David García Crespo
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55 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y PATOGENIA MOLECULAR DEL SCRAPIE David García Crespo 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 3 TESIS DOCTORALES N.° 55 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y PATOGENIA MOLECULAR DEL SCRAPIE Memoria presentada por D. David García Crespo para optar al grado de Doctor en Bioquímica por la Universidad del País Vasco NEKAZARITZA, ARRANTZA ETA ELIKADURA SAILA DEPARTAMENTO DE AGRICULTURA, PESCA Y ALIMENTACIÓN Eusko Jaurlaritzaren Argitalpen Zerbitzu Nagusia Servicio Central de Publicaciones del Gobierno Vasco Vitoria-Gasteiz, 2006 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 4 GARCÍA CRESPO, David Desarrollo de métodos moleculares y su aplicación al estudio de la resistencia genética y patogenia molecular del Scrapie / memoria presentada por David García Crespo para optar al grado de Doctor en Bioquímica. – 1a ed. – Vitoria-Gasteiz : Eusko Jaurlaritzaren Argitalpen Zerbitzu Nagusia = Servicio Central de Publicaciones del Gobierno Vasco, 2006 p. ; cm. – (Tesis doctorales ; 55) Tesis-Universidad del País Vasco ISBN 84-457-2142-9 1. Encefalopatía espongiforme-Tesis doctorales. I. Euskadi. Departamento de Agricultura, Pesca y Alimentación. II. Título III. Serie 619:616.831:636.3(043) Edición: 1.a Enero 2006 © Administración de la Comunidad Autónoma del País Vasco Departamento de Agricultura, Pesca y Alimentación Internet: www.euskadi.net Edita: Eusko Jaurlaritzaren Argitalpen Zerbitzu Nagusia Servicio Central de Publicaciones del Gobierno Vasco Donostia-San Sebastián, 1 - 01010 Vitoria-Gasteiz Fotocomposición: Composiciones RALI, S. A. Particular de Costa, 8-10, 7.ª - 48010 Bilbao Impresión: Lankopi, S. A. Colón de Larreategui, 16 - 48001 Bilbao ISBN: 84-457-2142-9 D.L.: BI-473-06 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 5 AUTORIZACION DEL/LA DIRECTOR/A DE TESIS PARA SU PRESENTACION Los Dres. Ana Hurtado Esgueva y Ramón A. Juste Jordán como Directores de la Tesis Doctoral: Desarrollo de Métodos Moleculares y su Aplicación al Estudio de la Resistencia Genética y Patogenia Molecular del Scrapie realizada en el Departamento de Microbiología, Inmunología y Parasitología por el Doctorando Don. David García Crespo autorizan la presentación de la citada Tesis Doctoral, dado que reúne las condiciones necesarias para su defensa. En Derio a 7 de Julio de 2005 DIRECTORES DE LA TESIS 5 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 7 RATIFICACION DEL/LA TUTOR/A Dr/a. Ramón Cisterna Cancér como Tutor/a de la Tesis Doctoral del Doctorando Don/ña. David García Crespo ratifico la autorización del/la Director/a para la presentación de la Tesis Doctoral que lleva por título Desarrollo de Métodos Moleculares y su Aplicación al Estudio de la Resistencia Genética y Patogenia Molecular del Scrapie realizada en el Departamento de Sanidad Animal del Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (Neiker). En Leioa a 7 de Julio de 2005 EL/LA TUTOR/A DE LA TESIS Fdo.: RAMÓN CISTERNA CANCÉR 7 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 9 CONFORMIDAD DEL DEPARTAMENTO El Consejo del Departamento de Microbiología, Inmunología y Parasitología en reunión celebrada el día 22 de Abril de 2005 ha acordado dar la conformidad a la admisión a trámite de presentación de la Tesis Doctoral titulada: Desarrollo de Métodos Moleculares y su Aplicación al Estudio de la Resistencia Genética y Patogenia Molecular del Scrapie dirigida por el/la Dr/a. Ana Hurtado Esgueva y Ramón A. Juste Jordán y presentada por Don/ña. David García Crespo ante este Departamento. En Leioa a 7 de Julio de 2005 Vº Bº DIRECTOR/A DEL DEPARTAMENTO SECRETARIO/A DEL DEPARTAMENTO 9 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 11 11 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 13 A mis padres, hermanos y a Anita 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 15 AGRADECIMIENTOS Curiosamente sin darte cuenta te pones a pensar en toda la gente y situaciones que de un modo u otro han contribuido a terminar este trabajo, aportando desde un granito hasta montones de arena. Y más curioso aun es pensar como este fruto maduro y nacido hace cinco años es más que un conjunto de líneas. En primer lugar me gustaría agradecer a la directora de este trabajo, la Dra. Ana Hurtado Esgueva por saber encontrar en todo momento las pautas necesarias para el buen desarrollo de esta Tesis Doctoral y por algo muy importante, saber enseñar a aprender. Agradecer también al co-director, el Dr. Ramón A. Juste Jordán por saber discutir, criticar y orientar el trabajo realizado. Agradecer a ambos el haberme brindado esta oportunidad a pesar de los inconvenientes que hayan podido surgir. Aunque ya queda un poco lejos, no me gustaría terminar esta tesis sin dar las gracias a todas las personas que he conocido durante mis años en la universidad del País Vasco. Compañeros de clase presentes y ausentes, compañeros de laboratorio y a la Dra. Elena Vecino Cordero por alimentar esa motivación