
 Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in Enzymology
182, 50-69.
 Peterson GL. 1977. A simplification of the protein assay method of Lowry
et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry 83,
346-356.
 Wang, Y., et al. 2007. Quantitative analyses reveal the importance of
regulated Hdmx degradation for P53 activation. PNAS, (104). 30, 1236512370.