Regulación de la expresión génica Regulation of gene expresion

E.1 Parasitología molecular
E.1 Molecular parasitology
E.2 Expresión génica en linfocitos
T humanos
E.2 Gene expression in human T
lymphocytes
E.3 Biología molecular de
microorganismos extremofilos
E.3 Molecular biology of
extremophilic
microorganisms
E.4 Mantenimiento y variabilidad
del genoma: enzimología de la
reparación de DNA.
E.4 Genome maintenance and
variability: enzymology of
DNA repair.
E
Regulación de la
expresión génica
Regulation of
gene expresion
E.5 Estructura y función del
ribosoma
E.5 Estructura y función del
ribosoma
E.6 Síntesis de proteínas y su
regulación en eucariontes
E.6 Protein synthesis and its
regulation in eukaryotes
E.7 Expresión génica en
Streptomyces y levaduras
E.7 Gene expression
Streptomyces and yeast
E.8 Regulación de la actividad
genética por hormonas
E.8 Hormonal regulation of gene
expression
E.9 Estructura cromatínica y
transcripción
E.9 Chromatin structure and
transcription
E.10 Envolturas celulares
E.10 Cell envelopes
E.11 Bases Moleculares de las
Enfermedades Metabólicas
E.11 Molecular basis of metabolic
diseases
E.12 División Celular Bacteriana y
Resistencia a Antibióticos
E.12 Bacterial Cell Division and
Antibiotics Resistance
E.13 Biotecnología y genética de
bacterias termofilas extremas
E.13 Biotechnology and genetics
of extreme thermophilic
bacteria
E.14 Regulación de la expresión
génica específica de tejido
E.14 Regulation of the tissuespecific gene expression
E.15 Iniciación interna de la
traducción en mRNAS
eucarióticos.
E.15 Internal initiation of
translation in eucariotic
mRNAs
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.1
Parasitología molecular
Resumen de Investigación
Jefe de Línea / Group Leader:
Carlos Alonso
Las especies de Leishmania son protozoos
parásitos, agentes etiológicos de las
Personal Científico / Scientific
Leishmaniosis, un grupo de enfermedades
Personnel:
que afectan a la población de 79 países,
Jose Mª Requena
Manuel Soto
Becarios Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
María José Pérez
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
en los que producen unos 400.000 casos
nuevos cada año, existen unos 12 millones
de personas infectadas y 350 millones están
en riesgo de contraer la enfermedad. Los
perros son el principal reservorio de L.
infantum en la cuenca mediterránea, Oriente
Próximo y Centro y Sudamérica. La
prevalencia de la leishmaniosis visceral
canina en la región mediterránea varía
desde el 1 al 37%.
Por otro lado, venimos estudiando
parámetros inmunológicos y clínicos
asociados a la infección por L. infantum de
hámsteres dorados como un modelo
experimental que se asemeja a las
infecciones de LV en humanos y cánidos.
Otra parte de nuestra actividad investigadora
se viene realizando en el campo de la
biología molecular de L. infantum. En
particular, estamos estudiando mecanismos
de regulación que, en este parásito, operan
a niveles post-transcripcionales. En estos
estudios estamos empleando los genes de
histonas y de HSP como sistemas modelo.
Nuestro grupo está colaborando con los
Drs. Ignacio Navarrete y Luis C. Gómez-
Ana Isabel Rico, Ruth Larreta, Nuria
Parody, Salvador Iborra, Maxy B. de los
La principal actividad investigadora de
Santos
nuestro grupo se dirige hacia la
caracterización de antígenos de L. infantum
Técnico de Investigación / Technical
y el análisis de los aspectos inmunológicos
Assistance:
del húesped que son inducidos durante la
Miguel A. Fuertes, María D. Doria, Javier
infección. Hemos identificado a proteínas
Carrión, Carlos Mey, David Navarro.
evolutivamente conservadas como
antígenos prominentes de Leishmania que
son específicamente reconocidos por los
Nieto (Facultad de Veterinaria, UEX,
Cáceres) en el análisis de la LV canina y
la infección experimental en perros. También
estamos colaborando con la Dra. Carmen
Navarro-Ranninger y el Dr Jose M. Pérez
(Departamento de Química Orgánica, UAM)
en la identificación de las vías bioquímicas
por las que algunos compuestos metálicos
ejercen su actividad antitumoral.
sueros de humanos y perros con
leishmaniasis visceral (LV). Además,
algunas de estas proteínas (p. ej., las
proteínas de choque térmico (HSP) 70 y
83, y la proteína ribosomal ácida LiP2a)
tienen destacables propiedades
inmunoestimuladoras como son una
actividad adjuvante para producir
anticuerpos frente a proteínas
acompañantes y un efecto mitogénico sobre
esplenocitos de ratones no inmunizados.
Macrófago de hámster infectado por L. infantum (Tinción de Giemsa)
88
Molecular parasitology
Publicaciones/Publications:
Research summary
Leishmania spp. are protozoan parasites,
etiological agents of Leishmaniasis, a
group of diseases affecting the population
of 79 countries at a rate of 400,000 cases
per year with 12 million currently infected
and 350 million at risk. Dogs are the
major reservoir of L. infantum in the
Mediterranean Basin, the Middle East,
and South and Central America. The
prevalence of canine visceral
leishmaniasis in the Mediterranean
region has been shown to vary from 1
to 37%.
Another part of our research activity is
being developed in the field of the
molecular biology of L. infantum. In
particular, we are studying mechanisms
of gene regulation that, in this parasite,
are operating at these post-transcriptional
levels. In this studies were are using
histone and HSP genes as system
is directed towards the characterization
of L. infantum antigens and the
understanding of host immunological
aspects elicited by the infection. We have
identified evolutionarily conserved
proteins as prominent Leishmania
Gonzalez, V.M., Fuertes, M.A., Jimenez-Ruiz, A, Alonso, C. and Perez, J.M.
(1999). The formation of DNA interstrand-cross-links by a novel Bis-[Pt2Cl4(diminacene aceturate)2Cl4.4H2O complexes inhibits the B to Z formation.
Mol. Pharmacol. 85, 770-778
Planelles, L., Marañon, C., Requena, J.M. and López, M.C. (1999). Phage
recovery by electroporation of naked DNA into host cells avoids the use of
packaging extracts. Anal. Biochem. 267, 234-235
Soto, M., Requena, J.M., Quijada, L., Perez, M.J., Nieto, C.G., Guzman, F.,
Patarroyo, M.E. and Alonso, C. (1999). Antigenicity of the Leishmania
infantum histones H2B and H4 during canine viscerocutaneous leishmaniasis.
Clin. Exp. Immunol. 115, 342-349
models.
Perez, J.M., Quiroga, A., Montero, E., Alonso, C. and Navarro-Ranninger, C.
(1999). A cycloplatinated compound of p-isoplropylbenzaldehyde induces
apoptosis in cis-DDP resistant cells which overspress H-ras oncogene. Inorg.
Biochem. 73, 235-242
Our group is collaborating with Dr Ignacio
Quiroga, A.G., Perez, J.M., Montero, E.I., West, D.X., Alonso, C. and NavarroRanninger, C. (1999). Synthesis and characterization of Pd(II) and Pt(II)
complexes of p-isopropylbenzaldehyde N-protected thiosemicarbazones.
Cytotoxic activity against ras-transformed cells. J. Inorg. Biochem. 75, 293301
Navarrete and Dr Luis C. Gómez-Nieto
(Facultad de Veterinaria, UEX, Cáceres)
on the analysis of canine VL and the
experimental infection in dogs. Also, we
are collaborating with Dr Carmen
The main research activity of our group
Pérez, J.M., Camazón, M., Alvarez-Valdes, A., Quiroga, A.G., Kellnad, L.R.,
Alonso, C. and Navarro- aninger, M.C. (1999). Synthesis, characterization and
DNA modification induced by a novel Pt(IV)-bis(monoglutarate) complex
which induces apoptosis un glioma cells. Clin. Biol. Interaction 117, 99-115
Navarro-Ranninger and Dr Jose M.
Pérez (Departamento de Química
Orgánica, UAM) in the identification of
the biochemical pathways by which
certain metallic compounds exert their
antitumour activity.
Perez, J.M., Matesanz, A.I., Martin-Ambite, A., Navarro, P., Alonso, C. and
Souza, P. (1999). Synthesis and characterization of complexes of p-isopropyl
benzaldehyde and methyl 2-pyridyl ketone thiosemicarbazones with Zn(II) and
Cd(II) metallic centers. Cytotoxic activity and induction of apoptosis in Pamras cells. J. Inorg. Biochem. 75, 255-261
Onoa, G.B., Moreno, V., Font-Bardia, M., Solans, X., Perez, J.M. and Alonso,
C. (1999). Structural and cytotoxic study of new Pt(II) and Pd(II) complexes
with the bi-heterocyclic ligand mepirizole. J. Inorg. Biochem. 75, 205-212
Puentes, F., Guzman, F., Marin, V., Alonso, C., Patarroyo, M.E. and Moreno,
A. (1999). Leishmania: fine mapping of the Leishmanolysin molecule's
conserved core domains involved in binding and internalization. Exp Parasitol.
93, 7-22
Olivares, M., Thomas, M.C., Alonso, C. and Lopez, M.C. (1999). The L1Tc,
long interspersed nucleotide element from Trypanosoma cruzi, encodes a
protein with 3'-phosphatase and 3'-phosphodiesterase enzymatic activities. J.
Biol. Chem. 274, 23883-23886
Perez, J.M., Quiroga, A.G., Montero, E.I., Alonso, C. and Navarro-Ranninger,
C. (1999). A cycloplatinated compound of p-isopropylbenzaldehyde
thiosemicarbazone and its chloro-bridged derivative induce apoptosis in cisDDP resistant cells which overexpress the H-ras oncogene. J. Inorg. Biochem.
73, 235-243
Fuertes, M.A., Berberich, C., Lozano, R.M., Gimenez-Gallego, G. and Alonso,
C. (1999). Folding stability of the kinetoplastid membrane protein-11 (KMP-11)
from Leishmania infantum. Eur. J. Biochem. 260, 559-67
antigens that are specifically recognized
- Nieto, C.G., García-Alonso, M., Requena, J.M., Mirón, C., Soto, M., Alonso,
C. and Navarrete, I. (1999). Analysis of the humoral immune response against
total and recombinant antigens of Leishmania infantum: correlation with
disease progression in canine experimental leishmaniasis. Vet. Immunol.
Immunopathol. 67, 117-130
by sera from both humans and dogs with
visceral leishmaniasis (VL). Furthermore,
Rico, A.I., Angel, S.O., Alonso, C. and Requena, J.M. (1999).
Immunostimulatory properties of the Leishmania infantum heat shock proteins
HSP70 and HSP83. Mol. Immunol. 36, 1131-1139
some of these proteins (e.g., heat-shock
proteins (HSP) 70 and 83, and acidic
Cervantes, G., Marchal, S., Prieto, M.J., Perez, J.M., Gonzalez, V.M., Alonso,
C. and Moreno, V. (1999). DNA interaction and antitumor activity of a Pt(III)
derivative of 2-mercaptopyridine. J. Inorg. Biochem. 77, 197-203
ribosomal protein LiP2a) possess
remarkable immunostimulatory
Perez, J.M., Lopez-Solera, I., Montero, E.I., Brana, M.F., Alonso, C.,
Robinson, S.P. and Navarro-Ranninger, C. (1999). Combined effect of
platination and intercalation upon DNA binding of novel cytotoxic Ptbis(naphthalimide) complexes. J. Med. Chem. 42, 5482-5486
properties such as adyuvant activity to
induce antibody production against an
Fuertes, M.A., Perez, J.M., Gonzalez, V.M. and Alonso, C. (1999). Empirical
validation of a two-state kinetic model for the B-Z transition of double-stranded
poly[d(G-m5C)]. J. Biol. Inorg. Chem. 4, 759-765
accompanying protein and mitogenic
Perez, J.M., Montero, E.I., Gonzalez, A.M., Alvarez-Valdes, A., Alonso, C. and
Navarro-Ranninger, C. (1999). Apoptosis induction and inhibition of H-ras
overexpression by novel trans-PtCl2(isopropylamine) (amine')] complexes. J.
Inorg. Biochem. 77, 37-42
effect on splenocytes from unprimed
mice. On the other hand, we are studying
Montero, E.I., Diaz, S., Gonzalez-Vadillo, A.M., Perez, J.M., Alonso, C. and
Navarro-Ranninger, C. (1999). Preparation and characterization of novel
trans-[PtCl(2) (amine) (isopropylamine)] compounds: cytotoxic activity and
apoptosis induction in ras-transformed cells. J. Med. Chem. 42, 4264-4268
immunological and clinical parameters
associated with the L. infantum infection
Thomas, M.C., Garcia-Perez, J.L., Alonso, C. and Lopez, M.C. (2000).
Molecular characterization of KMP11 from Trypanosoma cruzi: a cytoskeletonassociated protein regulated at the translational level. DNA Cell. Biol. 19, 4757
in Golden hamsters as the experimental
model mimicking the human and canine
Soto, M., Quijada, L., Alonso, C. and Requena, J.M. (2000). Histone synthesis
in Leishmania infantum is tightly linked to DNA replication by a translational
control. Biochem. J. 346, 99-105
VL infections.
Boceta, C., Alonso, C. and Jimenez-Ruiz, A. (2000). Leucine rich repeats are
the main epitopes in Leishmania infantum PSA during canine and human
visceral leishmaniasis. Parasite Immunol. 22, 55-62
Marañon, C., Thomas, M.C., Puerta, C., Alonso, C. and Lopez, M.C. (2000).
The stability and maturation of the H2A histone mRNAs from Trypanosoma
cruzi are implicated in their post-transcriptional regulation. Biochim. Biophys.
Acta. 1490, 1-10
Perez-Perez; J., Fernandez-Caldas, E., Marañón, F., Sastre, J., Lluch-Bernal,
M., Rodriguez, J. and Alonso, C. (2000). Molecular Cloning of Paramyosin, a
new allergen of Anisakis simplex. Allergy Immunol. 642, 1-10
Requena, J.M., Alonso, C. and Soto, M. (2000). Evolutionarily conserved
proteins as prominent immunogens during Leishmania infections. Parasitol.