fundamental en mis primeros años de laboratorio. También agradecer a Ana García, Jessie Barandika y Nieves Gomez por la incondicional ayuda encontrada en ellos para la obtención de los animales, en las relaciones con los ganaderos y en acercarme al mundo veterinario. A Wilfred Goldmann y Stewart Burgess del Animal Health Institute de Edimburgo por ese mes que nunca olvidaré. A Bea, Dani, Leyre y a los compañeros del laboratorio P3 por su aportación al genotipado y en las pruebas rápidas. A mis compañeros de laboratorio Mara, Josune, Itziar, Jon Imanol, Iratxe, Iker, Vega, Xeider, Olaia, Natalia, Lucía, Idoia, Inés y al resto de compañeros de Neiker. A Gaskón, Rua, Chamero, Leolo y demás amigos por compartir nuestras vivencias doctorales y no doctorales en altura y en bajura. A mis padres por su apoyo y por haberme dado esta gran oportunidad que jamás olvidaré, sin duda, vuestra mejor herencia. A Elena, Iñaki, Rebeca, Pablo, Mertxe y al pequeño Eder por su compañía. Agradecer enormemente a la persona de la que he recibido un gran apoyo y que más ha vivido y sufrido esta última etapa. No solo por aguantar carros y carretas sino también por esos momentos que merecen la pena. De todo corazón, gracias Anita. 15 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 16 Finalmente terminar agradeciendo al colectivo naranja o precario que no da las gracias a todo aquello que supone trabas injustas en la carrera de los jóvenes investigadores. Por ese esfuerzo en luchar por mejorar la situación de la investigación en general y sobre todo la de los becarios. Porque investigar es trabajar. 16 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 17 El presente trabajo ha sido desarrollado en el Dpto. de Sanidad Animal del Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (Neiker-Derio). Este trabajo ha sido financiado por el Dpto. de Educación, Universidades e Investigación del Gobierno Vasco a través de una beca predoctoral y por los proyectos PI00-20 y EC2001-3 y por el Dpto. de Agricultura y Pesca del Gobierno Vasco. 17 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 19 ABREVIATURAS GFAP: Proteína ácida fibrilar glial GH: Hormona del crecimiento GP: Gen problema GPI: Glicosilfosfatidilinositol GSS: Enfermedad de Gerstmann-Sträussler-Scheinker HK: Constitutivo, endógeno, housekeeping HMBS: Hidroximetilbilano sintasa IFF: Insomnio falmiliar fatal IGF-1: Factor de crecimiento similar a la insulina tipo I IHQ: Inmunohistoquímica Kb: Kilobase LCN: Latxa cara negra LCR: Latxa cara rubia LINE: Elementos largos dispersos M: Parámetro que indica la estabilidad de un gen Mcl-1: Myeloid cell leukemia 1 MGB: Unión a surco menor MnSOD: Superoxido dismutasa dependiente de Mn mRNA: Acido ribonucleico mensajero MRP8: Factor inhibidor de migración NBD: 4-cloro-7nitrobenceno-2oxal-diazol NCBI: Centro Nacional de Información Biotecnológica NGF: Factor de crecimiento neuronal NLM: Nódulo linfático mesentérico nPrP: Niveles normalizados de mRNA del gen PrP OH: Grupo hidroxilo OIE: Oficina Internacional de Epizootias ORF: Marco de lectura abierto A: Adenina ACTB: b-actina Bax: Proteína X asociada a Bcl-2 Bcl-2: B-cell CLL/lymphoma 2 BSA: Seroalbúmina bovina C: Citosina CA: Cuantificación absoluta CAPV: Comunidad Autónoma del País Vasco CCD: Sensor de transferencia de carga (charge coupled device) CDF: Células dendríticas foliculares CR: Cuantificación relativa Ct: Ciclo de la PCR a tiempo real (threshold cycle) CV: Coeficiente de variación ddNTP: dideoxinucleotido 5’-trifosfato DNA: Ácido desoxiribonucleico dNTP: Deoxinucleotidotrifosfato E: Eficiencia de la amplificación por PCR E1: Exón 1 E2: Exón 2 E3: Exón 3 ECJ: Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob EEB: Encefalopatía espongiforme bovina EET: Encefalopatía espongiforme transmisible FN: Factor normalizador FRET: Transferencia de energía fluorescente mediante resonancia G: Guanina G6PDH: Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa GAPDH: Gliceraldehido 3-fostato deshidrogenasa 19 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 20 SDHA: Succinato deshidrogenasa SDS: Dodecil sulfato sódico sECJ: Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob esporádico SINE: Elementos cortos dispersos SNC: Sistema nervioso central SNP: Polimorfismo de DNA en una base SOD: Superoxido dismutasa dependiente de Cu y Zn T: Timina T1: Grupo de riesgo 1 T2: Grupo de riesgo 2 T3: Grupo de riesgo 3 T4: Grupo de riesgo 4 T5: Grupo de riesgo 5 Ta: Temperatura ambiente Tm: Temperatura de disociación TNFa: factor de necrosis tumoral a UBC: Ubiquitina C UE: Unión Europea UK-NSP: Plan Nacional sobre Scrapie del Reino Unido UTR: Región no codificante UV: Ultravioleta YWHAZ: Tirosina 3-monooxygenasa pb: Pares de bases PCR: Reacción en cadena de la polimerasa PD: Dímero de cebador PEG: Polietilenglicol PrPc: Proteína prión celular PrPSc: Proteína prión patológica PS: Polisacárido Q: Cantidad de mRNA QGP: Cantidad de mRNA del gen problema QHK: Cantidad de mRNA de un gen endógeno de referencia QR: Quencher R: Reporter RFLP: Polimorfismo el la longitud de los fragmentos de