Establecimiento in vitro de Evolvulus glomeratus. Una nativa con

Establecimiento in vitro de Evolvulus glomeratus. Una nativa con potencial
ornamental.
Maritano, P. F.; Alderete, L. M. ; Mori, M. y Escandón, A. S.
Instituto de Floricultura INTA-Castelar. De los Reseros y Nicolás Reppetto s/n (1720)-Bs.As.
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Introducción
El mercado internacional de cultivos ornamentales se caracteriza por su competitividad y su
dinamismo debido a la necesidad de incorporar novedades en forma constante. La
Argentina posee una gran variedad de plantas herbáceas, arbustivas y leñosas con
potencial ornamental, lo que la convierte en una muy interesante fuente de material para el
desarrollo de nuevas variedades. A pesar de la disponibilidad de este material y que nuestro
país posee una gran tradición en el mejoramiento vegetal, en especies ornamentales muy
poco es lo que se ha hecho en este aspecto
Entre los géneros nativos con potencial ornamental, se encuentra el género Evolvulus
(Convolvulaceae) que está representado en el país por siete especies, una variedad y una
forma endémica (Zuloaga y Morrone, 1992). E. glomeratus Nees & Mart. es una planta
herbácea, semi-erecta, con entrenudos largos en la zona apical y flores de tamaño mediano
de un intenso color azul. Su área de distribución incluye una vasta región del norte y centro
de la Argentina, llegando inclusive hasta el norte de la Patagonia.
La Biotecnología ofrece una serie de herramientas alternativas para el mejoramiento de
cultivos: la mutagénesis y la obtención de poliploides in vitro, la variación somaclonal, el
cultivo de anteras, el cultivo de protoplastos, la transgénesis y la conservación de
germoplasma nativo ex situ, entre otras. En todas las mencionadas está involucrado el
cultivo in vitro de tejidos, por lo que la puesta a punto de un protocolo que permita el
establecimiento de material de la especie de interés bajo condiciones de cultivo in vitro es el
primer paso en el inicio de un programa de mejoramiento de la misma a través de la
aplicación de herramientas biotecnológicas (Escandón, 2004).
Objetivo
Establecimiento del cultivo in vitro de E. glomeratus y el establecimiento de la nutrición
mineral adecuada para el desarrollo de los explantos.
Materiales y métodos
Para el establecimiento in vitro de E. glomeratus, se ensayaron dos protocolos de
desinfección para segmentos nodales de plantas mantenidas bajo condiciones de
invernáculo. Se probó un protocolo de desinfección estándar de etanol/lavandina
comercial/detergente (70%/25%/0,01%, V/V) con cultivo en medio (Murashige-Skoog, 1962)
libre de hormonas, suplementado con 20 g/L de sacarosa y solidificado con 7 g/L de agar,
pH: 5,7. El segundo protocolo tuvo el mismo esquema de desinfección que el primero, con
siembra posterior en el mismo medio anterior pero suplementado con la mezcla (1X) de
antibióticos-antimicóticos de Sigma (AAS). Luego de 22 días de cultivo los brotes fueron
transferidos al mismo medio pero sin el agregado de AAS.
Estas vitroplantas fueron utilizadas como explantos y fueron subcultivadas a diferentes
diluciones del medio MS: 0,5X, 0,25X, 0,125X. Todos los tratamientos fueron suplementados
con 20 g/L de sacarosa y 100 mg/L de inositol; se solidificó con 7 g/L de agar Sigma® y el
pH fue ajustado a 5,7. Los explantos fueron cultivados en cuartos de cultivo a 24ºC±2ºC y
bajo un fotoperíodo de 16 horas de luz con una irradiancia de 52 μmol.mˉ².seg. Se
sembraron 60 explantos por tratamiento. La longitud de los explantos fue medida en el
momento de la siembra de los mismos y luego de 4 semanas. Se calculó un índice de
crecimiento (IC) como longitud final/longitud inicial. Los datos se analizaron mediante el test
de Student.
Al término de 4 semanas también se llevaron a cabo registros acerca de los porcentajes de
enraizamiento espontáneo y oxidación observados bajo cada una de las condiciones
ensayadas.