Today 16, 246-250
Quijada, L., Soto, M., Alonso, C. and Requena, J.M. (2000). Identification of
a putative regulatory element in the 3’-untranslated region that controls
expression of HSP70 in Leishmania infantum. Mol. Biochem. Parasitol. 110,
79-91
Olivares, M., Thomas, M.C., López-Barajas, A., Requena, J.M., García-Pérez,
J.L., Angel, S., Alonso, C. and López, M.C. (2000). Genomic clustering of the
Trypanosoma cruzi nonlong terminal L1Tc retrotransposon with defined
interspersed repeated DNA elements. Electrophoresis 21, 2973-2982
Larreta, R., Soto, M., Alonso, C. and Requena, J.M. (2000). Leishmania
infantum: gene cloning of the GRP94 homologue, its expression as
recombinant protein, and analysis of antigenicity. Exp. Parasitol. 96, 108-115
Hamster macophage infected by L. Infantum (Giemsa staining)
Soto, M., Alonso, C. and Requena, J.M. (2000). The Leishmania infantum
acidic ribosomal protein LiP2a induces a prominent humoral response in vivo
and stimulates cell proliferation in vitro and interferon-gamma (IFN-)
production by murine splenocytes. Clin. Exp. Immunol. 122, 212-218
Requena, J.M., Soto, M., Doria, M.D. and Alonso, C. (2000). Immune and
clinical parameters associated with Leishmania infantum infection in the
golden hamster model. Vet. Immunol. Immunopathol. 76, 269-281
89
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.2
Expresión génica en linfocitos T humanos
Resumen de Investigación
Jefe de Línea / Group Leader:
Miguel A. Alonso
Becarios Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Jaime Millán
Susana Guerra (desde 1-7-00)
Fernando Martín (desde 1-9-00)
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Rosa Puertollano (hasta 1-9-99)
Fernando Martín-Belmonte
María del Carmen de Marco
Alicia Batista (desde 1-4-99)
Estudiante de la Escuela Taller/
Workshop School Student
Sergio Gómez (desde 1-6-2000)
La compartimentalización de las
membranas celulares en microdominios o
balsas (“rafts”) es un nuevo concepto en
biología. A diferencia de la mayor parte de
las membranas celulares, que están
constituidas fundamentalmente por
fosfolípidos y empaquetadas de una
manera desordenada, los microdominios
de membrana enriquecidos en glicolípidos
y colesterol (GEM) parecen adoptar una
estructura más ordenada. La captación
selectiva de proteínas en el Golgi en este
tipo de balsas fue propuesta inicialmente
como modelo para explicar la segregación
y posterior transporte de proteínas de
nueva síntesis a la superficie apical de las
células epiteliales polarizadas. Mas
recientemente, este modelo ha sido
extendido como un mecanismo general
para el reclutamiento específico de
proteínas implicadas en otros procesos
celulares.
El proteolipido MAL, una proteína integral
de membrana expresada de forma
diferencial durante la ontogenia de los
linfocitos T, se expresa también en células
formadoras de mielina y en células
epiteliales polarizadas. En todos estos
tipos celulares la proteína MAL ha sido
identificada como un componente de los
microdominios ricos en glicolípidos y
colesterol. Uno de los logros más
sobresalientes de nuestro grupo en los
últimos años ha sido la demostración del
papel de MAL como un componente
esencial de la maquinaria integral de
proteínas implicada en el transporte apical
de células epiteliales polarizadas MDCK y
FRT. Teniendo en cuenta este papel
central de MAL en el transporte apical, y la
existencia de una familia de proteínas, la
90
“familia MAL de proteolípidos”,
relacionada con MAL, nuestros objetivos
presentes son: 1) el esclarecimiento del
mecanismo por el que MAL promueve el
transporte apical en células epiteliales
polarizadas, 2) la identificación en
linfocitos T de rutas de transporte
semejantes a la mediada por MAL en
células epiteliales, y 3) la caracterización
bioquímica y funcional de nuevos
miembros de la familia MAL de
proteolípidos que pudieran desempeñar
también un papel como maquinaria de los
microdominios ricos en glicolípidos y
colesterol en otros procesos celulares.
Gene expression in human T lymphocytes
Publicaciones/Publications:
Research summary
The compartmentation of cellular
membranes in microdomains or rafts is
an emerging concept in cell biology.
Unlike the bulk of membranes, which
are enriched in phospholipids and
packed in a disordered state, glycolipid
and cholesterol-enriched membrane
(GEM) rafts appear to be packed in a
liquid-ordered state. Recruitment of
specific proteins into GEM rafts in the
Golgi was initially proposed to explain
the segregation and subsequent
transport of newly synthesized apical
proteins in polarized epithelial cells,
and more recently has been extended
as a general mechanism to
concentrate specific proteins for
processes such as intracellular protein
transport and signaling.
central role of MAL in apical transport
and the existence of a family of
proteins, the “MAL proteolipid family”,
highly related to MAL, our current
objectives are: 1) the elucidation of the
molecular mechanism by which MAL
promotes apical transport in epithelial
cells, 2) the identification in T cells of
GEM raft-mediated pathways of
transport reminiscent of that of apical
transport in polarized epithelial cells,
and 3) the biochemical and functional
characterization of novel members of
the MAL proteolipid family which,
similar to MAL, might play a role as
machinery for cellular processes
mediated by GEM rafts.
Puertollano, R., Martín-Belmonte, F., Millán, J., de
Marco, M. C., Albar, J. P., Kremer, L., and Alonso, M. A.
(1999) The MAL proteolipid is necessary for normal
apical transport and accurate sorting of the influenza
virus hemagglutinin in Madin-Darby canine kidney
cells. J. Cell Biol. 145, 141-151.
Puertollano, R., and Alonso, M. A. (1999) MAL, an
integral element of the apical sorting machinery, is an
itinerant protein that cycles between the trans-Golgi
network and the plasma membrane. Mol. Biol. Cell 10,
3435-3477.
Copie-Bergman, C., Gaulard, P., Maouche-Chrétien,
L., Brière, J., Alonso, M. A. Roméo, P.-H., and Leroy, K.
(1999) The MAL gene is expressed in primary
mediastinal large B-cell lymphoma. Blood 94, 35673575.
Puertollano, R., and Alonso, M. A. (1999) Substitution
of the two carboxyl-terminal serines by alanine causes
retention of MAL, a component of the apical sorting
machinery, in the endoplasmic reticulum. Biochem.
Biophys. Res. Commun. 260, 188-192.
Luque, C. M., Lallena, M.-J., Pérez-Ferreiro, C. M., de
Isidro, Y., de Cárcer, G., Alonso, M. A. and Correas, I.
(1999) The N-terminal 209-aa domain of high
molecular weight 4.1R isoforms abrogates 4.1R
targeting to the nucleus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,
The MAL proteolipid is a 17-kDa
integral membrane protein, initially
identified in our laboratory as a protein
specifically expressed during T cell
differentiation, is expressed also in
myelin-forming cells and epithelial
polarized cells. In all these cell types,
MAL has been found to be selectively
present in GEM rafts. One of the major
achievements of our group in the last
two years has been the identification of
the MAL proteolipid as an essential
component of the integral protein
machinery for raft-mediated apical
transport in epithelial renal MDCK and
thyroid FRT cells. Keeping in mind this
14925-14930.
Puertollano, R., Menéndez, M., and Alonso M. A.
(1999) Incorporation of MAL, an integral protein
element of the machinery for the glycolipid and
cholesterol-mediated apical pathway of transport, into
artificial membranes requires neither of these lipid
species. Biochem. Biophys. Res. Commun. 266, 330333.
Martín-Belmonte, F., López-Guerrero, J. A., Carrasco,
L., and Alonso, M. A. (2000) The amino-terminal nine
amino acid sequence of poliovirus capsid VP4 protein
is sufficient to confer N-myristoylation and targeting to
detergent-insoluble membranes. Biochemistry 39,
1083-1090.
Martín-Belmonte, F., Alonso, M.A., Zhang,, X., and
Arvan, P. (2000) Thyroglobulin is selected as luminal
cargo protein for apical transport via detergentresistant membranes in epithelial cells. J. Biol. Chem.
275, 41074-41081.
Martín-Belmonte, F., Puertollano, R., Millán, J., and
Alonso, M.A. (2000) The MAL proteolipid is necessary
for the overall apical delivery of membrane proteins in
the polarized epithelial Madin-Darby canine kidney and
Fischer Rat thyroid cell lines. Mol. Biol. Cell 11, 20332045.
Tesis Doctorales/Doctoral Theses
Rosa Puertollano Moro: “El Proteolípido MAL como
Componente de la Maquinaria de Transporte Apical de
Células
Epiteliales
Polarizadas”.
Universidad
Autónoma de Madrid. 1999. Sobresaliente cum laude.
91
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.3
Biología molecular de microorganismos
extremofilos
Resumen de Investigación
chaperonas de haloarqueas.
Jefe de Línea/Group Leader:
Ricardo Amils
- Caracterización estructural y funcional de
El grupo de Biología Molecular de
extremófilos posee distintas líneas de
- Metanogénesis: tratamiento anaerobio de
Personal Científico / Scientific
investigación, cuyos objetivos principales
aguas contaminadas, con especial énfasis
Personnel
se resumen a continuación:
en la caracterización de inhibidores del
Irma Marín, Francisco Santamaría;
proceso y en la degradación de compuestos
José Luis Sanz
- Biohidrometalurgia: ecología, biología
recalcitrantes en condiciones anaerobias.
Becarios Posdoctorales /
molecular y biotecnología de
Posdoctoral Fellows:
microorganismos que se desarrollan en
- Cambios en la expresión global de genes
Consuelo Durán, Angéles Aguilera,
Felipe Gomez*
ambientes acidófilos, con especial énfasis
de dinoflagelados nocivos sometidos al
en los aspectos aplicados de los mismos
stress de fosfato: a) identificación y
(biominería, biodesulfuración de carbones,
clonación de proteínas relacionadas con la
secuestro específico de metales,
producción de toxinas PSP por diferentes
especies del género Alexandrium, y b)
Becarios Predoctorales / Graduate
Students:
Elena González-Toril,
fitorremediación)
desarrollo de kits para la deteccion de
Elayne Culubret,
Patricia Rojas,
- Ecología microbiana de ambientes
Enrique Marín,
extremos terrestres como modelos de vida
Javier Chichón,
Eva Lospitao
Emiliano Díaz,
Moustafa Malki
de interés astrobiológico: geomicrobiología
Raquel Mesa,
Juan Francisco Morales,
toxinas diarreicas (DSP) contaminates de
alimentos de origen marino.
del Río Tinto y de las lagunas hipersalinas
de la Mancha (en colaboración con el Centro
- Sistemas enzimáticos en el control de
de Astrobiología).
hongos fitopatogénicos.
Técnicos de Investigación/
Technical Assistance:
Nuría Rodriguez*,
dinoflagelados toxicos productores de
- Funciotipo: estudio de la evolución
funcional del ribosoma utilizando inhibidores
de la traducción con distinta especificidad.
Raquel García
Científicos Visitantes/ Visiting
Scientists:
Antonio Lazcano (U. Autónoma de
Mexico),
Ana Mª Amaro (U. de Chile), Violaine
Bonnefoy (CNRS Marsella),
Linda Amaral Zettler (Marine Biological
Laboratories, Woods Hole),
Erik Zettler (Marine Biological
Laboratories, Woods Hole).
*Miembros del Centro de Astrobiología
(CAB)
92
Molecular biology of extremophilic
microorganisms
Research summary
Publicaciones/Publications:
chaperons.
D. Cid, R. Sanz, I. Marín, H. de Greve, J.A. Ruiz Santa
Quiteria, R. Amils, R. de la Fuente. (1999) Characterization
of nonenterotoxigenic Escherichia coli strains producing
F17 fimbriae isolated from diarrheic lambs and goat kids.
J. Clin. Microbiol, 37: 1370-1375.
- Methanogenesis: anaerobic
A.I. López-Archilla, R. Amils (1999) A comparative
ecological study of two acidic rivers in Southwestern
Spain. Microb. Ecol, 38: 146-156.
- Structural and functional
characterization of haloarchaeal
The Extremophiles group has different
research projects in which the main
objectives are the following:
wastewater treatment with special
- Biohydrometallurgy: ecology, molecular
biology and biotechnology of acidophilic
microorganisms, with special emphasis
in their applied potential (biomining, coal
emphasis in the characterization of
inhibitors of the process and the
degradation of recalcitrant compounds
in anaerobic conditions.
biodesulfurization, specific heavy metal
sequestering, fitoremediation).
- Changes in the global expression of
genes from toxic dinoflagellates under
- Microbial ecology of terrestrial extreme
environments as models of
astrobiological interest:
greomicrobiology of the Tinto River and
hypersaline ponds from la Mancha (in
colaboration with the Centro de
Astrobiología).
- Functiotype: ribosomal functional
evolution using translational inhibitors
phosphate stress: a) identification and
M. Navarrete, N. Rodríguez, R. Amils, J.L. Sanz (1999)
Effect of 1,1,2,2-tetrachloroethane on the performance
of upflow anaerobic sludge bed (UASB) reactors. Wat.
Sci. Tech., 40: 153-159.
A. Sanhueza, I.J. Ferrer, T. Vargas, R. Amils, C. Sánchez
(1999) Attachment of Thiobacillus ferrooxidans on synthetic
pyrite of varying structural and electronic properties.
Hydromet., 51: 115-129.
C. Durán, I. Marín, R. Amils (1999) Specific metal
sequestering acidophilic fungi. En “Biohydrometallurgy
and the Environment toward the Mining of the 21st century”,
vol B, R. Amils y A. Ballester (eds.), Elsevier, Amsterdam,
pp. 521-530.
cloning of the proteins related with the
production of PSP by different species
of the genus Alexandrium, and b)
development of kits for the detection of
E. González-Toril, F. Gómez, N. Irazabal, R. Amils, I.
Marín (1999) Comparative genome characterization of
iron oxidizing bacteria isolated from the Tinto River. En
“Biohydrometallurgy and the Environment toward the
Mining of the 21st century”, vol B, R. Amils y A. Ballester
(eds.), Elsevier, Amsterdam, pp. 149-157.
toxic dinoflagelates responsible of DSP
V. E. Buckwold, M. Alvarado, R. Mesa, R. Amils (1999)
A method for the determination of the pH optima of
proteases using unexposed photographic film. Anal.
Biochem., 267: 420-421.
in sea food.
- Enzymatic systems involve in the
control of fitopathogenic fungi.
with different specificity.
F. Gómez, R. Amils, I. Marín (1999) Bioremoval of organic
and inorganic sulphur from coal samples. Appl. Microbiol.
Biotechnol., 52: 118-121.
C. Rodríguez-Fonseca, H. Phan, K.S. Long, B.T. Porse,
S.V. Kirilov, R. Amils, R. Garret. (2000)
Puromycin-rRNA interactions sites at the peptidyl
transferase center. RNA, &: 744-754.
C. Briones, R. Amils. (2000) Nucleotide sequence of the
23S rRNA from Haloferx mediterranei and phylogenetic
analysis of halophilic Archaea based on LSU rRNA. Syst.
Appl. Microbiol., 23: 124-131.
R. Sanz, I. Marín, J.A. Ruiz-Santa-Quiteria, J.A. Orden,
D. Cid, R.M. Diez, K.S. Silhadi, R. Amils, R. de la Fuente.
(2000) Catalase deficiency in Staphylococcus aureus
subsp. anaerobius is associated with natural loss-offunction mutations within the structural gene. Microbiol.,
146: 465-475.
J.L. Sanz, N. Rodriguez, J. Ferrer, A. Moreno, J.L. Berna
(2000) Evaluation of the inhibition potential of linear
alkylbenzene sulfonate (LAS) to the methanogenic
process. The Clear View, 6: 26-30.
R. Amils (2000) Impacto de la biotecnología en el medio
ambiente. En “Bioética 2000”, M. Palacios (ed.), Ediciones
Nobel, Oviedo, pp. 387-403.
E. González-Toril, F. Gómez, R. Amils (2000) Biodiversidad
en condiciones extremas de acidez y metales pesados:
el caso del río Tinto. Actualidad Tecnológica Ibérica, 463464.
E.N. Culubret, M. Luz, R. Amils, J.L. Sanz (2000)
Biodegradation of 1,1,1,2-tetrachloroethane under
methanogenic conditions. En “VI Latin-american Workshop
Wastewater anaerobic treatment”, pp. 215-220.
Tesis Doctorales/Doctoral theses
Patricia Rojas. “Tratamiento y post-tratamiento de
efluentes ganaderos”, U. Autónoma de Madrid, septiembre
2000, Apto cum laude.
93
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.4
Mantenimiento y variabilidad del genoma:
enzimología de la reparación de DNA.
