PreProyecto_MAUNE_Federico

Área de Posgrado Ciencias de las Plantas y Recursos Naturales
Pre-proyectos de Tesis Ciclo 2009
Título:
BASES GENÉTICAS DE LAS BARRERAS PRE-CIGÓTICAS A LA HIBRIDACIÓN EN
ESPECIES TUBEROSAS DE SOLANUM
Lic. Genética Juan Federico Maune
Introducción
La papa común, Solanum tuberosum spp. tuberosum (tbr, 2n=4x=48), es uno de los cultivos de
mayor importancia mundial en cuanto a superficie plantada y uno de los principales componentes de la
dieta humana, junto al trigo, el maíz y el arroz. En la Argentina, se cultivan alrededor de 100.000 has. por
año; 80% de esa superficie se ubica en las provincias de Córdoba y Buenos Aires y el resto se distribuye
en Mendoza, Santa Fe y Tucumán. La estrecha base genética de esta especie y su herencia tetrasómica
hacen que los avances en el mejoramiento sean lentos. Pero hay aproximadamente 200 especies
tuberosas y etuberosas silvestres emparentadas (Hawkes, 1990), que constituyen un importante
reservorio de diversidad genética y una valiosa fuente de resistencias heredables a agentes bióticos y
abióticos adversos (Ross, 1986). Estas especies crecen desde el sur de Estados Unidos, pasando por
América Central y siguiendo la línea de los Andes, hasta el sur de Chile, extendiéndose hacia el este, a
través de nuestro país, hasta Paraguay, Uruguay y Brasil.
Las especies tuberosas de Solanum son alógamas y se reproducen por semillas y tubérculos. La
alogamia es debida a un sistema de autoincompatibilidad gametofítica, gobernado por el locus S, que
previene la fecundación cuando el polen lleva un alelo S igual a uno de los alelos S del pistilo. Este gen
es polimórfico y ha sido clonado en varias especies silvestres, revelando una estructura común con cinco
regiones conservadas y regiones hipervariables, que determinan la especificidad de los alelos S (Kirch y
col., 1992; Matton y col., 1999). En especies del género Nicotiana (familia Solanaceae), se ha
determinado que el locus S codifica una ribonucleasa, determinante de la reacción de incompatibilidad a
nivel del estilo (de Nettancourt, 2001).
En general, es posible realizar cruzamientos controlados entre las especies silvestres y las formas
cultivadas. En su mayoría, los híbridos que se obtienen son vigorosos y presentan un alto porcentaje de
apareamiento cromosómico debido, principalmente, a que no existe una importante diferenciación
cromosómica entre especies (Ramanna y Hermsen, 1979; Masuelli y Camadro, 1992). Por ello, es
posible incorporar pequeños segmentos cromosómicos de las especies silvestres a las formas
cultivadas, tanto para introducir resistencias heredables como para ampliar la base genética e
incrementar la heterocigosis, positivamente relacionada con el rendimiento. Sin embargo, cerca del 70 %
de las especies silvestres de papa son diploides (2n=2x=24) y muchas de ellas no se pueden cruzar en
forma directa con la papa común debido a la presencia de barreras internas a la hibridación. Estas
barreras pueden ser pre-cigóticas, que inhiben la germinación del grano de polen o el crecimiento del
tubo polínico en el pistilo, y post-cigóticas, que producen muy frecuentemente el aborto del endosperma
en cruzamientos interploides o, en mucha menor frecuencia, el aborto del embrión (Masuelli y Camadro,
1997).
La principal barrera pre-cigótica a la hibridación es la incompatibilidad cruzada o incongruencia (de
Nettancourt, 2001, Camadro y col., 2004, y Kermicle, 2006). Esta barrera puede resultar de la falta de
información, en una de las partes (polen o pistilo) con respecto a la otra, para una función determinada
(Hogenboom, 1973), o pude deberse a genes que funcionen específicamente para reconocer el origen
externo del polen y bloquear una reacción que, de otro modo, sería compatible (Kermicle, 2006). Esta
incompatibilidad cruzada, a su vez, puede ser unilateral (es decir, el cruzamiento recíproco es
compatible) o bilateral. A diferencia del sistema de autoincompatibilidad, extensamente estudiado en
diversas especies tanto a nivel genético como molecular y fisiológico (ver de Nettancourt, 2001), el
conocimiento de las bases de la incompatibilidad cruzada es aun fragmentario. Al respecto, algunos
autores han propuesto la hipótesis de una función dual del locus S (Camadro y col., 2004). Sin embargo,
los sitios de inhibición del crecimiento del tubo polínico difieren entre la reacción de autoincompatibilidad
y la de incompatibilidad cruzada y tanto la incompatibilidad cruzada, unilateral como la bilateral, existen
en especies con o sin sistemas de autoincompatibilidad. Así, numerosos autores se han inclinado por la
hipótesis alternativa del control genético de la incompatibilidad cruzada mediante un sistema
independiente del locus S (Camadro y col., 2004). Por ejemplo, Camadro y Peloquin (1981) propusieron
un modelo en Solanum, en el que genes dominantes de incompatibilidad cruzada en el estilo previenen
la fertilización por parte de aquel polen que posee genes específicos complementarios. Además, Evans y
Kermicle (2001) identificaron una región cromosómica en teosinte (especie autocompatible) que controla
en forma dominante la restricción a su cruzamiento con el maíz (también autocompatible). No existe
información alguna, sin embargo, sobre las bases moleculares o fisiológicas de la incompatibilidad
cruzada.
