SpeedCycler

RAPIDPCR
INTRODUCCIÓN, BASE Y
CARACTERÍSTICAS
rapidPCR
Introducción
Definición de rapidPCR
Amplificación de DNA mediante una PCR realizada de mánera
rápida, mediante ciclos de incremento y disminución de la
temperatura muy rápidos.
30 ciclos de amplificación en < 30min [Witwer et al., 1994]
PCR estándar
rapidPCR
1-2 °C/seg
>8 °C/seg
3-5 min./ciclo
20 seg/ciclo
2-3 h/PCR
< 30min/PCR
rapidPCR
Características
▪
Reducción de errores en la hibridación de los primers (cebadores)
▪
Resultados de alta calidad y mayor especificidad de los productos
amplificados
▪
Mejor recuperación de la muestra incluso en volúmenes muy pequeños (2
µl) debido a la presión automatizada de la tapa sobre la placa / tubos
▪
Hasta diez veces más rápido debido al control de temperatura de alta
velocidad
▪
Velocidad de calentamiento de hasta 15°C/seg y velocidad de enfriamiento
de hasta 10°C/seg
▪
Alta transferencia de energía
▪
Sistema de Protección de la muestra (SPS)
▪
Incrementos / decrementos de tiempo y temperatura
rapidPCR
Objetivos del rapidPCR
Mayor precisión en los ciclos – temperatura medida en el interior de la muestra
Perfil de Temperatura de la muestra
------Competencia (E)
------SpeedCycler
Tempertaura [°C]
95 °C – 3 seg
56 °C – 3 seg
72 °C – 12 seg
Tiempo [seg]
Rampa de temperatura (E) vs. picos definidos (AJ)
En el mismo lapso de tiempo: 1 ciclo (E) vs. 3 ciclos (AJ)
¿Cómo se alcanzan esos objetivos?
rapidPCR
Características técnicas
Bloques para placas de muestras
Efecto Peltier (termoeléctrico)
Consumibles especiales para PCR con
Reducción de la masa térmica
Fundamental para rápidas variaciones de Tª
Mejora la transferencia de calor
paredes ultrafinas
Primer termociclador para rapidPCR basado en el efecto peltier
▪ Ventajas de la tecnología peltier
▪ Empleo de equipamiento estándar
▪ Protocolos rápidos de PCR para ganar tiempo
rapidPCR
Material Fungible
La velocidad lograda mediante esta PCR se debe a la combinación del
termociclador y el material fungible empleado
+
Placas y tubos de plástico
ultrafino
Bloques LPR/LP – Bloques Rápidos
Low Profile Rapid Blocks
Empleo únicamente con plásticos ultrafinos
rapidPCR
Low Profile Rapid (LPR) blocks
Bloque ultrafino 96 pocillos
Microplaca ultrafina 96 pocillos
Tiras ultrafinas de 8 pocillos
▪
5 mm altura = Ultrafino (Low Profile) con reducción muy significativa de masa térmica
▪
Recubrimiento de oro, bloque de muestras de plata de ley (aumenta la conductividad)
▪
De alta potencia, elementos peltier de alta durabilidad
▪
Technología SAC (* se verá luego)
▪
LPR: únicamente acepta consumibles de AJ (los pocillos son más pequeños)
rapidPCR
Low Profile Rapid (LPR) blocks
Patentado – Microplacas de pared ultrafina
Propiedades
▪
Paredes ultrafinas
▪
Alta transferencia de energía delbido a la tecnologia
SAC (*)
▪
Optimizados para un bajo consume de muestra
Ventajas de emplear polipropileno en PCR
▪
Inerte químicamente
▪
No hay uniones inespecíficas a las paredes del
recipiente
rapidPCR
Low Profile Rapid (LPR) blocks
Tecnología SAC - Self Adapting Container
La tapa térmica ejerce una
alta presión en la muestra
Pocillo con muestra (5-20 µl)
Bloque LPR
11
rapidPCR
Low Profile Rapid (LPR) blocks
Tecnología SAC - Self Adapting Container
(Contenedor adaptable)
1. Durante el ciclo
térmico la presión
en el tubo aumenta
2. Las paredes
elásticas ultrafinas
se deforman
durante el proceso
3. El tubo encaja con
precisión en el
pocillo del bloque
>90%
de transferencia
de energía
Mayor flexibilidad:
Bloques SPR – Standard Profile Rapid
Blocks
Han de ser usados con plástico fino
rapidPCR
Standard Profile Rapid (SPR) blocks
Bloque de perfil estándar Rápido de 96 pocillos
200 µl tubos finos, tiras o microplacas
▪
Diseñado para adaptarse a los plásticos
estándares
▪
Importante: emplear tubos de pared fina
▪
Adicional: precalentar los consumibles
antes de correr la PCR
▪
Altura reducida del bloque para reducir la masa térmica