Resumen de Investigación
su analogía funcional con la Pol beta,
Jefe de Línea/Group Leader:
Luis Blanco Dávila
El interés de nuestra línea de investigación
se centra actualmente en la identificación
de nuevas DNA polimerasas de reparación
Becarios Posdoctorales /
Posdoctoral Fellows:
Orlando Domínguez López (hasta Enero
2000)
Tomas Kirchhoff
Esther García Palomero (desde Julio
2000)
Rosario Sabariegos Jareño (desde Julio
2000)
de DNA en mamíferos, cuyo papel podría
ser muy relevante tanto para el
mantenimiento de la estabilidad genómica,
como para proporcionar un cierto grado de
de DNA. Estamos estudiando alteraciones
de expresión y polimorfismos de la Pol
lambda humana que pudieran tener relación
con el desarrollo de determinados tumores.
La Pol mu, 42% idéntica (aminoácidos) a
la TdT, es una DNA polimerasa de muy baja
contribución a incrementar el fenotipo
fidelidad de copia (mutador), capaz de
mutador que se haya asociado a una gran
introducir un elevado número de
mayoría de procesos tumorales.
mutaciones, tanto "in vitro" como "in vivo".
El análisis de expresión de la Pol µ sugiere
En nuestro laboratorio hemos identificado
dos nuevas DNA polimerasas eucarióticas,
homólogas a la Pol beta, implicada
nuclear (ver figura).
José Ruiz Pérez
El análisis de expresión de la Pol lambda,
tanto murina como humana, sugiere su
participación específica en células
Estudiantes / Students:
compatibles con una función en reparación
de antígeno, pero indeseable en su
específicamente en la reparación del DNA
Miguel García Díaz
y relativa fidelidad de inserción, ambas
genes como en el caso de los receptores
pertenecen al grupo de DNA polimerasas
Students:
compartiendo propiedades de distributividad
variabilidad, necesario en determinados
denominadas Pol lambda y Pol mu, que
Becarios Predoctorales / Graduate
humana expresada en E. coli demuestra
germinales, en reparación de DNA asociada
a la meiosis, y un papel mas general en
Josana Rodríguez Sánchez (hasta
células somáticas, en la reparación de
Septiembre 2000)
dobles roturas en la cadena de DNA. El
análisis bioquímico de la Pol lambda
Raquel Juárez Santos (desde
Septiembre 2000)
94
su participación específica en el proceso
de hipermutación somática de los genes
de inmunoglobulinas. Estamos analizando
la contribución de la Pol mu al desarrollo
de los linfomas B en los que el proceso de
hipermutación somática está activo.
Genome maintenance and variability:
enzymology of DNA repair.
Research summary
polymorphisms associated to human
Pol lambda potentially related with
Our reserach interest is the identification
involved in DNA repair and variability.
Pol mu shares 41% amino acid identity
These novel enzymes are predicted to
with terminal transferase (TdT). Our
be relevant to maintain the equilibrium
biochemical analyses demonstrated that
between genome stability and the levels
Pol mu is an error-prone DNA
of variability required, not only for
polymerase that behaves as a strong
evolution, but also for the normal
DNA mutator, both in vitro and in vivo.
function of specific genes. Moreover,
Expression analysis suggest that Pol
disregulation of these enzymes could
mu plays a specific role in somatic
be responsible for the mutator phenotype
hypermutation of inmunoglobulin genes.
associated to carcinogenesis.
We are analyzing the contribution of Pol
mu to the development of those B-cell
DNA polymerases named Pol lambda
and Pol mu, that belong to the DNA
V. Truniger, L. Blanco and M. Salas (1999) Role of
the "YxGG/A" motif of ø29 DNA polymerase in
protein-primed replication. J. Mol. Biol., 286, 57-69.
tumorogenesis, are being studied.
of novel mammalian DNA polymerases
We have identified two novel eukaryotic
Publicaciones/Publications:
lymphomas that are constitutively
hypermutating their inmunoglobulin
genes.
B. Illana, J.M. Lázaro, C. Gutiérrez, W.J.J. Meijer,
L. Blanco and M. Salas (1999) Phage ø29 terminal
protein residues Asn80 and Tyr82 are recognition
elements of the replication origins. J. Biol. Chem.
274, 15073-15079.
A. Bonnin, J.M. Lázaro, L. Blanco and M. Salas
(1999) A single tyrosine prevents insertion of
ribonucleotides in the eukaryotic-type ø29 DNA
polymerase. J. Mol. Biol. 290, 241-251.
M. de Vega, L. Blanco and M. Salas (1999)
Processive proofreading and spatial relationship
between polymerase and exonuclease active sites
of bacteriophage ø29 DNA polymerase. J. Mol. Biol.
292, 39-51.
V. Truniger, L. Blanco and M. Salas (2000) Analysis
of ø29 DNA polymerase by partial protelysis: Binding
of terminal protein in the double-stranded DNA
channel. J. Mol. Biol. 295, 441-453.I.
E. Dufour, J. Méndez, J.M. Lázaro, M. de Vega, L.
Blanco and M. Salas (2000) An aspartic acid residue
in TPR-1, a specific region of protein-priming DNA
polymerases, is required for the functional interaction
with primer terminal protein. J. Mol. Biol. 304, 289300.
polymerase family X, whose paradigm
is Pol beta, a polymerase specifically
involved in nuclear DNA repair (see
figure).
O. Domínguez, J.F. Ruiz, M. García-Díaz, M. Laín,
M. González, C. Martínez-A., A. Bernad and L.
Blanco (2000) DNA polymerase mu (Pol
µ,homologous to TdT, could act as a DNA mutator
in eukaryotic cells. The EMBO J. 19, 1731-1742.
Expression analysis of both murine and
human Pol lambda indicated its specific
participation in DNA repair associated
to meiosis, together with a more general
M. García-Díaz, O. Domínguez, L.A. LópezFernández, T. Laín de Lera, M.L. Saníger, F.J. Ruiz,
M. Párraga, M.J. García, T. Kirchhoff, J. del Mazo,
A. Bernad and L. Blanco (2000) DNA polymerase
lambda (Pol ?), a novel eukaryotic DNA polymerase
with a potential role in meiosis. J. Mol. Biol. 301,
851-867.
role in double-strand break DNA repair
in somatic cells. Biochemical analysis
of Pol lambda demonstrated its functional
analogy to Pol beta, sharing similar
properties and base-discrimination
parameters that are compatible with its
function in DNA repair. Alterations of
Patentes/Patents
expression and single-nucleotide
Título: "DNA polimerasa lambda, un nuevo marcador
tumoral”.
Inventores (p.o. de firma): Luis Blanco, Antonio
Bernad, Orlando Domínguez y Miguel García-Díaz.
Nº de solicitud: P9902169. País de prioridad:
España. Fecha de prioridad: 8 de Octubre de 1999.
Entidad titular: CSIC. International patent
application No: PCT/GB00/03784.
Título: "DNA polimerasa mu (Pol µ), una DNA
polimerasa mutadora”. Inventores (p.o. de firma):
Luis Blanco. N.º de solicitud: P200000517. País
de prioridad: España. Fecha de prioridad: 3 de
Marzo de 2000. Entidad titular: CSIC.
La familia X de DNA polimerasa humanas. Los cuatro DNA polimerasas presentas cuatro subdominios denominados:
“8 kDa”, “dedos” (F), “palma” (P), “pulgar” (T), que se indican en verde, amarillo, rojo y magenta, respectivamente.
Además, las DNA polimerasas Pol lambda, Pol mu y TdT comparten un dominio adicional, denominado BRCT (indicado
en azul) que probablemente juega un papel regulador. La porción equivalente a la Pol beta (core) se encuadra sobre
fondo oscuro. Las barras blancas indican secuencias adicionales en los distintos subdominios.
The Pol X family of DNA polymerases. All members have the same four subdomains, named: “8 kDa”, “fingers” (F),
“palm” (P) and “thumb” (T), indicated in green, yellow, red and magenta, respectively. Additionally, Pol lambda, Pol mu
and TdT also share an additional subdomain, named BRCT (shown in blue), that likely has a regulatory role. The generally
conserved Pol β core is shown as a dark box. The presense of additional sequences is indicates by the white bars.
95
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.5
Estructura y función del ribosoma
Resumen de investigación
traducción es regulada por la composición
Jefe de Línea / Group leader:
Juan Pedro García Ballesta
Papel del Tallo Ribosómico y del Centro
GTPasa como Reguladores de la
Personal Científico / Scientific Staff:
C.- Caracterización de mRNAs cuya
Traducción en S.cerevisiae.
del tallo ribosómico. Se utilizan cepas
mutantes con alteraciones en el tallo y
técnicas de microarrays y de proteómica.
Miguel Remacha
Técnico de investigación / Technical
A.- Estudio de la dinámica de las
Assistance:
interacciones entre los diferentes
Mari Carmen Fernández Moyano
componentes del tallo, (P0, P1α, P1β, P2α,
P2β, L12) y de ellos con los factores del
Becarios Postdoctorales / Postdoctoral Fellows:
Cruz Santos, Gretel Nusspaumer,
Esther Guarinos
Becarios Predoctorales / Graduate
sobrenadante y con compuestos inhibidores.
D.- Regulación de la síntesis y ensamblaje
del tallo ribosómico. Se ha identificado un
mecanismo que implica degradación por
proteasas especificas que se intentan
identificar.
Se usan técnicas de puenteo químico,
espectroscopía de fluorescencia clásica
(colaboración con Dr. J. Jameson, Univ.
Análisis del genoma de S. cerevisiae
(dirigido por M. Remacha).
Hawaii), de fluorescencia de dos fotones
Students:
(colaboración con Dr. Gratton Univ, Illinois).
Sonia Zúñiga, Pilar Parada, Patricia
González Santamaría, Jorge Pérez
Se realizan en paralelo estudios con
Aspergillus fumigatus para entender su
Fernández, De-yi Qiu, Alberto García
resistencia a antifúngicos inhibidores del
Marcos
centro GTPasa
Completado el análisis sistemático, donde
se generaron deleciones en 30 genes, se
ha profundizado en la función de dos de
ellos. Ydl097c es una proteína esencial,
constituyente del proteasoma. Su ausencia
produce un arresto en G2/M por un defecto
Científicos Visitantes / Visiting
Scientists:
B.- Caracterización de los tres dominios
celular en la degradación de ciclinas.
David Jameson (30 dias), Dept.
funcionales de la proteína P0.
Ydl100p es una proteína periférica de
membrana implicada en homeostasis de
Biología Molecular, Univ. de Hawaii,
USA
M. Helms (30 dias), Dept. Biología
Molecular, Univ. de Hawaii.
La proteína P0 es el componente central
del tallo ribosómico desempeñando
Dra. Sophia Kouyanou, (30 dias) Dept.
simultáneamente tres funciones esenciales:
Biología, Universidad de Atenas
1.- Se une el RNA en el centro GTPasa; 2.Forma un complejo con las proteínas P1
y P2; 3.- Interacciona con los factores
solubles. Se están caracterizando funcional
y estructuralmente los dominios
responsables de cada una de estas
funciones. Se utilizan técnicas de genética
y biología molecular (deleciones,
mutaciones puntuales, etc) y bioquímicas
(doble híbrido, cambio de movilidad de
bandas en gel, etc).
96
metales. En el caso de zinc, su localización
celular depende de la presencia/ausencia
de metal, regulando la endocitosis del
receptor de alta afinidad Zrt1.
Structure and function of the ribosome
Publicaciones/Publications:
Research Summary
Role of the ribosomal stalk and the
GTPase center as translation regulators
in S. Cerevisiae.
C.- Ribosomal stalk-dependent
M.E. Gagou, M.A. Rodriguez-Gabriel, Ballesta, J.P.G. and Kouyanou,
translational regulation. Characterization
S. (1999) Isolation and expression of genes encoding the acidic
of mRNAs whose translation is affected
ribosomal phosphoproteins P1 and P2 of the medfly Ceratitis capitata.
by the ribosomal stalk composition using
stalks mutant strains with microarrays
phenotypic analysis of the deletants. Yeast 15, 945-953.
A.- Dynamic of interactions among the
P2α, P2β, L12) and the supernatant
factors, and effect of inhibitors. Chemical
cross-linkig, classic fluorescence
spectroscopy (in collaboration with D. J.
Jameson , Univ. of Hawaii) as well as
S. Zúñiga, J. Boskovic, A. Jimenez, J.P.G. Ballesta, M. Remacha
(1999) Disruption of six Saccharomyces cerevisiae novel genes and
and proteomic techniques.
different stalk components (P0, P1α, P1β,
Gene, 226, 365-373.
M.A. Rodriguez-Gabriel, G. Bou, E. Briones, R. Zambrano, M.
D.- Regulation of the synthesis and
Remacha, and J.P.G. Ballesta (1999) Structure and function of the
assembly of the ribosomal stalk. We have
stalk, a putative regulatory element of the yeast ribosome. Role of
studying in detail a recently found
stalk protein phosphorylation. Folia Microbiol. 44, 153-163.
regulatory mechanisms that differentially
R. Zambrano, E. Briones, J. Avila and J.P.G. Ballesta (1999)
control stalk components by degradation
Phosphorylation of P1 serine inhibits peptide bond sensitivity to
Staphylococcus aureus V8 protease. Arch. Biochem. Biophys. 368,
with specific proteases.
207-209.
two-photons flourescence (in
J.P.G. Ballesta, M.A. Rodriguez-Gabriel, G. Bou, E. Briones, R.
collaboration with Dr. E, Gratton, Univ, of
Analysis of the S. cerevisiae genome.
Zambrano, M. Remacha (1999) Phosphorylation of yeast ribosomal
Illinois) are being used. Similar parallel
(Directed by M. Remacha)
stalk. Functional effects and enzymes involved in the process FEMS
Microbiol. Lett. 23, 537-550.
studies are being carried out using
Aspergillus fumigatus, trying to understand
A systematic analysis by gene deletion
its resistance to antifungals that inhibit
of 30 genes was completed. Two of them,
the ribosomal GTPase Center.
Ydl097c and Ydl100p, have been studied
S. Zúñiga, J. Boskovic, J.M. Garcia-Cantalejo, A. Jimenez, J.P.G.
Ballesta, M. Remacha (1999) Deletion of 24 open reading frames
from chromosome XI from Saccharomyces cerevisiae and phenotypic
analysis of the deletants. Gene, 233, 141-150.
in more detail. Ydl097c encodes an
M.A. Rodriguez-Gabriel, M. Remacha, y J.P.G.Ballesta (2000) The
B.- Characterization of the three functional
essential proteasomal protein whose
domains in the ribosomal stalk protein
deletion causes a G2/M cell arrest due
highly conserved in ribosomal protein P0 J. Biol. Chem. 275, 2130-
P0.
to a deffect in cyclin degradation.
2136.
Ydlo100p is a peripheral membrane
G. Bou, M. Remacha y J.P.G. Ballesta (2000) Ribosomal stalk
Protein P0 is the central component of
protein involved in metal homeostasis. In
protein phosphorylating activities in Saccharomyces cerevisiae. Arch.
the case of Zn, the metal directs its cellular
Biochem. Biophys. 375, 83-89.
the ribosomal stalk and carries out three
essential functions: 1.- Binds to rRNA at
location by regulating the high affinity
M.E. Gagou, M.A. Rodriguez-Gabriel, J.P.G. Ballesta, S. Kjouyanou
the GTPase center; 2.- Forms a complex
receptor Zrt1 endocytosis.