Para poder determinar el control genético y molecular de las barreras pre-cigóticas a la hibridación
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en especies tuberosas del género Solanum es necesario:
a. Realizar cruzamientos recíprocos entre especies tuberosas silvestres del género Solanum y entre
éstas y la papa cultivada, S. tuberosum ssp. tuberosum
b. Determinar las relaciones de compatibilidad polen-pistilo en dichos cruzamientos
c.
Identificar el momento de inhibición del crecimiento de los tubos polínicos en los cruzamientos
incompatibles
d. Seleccionar una muestra de cruzamientos compatibles en ambas direcciones, incompatibles
unilateralmente e incompatibles en ambas direcciones y analizar la expresión diferencial de genes
en pistilos polinizados
e. Clonar, secuenciar y anotar ADNc polimórficos en combinaciones genotípicas de los tres tipos de
cruzamientos
f.
En una muestra mayor de combinaciones genotípicas, establecer la relación entre los
polimorfismos que se observen y las reacciones de compatibilidad polen-pistilo
Estas actividades exceden los tiempos acotados para la realización de una tesis de maestría. Por
ello los objetivos que se establecen son los mencionados en los incisos a, b y c, para poner a prueba las
siguientes hipótesis:
En cruzamientos interespecíficos de especies tuberosas de Solanum, incompatibles en el nivel
polen-pistilo:
1. el tiempo que transcurre desde la polinización hasta la detención del crecimiento del tubo polínico es
función del sitio en el que se produce la reacción de incompatibilidad;
2. las reacciones de incompatibilidad están controladas por genes dominantes en el polen y genes
complementarios dominantes en el pistilo, que pueden segregar.
Materiales y Métodos:
(a) Cruzamientos controlados entre especies silvestres del género Solanum y S. tuberosum:
Se utilizarán las especies silvestres S. chacoense (chc, 2n=2x=24, 2NBE), S. gourlayi (grl,
2n=2x=24, 2NBE y 2n=4x=48, 4NBE) y S. spegazzinii (spg, 2n=2x=24, 2NBE), y S. tuberosum (tbr,
2n=2x=24, 2NBE y 2n=4x=48, 4NBE). Se cultivarán diez plantas en macetas individuales por cada una
de dos introducciones por especie silvestre, tres haploides de tbr y tres variedades comerciales de papa
en una jaula antiáfidos. Se realizarán cruzamientos intra- e interespecíficos recíprocos en todas las
combinaciones genotípicas posibles bajo un diseño dialélico incompleto.
(b) Determinación de las relaciones de compatibilidad polen-pistilo en los cruzamientos mencionados en (a):
Se utilizará la técnica de Martin (1958). Transcurridas 48 h después de la polinización, se fijarán tres
pistilos polinizados por combinación de genotipos en FAA (1 formaldehído: 8 etanol: 1 ácido acético
glacial, v/v/v), se los incubará a temperatura ambiente por 4 h en una solución de NaOH 8 N, y, tras
haber sido sometidos a una serie de enjuagues en agua destilada se los teñirá por inmersión en azul de
anilina decolorada durante 2-4 h. Posteriormente serán montados sobre una gota de glicerina en un
portaobjetos, aplastados con un cubreobjetos, y visualizados en un microscopio con luz ultravioleta. Las
reacciones serán clasificadas en: (1) compatibles (los tubos polínicos alcanzan los óvulos) o (2)
incompatibles a nivel del (A) estigma (el polen no germina o germina pero el tubo polínico no se
desarrolla), (B) primer tercio, (C) segundo tercio o (D) tercer tercio del estilo (los tubos polínicos se
detienen en el primero, segundo o tercer tercio del estilo, respectivamente).
(c)
Identificación del momento de inhibición del crecimiento de los tubos polínicos en cruzamientos
incompatibles:
A partir del análisis realizado en (b) se seleccionará una muestra de combinaciones genotípicas
incompatibles de manera que estén representados los distintos sitios de detención del crecimiento de los
tubos polínicos en el pistilo. Se realizarán nuevas polinizaciones y se fijarán pistilos en intervalos de 1 h
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a partir de los 30 min posteriores a la polinización y hasta las 24 h post-polinización. Los pistilos serán
procesados de acuerdo con la técnica descrita en (b), y se tomarán fotografías digitales de cada uno con
una cámara montada en el microscopio. Posteriormente se determinará la longitud de los tubos polínicos
y del pistilo mediante la utilización de un programa de edición y procesamiento de imágenes en una
computadora. Los valores de longitud de los tubos polínicos serán corregidos por la longitud del pistilo,
de ser necesario. Se analizarán estadísticamente los promedios de longitud de los tubos polínicos en
cada momento de muestreo comparado con el inmediatamente anterior, y se estimará el momento de
detención de su crecimiento de acuerdo con los momentos de muestreo entre los que no haya
diferencias significativas.
Bibliografía:
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