▪
Bloque robusto: recubrimiento de oro y plata (incremento conductividad)
▪
De alta potencia, elementos peltier de alta durabilidad
▪
Technología SAC
▪
SP/SPR: plásticos AJ y competencia (finos)
▪
COMPETENCIA: BioRad
rapidPCR
Standard Profile (SP) blocks
Plásticos finos para incrementar la transferencia de calor
Placa de aluminio: más barata
Propiedades de los plásticos estándares finos
▪
Transferencia de energía alta
▪
Optimizado para un consumo de muestras
estándar
Ventajas de emplear polipropileno en PCR
▪
Inerte químicamente
▪
No hay uniones inespecíficas a las paredes del
recipiente
rapidPCR
Standard Profile/ Rapid (SP/R) blocks
Tecnología SAC - Software Adaption Controlling
▪
▪
Compensa el espesor
del plástico con una
mayor aplicación de
energía
PERO a mayor grosor,
mayor duración
Application of energy
Transferencia de energía
Cooling
Heating
1 2 3
4 5 6
7 8 9
10 1 2
3 4
Simulated tube control
(factor 1-10)
5
6
7
8
9 10
rapidPCR
Aplicaciones
Consumo de muestras
▪
Bloques LPR / LP (Low Profile Rapid or Low Profile):
Bloques de 96 pocillos
Volumen de muestra desde 2 µl
Max. volume de muestra hasta 20 µl
▪
Bloques SPR / SP (Standard Profile Rapid or Standard Profile)
Bloques de 96 pocillos
Posibilidad de emplear de 10 – 60 µl
Aplicacicones para rapidPCR
rapidPCR
Aplicaciones
Características
▪
Empleo normal de polimerasas
▪
Modificaciones en la concentración de Magnesio
▪
No require función de gradient
▪
Protocolos adaptables
Ventajas
Notas importantes:
▪
No require químicas especiales
▪
▪
Ahorra tiempo
Generalmente puede emplearse la
mayoría de polimerasas
▪
Reduce el consumo de muestra
▪
Fácil adaptación de protocolos
estándares
▪
Mayor rango de amplificación
▪
▪
Mayor especificidad
Como en cualquier PCR, los resultados
dependen de la calidad y pureza de la
muestra
rapidPCR
Características
Propiedades de la Taq Polimerasa
Elongación:
1000 bp/min = 16.7 bp/seg
Taq polimerasa sintetiza en:
100 bp/sec
85% del tiempo desperdiciado
http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/gene/taq.polymerase.jpg
Influencia del Magnesio
▪
▪
▪
▪
Cofactor para la Taq DNA Polimerasa
Forma complejos solubles con los dNTPs (nucleosi trifosfatos)
Estabilizan el complejo cebador-molde
Promueve la cinética de la primera unión del cebador
rapidPCR:
Debido a la rapidez de los cambios de temperatura, se promueve la unión específica del cebador
La alta concetración de Mg2+ estabiliza el complejo
rapidPCR
No require función de gradiente
Temperature Curve Standard Cycler
Termociclador estándar
100
100
Block 55
95
95
Sample 55
Retraso de la muestra en
alcanzar la temperatura
fijada en el bloque
(superior a 20seg (con
tubos finos)
▪
Diferencia de temperatura
entre los parámetros
fijados para el bloque y la
temperatura real de la
muestra
▪
El gradiente ayuda a
encontrar la mejor
temperatura de
anillamiento
Block 53
90
90
Sample 53
Block 57
85
85
Sample 57
80
80
∆T = 6.2 °C
5 sec
75
75
T (°C)
T (°C)
▪
∆T = 3.0 °C
10 sec
70
70
∆T = 1.5 °C
15 sec
65
65
60
60
55
55
50
50
45
45
20
20
40
40
60
60
80
80
t (sec)
t(s)
100
100
120
120
∆T = Diferencia de temperatura entre los parámetros fijados para el bloque y la temperatura
real de la muestra
rapidPCR
No require función de gradiente
Termociclador para PCR
rápida: no require gradiente
▪
La temperatura de la
muestra es igual que la
del bloque prácticamente
en todo momento
Por ello hay una mejor
temperatura de
anillamiento
Ventajas
▪
Mayor uniformidad en la
temperatura del bloque y
fácil adaptación/diseño
de los protocolos
AJ Block
AJ in sample
85
∆T = 0.5 °C
5 sec
T (°C)
▪
95
75
∆T = 0.3 °C
10 sec
∆T = 0.15 °C
15 sec
65
55
45
10
20
30
40
50
60
70
t (seg)
∆T = Diferencia de temperatura entre los parámetros fijados para el bloque y la temperatura
real de la muestra
rapidPCR
Ventajas
No requiere química especial
PCR estandar
rapidPCR
Primer 1
Primer 2
dNTPs
MgCl2
Taq polimerasa
Tampón de reacción
0.1 – 1 µM
0.1 – 1 µM
200 µM