(2000) The ribosomal P-proteins of the merfly Ceratitis capitata form
RNA interacting domain but not the protein interacting domain is
a heterogenous stalk structure interacting with the endogenous P-
with proteins P1 and P2; 3.- Interacts with
proteins, in conditional P0-null strains of the yeast Saccharomyces
the supernatnat factors. We are
cerevisiae Nucleic Acid Res. 28, 736-743
functionally and structurally characterizing
M. Gómez-Lorenzo, C.M.T. Spahn, R.K. Agrawal, R.A. Grassucci,
the protein domains involved in each one
P. Penczek, K. Chakraburtty, J.P.G. Ballesta, J.L. Lavandera, J.F.
of these functions using genetic and
Garcia-Bustos, J. Frank (2000) Threre-dimensional cryo-localization
of EF2 in the Saccharomyces cerevisiae 80S ribosome at 17.5Å
molecular biology approaches (deletions,
resolution. EMBO J. 19, 2710-2718.
site directed mutations, ect) as well as
J. Zurdo, P. Parada, A. van den Berg, G. Nusspaumer, A. Jimenez-
biochemical techniques (two-hybrids, gel
Diaz, M. Remacha, J.P.G. Ballesta (2000) Assembly of
band-shifts, etc).
Saccharomyces cerevisiae stalk: Binding of P1 proteins is required
for the interaction of P2 proteins. Biochemistry 39, 8929-8934.
Tesis Doctorales/Doctoral theses
J. Zurdo, C. Gonzalez, J.M. Sanz, M. Rico, M. Remacha, J.P.G.
El tallo ribosómico de S. cerevisiae. Estudio estructural
Ballesta (2000) Structural differences between Saccharomyces
y funcional. Esther Guarinos Viñals, 1999, Universidad
cerevisiae ribosomal protein P1 and P2 support their functional
Autonóma de Madrid, Sobresaliente cum laude
diversity. Biochemistry 39, 8935-8943.
G. Nusspaumer, M. Remacha and J.P.G. Ballesta (2000)
Control de la expresión de las proteínas ribosómicas
P1/P2 en S. cerevisiae. Gretel Nusspaumer da Costa,
1999, Universidad Autónoma de Madrid, Sobresaliente
Phosphorylation and N-end region of the yeast ribosomnal prtoein
P1 mediate its degradation, which is prevented by protein P2 EMBO
J. 19, 6075-6084.
cum laude.
C. Briones and J.P.G. Ballesta (2000) Conformational changes
Análisis funcional de seis ORFs de Saccharomyces
induced in the S. cerevisiae GTPase associated RNA by ribosomal
cerevisiae. Implicación de YDL100c en la homeostasis
stalk components and a translocation inhibitor. Nucleic Acid Res.
de metales. Sonia Zúñiga Lucas. 2000, Universidad
28, 4497-4505.
Autonóma de Madrid, Sobresaliente cum laude.
97
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.6
Síntesis de proteínas y su regulación en
eucariontes
Resumen de Investigación
reconocimiento y unión del mRNA al
Jefe de Línea / Group Leader:
César de Haro, José M. Sierra
Proteínas implicadas en el
Control de la traducción por las eIF-2α
quinasas
ribosoma durante la iniciación de la
traducción y su papel en el desarrollo y
crecimiento celular.
Becarios Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Juan José Berlanga
Cuatro proteínas quinasas diferentes
regulan la traducción en células eucarióticas
Becarios Predoctorales / Graduate
fosforilando el eIF2α en el residuo Ser-51.
Students:
Estas son, el inhibidor regulado por hemina
Mónica Elías, Greco Hernández (hasta
(HRI); la proteína quinasa dependiente de
31-Agosto-1999), Saturnino Herrero,
RNA (PKR); la proteína quinasa del retículo
Natalia Pomar
Técnico de Investigación /
Technical Assistance:
José Alcalde
endoplásmico (PERK) y el GCN2. Estas
proteínas quinasas se activan por distintos
estímulos, a saber: el HRI, por deficiencia
de hemina: la PKR, por RNA de doble
cadena; la PERK, por estrés del retículo
endoplásmico y el GCN2 de S. cerevisiae,
por limitación de aminoácidos. Previamente,
nosotros clonamos el homólogo del GCN2
de embriones de Drosophila (DGCN2) y
demostramos que su expresión está
regulada durante el desarrollo. Ahora,
hemos continuado la búsqueda de nuevos
miembros de esta familia de proteínas
quinasas. Hemos identificado el primer
homólogo del GCN2 en mamíferos
(MGCN2). La escasez de suero aumenta
la fosforilación del eIF-2α en células 293T
humanas transfectadas con MGCN2.
Hemos clonado la PERK de embriones de
Drosophila y su expresión también está
regulada durante el desarrollo y además,
su actividad en células S2 es sensible a
estrés del retículo endoplásmico.
Finalmente, hemos caracterizado los dos
primeros genes que codifican por una nueva
subfamilia de eIF-2α quinazas en
Schizosaccharomyces pombe (SEK1 y
Las proteínas eIF (eukaryotic initiation factor)
4E, eIF4G, eIF4A y eIF4B forman parte de
un complejo proteico implicado en el
reconocimiento y unión del mRNA al
ribosoma. Resultados previos de nuestro
laboratorio permitieron el aislamiento y
caracterización de eIF4E y eIF4G de
Drosophila, así como la clonación y
caracterización de los genes
correspondientes, iniciándose el estudio de
su expresión. Recientemente hemos
completado la clonación y expresión durante
el desarrollo de los genes eIF4A y eIF4B.
Actualmente nuestros intereses se centran
en la caracterización bioquímica de los
factores eIF4A y eIF4B de Drosophila y,
especialmente, en el posible papel de eIF4E,
eIF4G, eIF4A y eIF4B en la regulación
traduccional de genes implicados en el
desarrollo de Drosophila. Con este fin
estamos utilizando mutantes defectivos en
cada una de estas proteínas y moscas
transgénicas que las sobreexpresan en
distintas condiciones. También deseamos
detectar mRNAs cuya traducción se active
preferentemente en células en cultivo que
sobreexpresan eIF4E o eIF4G. Con estos
abordajes experimentales esperamos
identificar genes implicados en la regulación
del crecimiento celular y/o en el desarrollo
embrionario, que estén regulados a nivel
de su traducción.
SEK2). Ahora, estamos interesados en
determinar los mecanismos de regulación
y las funciones de estas nuevas eIF-2α
quinasas en el control traduccional de
proteínas reguladoras del crecimiento en
células eucarióticas.
Expresión de la PERK de Drosophila durante el desarrollo embrionario
(N. Pomar, J.J. Berlanga, S. Campuzano, and C. de Haro)
Expression of Drosophila PERK during embryonic development (N.
Pomar, J.J. Berlanga, S. Campuzano, and C. de Haro)
98
Protein synthesis and its regulation in
eukaryotes
Research Summary
Translational control by eIF-2α kinases
Publicaciones/Publications:
Proteins involved in the recognition
Berlanga, J.J., Santoyo, J., and de Haro, C. (1999)
and binding of the mRNA to the
Characterization of a mammalian homolog of the GCN2
ribosome during translation initiation
eukaryotic initiation factor 2α kinase. Eur. J. Biochem.
and their role on development and cell
growth.
265, 754-762
Four distinct protein kinases regulate
translation in eukaryotic cells by
phosphorylating eIF2α at Serine-51. There
are the heme-regulated inhibitor (HRI);
the interferon inducible RNA-dependent
kinase (PKR); the endoplasmic reticulum
(ER)-resident kinase (PERK) and the
GCN2 kinase. These kinases are
activated by distinct stimuli as follows :
HRI, by heme deficiency; PKR, by the
occurrence of double-stranded RNAs;
PERK, by ER stress and GCN2 of S.
cerevisiae by amino acid deprivation.
Previously, we cloned the GCN2 kinase
from Drosophila (DGCN2) and
demonstrated that its expression is
developmentally regulated.
We have continued with the search for
new members of this family of kinases.
We found the first mammalian GCN2
homolog (MGCN2). Serum starvation
increased eIF2α phosphorylation in
MGCN2-transfected human 293T cells.
Also, we cloned the Drosophila PERK
homolog (DPERK). Expression of DPERK
transcripts is also developmentally
regulated and the endogenous DPERK
activity from Drosophila S2 cells is
sensitive to ER stress. Finally, we have
characterized the first two genes of a new
subfamily of eIF2α kinases from
Schizosaccharomyces pombe (SEK1 and
SEK2). We are now interested in
determining which are the regulatory
mechanisms and the functions of these
novel eIF2α kinases in the translational
control of key growth regulatory proteins
in eukaryotic cells.
Muñoz, F., Martín, M. E., Manso-Tomico, J., Berlanga,
The proteins eIF (eukaryotic initiation
factor) 4E, eIF4G, eIF4A y eIF4B are part
J. J., Salinas, M., and Fando, J. L. (2000) Ischemia-
of a protein complex involved in the
induced phosphorylation of initiation factor 2 in
recognition and binding of the mRNA to
differentiated PC12 cells. Role for initiation factor 2
the ribosome. Previous results from our
phosphatase. J. Neurochem. 75, 2335-2345
laboratory led to the isolation and
characterization of eIF4E and eIF4G from
Drosophila, as well as the cloning and
characterization of the corresponding
genes, beginning the study of their
expression. Recently, we have finished
the cloning and expression during
development of the genes eIF4A and
eIF4B. At present, our aims are the
biochemical characterization of Drosophila
eIF4A and eIF4B factors and, especially,
the study of the possible role of eIF4E,
eIF4G, eIF4A y eIF4B on the translational
regulation of the genes involved in
Drosophila development. To this end, we
are using mutants lacking each of these
proteins and transgenic flies
overexpressing them at different
conditions. Also, we want to detect
mRNAs whose translation is preferentially
activated in culture cells overexpressing
eIF4E or eIF4G. Based on these
experimental approaches, we hope to
identify genes involved in cell growth
regulation and/or embryonic development
regulated at the translational level.
99
Tesis Doctorales/Doctoral theses
Greco Hernández Ramírez: “Estructura y expresión de
los genes de Drosophila de los factores de iniciación de
la traducción involucrados en la unión del mRNA al
ribosoma”. Universidad Autónoma de Madrid. 1999.
Calificación: Apto cum laude.
Saturnino Herrero: "Clonaje y caracterización de nuevas
eIF2α quinasas reguladas por hemina". Universidad
Autónoma de Madrid. 2000. Calificación : Sobresaliente
cum laude.
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.7
Expresión génica en Streptomyces y levaduras
Resumen de Investigación
Jefe de Línea / Group leader:
Antonio Jiméndez
Personal Científico /
Scientific Personnel:
María Fernández-Lobato
Becarios Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Eloísa Sanz Martínez,
Natalia Martínez Romero (hasta Junio
2000)
Becarios Predoctorales / Graduate
Students:
Juan Alva Rabanal (hasta Octubre
2000),
Teresa A. Carmona,
Dolores Marín Alberdi (hasta Julio 2000,
Irene Saugar Gómez,
Mercedes Tiemblo (hasta Julio 2000)
Tecnicos de Investigación /
Technical Assistance:
Bárbara Asunción Martín Redondo
Científicos Visitantes / Visiting
Scientists:
María Josefa Elena FernándezFernández
Se ha continuado el estudio del cluster
pur, determinante de la ruta de biosíntesis
de puromicina en Streptomyces alboniger.
El gen pur4 se ha comprobado que
participa en la ruta biosintética mediante
deleción y complementación génicas. Se
supone que su producto introduce un
grupo –NH2 en la posición 3’ de la
adenosina para dar lugar a 3’-amino-3’desoxiadenosina. De acuerdo con esto,
un mutante pur4- produce puromicina al
ser complementado por 3’-amino-3’desoxiadenosina. El gen pur6 de este
cluster determina un producto (Pur6) que
participa en esta ruta biosintética, como
se ha demostrado por deleción y
complementación génicas. Pur6 se ha
expresado en Escherichia coli, con una
solubilidad muy limitada, y en
Streptomyces lividans. Se ha demostrado
que es una sintetasa del tipo de las
péptidosintetasas no ribosómicas, ya que
lleva a cabo la unión de 3’-amino-3’desoxiadanosina y tirosina formando un
enlace amida entre los grupos 3’-amino y
carboxilo de estos dos precursores,
respectivamente. Esta reacción da lugar
al esqueleto carbonado de puromicina
(tridesmetilpuromicina). Sin embargo,
Pur6 también es capaz de realizar esta
misma unión pero utilizando N6,N6-dimetil3’-amino-3’-desoxiadenosina como
sustrato. En este caso se obtiene Odesmetilpuromicina, un intermediario que
se supone derivado de
tridesmetilpuromicina. Esta relativamente
baja especificidad no es sorprendente
100
dentro de los enzimas biosintéticos de
antibióticos. Ambas reacciones requieren
ATP y Mg2+, como es característico de las
péptidosintetasas. En relación al cluster
de biosíntesis del nucleósido A201A,
relacionado químicamente con
puromicina, de Streptomyces capreolus
se ha completado la secuenciación del
posible cluster génico a201A. Esto ha
permitido establecer una hipotética ruta
de biosíntesis de este antibiótico.
En relación a la biosíntesis de puromicina
en cultivos de S. alboniger, se ha
comprobado que el fosfato desreprime la
represión de esta biosíntesis inducida por
glucosa.
En relación a levaduras se han terminado
los proyectos EUROFAN I y II,
estudiándose la funcionalidad de una
variedad de ORFs de función
desconocida. Además se ha continuado la
preparación de levaduras industriales con
capacidad amilolítica y obtenido
organismos panaderos con este fenótipo.
Se ha estudiado la actividad del promotor
del gen SWA2 de Schwanniomyces
occidentalis en S. cerevisiae y analizado
su regulación por fuente de carbono. En la
secuencia de este promotor se han
localizado dos motivos implicados en
represión catabólica, no reconocidos por
la proteína Mig1 de S. cerevisiae. Se ha
aislado y secuenciado el gen de
Schwanniomyces occidentalis homólogo
a Mig1 de S. cerevisiae.
Gene expression in Streptomyces and yeast
Publicaciones/Publications:
Research Summary
The study of the pur cluster, which
determines the biosynthetic pathway of
the puromycin antibiotic in
Streptomyces alboniger, was continued.
Gene deletion and complementation
experiments proved that the pur4 gene
is implicated in this pathway. It was
hypothesized that the Pur4 enzyme
catalyzes the linking of a –NH2 group to
the 3’ position of adenosine to produce
3’-amino-3’-deoxyadenosine. Indeed,
cultures of a pur4- mutant produced
puromycin in the presence of 3’-amino3’-deoxyadenosine. Similarly to pur4,
the pur6 gene was shown to determine
an ezyme of the pathway. The Pur6
enzyme was expresed in Escherichia
coli as a poorly soluble His-tailed protein
and in Streptomyces lividans. It links 3’amino-3’-deoxyadenosine and tyrosine
by forming an amide bond between the
3’-amino and the carboxyl group of
these two intermediaries, respectively,
giving rise to the carbon backbone of
puromycin (tridemethylpuromycin). In
addition, Pur6 is able to perform this
bond by using N6,N6-dimethyl-3’-amino3’-deoxyadenosine as a substrate. This
renders O-demethylpuromycin, an
intermediary presumed to derive from
tridemethylpuromycin. This relatively
low specificity of Pur6 is not unfrequent
in enzymes of secondary metabolism.
Both rections require ATP and Mg2+ as
it is characteristic of non ribosomal
aminopeptidases. Therefore, it was
concluded that Pur6 pertains to this
group of enzymes.