Resultados y discusión
Al cabo de de 5 días de cultivo, el 100% de los brotes desinfectados y sembrados en el
medio sin AAS, mostraron desarrollo de contaminación fúngica. Por su parte, el 95% de los
brotes desinfectados y cultivados en el medio suplementado con AAS se mostró libre de
contaminación y la totalidad de los mismos fueron transferidos al mismo medio libre de AAS.
Es posible que la desinfección por el método estándar haya sido efectiva en el eliminación
de la contaminación superficial de los explantos pero no resultó suficiente para el control del
desarrollo tardío de los organismos contaminantes, los que si pudieron ser controlados
satisfactoriamente con el agregado al medio de cultivo de la mezcla AAS.
Si bien en la primera semana se observó movimiento de las yemas de los explantos en
todas las diluciones del medio MS probadas, posiblemente estuvieran activadas por el
hecho de provenir todas de un medio con condiciones favorables de cultivo, a los 30 días de
cultivo las diferencias de cultivo se hicieron evidentes. La Figura 1 muestra el grado de
desarrollo detectado entre los tratamientos al cabo de 4 semanas de cultivo.
Figura 1. Comparación de los explantos en la 4º semana, de izquierda a derecha: explantos
establecidos en MS 1X, MS 0,5X, MS 0,25X y MS 0,125X.
En este contexto es importante destacar que, en los diferentes medios, E. glomeratus
mostró diferentes respuestas, según el parámetro evaluado. En efecto, en lo que a
desarrollo se refiere la dilución 0,25X fue la menos efectiva de las cuatro probadas,
mostrando diferencias significativas respecto al resto de los tratamientos, en los que se
observó una respuesta similar en cuanto a su capacidad de crecimiento medida como IC.
En cambio cuando se evaluó su capacidad de enraizamiento fue notoria la diferencia
detectada a favor de la dilución 0,5 X. Por otra parte, el porcentaje de explantos con signos
de oxidación también mostró diferencias entre los tratamientos, siendo el MS 1X la más
adecuada respecto de las otras diluciones probadas (ver Tabla 1).
Dilución MS
MS 1,0X
MS 0,5X
MS 0,25X
MS 0,125X
n
56
51
33
40
IC
6,575¹
7,333¹
4,909²
7,608¹
% Enr.
0
11,6
0
5
% Oxid.
6,6
15
45
33,3
Tabla 1. Resultados de los cuatro tratamientos aplicados. n: cantidad de explantos por
tratamiento; IC.: media de los índice de crecimiento; % Enr.: porcentaje de explantos que
enraizaron espontáneamente; % Oxid.: porcentaje de explantos oxidados en cada
tratamiento; Diferentes números indican diferencias significativas (P≤ 0,05) entre
tratamientos.
No son numerosos los reportes sobre cultivo in vitro de tejidos en la familia Convolvulaceae
(Monteiro Correa et al., 2003), en este contexto, es importante indicar que este es el primer
reporte sobre el cultivo de tejidos de E. glomeratus y que servirá de base para futuras
aplicaciones de herramientas biotecnológicas en el mejoramiento del género.
Conclusiones
La utilización de la mezcla ASS como suplemento del medio MS posterior al método de
desinfección estándar resultó ser limitante para la introducción in vitro de E. glomeratus.
El ensayo con diferentes diluciones de medio MS permitió determinar la sensibilidad de E.
glomeratus a las diferentes concentraciones, por lo que un protocolo ajustado para la
multiplicación in vitro de esta especie deberá usar medio MS 1X para el establecimiento y,
eventualmente, la multiplicación del cultivo y el MS 0,5 X para la etapa de enraizamiento.
Bibliografía
Escandón, A.S. Biotecnología en el cultivo de especies ornamentales. Sección: VIII. Cap.: 1. En:
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. Editores: Viviana Echenique, Clara Rubinstein y Luis
Mroginski. Pags.: 1-10; 2004.
Monteiro Corrêa, R. Potencial do carvão ativado, filtro amarelo e interação fotoperiodo/temperatura de
batata-doce in vitro. Ciência Rural, vol.33, n.3, pag. 423-430; 2003.
Murashige, T. & Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue
cultures. Physiol. PI 15: 437-497; 1962.
Zuloaga, F.; Morrone, O.; Catálogo de las Plantas Vasculares de la República Argentina II; Missouri
Botanical Garden Press; 1999.