1.5 – 2.5 mM
0.2 – 1 U
1x
0.1 – 1 µM
0.1 – 1 µM
200 µM
2.5 – 7 mM
0.2 – 1 U
1x
Muestra DNA (molde)
0.1 – 150 ng
H2Od
añadir para alcanzar
añadir para alcanzar
el volumen final
el volumen final
0.1 – 150 ng
Nota: En caso de moldes complejos, puede incrementarse el volumen de muestra
(concentración del DNA) mediante la reducción del volumen de agua
rapidPCR
Ejemplos de aplicaciones
Tiempo empleado
▪
Emplea menos tiempo que los sistemas estándares
▪
Reducción del tiempo de los experimentos de 2-3h a 15 - 30 min
▪
La rapidez de calentamiento y enfriamiento de las muestras, asi
como el incremento de transferencia de energía debido a la
tecnología SAC, reduce el tiempo empleado en 4-10 veces
rapidPCR
Ejemplos de aplicaciones
24 kb PCR
Muestra: gDNA humano
30 ciclos
4:59 h
Lambda/HindIII AJ SpeedC.
30 ciclos
8:22 h
Compet( E)
El Speed Cycler de AJ ahorra
3:23 h, es decir tarda un 40%
menos en amplificar que el
equipo de la competencia
AJ SpeedC. Compet Time Saving
600
500
203 Ahorro
400
300
502
200
299
100
0
min
Clientes potenciales: aquellos que realizan PCR muy largas
Ej. secuenciación(+/-8h), clonaje de vectores, etc.
rapidPCR
Ejemplos de aplicaciones
Productos de PCR de mayor calidad
▪ Incremento de la especificidad del cebador
 Al variar rápidamente la Tª, reduce el riesgo de ligarse a
secuencias inespecíficas
▪ Reducción significativa de productos inespecíficos
▪ Temperatura seleccionada = temperature real de la
muestra
rapidPCR
Ejemplos de aplicaciones
rapidPCR del gen B-actina de gDNA humano (295 bp)
1x
25x
1x
30 seg
0 seg
0 seg
30 seg
96°C
95°C
60°C
72°C
rapidPCR del gen B-globina de gDNA humano(536 bp)
1x
28x
1x
30 seg
0 seg
0 seg
30 seg
96°C
95°C
56°C
72°C
▪
Excelente uniformidad del bloque incluso con protocolos muy cortos (8 – 9 min)
▪
Alta calidad, rendimiento y especificidad de los productos amplificados
* Empleo de la DNA polimerasa innuTaq HOT A de Analytik Jena
rapidPCR
Resumen
▪
▪
Ultra-rápido
Mayor calidad,
rendimiento y
especificidad
▪
Hasta 10 veces más rápidotimes faster
▪
Velocidad de calentamiento: hasta 15 °C/s
y de enfriamiento hasta 10 °C/s
▪
Mejor transferencia de energía (>90%)
Menos uniones inespecíficas del cebador
SPS – Sistema de protección de muestras
▪
Flexibilidad
▪
Placas LP (Low Profile) o consumibles
estándares de pared fina
▪
Fácil
▪
Cambios en los iones de Mg2+
▪
Amplio rango de
aplicaciones
▪
Todas las aplicaciones estándares son
posibles: PCR Multiplex, Colony PCR (de
colonias bacterianas), secuenciación…
▪
rapidPCR
▪
Variedad de dispositivos y manejo flexible
SpeedCycler²
Termociclador para rapidPCR
Life science unlimited
SpeedCycler²
Características
 Interfaz externo HID-Pro 320
 Pantalla táctil de 5.7”
 Software Windows CE-based
 Idiomas: Inglés y Alemán
 LAN y puerto USB
 Es el termociclador más rápido del mercado
 Tapa térmica automática con presión por contacto
SpeedCycler²
Bloques térmicos
96 LPR (96 x 20 µl)
Aumento Tª: 15°C/sec
Disminución Tª: 10 °C/sec
96 LP (96 x 20 µl)
Aumento Tª: 15°C/sec
Disminución Tª: 10 °C/sec
96 SPR (96 x 0.2 ml)
Aumento Tª: 8°C/sec
Disminución Tª: 6 °C/sec
96 SP (96 x 0.2 ml)
Aumento Tª: 5.5°C/sec
Disminución Tª: 4 °C/sec
LPR
LP
SPR
SP
–
–
–
–
Low Profile Rapid (alta conductividad)
Low Profile (aluminio)
Standard Profile Rapid (alta conductividad)
Standard Profile (aluminio)
SpeedCycler²
Pantalla HID-Pro 320
HID-Pro 320 – Human Interface Device
 Interfaz externo HID-Pro 320
 Pantalla táctil de 5.7” (no require teclado ni ratón)
 Windows CE-based
 Barra de herramientas: función rápida para
realizar el SetUp de muestras
 LAN y puerto USB para mejor conectividad
 HID-Pro 320: aplicable a otros instrumentos de
Analytik Jena (ej. ScanDrop® or InnuPure® C16)
SpeedCycler²
Pantalla HID-Pro 320
 Programa de fácil uso (intuitivo)
 Indicación del tiempo, asi como del
aumento y disminución de la
temperatura
Visualización gráfica del programa de
PCR
SpeedCycler²
Software rPCRsoft