Sequencing of the a201a cluster, which
encodes the A201A biosynthetic
pathway from Streptomyces capreolus,
L. del Pozo, L. Osaba, J. Corchero and A. Jiménez.
was completed. This has permitted to
propose a hypothetical biosynthetic
pathway for A201A. This
aminonucleoside antibiotic is chemically
related to puromycin. Indeed, a201a
manganese in Saccharomyces cerevisiae”. Yeast, 15,
contains all the genes encoding the
common biosynthetic moiety, N6,N6-
deletants”. YEAST 15, 945-953 (1999).
dimethyl-3’-amino-3’-deoxyadenosine,
between both drugs. Moreover, three of
the homologous genes (pur4, pur5 and
S. Zúñiga*, J. Boskôvic*, A. Jiménez, J. P. G. Ballesta
pur10) from S. capreolus complement
the relevant mutants from S. alboniger.
On a different subject, the glucoseinduced repression of puromycin
biosynthesis by S. alboniger, was
shown to be derepressed by phosphate.
This finding widen up initial results on
this repression.
and phenotypic analysis of the deletants”. GENE 233,
Concerning yeasts, the EUROFAN I and
II projects of the EU were ended.
The functionality of a variety of ORFs of
unknown function was studied.
Furthermore, the preparation of
industrial yeasts with amylolytic function
was pursued and baker’s yeast strains
expressing this phenotype were
obtained. Activity of Schwanniomyces
occidentalis SWA2 gene promoter as
expressed in S. cerevisiae was studied
and its regulation by the carbon source
analysed. It carries two motives, which
could be implicated in catabolic
repression. However, they are not
recognized by the Mig1 protein from
Saccharomyces cerevisiae. A
Schwanniomyces occidentalis gene
which is homologous to Mig1 from S.
cereisiae was cloned.
101
(1999). “A single nucleotide change in the MNR1
(VCX1/HUM1)
gene
determines
resistance
to
371-375
S. Zúñiga, J. Boskovic, A. Jiménez, J. P. G. Ballesta and
M. Remacha. “Disruption of six Saccharomyces
cerevisiae novel genes and phenotypic analysis of the
and M. Remacha (1999). “Deletion of twenty four ORFs
from chromosome XI from Saccharomyces cerevisiae
141-150 *Estos dos autores contribuyeron igualmete a
este trabajo.
J. C. Espinosa, M. A. Rubio, E. Fernández, J. A. Tercero
and A. Jiménez. (1999). “The pur7 gene from the
puromycin biosynthetic pur cluster of Streptomyces
alboniger encodes a nudix hydrolase”. J. Bacteriol. 181,
4914-4918.
Tesis Doctorales/Doctoral Theses
Irene
Saugar Gómez. “Caracterización del clúster
génico a2a de la ruta biosintética del antibiótico A201A
de Streptomyces capreolus”. Universidad Autónoma de
Madrid. 2000. Apto Cum Laude.
Teresa de los Ángeles Carmona Delgado. “Estudio de
la
actividad
del
Schwanniomyces
promotor
del
occidentalis
gen
SWA2
expresado
de
en
Saccharomyces cerevisiae. Regulación por fuente de
carbono”. Universidad Autónoma de Madrid. 2000. Apto
cum Laude.
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.8
Regulación de la actividad genética por
hormonas
Resumen de Investigación
Jefe de Línea / Group Leader:
Antonio Nieto
Personal Científico / Scientific
Staff:
Nuestro objetivo es el estudio de los
mecanismos moleculares de la acción de
las hormonas esteroides así como de la
hormona polipeptídica prolactina.
J. Predestinación García-Ruiz
Becarios Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Marta Riffo, Eva Obregón
Becarios Predoctorales / Graduate
Students:
Aparicio Aguilar,
Karla Solorzano,
Henry Rivera,
Isabel Olazábal,
Samuel Ogueta
Técnico de Investigación /
Technical Assistance:
Carlos García
Regulación por hormonas esteroides
del gen de la uteroglobina (UG).
El gen de uteroglobina (UG) se expresa
en varios tejidos del conejo y de otros
mamíferos. En cada tejido el gen es
regulado específicamente por una
determinada hormona, entre las que están
los glucocorticoides, la progesterona y los
estrógenos. Un elemento de respuesta a
estrógenos (ERE) y varios posibles
elementos de respuesta a
glucocorticoides/progesterona
(GRE/PRE) se han observado en el
promotor a –0,26 Kb y a 2,6 Kb
respectivamente. Varios estudios han
demostrado que todos esos elementos de
respuesta pueden ser modulados por
otros factores de transcripción que se
unen a diferentes sitios en el promotor de
ug. Nosotros nos hemos centrado de
varias E-box (sitios de unión de factores
de transcripción HLH) presentes en el
promotor. Nuestros estudios indican que
una de esas E-box, localizada cerca de la
TATA-box, une dos factores nucleares y
que ese elemento parece ser importante
en la determinación de la expresión
específica de tejido del gen ug. Nuestros
estudios también indican que otra E-box
es necesaria para la adecuada inducción
del gen por estrógenos. Nosotros también
investigamos la actividad de los GRE/PRE
del gen de ug en el contexto de diferentes
promotores. Los resultados indican que la
estructura de los promotores es de gran
importancia para la respuesta hormonal.
Mecanismos moleculares de la acción
de la prolactina.
La hormona polipeptídica prolactina (PRL)
ejerce numerosos efectos en múltiples
células blanco, incluyendo la estimulación
del crecimiento y la diferenciación. Uno de
nuestros objetivos es entender los
mecanismos moleculares que envuelven
la proliferación celular inducida por PRL.
Nuestros resultados indican que este
efecto esta mediado a través de la
activación de sitios AP-1. Esta activación
es debida a un incremento en el contenido
de c-Jun de los complejos
transcripcionales AP-1. La proliferación
inducida por PRL de células epiteliales
mamarias esta inhibida por
glucocorticoides con un decrecimiento
concomitante del contenido de c-Jun. La
regulación del sitio AP-1 parece ocurrir a
través de una activación dependiente de
PRL de la quinasa de c-Jun (JNK),
mientras que los glucocorticoides
previenen la activación de JNK. Así, la
proliferación celular inducida por PRL,
parece ocurrir por la activación de JNK,
que a su vez activa los elementos
transcripcionales de un sitio de unión AP1 y este proceso es inhibido por
glucocorticoides de una manera no
dependiente de la unión a DNA.
Estructura esquemática de la uteroglobina.
102
Hormonal regulation of gene expression
Publicaciones/Publications:
Research Summary
Our aim is the study of the molecular
mechanisms of action of steroid
hormones as well as of the polypeptide
hormone prolactin.
Steroid hormone regulation of the
uteroglobin (UG) gene.
The UG gene is expressed in several
tissues of the rabbit and other
mammals. In each tissue a determined
hormone, including glucocorticoids,
progesterone and estrogens,
specifically regulates the gene. An
estrogens response element (ERE) and
several putative glucocorticoid/
progesterone response elements
(GRE/PRE) have been observed in the
promoter at -0,26 Kb and -2,6 Kb,
respectively. Several studies have
demonstrated that all these response
elements can be modulated by other
transcription factors that bind at different
sites in the ug promoter. We have
focused on several E-box (binding sites
for HLH transcription factors) present in
the promoter. Our studies indicated that
one of these E-box, located close to the
TATA-box, bind two nuclear factors and
that element appear to be important in
determining the tissue-specific
expression of ug. Our studies also
indicated that other E-box is necessary
for an adequate induction of ug by
estrogens. We are also investigating the
activity of the GRE/PRE of ug in the
context of different promoters. The
results indicate that the structures of the
promoters are of great importance for
the hormonal response.
Molecular mechanisms of action of
the prolactin.
The polypeptide hormone prolactin
(PRL) exerts numerous effects on
multiple target cells, including
stimulation of growth and differentiation.
One of our goals is to understand the
molecular mechanisms involved in the
PRL-induced cell proliferation. Our
results indicate that this effect is
mediated through activation of AP-1
sites. This activation is due to an
increase in the c-Jun content of AP-1
transcriptional complexes. The PRLinduced proliferation of mammary
epithelial cells is inhibited by
glucocorticoids with a concomitant
decrease of c-Jun content. The
regulation of the AP-1 site appears to
occur through a PRL-activation of c-Jun
kinase (JNK) while glucocorticoids
prevent the activation of JNK. Thus,
PRL-induced cell proliferation appears
to occur by activation of JNK that, in
turn, activates the transcriptional
elements of an AP-1 binding site and
this process is inhibited by
glucocorticoids in a DNA-binding
independent manner.
Ogueta, S., Olazabal, I., Santos, I., Delgado-Baeza, E.
and
García
Ruiz,J.P.
(2000).
Transgenic
mice
expressing bovine GH develop arthritic disorder and
self-antibodies. J. of Endocrinology. 165, 321-328
Olazabal, I., Muñoz, J., Ogueta, S., Obregón, E., and
García-Ruiz, J.P. (2000). Prolactin (PRL)-PRL receptor
system increases cell proliferation involving JNK (c-Jun
amino terminal kinase) and AP-1 activation: inhibition
by glucocorticoids. Mol. Endocrinology. 14, 564-575
Riffo, M. and Nieto, A. (1999). Lysophosphatidylcholine
induces changes in physicochemical, morphological,
and functional properties of mouse zona pellucida: a
possible role of phospholipase A2 in sperm-zona
pellucida interaction. Mol. Reprod. Dev. 53, 68-76
García, C. and Nieto, A. (1999). Two progesteronedependent endometrial nuclear factors bind to an E-box
in the rabbit uteroglobin gene promoter: involvement in
tissue-specific transcription. Arch. Biochem. Biophys.
362, 301-308
Tesis Doctorales/Doctoral Theses
Isabel Olazabal Olarreaga: “ Efecto proliferativo de la
prolactina en células epiteliales y sus mecanismos
moleculares.” Universidad Autónoma de Madrid. 1999.
Calificación: Sobresaliente cum laude.
Samuel Ogueta Villarreal: “ Nuevo sistema regulador de
los tejidos articulares de la rodilla humana y murina.
Regeneración del cartílago articular.” Universidad
Autónoma de Madrid. 2000. Calificación: Sobresaliente
cum laude.
Schematic structure of uteroglobin.
103
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.9
Estructura cromatínica y transcripción
Resumen de Investigación
Jefe de Línea / Group Leader:
Enrique Palacián
Personal Científico / Scientific Staff:
Francisco Hernández
Técnicos de Investigación / Technical
Assistance:
Santiago Arenas,
Miguel Ángel Sánchez
Estudiante / Students:
Gonzalo Gómez
Nuestro objetivo es el esclarecimiento en
cromatina de las relaciones básicas entre
estructura y función transcripcional,
utilizando para ello moldes
oligonucleosómicos definidos, ensamblados
sobre DNA con secuencias posicionantes
de nucleosomas regularmente espaciadas,
y un sistema sencillo y eficiente de
transcripción in vitro. Antes de 1999,
estudiamos los efectos sobre la
transcripción de la ausencia de los dímeros
H2A·H2B y los producidos por la acetilación
o la eliminación de los dominios histónicos
terminales. Durante los últimos dos años,
hemos investigado cómo se afecta la
elongación de las cadenas de RNA al
incorporarse a los moldes
oligonucleosómicos las histonas H1/H5,
las cuales interaccionan con el DNA
espaciador estabilizando la fibra de 30 nm.
La unión de H1/H5 podría afectar la
eficiencia transcripcional a tres niveles:
nucleosomas individuales, fibra de 30 nm
y agregados de las cadenas
oligonucleosómicas.
Para investigar estas posibilidades, se
determina paralelamente el grado de
compactación y la eficiencia transcripcional
de los distintos moldes en condiciones
salinas apropiadas para obtener diferentes
104
niveles de plegamiento. La formación de la
fibra de 30 nm requiere un nivel alto de
ocupación de las secuencias posicionantes.
Como la presencia de cada octámero de
histonas inhibe parcialmente el proceso de
elongación, el molde de DNA con 18
secuencias posicionantes anteriormente
empleado es inadecuado para estudiar el
efecto sobre la transcripción de la fibra de
30 nm, ya que la ocupación por octámeros
de 15 de las 18 secuencias posicionantes
inhibe totalmente la sintesis de RNA.
Para evitar este problema, se han empleado
especies de DNA semejantes a la ya
utilizada pero con solo 8 y 12 secuencias
posicionantes. En contra de lo inicialmente
esperado, la incorporación de H5 en las
cadenas oligonucleosómicas no parece
afectar la eficiencia de éstas como moldes
de transcripción, ni siquiera cuando H5
estabiliza la fibra de 30 nm.
Chromatin structure and transcription
Publicaciones/Publications:
Research Summary
The purpose of our research is to
elucidate the relationships between
chromatin structure and transcriptional
function. To accomplish this goal we use
defined oligonucleosome templates,
assembled on DNA containing regularly
spaced nucleosome positioning
sequences, and a simple and efficient in
vitro transcription system. Prior to 1999
we studied the effects on transcription
caused by the absence of H2A·H2B
dimers, and by acetylation or elimination
of the histone tail domains.
During the last two years, our group has
investigated how elongation of RNA
chains is affected by the incorporation of
histones H1/H5 into oligonucleosome
templates. H1/H5 bind to the linker DNA
stabilizing the 30-nm fiber. Binding of
H1/H5 might affect the transcriptional
efficiency of the templates at three
different levels: individual nucleosomes,
30-nm fiber, and aggregates of
oligonucleosomal chains. To investigate
these posibilities, the degree of
compaction and the transcription efficiency
of oligonucleosome templates were
determined in paralell under the salt
conditions required to obtain different
compaction levels. Formation of the 30nm fiber requires a high level of
occupancy of the positioning sequences,
and the binding of each histone octamer
partially inhibits the elongation process.
Therefore, the DNA template with 18
positioning sequences, which was that
previously employed, is unsuitable to
study the effect of the 30-nm fiber on
transcription, since the binding of histone
octamers to 15 of the 18 positioning
sequences totally inhibits RNA synthesis.
To avoid this problem, similar DNA species
with only 8 and 12 positioning sequences
were used. Against the expected results,
incorporation of histone H5 into the
oligonucleosomal chains does not appear
to affect their efficiency as transcription
templates, even when H5 stabilizes the
30-nm fiber.
105
Chirinos, M., Hernández, F., and Palacián, E. (1999)
Transcription of DNA templates associated with histone
(H3·H4)2 tetramers. Arch. Biochem. Biophys. 370, 222230
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.10
Envolturas celulares
Resumen de Investigación
Jefe de Línea / Group Leader:
Miguel Angel de Pedro Montalban
Personal Científico / Scientific Staff:
Francisco García del Portillo
Becarios Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Graciela Pucciarelli Morrone.
Ana Dopazo González.
El tema de estudio de la linea es la biología
de la envoltura celular bacteriana, como
principal elemento morfogenético, de
relación con el medio y con otros otros
organismos y como sitio de acción de
agentes antibacterianos. En este contexto
nuestro trabajo se centra en los siguientes
aspectos:
Ana María Alonso.
Antonio Cebriá.
Amparo Haro Castuera.
Silvia Gutierrez Erlandsson.
Becarios Predoctorales / Graduate
Students:
Katysulla Costa
Marina Martínez-Moya.
María José Rodríguez. Miguel Angel
Serrano Melgar
Técnico de Investigación / Technical
Assistance:
Juliana de la Rosa (1999)
Nuria Gómez López.
