Tipos de cultivos celulares

Tipos de cultivos celulares
Generalidades
Curso Introducción al Cultivo de Células
Eucariotas
Año 2015
Dra. Romina Manarin
Y así comenzó todo…
Wilhem Roux
1885
Ross Harrison
1907
Alexis Carrel
1913
Cultivo celular
Abarca al conjunto de técnicas que permiten el
mantenimiento de las células in vitro,
vitro,
conservando al máximo sus propiedades
fisiológicas, bioquímicas y genéticas.
Existen 3 formas principales de iniciar un cultivo celular:
CULTIVO DE
ÓRGANOS
EXPLANTES
PRIMARIOS
CÉLULAS
DISGREGADAS
Cultivo de órganos
• El tejido se coloca sobre una
rejilla situada en la interfase
líquido-gas de un medio del que
obtiene los nutrientes.
• Representa una buena réplica
del tejido de origen ya que se
conservan las interacciones
histológicas.
• El crecimiento es limitado.
• Se necesita un nuevo explante
para cada experimento.
Explantes primarios
•Constituidos por fragmentos pequeños de
tejidos u órganos que se adhieren a una
superficie en la que generalmente crecen
las células de la periferia del explante.
•Útil para pequeñas cantidades de tejidos,
como biopsias de piel.
Cultivo de un Explante primario de
carcinoma de piel de ratón
explante
crecimiento temprano de
células (3 dpe)
crecimiento celular luego de
la remoción del explante
(7dpe)
Cultivo de células disgregadas
•Este tipo de cultivo está formado por células
dispersas disgregadas de un tejido vivo, de un
cultivo primario, o de una línea celular, mediante
distintos sistemas mecánicos, químicos o
enzimáticos.
•Las células crecen en suspensión o adheridas a una
superficie.
•Generalmente son cultivos que contienen un único
tipo de célula y éstas suelen ser homogéneas
genéticamente.
•Es el tipo de cultivo más utilizado en la actualidad
debido a su capacidad de propagación, es decir de
crecimiento mantenido.
Propiedades de los tipos de cultivos
Mecanismos de disgregación
• Enzimática
1.tripsina fría
2.tripsina caliente
3.colagenasa
• Mecánica
Tripsina caliente
• Pequeñas porciones
de tejido se incuban
con tripsina a 37°C y
las células disociadas
deben recolectarse
por centrifugación
cada media hora. La
tripsina se neutraliza
con suero en medio
de cultivo.
Tripsina fría
• Las porciones de
tejido se incuban en
tripsina a 4°C
durante 6-18 hs
permitiendo la
penetración con una
mínima actividad
tríptica y la digestión
se puede hacer en
un tiempo corto de
20-30 min a 37°C.
Disgregación por colagenasa
Disgregación mecánica
SCRAPING O “RASCADO”
DISGREGACIÓN CON LA
JERINGA
TAMIZADO
PIPETEO
Inicio de un cultivo celular
Puede derivar del crecimiento de las células disgregadas.
El cultivo primario es lo primero de una serie de
procesos selectivos que finalmente darán origen a una
línea celular.
Los cultivos celulares son los más utilizados
MONOCAPA
SUSPENSIÓN
células hematopoyéticas, células madres
Cultivos primarios
CULTIVO PRIMARIO
Cuando las células o tejidos
procedentes de un ser vivo crecen
sin haber pasado previamente por
una fase de crecimiento in vitro.
CULTIVO
SECUNDARIO
Cuando el cultivo procede
de una fase previa de
crecimiento in vitro
LÍNEA CELULAR
Subcultivos en monocapas
Tripsinización
Cuándo hacer un Subcultivo o Pasaje
1. Alta densidad del
cultivo.
2. Agotamiento del
medio de cultivo.
3. Tiempo desde el
último pasaje.
El origen de una línea celular
Algunos Conceptos
LINEA CELULAR- CEPAS
Con los sucesivos pasajes o subcultivos, un cultivo
primario forma una línea celular. Este término
implica la presencia de varios linajes celulares de
fenotipos similares o distintos.
Así, al seleccionar uno de los linajes celulares por
clonado o por separación celular física o por
cualquier otra técnica de selección, para tener
ciertas propiedades específicas que han sido
identificadas en la masa de células del cultivo, esta
línea celular se transforma en lo que se conoce
como cepa celular (o cell strain).
Evolución de una línea celular
Líneas celulares finitas y continuas
• Normalmente, las líneas celulares tienen una vida finita que, según el tipo
de célula, se puede prolongar entre 20 y 80 generaciones. Superado ese
límite, las células entran en senescencia en la que pierden su capacidad
de proliferar, supuestamente por el acortamiento de los telómeros, y
mueren.
• Sin embargo, algunas células (como las células de roedores y las células
tumorales) evitan la senescencia y dan lugar a líneas celulares continuas,
que crecen indefinidamente. Estas células pueden surgir de forma
espontánea (exposición a radiaciones ionizantes o a carcinógenos
químicos) o inducida (infección vírica o transfección de ADN) y son el
resultado de un cambio genotípico denominado transformación.
• Las células transformadas se caracterizan porque son inmortales (crecen
indefinidamente); su crecimiento es aberrante (se pierde la inhibición por
contacto, la limitación de la densidad celular durante la proliferación y la
dependencia del anclaje); son malignas (invaden tejidos y dan lugar al
crecimiento de tumores); son genéticamente inestables y presentan
aberraciones cromosómicas.
Líneas celulares más frecuentemente
utilizadas
Células en cultivo
fibroblastos
mioblastos
Células de tabaco
Epimastigotes de T. cruzi
Células VERO
Células RAW 264.7
Ventajas de los cultivos celulares
Ventajas de los cultivos celulares
Desventajas de los cultivos celulares
Desventajas de los cultivos celulares
Bancos y colecciones de cultivos
celulares
• Los 2 bancos de líneas celulares más importantes son:
- American Type Culture Collection (ATCC)
- European Collection of Cell Cultures (ECACC)
• En Argentina:
- Asociación Banco Argentino de Células (ABAC)
- Asociación Argentina de Bancos de Tejidos (para
transplantes)
- Centro de Investigaciones en Química Biológica
de Córdoba (ciquibic)
Servicios de ABAC
• Venta de líneas celulares
• Control de Micoplasma en Muestras de
Células
• Depósito de Ampollas en Nitrógeno Líquido
• Manual de ATCC
Designación de líneas celulares
Las nuevas líneas celulares deberían tener:
• un código o designación. Por ej. normal human brain, NHB
• una clase celular o número de línea celular . Si varias líneas
celulares fueron obtenidas de la misma fuente. Por ej. NHB1, NHB2,
etc.)
• un número de clon. Por ej. NHB2-1, NHB2-2, etc.
• el número de duplicaciones de la población ( para líneas celulares
finitas), debería ser estimado e indicado después de una barra. Por
ej. NHB2/2.
• el número de pasaje desde el último descongelamiento (para una
línea celular continua) Por ej. HeLa-S3/p4).
Es esencial que la designación de la línea celular sea única, para evitar
confusiones en distintos trabajos de la literatura. Los bancos de células eliminan
este inconveniente dando a cada línea celular un número de acceso.
Consideraciones al elegir una línea celular
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Línea celular finita o continua
Células normales o transformadas
Especie
Características de crecimiento
Disponibilidad
Validación
Expresión fenotípica
Línea celular control
Estabilidad
Muchas gracias