Unidad9. Principios de Ingeniería Genética Aplicaciones de

Unidad9. Principios de Ingeniería Genética
Aplicaciones de Biología Molecular
• Aislamiento, análisis y manipulación de ácidos
nucleicos
Análisis de Ácidos Nucleicos por Espectrofotometría
Espectro de
absorción de DNA
Estimación de la
concentración de A.N. por
espectrofotometría
A260 = 1
50 µg/ml DNA dc
• Generación de moléculas de DNA recombinante
33 µg/ml DNA cs
• Ingeniería Genética
40 µg/ml RNA
También se mide la
relación de abs.
A260/ A280 => 1.8-2.0
AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS (DNA)
Lisis celular y de núcleos en el caso de eucariontes (para DNA)
(detergentes, proteasas, cambios de presión)
ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Separación en geles de agarosa (1–4%)
Electroforesis horizontal.
Separación del DNA del resto de los componentes celulares
(principalmente proteínas). Desnaturalizantes de proteínas,
solventes (fenol-cloroformo)
Repetir la extracción. Eliminación del fenol.
Migran al ánodo
Tinción con bromuro de etidio
Intercala entre las bases del DNA
Forman complejos fluorescentes
Formación de sal de ácido nucleico y precipitación con etanol o
isopropanol
Disolver el DNA (Se concentra)
Análisis del DNA
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Herramientas para el análisis de DNA.
Enzimas de restricción y sus sitios de corte
VECTORES DE CLONACIÓN: PLÁSMIDOS
• Son purificadas de bacterias
•Las enzimas de restricción son
endonucleasas
•Rompen en sitios específicos del
DNA
•Reconocen secuencias
palíndromicas específicas de 4; 6
o 8 pb
•Algunas generan extremos
romos y otros extremos cohesivos
en el DNA al que cortan
LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN CORTAN DEJANDO
EXTREMOS COHESIVOS “STICKY”
DNA de un plásmido
digerido con EcoRI
DNA genómico
digerido con EcoRI
INSERCIÓN DE DNA FORÁNEO EN UN PLÁSMIDO (VECTOR)
Corte del DNA con enzimas de restricción
Ligación del DNA foráneo con una DNA ligasa, incorporándolo al vector
Plásmido
DNA de interés
Tratamiento con
enzima de restricción
Extremos son compatibles
Fragmentos de DNA con
extremos cohesivos
compatibles
Se aparean las bases de los extremos cohesivos y la DNA ligasa
forma el enlace fosfodiéster entre la G y la A en ambas cadenas
Mezclar los
fragmentos en
presencia de una
DNA ligasa
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CONSTRUCCIÓN DE UNA
BIBLIOTECA GENÓMICA
BÚSQUEDA DE UN GENE EN LA BIBLIOTECA GENÓMICA o DE cDNA
Membrana de nylon o nitrocelulosa
Una biblioteca de DNA genómico
es un conjunto de fragmentos
de DNA de un organismo y
empaquetados en
vectores (plásmidos), que son
mantenidos en células
bacterianas.
Digestión
con enzimas
de restricción
Incubación con
las sonda y
lavado
Colonias con el
plásmido de
interés
Sonda: DNA de
cadena sencilla
marcado con 32P
DNA fragmentado
y clonado en plásmidos
Caja Petri con
colonias de
bacterias
Introducción de los
plásmidos en bacterias
TÉCNICAS DE HIBRIDIZACIÓN DEL DNA
DESNATURALIZACIÓN-RENATURALIZACIÓN
Se hace una réplica
de las colonias en la
membrana
Lisis de las
bacterias y
desnaturalización
del DNA con
NaOH
Exposición a un
film fotográfico.
Detección de
colonias con el
plásmido de
interés.
SÍNTESIS DE cDNA y construcción de una biblioteca
de cDNA
Selección del tejido
Extracción de RNAm
Hibridar con oligo-dT
Síntesis de cDNA con
una transcriptasa
reversa
DNA de
doble hélice
Desnaturalización:
se genera DNA de
cadena sencilla
Renaturalización:
se forma DNA
duplex
Eliminación del RNA
Las transcriptasas
reversas son
enzima virales.
Sintetizan DNA
usando RNA como
molde
Síntesis de la segunda
cadena de DNA
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Transferencia en Southern
El número de copias del fragmento de DNA aumenta
exponencialmente
Desarrollo de la Técnica de Reacción en Cadena
de la Polimerasa (PCR)
Thermus aquaticus
Taq
DNA Polimerasa
Great Fountain Geyser,
Yellowstone. Manantial
Temperatura 55-80°C
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La reacción de PCR tiene múltiples
aplicaciones
• Detección de alelos mutantes caracterizados.
• Búsqueda de alelos mutantes no conocidos.
• Identificación de microorganismos patógenos.
– Caracterización de cepas del virus de la influenza
• Aislamiento de moléculas de DNA genómico y de
cDNA (Clonación de genes)
• Secuenciación de DNA
• Generación de mutantes puntuales.
• Estudiar la expresión génica.
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La era genómica. Secuenciación de DNA
SECUENCIACIÓN DE DNA
La era genómica. Secuenciación de DNA
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Secuenciación de Genomas
Mapeo basado en el análisis de RFLP (polimorfismo basado en la
longitud de fragmentos de restricción)
A lo largo del genoma de cada individuo hay diferencias sutiles en la
secuencia del DNA. Estos cambios son de una sola base.
Estos cambios pueden generar la formación de un sitio de
reconocimiento para enzimas de restricción por lo que el patrón de
corte de una enzima de restricción para cada individuo va a ser
único.