Maria Teresa Villalba Villacorta
a) Morfogénesis de Escherichia coli y
Salmonella typhimurium; Continuamos
nuestros estudios sobre la generación y
función de regiones topologicamente
diferenciadas en el sáculo y en la membrana
externa de la bacteria. Hemos demostrado
la existencia de regiones de larga vida
media y metabolicamente inertes en ambas
estructuras cuya génesis esta asociada al
fenómeno de división celular. Estamos
estudiando las bases estructurales y
metabólicas de las heterogeneidades asi
como su relevancia en la morfogénesis
bacteriana.
de persistencia de S. typhimurium. También
estamos estudiando la participación en
dichos procesos de una ámplia serie de
enzimas relacionadas con el metabolismo
del sáculo que se caracterizan por su
redundancia y dispensabilidad en cultivos
in vitro.
c) Cambios adaptativos en la estructura y
enzimología del sáculo de Helicobacter
pylori asociados a la generación de formas
cocoides. H. pylori sufre un drástico cambio
morfológico y fisiológico en respuesta a
condiciones de estress que implica la
generación a partir de bacterias con
morfología helicoidal de unas formas
cocoides, que posiblemente representan
una forma de resistencia asociada a la
transmisión del patógeno. Anteriormente
hemos demostrado cambios sustanciales
en el metabolismo de la pared reminiscentes
de los descritos en la esporulación de
Bacillus. Estamos estudiando la enzimología
del proceso, y la posibilidad de explotar la
singularidad de las reacciones para el
desarrollo de antibacterianos de alta
especificidad.
b) Adaptaciones y participación de la
envoltura bacteriana en la colonización de
células eucarióticas, y establecimiento de
estados de persistencia, por Salmonella
typhimurium. La envoltura celular de S.
typhimurium sufre cambios estructurales
radicales durante las primeras etapas del
proceso de colonización de células
eucarióticas, fenómeno base de la
patogenia de dicho organismo. Estamos
estudiando la relevancia de tales fenómenos
en la progresión de la infección, en la
multiplicación intracelular y en la capacidad
Demostracion de heterogeneidades topológias durante el crecimeinto del sáculo en
un mutante amiABC de S. typhimurium. Rojo: regiones inertes. Verde: regiones de
inserción zonal de precursores. Amarillo: regiones de inserción difusa de precursores.
106
Cell envelopes
Publicaciones/Publications:
Research Summary
The research topic of the group is the
biology of the bacterial cell envelope, as
the main element in morphogenesis and
relation with both the environment and
other organisms, and as site of action of
antibacterial agents. Our investigations
are focused on the following directions:
a) Morphogenesis of Escherichia coli; we
continue our investigations on the
generation and function of topologically
differentiated regions in the bacterial
sacculus and outer membrane. The
existence of long lived, metabolically
inert regions in both structures has been
positively demonstrated. Generation of
such regions is intimately linked with
bacterial division. At present we are
working on the structural and metabolic
basis of the heterogeneity as well as on
the evaluation of its relevance for bacterial
morphogenesis.
investigating the relevance of envelope
alterations for the outcome of the infection,
for intracellular proliferation and for the
persistence ability of S. typhimurium. The
possible involvement on S. typhimurium
pathogeneicity of cell wall metabolizing
enzymes is also under study.
García-del Portillo, F., M.G. Pucciarelli, y J. Casadesús
(1999). DNA methylase mutants of Salmonella
typhimurium show defects in protein secretion, cell
invasion, and M cell cytotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 96:11578-11583.
García-del Portillo, F. (1999). Pathogenic interference
c) Adaptive modifications in the structure
and enzymology of Helicobacter pylori
sacculus associated to the generation of
coccoid forms. Under stress conditions
H. pylori undergoes a morphological
transition from the vegetative spiral form
into a coccoid shape. Coccoid cells may
represent a resistance form mediating
transmission and spreading of the
pathogen. We have shown that during
the transition the cell wall is substantially
modified in a way reminiscent in some
aspects of endospore formation in
Bacillus. At present we are studying the
enzymology of the process, and the
possibility to exploit the uniqueness of
the process to search for high specificity
antibacterials.
b) Adaptive modifications and involvement
of Salmonella typhimurium bacterial
envelope in eukaryotic cell colonization,
and in the establishment of the
persistence state. S. typimurium cell
envelope is severely modified during the
early stages of eukaryotic cell colonization,
a key process for Salmonella
pathogeneicity. We are currently
with host vacuolar trafficking. Trends in Microbiology
7:467-469.
Hilbert, F., F. García-del Portillo y E.A. Groisman. (1999).
A periplasmic D-alanyl-D-alanine dipeptidase in the Gram
negative bacterium Salmonella enterica. J. Bacteriol.
181:2158-2165.
Costa, K., G. Bacher, G. Allmaier, M.G. Domínguez-Bello,
L. Engstrand, P. Falk, M.A. de Pedro, y F. García del
Portillo. (1999) The morphological transition of
Helycobacter pylori cells from spiral to coccoid is preceded
by a substantial modification of the cell wall. J. Bacteriol.
181:3710-3715.
Quintela, J.C., P. Zöllner, F. García del Portillo, G. Allmaier,
y M.A. de Pedro. (1999) Cell wall structural divergence
among Thermus spp. FEMS Microbiol. Lett. 172:223229.
Quintela,J.C.; F.G. del Portillo; E. Pittenauer, G. Allmaier,
de Pedro,M.A.(1999) Peptidoglycan fine structure of the
radiotolerant bacterium Deinococcus radiodurans Sark.
J. Bacteriol. 181:334-337
Tesis Doctorales/Doctoral Theses
Martinez-Moya, M. (1999). “Estudio del fenómeno de
persistencia intracelular de Salmonella typhimurium en
células eucariotas no fagocíticas”. Tesis Doctoral.
Marzo 1999. Universidad Autónoma de Madrid.
Ilustration of topological heterogeneities in growing sacculi of an amiABC S. typhimurium
mutant strain. Red: Inert regions. Green: zonal insertion of new precursors. Yellow:
diffusse insertion of precursors.
107
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.11
Bases Moleculares de las Enfermedades
Metabólicas
Resumen de Investigación
Jefe de Línea / Group Leader:
Magdalena Ugarte
Personal Científico / Scientific Staff:
Mª José García Muñoz,
Begoña Merinero,
Belén Pérez,
Celia Pérez-Cerdá,
Pilar Rodríguez-Pombo,
Los objetivos principales de esta línea de
investigación consisten en la caracterización
de los genes implicados en distintas
enfermedades metabólicas, sus variantes
alélicas y el efecto de las mismas sobre la
relación estructura-función de las enzimas
codificadas.
Lourdes Ruiz Desviat.
Becarios Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Silvia Muro ,
Pedro Ruiz Sala.
Becarios Predoctorales / Graduate
Students:
Margarita Castro,
Sonia Clavero Alejandra Gámez, Jon
A. Gangoiti,
Fernando García,
Mª Angeles Martínez,
Angel L. Pey
Técnico de Investigación / Technical
Assistance:
Mª Jesús Ecay,
Mar Infante,
Rocío Martín,
Rosa Navarrete,
Ascensión Sánchez,
Paloma Sanz.
Durante este periodo se ha continuado con
el estudio de las bases moleculares de la
fenilcetonuria (PKU), ampliando el estudio
epidemiológico a distintas regiones
españolas y a otras poblaciones, analizando
la relación fenotipo-genotipo y desarrollando
la metodología necesaria para expresar
mutaciones en sistemas eucariotas y
procariotas que permitan definir qué
mutaciones afectan al plegamiento,
ensamblaje y estabilidad de la proteína
PAH. Otros abordajes experimentales
aplicados con éxito han sido los ensayos
de doble híbrido para estudiar la interacción
entre subunidades PAH y ensayos de pulsocaza en sistemas libres de células
(transcripción-traducción acopladas) para
estudiar la estabilidad de las proteínas
mutantes. Estos estudios se complementan
con el análisis estructural y modelado
molecular de las mutaciones en las
estructuras cristalinas disponibles de las
formas activas de la PAH.
Asimismo, se ha continuado con el análisis
genético de la acidemia propiónica,
identificando mutaciones en los genes
implicados PCCA y PCCB. El análisis de
la correlación genotipo-fenotipo ha permitido
108
asociar la presencia de determinadas
mutaciones que se pueden predecir como
nulas funcionalmente, con la forma más
severa de la enfermedad, mientras que
algunas mutaciones de cambio de
aminoácido tienden a estar relacionadas
con la presentación tardía (más suave) de
la enfermedad. Por otra parte, se ha
analizado el efecto de mutaciones PCCA
y PCCB mediante distintos sistemas
(síntesis in vitro e importe mitocondrial,
doble híbrido) demostrando un defecto de
estabilidad intramitocondrial para la
mutación PCCA M348K y delimitando la
región carboxilo terminal de la proteína
PCCB implicada en la interacción
homomérica β−β.
En el último año se han caracterizado las
bases moleculares de la 3-metil-crotonil
glicinuria, identificando los dos genes
implicados mediante búsquedas
bioinformáticas (BLAST) en las bases de
datos públicas, clonaje de los cDNAs
humanos candidatos, caracterización de la
estructura genómica de ambos genes e
identificacón de mutaciones en pacientes.
Molecular basis of metabolic diseases
Publicaciones/Publications:
Research Summary
The main research interests are the
characterization of genes involved in
metabolic diseases and of their variant
alleles and the effect on the structurefunction relationship of the encoded
enzymes.
During this period we have continued with
the study of the molecular basis of
phenylketonuria (PKU), characterizing
the mutational spectrum of different
Spanish regions and other populations,
analyzing the genotype-phenotype
correlations and setting up the techniques
for the expression of mutations in
eukaryotic and prokaryiotic systems which
allow us to define those mutations
affecting folding, assembly and stability
of the PAH protein.Two-hybrid assays
analyzing the interactions between
subunits and pulse-chase experiments in
cell-free systems (coupled transcriptiontranslation) to study mutant protein stability
have also been successfully performed.
All these studies are completed with the
structural analysis and molecular
modelling of the mutations on the available
crystal structures of the active PAH forms.
severe form of the disease, while some
missense mutations are associated with
a late presentation (mild form) of the
disease.We have also analyzed the effect
of PCCA and PCCB mutations in different
systems (in vitro synthesis and
mitochondrial import, two hybrid assays),
demonstrating a defect in
intramitochondrial stability for the M348K
PCCA mutation, and the involvement of
the carboxy-terminal region of PCCB in
the homomeric β−β interaction between
beta subunits.
Richard E., Desviat L.R., Pérez B., Pérez-Cerdá C. and Ugarte M. (1999).
“Genetic heterogeneity in propionic acidemia patients with α-subunit defects.
Identification of five novel mutations, one of them causing instability of the
protein”. Biochimica et Biophysica Acta 1453:351-358.
Muro, S., Perez-Cerdá, C., Rodríguez-Pombo, P., Pérez, B., Briones, P., Ribes,
A., Ugarte, M. (1999) “Feasibility of DNA-based methods for prenatal diagnosis
and carrier detection of propionic acidemia”. J. Med. Genetics, 36(5):412-414.
Pérez B., Desviat L.R., De Lucca M., Cornejo V., Raimann E. and Ugarte
M. (1999) “Molecular characterization of phenylalanine hydroxylase
deficiency in Chile”. Human Mutation Mutation in Brief 243. On line.
Desviat L.R., Pérez B., Gámez A., Sánchez A., García M.J., MartínezPardo M., Marchante C., Bóveda D., Baldellou A., Arena J., Sanjurjo P.,
Fernández A., Cabello M.L. and Ugarte M. (1999) .“Genetic and phenotypic
aspects of phenylalanine hydroxylase deficiency in Spain. Molecular survey
by regions”. Eur. J. Hum. Genet. 7:386-392.
Muro S., Rodríguez-Pombo P., Pérez B., Pérez-Cerdá C., Desviat, W.
Sperl L.R., Skladal D., Sass J. O. and Ugarte M. (1999) “Identifacation of
During the last year we have
characterized the molecular basis of 3methyl-crotonyl glicinuria, identifying the
genes after bioinformatic searches
(BLAST) in public databases, cloning the
human candidate cDNAs, characterization
of the genomic structure of both genes
and identification of mutations in patients.
novel mutations in the PCCB gene in European Propionic Acidemia
Patients”. Hum. Mut. Mutation in Brief 253. On Line.
Ugarte M., Pérez-Cerdá C., Rodriguez-Pombo P., Desviat L.R., Pérez B.,
Richard E., Muro S., Campeau E., Ohura T. (1999)“An overview of mutations
in the PCCA and PCCB genes causing propionic acidemia”, R.A. Gravel.
Hum. Mut. 14:275-282.
Martínez-Pardo M., Suares L., Díaz M.C. y García M.J. (1999) “Enfermedades
metabólicas e hígado” Anales Españoles de Pediatría. Mayo Suplemento 126.
Merinero B., Pascual Pascual S.I., Pérez-Cerdá C., Gangoiti J., Castro M., García
M.J., Pascual Castroviejo I., Vianey-Saban C., Andresen B., Gregersen N., Ugarte
M. (1999) “Adolescent myopatic presentation in two sisters with very long-chain
acyl CoA dehydrogenase deficiency”. J. Inher. Metab. Dis. 22:802-810
Pérez B., Desviat LR., Martínez-Pardo M., Garcia MJ. y Ugarte M. (1999)
“Fenilcetonuria:30 años de investigación y prevención”. Premio Real
Academia de Farmacia 1998. Anales de la Real Academia de Farmacia,
65:271-304.
Pérez- Cerdá C., Merinero B., Rodriguez-Pombo P., Pérez B., Desviat
LR., Muro S., Richard E., García MJ, Gangoiti J., Ruiz-Sala P., Sanz P.,
Briones P., Ribes A., Martinez-Pardo M., Campistol J.,Perez M., Lama R.,
Murga ML, Lema T.-Garret A. Verdu and Magdalena Ugarte (2000) “Potencial
Relationship between genotype and clinical outcome in propionic acidemia
patients. Eur J Hum Genet 8:187-194.
We have also progressed on the genetic
analysis of propionic acidemia, identifying
mutations in the two genes involved,
PCCA and PCCB. The study of the
genotype-phenotype correlation has
revealed that certain potentially null
mutations are associated with the most
Muro S., Pérez B., Rodríguez-Pombo P., Desviat L.R., Pérez Cerdá C. y
Ugarte M. (2000) “Mutations affecting the β−βhomomeric interaction in
propionic acidaemia: An approach to the determination of the β−propionil
CoA carboxylase fuctional domains.” J. Inherit. Metab. Dis. 23:300-304.
“In vitro expression analysis of R68G and R68S mutations in phenylalanine
hydroxylase gene”. C. Zekanowski. B. Pérez, L.R. Desviat, W. Wiszniewski
and M. Ugarte. Acta Biochimica Polonica (2000) 47(2):365-369.
Gámez A., Pérez B., Ugarte M. and Desviat L.R. (2000) “Expression
analysis of phenylketonuria mutations. Effect on folding and stability of the
phenylalanine hydroxylase protein”. J. Biol. Chem. 275:29737-29742
Busquets C., Merinero B., Christensen E., Gelpí J., Campistol J., Pineda
M., Fernández-Alvarez E., Prats J., Sans A., Arteaga R., Martí M., Campos
J., Martínez-Pardo M., Martínez-Bermejo A., Ruiz-Falcó ML., Vaquerizo
J., Orozco M., Ugarte M., Coll M.J., Ribes A. (2000) “Glutaryl-CoA
Tesis Doctorales/Doctoral theses
dehydrogenase deficiency in Spain: Evidence for two groups of patients,
Silvia Muro Galindo “Caracterización molecular del
gen PCCB. Análisis y expresión de mutaciones
causantes de Acidemia Propiónica”. Universidad
Autónoma de Madrid. Sobresaliente “Cum Laude”.