Programación de los protocolos de
de la PCR

Ajuste de las tapas individualmente

Gestión de proyectos / usuarios

Simulaciones de PCR
 Visualización gráfica del programa de PCR
 Funciones de incremento y decremento de temperatura
SpeedCycler²
Resumen
SpeedCycler²
Resumen
Características
SpeedCycler²
SpeedCycler²
Bloque Low Profile Rapid (LPR)
rapidPCR

Material
Plata con recubrimiento Au
Control
Autónomo o HID-Pro 320
Aumento Tª
15 °C/sec
Software
Windows CE (HID-PRO 320)
o rPCRsoft con ordenador
Disminución Tª
10 °C/sec
Visualización
Visualización gráfica del
programa de PCR
Bloque Low Profile (LP)
Material
Aluminio
Pantalla táctil

Aumento Tª
15 °C/sec
Fallo de la red
eléctrica

Disminución Tª
10 °C/sec
Gestión de usuarios

Inicio rápido

Tapa
Bloque Standard Profile Rapid (SPR)
Presión por contacto
automático
Hasta 120 °C
Material
Plata con recubrimiento Au
Aumento Tª
8 °C/sec
Disminución Tª
6 °C/sec
Bloque Standard Profile (SP)
Bloques LPR

Material
Bloques SPR

Aumento Tª
Bloques SP

Disminución Tª
Bloques LP

Aluminio
5.5 °C/sec
4 °C/sec