Individuo 1
Homocigoto
Homocigoto
Aplicaciones de Biología Molecular
Individuo 2
Este es el fundamento de pruebas de paternidad.
Mapeo basado en el análisis de RFLP (polimorfismo basado en
la longitud de fragmentos de restricción)
Diagnóstico genético. PCR
Producción de proteínas recombinantes en bacterias
Plantas genéticamente modificadas. Plantas transgénicas
Terapia génica
heterocigoto
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Esta prueba también se utiliza en peritaje forense para obtener
la “huella genética”
Mancha de
Sangre
El DNA se extrae
de las células
sanguíneas
Digestión del DNA con
enzimas de restricción
Se han mapeado genes anormales causantes de enfermedades
Distrofia Muscular
Enf. de Gaucher
Hemofilia
Cáncer de colon
Neurofibromatosis
Retinitis pigmentosa
Esclerosis lateral
Enf. Huntington
Inmunodeficiencia ADA
Poliposis
Hemocromatosis
Hipercolesterolemia
Se utiliza la
técnica de
Southern
blot
Amiloidosis
Sonda de DNA
marcada se une
específicamente
Southern blot
Fibrosis cística
Los fragmentos de DNA se
separan por electroforesis
Cáncer de mama
Exostosis múltiple
Melanoma maligno
Enfermedad
policística de hígado
Neoplasia endócrina
Enfermedad de
Tay-Sachs
La membrana se lava y se revela
para detectar bandas de
interacción DNA-DNA
El patrón de DNA se
compara con el de
“sospechosos”
Anemia falciforme
Alzheimer
Fenilcetonuria
Retinoblastoma
Diagnóstico genético. PCR
Debido a que las mutaciones más comunes que son responsables de
estas enfermedades ya están caracterizadas, se han establecido
algunas pruebas genéticas:
Pruebas diagnósticas. Establecen o confirman el diagnóstico de un
individuo que ya está afectado.
Pruebas pre-sintomáticas. Determinan con un alto grado de certeza si
un individuo va a desarrollar alguna enfermedad.
Pruebas predictivas. Indican un elevado riesgo de una enfermedad
pero no pueden establecer con certeza si un individuo va a estar
afectado.
Estas pruebas genéticas son especializadas pues muchas de ellas
involucran la amplificación del fragmento de DNA correspondiente
al gen que se busca y la secuenciación del gen.
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Producción de proteínas recombinantes en bacterias.
Aplicaciones en Biotecnología Vegetal
• Plantas transgénicas que expresan proteínas que le
confieren alguna propiedad agronómica
importante:
– Resistencia a plagas de insectos
– Resistencia a herbicidas
– Resistencia a virus
• Detección de microorganismos patógenos en
plantas por métodos moleculares.
– Virus, bacterias, micoplasmas
Escalamiento y purificación de la proteína
El mejoramiento tradicional de plantas implica hacer una cruza
entre genotipos distintos para incorporar un carácter y luego hacer
selección y autocruzas para obtener un homocigoto.
Patrón de herencia Mendeliana. Puede llevar varios años hasta
obtener el homocigoto con los caracteres deseados.
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La ingeniería genética de plantas implica el aislamiento de un
gen de cualquier especie e incorporarlo en plantas para que
tengan una nueva característica.
Una limitación importante es
la transformación
(introducción del DNA) de
céluals vegetales.
Resistencia a plagas de insectos. Gusano barrenador en maíz.
Transformación por bombardeo
En las esporas de Bacillus thuringiensis se acumulan proteínas (Cry) con
actividad insecticida.
Toxinas Bt
Transformación por Agrobacterium tumefaciens
Mecanismo de acción de las toxinas Bt
El insecto ingiere la protoxina al
alimentarse del tejido de la planta
La toxina se une a receptores en
las cel. epiteliales del intestino
La protoxina sufre proteólisis en
el intestino del insecto y se
genera la toxina activa
La toxina se oligomeriza y forma
poros en la MP de la cel. epitelial
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La toxina Bt es orgánica, por lo tanto es biodegradable
Por el uso de cultivos Bt resistentes a insectos:
El caso de maíz en México.
Se reduce el número de aplicaciones de insecticidas.
México es el centro de origen del maíz. Hay amplia diversidad y
especies de maíz silvestre en México.
Se incrementa el rendimiento
Transferencia de genes a estas especies.
El uso de estos cultivos se ha incrementado mundialmente en
los últimos años:
Controversias sobre plantas transgénicas.
• Los vectores para la transformación de plantas tienen
marcadores de resistencia a antibióticos como marcadores de
selección. La presencia ubicua de estos genes pueden facilitar la
transferencia resistencia a antibióticos a bacterias pátogenas.
• Generalmente los marcadores de selección son KanR y NeoR
• Escape de genes del cultivo transgénico a malezas.
Generación de supermalezas resistentes a herbicidas.
Reducción en la diversidad?
Animales transgénicos. Ratones “knock-out”
Aislar el gen de interés y clonarlo en un vector.
Interrumpir el gen con una secuencia de DNA que
confiera resistencia a un antibiótico.
Transformar células embrionarias totipotenciales con la
secuencia quimérica de DNA.
Seleccionar las células transformadas en presencia del
antibiótico.
Inyectar las células a embriones de ratón.
Transferir los embriones a una hembra para su
desarrollo.
En la camada se obtendrán ratones heterocigotos (x/-)
Hacer una cruza entre dos heterocigotos.
El 25% será (-/-).
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