Ulla Rüetschi, Roberto Cerone, Celia Pérez-Cerdá, Maria Cristina Schiaffino,
genetically and biochemically distinct”. Pediatr. Res 48(3):315-322
Sue Staanding, Magdalena Ugarte, Elisabeth Holme. (2000) “Mutations
in the 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase gene (HPD) in patients with
tyrosinemia type III. Hum Genet. 106:654-662.
Gibson M., Mitchell G., Fukao T. and Ugarte M.. (2000) “Molecular and
Enzymatic Methods for Detection of Genetic Defects in the Distal Pathways
of Brached- Chain Amino Acid Metabolism”. Methods Enzymol 324:432-53
Lázaro C., Nunes V., Peral B., Ugarte M. Enfermedades Hereditaria, cap. 169, pp.13961410. Tratado de Medicina Interna Farreras-Rozman, vol I, 14ª edición, 2000.
Busquets C., Coll MJ., Merinero B., Ugarte M., Ruiz M.A., Martínez-Bermejo
A., Ribes A. “Prenatal molecular diagnosis of glutaric acidduria type I by
direct mutation analysis”. Prenat Diag. Prenat. Diag. (2000) 20(9): 761-764.
109
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.12
División Celular Bacteriana y Resistencia a
Antibióticos
Resumen de Investigación
Personal Científico / Scientific
Personnel:
Juan Alfonso Ayala Serrano
Becarios Predoctorales /Graduate
Students:
Julian Alberto Ferreras
Guillermo Cobas Pupo
Jose di Conza
Beatriz Lara Arnaud
Silvina Sara Dongarrá
Alfonso Alexander Aguilera
Jenny Dussan Garzón
genes parálogos para las PBPs no
previamente identificados por estudios
Nuestro equipo tiene centrado su interés,
desde su creación como línea
independiente, en el análisis, bajo
diversas aproximaciones moleculares, de
dos importantes procesos celulares en
bacterias, como son la septación durante
la división celular, y la aparición de los
diversos mecanismos de resistencia a
antibióticos β-lactámicos. Una gran parte
de los enzimas implicados en estos
procesos se encuentran agrupados en un
Técnicos de Investigación /
Technical Assistance:
Juliana de la Rosa
Jose Manuel Rodríguez Vadillo
Rodrigo Guardián Sevilla
Científicos visitantes / Visiting
Scientist:
Dr. Sergei Borksenious (Academia Rusa
de Ciencias, San Petersburgo, Rusia)
Dr. Gabriel Gutkind (Universidad Buenos
Aires, Argentina)
Bouli Ali Diallo (Universite de Niamey,
Niger)
Felipe Fernández Cuenca (Universidad
de Sevilla)
Alma Hernández de Rojas (Instituto
Productos Lacteos, Oviedo)
Dr. Claudine Parquet Universite de
Paris-Sud, Francia)
Paz Bellido Armenteros (Universidad de
Navarra)
Jose Bravo (University of California,
Irvine)
cluster denominado dcw (division and cell
wall), donde se incluyen, entre otros, los
genes mraZ, mraW, mraR, pbpB (PBP3),
bioquímicos. Uno de estos genes codifica
para la β-lactamasa cromosómica de tipo
C (ampC), que no está presente en
Salmonella, en contraste con otros
miembros de la familia
Enterobacteriaceae, como Escherichia,
Citrobacter, o Enterobacter. Hemos
analizado esta proteína desde el punto de
vista génetico, enzimático y fisiológico, y
encontrado evidencia de la actividad
enzimática y de la implicación en el
proceso de invasión celular.
El peptidoglicano septal se sintetiza por la
ftsW y ftsZ. El estudio de la regulación de
la expresión de estos genes del cluster y
la determinación funcional de MraW en
Escherichia coli son dos aspectos que
hemos desarrollado en este periodo.
Además, hemos ampliado el estudio a una
serie de estirpes patógenas en humanos y
de interés medioambiental, tales como
Shigella, Salmonella, Pseudomonas,
Mycoplasma y Thermus, con vistas a ser
utilizados como dianas para la búsqueda y
desarrollo de nuevos antimicrobianos
proteína PBP3, que aporta la actividad
La proteína FtsZ es un componente
Los logros esenciales en los dos últimos
esencial del anillo septal para la división
bacteriana. Este anillo, con estructura que
años han sido: 1.- Mejor definición como
gen esencial para mraW del cluster dcw
presenta analogías al citoesqueleto
de Escherichia coli. 2.-Identificación de los
eucariota, parece ser un componente
productos metilados por la actividad metil-
universal para el mecanismo de división.
Dado que Acholeplasma laidlawwii tiene
transferasa de la proteína MraW. 3.Caracterización del gen ftsZ de
todas las características de la célula
Acholeplasma laidlawii y de su producto
génico. 4.- Purificación y caracterización
de los dos módulos catalíticos, glicosiltransferasa y acil-transferasa, de la
proteína PBP1b polimerizadora de
peptidoglicano de la pared de Escherichia
coli. 5.- Análisis del coste biológico que
supone la producción de la proteína AmpC
para la supervivencia intracelular de
Salmonella enterica serotipo Typhimurium
procariota mínima y algunos de los
procesos de las bacterias con envoltura,
es un modelo prometedor para el estudio
de los principios básicos del proceso de
división. En este periodo hemos iniciado el
estudio de esta proteína en este
microorganismo.
Tras la publicación de la secuencia
completa del genoma de Escherichia coli
transpeptidasa (crosslinking) asociada a
otra proteína, posiblemente PBP1B, que
aporta la actividad transglicosilasa
(elongación de cadena). A pesar de los
esfuerzos de varios grupos para la
cristalización y determinación de la
estructura de estas proteínas, aun no se
han conseguido resultados positivos. No
obstante hemos avanzado en el
conocimiento de la estructura modular y
funcionalidad de cada dominio.
se ha hecho patente la presencia de
Relación de homologías entre las distintas PBPs de Salmonella Typhi. Los números
indican el puntaje obtenido con la utilización del programa BLASTA. La ausencia de
flecha entre dos proteínas indica un valor de E mayor de 2e-10.
Homology relationship among the different PBPs of Salmonella Typhi. The numbers
indicate the radio values obtained by the BLASTA program. Absence of an arrow
between two proteins indicates a value of E higher than 2e-10.
110
Bacterial Cell Division and Antibiotics
Resistance
Research Summary
Our main interest, from the initial step as
an independent group, is the analysis under
diverse molecular approaches of two
important cellular processes in bacteria,
i.e. septation during cell division and the
appearance of different resistance
mechanisms to β-lactam antibiotics. Most
of the gene coding for these enzymes
Publicaciones/Publications:
type C β-lactamase, which is not present
in Salmonella, in contrast with other
members of the Enterobacteriaceae
family, i.e. Escherichia, Citrobacter or
Enterobacter. We have analyzed this
protein from the genetic, enzymatic and
physiological point of view, and we have
found evidence for the enzymatic activity
and the involvement on the cellular
invasion process.
involved on these processes are grouped
Carrión M., M. Gómez, R. Merchante-Schubert , S.
Dongarrá and J.A. Ayala*. 1999. mraW, an essential gene
at the dcw cluster of Escherichia coli codes for a
cytoplasmic protein with methyltransferase activity.
Biochimie 81: 879-888.
Kukelova A.V., A. Yu. Malinin, J.A. Ayala* and S.N.
Borchsenius 1999. Characterization of Acholeplasma
laidlawii ftsZ gene and its gene product. Biochem. Biophys.
Research Comm. 262(1): 44-49.
in a so called dcw cluster (division and cell
Septal peptidoglycan is synthesized by
wall), that include, among others, the genes
mraZ, mraW, mraR, pbpB (PBP3), ftsW
the penicillin-binding protein PBP3. This
and ftsZ. The study of the regulation of the
expression of these genes, and the
functional characterization of the MraW
protein has been two aspects with special
emphasis during this period. Also, we have
extended this type of studies to pathogenic
and environmental strains, as Salmonella,
Shigella, Pseudomonas, Mycoplasma and
Thermus, which will allow the search and
development of new antimicrobial agents.
(crosslinking) in the C-terminal domain,
M. Lampilas, J. Aszodi, J.A. Ayala, J.M. Ghuysen and M.
and associates with another protein,
Nguyen-Distèche 1999. The catalytic, glycosyl transferase
probably PBP1B, which supplies the
and acyl transferase, modules of the cell wall peptidoglycan
transglycosylase activity (chain
polymerizing penicillin-binding protein 1b of Escherichia
The FtsZ protein is an essential
protein holds the transpeptidase activity
elongation). In spite of the big effort of
determine the 3D structure of these
proteins, there are no positive results.
Morosini M.I., J.A. Ayala, F. Baquero, J.L. Martínez and J.
However, we have advanced on the
Blázquez. 2000. Biological cost of AmpC production for
knowledge of the modular structure and
Salmonella enterica serotype Typhimurium. Antimicrobial
functionality of each domain of both
Agents and Chemotherapy. 44(11): 3137-3143.
proteins.
Tesis Doctorales/Doctoral Thesis
ring. This cytoskeleton-like ring is
Our main achievements in the last two
believed to be the universal way of
bacterial division. Acholeplasma laidlawii
years were: 1.-Further characterization of
mraW, as an essential gene at the dcw
cluster of Escherichia coli. 2.-.
Identification of the methylated product
by the methyltransferase activity of the
MraW protein. 3.- Characterization of
Acholeplasma laidlawii ftsZ gene and its
gene product. 4.- Characterization of the
two catalytic, glycosyl transferase and
acyl transferase, modules of the cell wall
peptidoglycan polymerizing penicillinbinding protein 1b of Escherichia coli. 5Analysis of the biological cost of AmpC
production for Salmonella enterica
serotype Typhimurium
and some traits of cell-wall bacteria and
seems to be a promising object for study
of basic principles of the bacterial division
process. In this period we have started
the analysis of this protein in this model
microorganism.
After the complexion of the Escherichia
coli genome sequence, it has become
apparent that some paralogous PBP
genes have not been identified previously
by the biochemical methods. One of
these genes codes for a chromosomal
coli. Mol. Microbiol. 34(2): 350-364.
several groups to crystallize and to
component of the bacterial cell division
possesses all features of the minimal cell
Terrak M., T.K. Gosh, J. van Heijenoort, J. Van Beeumen,
111
Título: Actividad transglicosilasa del dominio B de la
penicillin-binding protein 3 y su proteína helper FtsW en
Escherichia coli Beatriz Lara Arnaud, Facultad de
Ciencias, Departamento de Biología Molecular,
Universidad Autónoma de Madrid 1999.
SOBRESALIENTE CUM LAUDE
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.13
Biotecnología y genética de bacterias termofilas
extremas
Resumen de Investigación
Jefe de Línea / Group Leader:
José Berenguer
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Cristina Vallés,
Pablo Castán,
Renata Moreno,
Felipe Cava (desde Octubre del 99),
Olga Zafra (desde Octubre del 99),
Edy Caro (desde Enero de 2000),
Martin Eckar (Noviembre a
Diciembre de 2000).
Durante los dos años anteriores hemos
centrado el trabajo de nuestro grupo de
investigación tanto en aspectos básicos de
la biología de Thermus thermophilus, como
en aplicaciones biotecnológicas de enzimas
y sistemas reguladores de expresión génica
de este organismo. En su vertiente básica,
hemos continuado nuestros estudios sobre
la regulación de la expresión del gen de la
capa S (slpA) y en el análisis del
agrupamineto génico para la respiración
de nitrato (nar), localizado en un plásmido
conjugativo autotransferible.
En el primer tema, hemos determinado
que las proteínas SlrA y SlpM, implicadas
en la regulación transcripcional de slpA,
pueden ser secretadas a través de la
membrana al igual que la proteína que
regulan. También hemos confirmado in vivo
la implicación de secuencias no traducidas
de slpA en su regulación transcripcional
y traduccional mediante el aislamiento de
mutantes de deleción en estas regiones.
agrupamiento funcionan como
antiportadores nitrato/nitrito mutuamente
reemplazables in vivo. Actualmente estamos
analizando el posible papel del primer gen
del operón, un citocromo C dihemo
periplásmico, en la regulación por oxígeno
de este promotor.
A nivel aplicado, hemos transferido al sector
privado varias enzimas termoestables
purificadas (chaperoninas, pirofosfatasas,
DNAligasas) y plásmidos de clonaje y/o de
expresión para Thermus sp. Para el
desarrollo de éstos, hemos empleado
replicones autónomos aislados y
caracterizados por nuestro grupo, y
elementos de control de la expresión
obtenidos de los trabajos en biología básica
de T. thermophilus anteriormente
comentados. Uno de nuestros objetivos
prioritarios en este campo consiste en el
desarrollo de sistemas de expresión
termófilos que pudieran ser empleados
como factoría celulares para la expresión
de enzimas termófilas complejas.
Respecto al agrupamiento nar hemos
confirmado la cotranscripción de 7 genes
desde un promotor (Pnar), regulado por
nitrato y anoxia, en vez de los 4 que
aparecen en el resto de los organismos
analizados hasta ahora. Nuestros datos
demuestran que los dos últimos genes del
Micrografía confocal de los cuerpos multicelulares (MB’s) formados en mutantes de expresión de la capa S.
La detección se llevó a cabo in situ con un sustrato fluorogénico de una fosfatasa alcalina. El interior libre
de células de cada MB es equivalente al espacio periplásmico de bacterias Gram negativas.
Confocal microscopy micrograph of multicellular bodies (MB’s) from S-layer expression mutants of Thermus
thermophilus. The image was obtained by using a fluorescent substrate from thermostable alkaline phosphate
engineered to be overexpressed in the mutant. The intercellular space within each MB is functionally equivalent
to the periplasmic space of Gram negative bacteria.
112
Biotechnology and genetics of extreme
thermophilic bacteria
Research Summary
In the last two years we have focused
our work on both, basic research projects
on the biology of Thermus thermophilus,
and biotechnological applications of
enzymes and gene expression systems
for this microorganism. On the basic side,
we have continued our work on the
regulation of the gene encoding the Slayer protein (slpA) and on the analysis
of the gene cluster for nitrate respiration
(nar), which is included in a selftransferable conjugative plasmid.
In the first topic, we have demonstrated
that the SlrA and SlpM proteins, which
are implicated in the transcriptional
regulation of slpA, can be secreted
through the membrane as the protein
which expression they regulate does.
Also, we have confirmed the implication
of untranslated sequences of slpA in its
transcriptional and translational regulation
in vivo through the isolation of adequate
deletion mutants.
promoter (Pnar) instead of the 4 which
are found in all the microorganisms so
far studied. Our data demonstrate that
the last two genes of this cluster function
as nitrite/nitrate antiporters which can
replace each other in vivo. At present, we
are analyzing the putative implication of
the first gene of the nar operon, which
encodes a periplasmic di-heme
cytochrome C, in the regulation by oxygen
of its promoter.
Publicaciones/Publications:
de Grado, M., Castán, P. y Berenguer J. (1999). A
high-transformation efficiency cloning vector for
Thermus thermophilus. Plasmid ,
42: 241-245.
Fernández-Herrero, L. A. y J. Berenguer. (2000). Secretion
and assembly of regular surface structures in Gramnegative bacteria. FEMS Microbiol. Rev, 24: 21-44
Ramírez, S., Moreno, R., Zafra, O., Castán, P., Vallés.
C., y J. Berenguer. (2000). Two nitrate/nitrite transporters
are encoded within the mobilizable plasmid for nitrate
From the applied point of view, we have
transferred to a private company different
thermophilic enzymes (chaperonins,
pyrophosphatase, DNA-ligase) and
plasmids for cloning and/or expression
in Thermus sp. For the development of
these plasmids, we have used
autonomous replicons isolated and
characterized by our group, and elements
for the control of the expression which
were obtained from the basic work above
commented. One of our priority objectives
on this field is the development of a
thermophilic expression system that could
be used as cell factory for the production
of complex thermophilic enzymes.
In relation to the nar cluster, we have
confirmed the co-transcription of 7 genes
from a nitrate and anoxia regulated
113
respiration of Thermus thermophilus HB8. J. Bacteriol.
182: 2179-2183
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.14
Regulación de la expresión génica
específica de tejido
Resumen de Investigación
Jefe de Línea / Group Leader:
José Luis Castrillo Díez
Becarios Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Oscar Jiménez-Mateo
Becarios Predoctorales /
Graduate Students:
Silvia Avila Flores
Olga Bassy Alvarez
Martha Díaz Gallardo
Job García Liévana
Angelina Rodríguez Torres
Marina Romero Prado
El objetivo general de nuestra línea de
investigación es el estudio a nivel
molecular de la expresión génica
específica de tejido en células humanas.
Nuestro sistema modelo principal lo
constituye el gen humano HGH-N que se
transcribe específicamente en la hipófisis
anterior y que se localiza en el
cromosoma 17q23.3 dentro del locus
"HGH-HPL". A este locus pertenecen
genes que comparten una gran homología
de secuencia pero que se transcriben en
tejido placentario: HGH-V, HPL-3 y HPL-4.
Asimismo, hemos iniciado el estudio de
los mecanismos de restricción especifica
de tejido de otro locus génico humano:
"HLH-HCG", localizado en el cromosoma
19q13.3 y que también presenta un patrón
de expresión tisular semejante: hipófisis
vs placenta. Para ello se están analizando
las regiones promotoras y enhancers de
estos genes, identificando los elementos
que confieren restricción de expresión
específica de tejido, así como la
purificación de los factores de
transcripción que las regulan.
Otra área de desarrollo dentro de nuestra
línea de investigación, es la puesta a
punto de técnicas de análisis de expresión
diferencial de mRNAs: "Differential
Display RT-PCR" y DNA Microarrays" que
nos ha permitido establecer dos nuevos
objetivos:
(1) Identificación y clonaje de genes
específicamente expresados en tumores
hipofisarios humanos, que nos permitirán
profundizar en los mecanismos
moleculares de expresión génica
hipofisaria, así como en el desarrollo de
nuevos marcadores de progresión tumoral
hipofisaria.
(2) Identificación y caracterización de
genes específicamente expresados en
tejido endometrial humano durante la
"ventana" de implantación, para clonar
nuevos genes marcadores de
implantación embrionaria.
DNA Microarrays
El patrón de expresión génica específico en células de
endometrio humano, se estudió utilizando sondas cDNAs
marcadas con 33P a partir de RNA total de células de
endometrio humano. Los filtros de cDNAs (porción)
humanos incluyen duplicados para cada cDNA. Nosotros
hemos analizado simultáneamente la expresión de 375
genes humanos en endometrio humano receptivo y noreceptivo. Los filtros fueron expuestos (phosphor screen)
y mediante análisis densitométrico, se estudió el patrón
de expresión génico diferencial.
DNA microarrays
Gene expression profiling using 33P-labeled cDNA
probes prepared from total RNA of human endometrial
cells. The Atlas Arrays shown here (portion) include
duplicate spots of each cDNA. We have analyzed the
differential expression of 375 human cDNAs in receptive
versus non-receptive human endometrium. The
membranes were exposed to a phosphor screen and
the differential gene expression patterns were analyzed
by densiometric analysis.
114
Regulation of the tissue-specific gene
expression
Research Summary
The overall goal of this project is to
study at molecular level the tissuespecific gene expression in human cells.
Our working model is the human growth
hormone gene (HGH-N) specifically
transcribed in the anterior pituitary and
mapped at chromosome 17q23.3 in the
"HGH-HPL" locus. This is a gene-cluster
with other four closely related genes
(HGH-V, HPL-3 y HPL-4), but
specifically transcribed in placenta
tissue. In addition, we started the study
of the tissue-specific transcriptional
control of the human "HLH-HCG" locus,
located at chromosome 19q13.3, and
also expressed in pituitary or placenta
tissues. We are analyzing the promotor
and enhancer regions, identifying the
cis-DNA elements, and cloning the
transcription factors involved in the
tissue-specific transcriptional control.
Publicaciones/Publications:
A new area of research and
development in our laboratory, is to setup new approaches to study differential
expression of mRNAs: DD-RTPCR and
DNA Microarrays techniques. We are
involved in two new goals: (1)
Identification and cloning of genes
specifically expressed in human
pituitary tumours. This approach can
lead us to improve our understanding of
pituitary gene-expression control, and
use this knowledge to develop new
therapeutic agents; (2) Identification of
genes diferentially expressed in
receptive versus non-receptive human
endometrium. Using two cell lines with
extreme receptive phenotype and
screening genome-wide gene
expression using DNA Microarrays and
DD-RTPCR, we are finding new genes
involved in the receptive or nonreceptive status. This approach can
lead us to improve our understanding of
endometrial receptivity and use this
knowledge to optimize it in infertility
patients or to alter it as an interceptive
procedure.
Castrillo, J.L. and Barrera-Saldaña,H.A. (1999) "El gen
HGH-N y su regulacion hipofisaria". Ciencia, 1 (4) 333
Castrillo,J.I., Dueñas,M., Bassy,O., Castrillo,J.L. and
Ugalde,U. (1999) "Use of Aspergillus Nidulans amds
gene as a dominant selectable marker in nonconventional Kluyveromyces yeasts" Current Genetics,
35 (3-4), 447
Valin, A., Cosano, J., Castrillo, J.L. And Esbrit, P. (1999)
"Parathyroid hormone-related protein [107-139]
induces c-Fos expression and AP-1 activity in
osteoblastic osteosarcoma UMR-106" Bone, 23, 14
Martínez-Conde, A., Mayor, P., García-Uría, J.,
Castrillo, J.L. And Jiménez, O. (2000) "A new mRNA
homologous to 60-Kd Ss-A/Ro/RNPAA mRNA is highly
expressed in a GH producing human pituitary tumor" J.
Endocrinol.,167, 40
Martin, J., Avila, S., Jimenez, O., Mayor, P. Martínez, A.,
Pellicer, A., Castrillo, J.L. And Simon, C.(2000).
"Differential Gene Expression in high versus low
endometrial receptivity status" Fertility & Sterility, 74, 91
Jiménez, O., Martínez-Conde, A., García-Uría, J.,
Castrillo, J.L. And Mayor, P. (2000) "Mitochondrial genic
expression in GH-secreting pituitary tumors"
J. Endocrinol.,167, 41
Tesis Doctorales/Doctoral Thesis
Ana Güell Ferré. "El factor de transcripción GHF-1/PIT1 y su interacción con los receptores nucleares de
hormonas". Abril-1999.
Differential display (DD-RT-PCR)
Geles de alta resolución DD-RT-PCR usando RNAs
totales extraídos de tumores hipofisarios humanos y
analizados usando diferentes combinaciones de oligos
específicos y aleatorios. Todas las reacciones DD-PCRs
se realizaron y cargaron en duplicado para verificar su
reproducibilidad. La representación diferencial de los
cDNSs permite detectar patrones específicos de
expresión génica. Nosotros hemos purificado 120 bandas
expresadas diferencialmente. Un 25% han sido clonadas
y secuenciadas. Hemos identificado los genes mediante
análisis informático y estamos en la actualidad
profundizando en los estudios funcionales.
High resolution Differential Display (DD-RT-PCR) gel
using total RNAs from human pituitary tumors, analyzed
with different anchored and arbitary primer pairs. All DDPCRs are run and loaded on the gel in duplicate to verify
pattern reproducibility. Differential display of the cDNA
preparations shows distinct patterns of gene expression.
We have currently purified 120 differentially expressed
bands. Approximately 25% of them have been cloned
and sequenced. We are identifying the genes by computer
analysis before go forward with functional analysis.
115
Regulación de la
expresión génica
Regulation of gene
expression
E.15
Iniciación interna de la traducción en mRNAs
eucarióticos.
Resumen de Investigación
JJefe de Línea / Group Leader:
Encarnación Martínez-Salas
Personal científico / Scientific Staff:
Ricardo Ramos Ruiz
Becarios Postdoctorales /
Postdoctoral Fellows:
Esther Lafuente Duarte
Sonia López de Quinto
(desde enero 2000)
Becarios Predoctorales / Graduate
Students:
Sonia López de Quinto
(hasta enero 2000)
Olga Fernández Miragall
Técnicos de laboratorio / Technical
Assistance:
Emilio Cano Cabezas
Algunos mRNAs eucarióticos que son
traducidos en condiciones de estrés celular
agudo (apoptosis, infecciones virales, etc.)
contienen en su region 5´ no traducida
elementos que dirigen la entrada del
ribosoma a un codon de iniciación interno,
denominados IRES. Los objetivos de
nuestro grupo se han centrado en 1)
identificar regiones estructurales del IRES
del virus de la fiebre aftosa (FMDV) y
hepatitis C (HCV) esenciales para su
actividad, 2) identificar interacciones del
IRES con proteínas celulares que reclutan
la maquinaria de traducción a las cercanías
del AUG iniciador, 3) determinar el valor
predictivo de la secuencia del IRES y NS5
en pacientes afectados de hepatitis C con
la respuesta al tratamiento combinado de
interferón y ribavirina, y 4) estudiar el
mecanismo de selección del AUG iniciador
de la traducción dependiente de IRES.
Estos estudios han sido claves para
entender la biología de los elementos IRES,
identificar regiones contra las que dirigir
drogas antivirales, así como potenciar el
uso de IRES en vectores de expresión
bicistrónicos.
La demostración de interacciones terciarias
RNA-RNA entre dominios del IRES de
FMDV in vitro, en condiciones que se
asemejan a las de una infección, tiene
implicaciones biológicas de gran relevancia.
El dinamismo encontrado en la formación
de estos complejos que depende de la
concentración de RNA, de la temperatura
y de las condiciones iónicas del ensayo,
sugiere que la eficiencia de traducción a lo
largo del ciclo infeccioso podría estar
modulada por cambios en la interacción
RNA-RNA entre dominios.
Recientemente hemos mapeado el sitio de
interacción de los factores de iniciación de
la traducción eIF4B y eIF4G en la región
3´ del IRES de FMDV. En particular, la
interacción de eIF4G es esencial para la
actividad del IRES, existiendo una
correlación perfecta entre caída de actividad
y pérdida de la interacción con eIF4G. Con
estos datos hemos propuesto un modelo
(Figura 1) por el que el IRES estaría
conectado directamente con eIF4G, que a
su vez interaccciona con eIF3 y éste con
la subunidad 40S del ribosoma.
Representación esquemática de las interacciones RNA-RNA y RNA-proteína
en el IRES de FMDV. eIF4G, eIF4B, eIF3 y eIF2 corresponden a los factores
de iniciación de la transducción; PTB, polypirimidin binding protein; 40S, la
subunidad pequeña del ribosoma.
116
Internal initiation of translation in eucariotic
mRNAs
Research Summary
A subset of eukaryotic mRNAs which are
translated under acute cellular stress (viral
infections, apoptosis, etc., ) usually contain
long 5´untranslated regions, known as
IRES, involved in directing ribosomal entry
to an internal start codon. The research
interests of our group have been focused
to 1) the study of essential structural
regions in the IRES of foot-and-mouth
disease virus (FMDV) and hepatitis C
(HCV), 2) the identification of RNA-protein
interactions involved in the recruitment
of the translational machinery to the
vicinity of the start codon, 3) to determine
the predictive value of the HCV IRES
sequence as well as the NS5 region with
the response to the combined treatment
of interferon plus ribavirin, and 4) to
identify the parameters affecting start
codon selection in IRES-dependent
translation initiation. The results obtained
have provided new insights into the
biology of IRES elements, including the
identification of key regions that constitute
essential targets for antiviral drugs.
Additionally the understanding of IRESmediated translation is crucial to its use
in bicistronic expression vectors.
We have identified long-range RNA
interactions between separated domains
of the IRES in vitro, under conditions
which resemble the viral infection
environment. Complex formation was
dependent upon RNA concentration,
temperature and ionic conditions. The
dynamism observed in these interactions
may be of important biological relevance
to govern translational efficiency during
the changes in ionic conditions observed
along the viral infection cycle.
Publicaciones/Publications:
López de Quinto S. and Martínez-Salas, E. (1999).
"Involvement of the aphthovirus RNA sequence located
between both functional AUGs in start codon selection".
Virology 255, 324-336
Martínez-Salas, E. (1999). "Internal ribosome entry site
(IRES) biology and use in gene expression vectors". Curr.
Opin. Biotechnol. 10, 458-464
Ramos, R., and Martínez-Salas, E. (1999) "Long-range
interactions in aphthovirus internal ribosome entry site
elements". RNA 5, 1374-1383
Sáiz, J-C., López de Quinto, S., Ibarrola, N., LópezLabrador, F-X., Sánchez-Tapias, J-M., Rodés, J., and
Recently we have mapped the interaction
site of the eukaryotic initiation factors
eIF4B and eIF4G in the 3´ region of the
FMDV IRES. Interestingly, the eIF4GIRES interaction is a key determinant of
IRES activity, as shown by the correlation
between eIF4G interaction and IRES
activity in FMDV IRES mutants. In
agreement with these results we have
proposed a working model to explain
IRES-dependent translation initiation
(Figure 1). In essence, the eIF4G protein
binds directly to the RNA sequence of the
IRES element and to eIF3, which in turn
is linked to the 40S ribosomal subunit.
Martínez-Salas, E. (1999). "Internal initiation of translation
efficiency in different hepatitis C genotypes isolated from
Interferon responder and non-responder patients". Arch.
Virol. 144, 1-15
Ibarrola, N., Moreno-Monteagudo, J.A., Sáiz, M., GarcíaMonzón, C., Sobrino, F., García-Buey, L., Iacono, O. L.,
Moreno-Otero, R., and Martínez-Salas, E. (1999).
"Response to retreatment with Interferon alpha plus
ribavirin in chronic hepatitis C is independent of the NS5A
gene nucleotide sequence". Amer. J. Gastroenterol. 94,
2487-2495
Martínez-Salas, E. López de Quinto, S., and R. Ramos.
(1999) "Requirement of structural motifs in the internal
ribosome entry site of picornavirus for translation initiation".
Recent Res. Dev. Virol. 1, 173-182
Bigeriego, P., Rosas, M.F., Zamora, E., Martínez-Salas,
E., and Sobrino, F. (1999). "Heterotypic inhibition of footand-mouth disease virus infection by combinations of
RNA transcripts corresponding to the 5´ and 3´ regions"
Antiviral Res. 44, 133-141
López de Quinto S., and Martínez-Salas, E. (2000).
"Interaction of the eIF4G initiation factor with the
aphthovirus IRES is essential for internal translation
initiation in vivo". RNA 6, 1380-1392
Tesis Doctorales/Doctoral Thesis
"Estudio de las bases moleculares de la iniciación interna
de la traducción en RNAs de picornavirus". Sonia López
de Quinto. Enero, 2000. Universidad Autónoma de Madrid.
Schematic representation of RNA-RNA and RNA-protein interactions in the
FMDV IRES. eIF4G, eIF4B, eIF3 and eIF2 depict translation initiation factors;
PTB, the polypirimidin binding protein; 40S, the small ribosomal submit.
117