restricción RNA: Acido ribonucleico RNS: Especies reactivas de nitrógeno ROS: Especie reactiva de oxígeno RPL19: Proteína ribosomal L19 RT: Retrotranscripción RT-PCR: Retrotranscripción seguida de la reacción en cadena de la polimerasa SAF: Fibras asociadas a scrapie SD: Desviación estandar 20 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 21 Lista de los 20 aminoácidos con sus abreviaturas. Aminoácido Código Aminoácido Código Alanina Arginina Asparagina Ácido Aspártico Cisteína Fenilalanina Glutamina Acido Glutámínico Glicina Histidina Ala, A Arg, R Asn, N Asp, D Cys, C Phe, F Gln, Q Glu, E Gly, G His, H Isoleucina Leucina Lisina Metionina Prolina Serina Tirosina Treonina Triptófano Valina Leu, L Ile, I Lys, K Met, M Pro, P Ser, S Tyr, Y Thr, T Trp, W Val, V Código genético. La combinación de tres bases da lugar a un triplete específico que codifica para un determinado aminoácido. El triplete AUG es señal de iniciación durante la traducción del mRNA y las señales UAA, UAG, UGA son señales de parada. 21 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 23 ÍNDICE Capítulo 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1. El scrapie y las EETs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2. Etiología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3. Cepas priónicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.4. Síntomas clínicos y diagnóstico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.5. Patogenia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.6. Transmisión de las EETs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.7. El gen PrP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.7.1. Estructura del gen PrP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.7.2. Expresión del gen PrP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.7.3. Regulación de la expresión del gen PrP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.7.4. Susceptibilidad genética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.8. La proteína PrP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.8.1. Estructura y topología de la PrPc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . c 1.8.2. Funciones biológicas de la PrP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.8.2.1. Función antioxidante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.8.2.2. Homeostasis mineral del cobre y del calcio intracelular . . . . . . . . 1.8.2.3. Implicación en el ritmo circadiano y en el sueño . . . . . . . . . . . . . . 1.8.2.4. Señalización celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.8.2.5. Otras funciones protectoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.9. Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 29 33 37 38 39 42 43 43 45 46 47 50 50 53 54 55 55 55 56 58 Capítulo 2. MATERIALES Y MÉTODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1. Obtención de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.1. Obtención de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.1.1. Extracción de DNA a partir de muestras de sangre . . . . . . . . . . . . 2.1.1.2. Extracción de DNA a partir de muestras de tejido . . . . . . . . . . . . . 2.1.1.3. Extracción de DNA a partir de muestras de tejido en parafina . . . . 2.1.1.4. Purificación de plásmidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.2. Obtención de RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2. Concentración, pureza e integridad de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3. PCR cualitativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.1. Fundamento teórico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.2. Componentes y optimización de la reacción de amplificación . . . . . . . . . . . 59 61 61 61 61 62 62 63 64 65 65 66 23 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 24 2.3.2.1. Calidad del DNA molde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.2.2. Diseño de los cebadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.2.3. DNA Polimerasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.2.4. Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.2.5. Sales de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.2.6. Temperatura y número de ciclos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.3. Contaminaciones en la PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.4. Detección del producto de PCR. Electroforesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.5. Purificación de productos de PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . PCR a tiempo real . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.1. Fundamento teórico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.2. Detección del producto de PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.2.1. Sondas TaqMan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.2.2. SYBR Green . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.3. Componentes y optimización de la reacción de amplificación . . . . . . . . . . . 2.4.3.1. Componentes de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.3.2. Diseño de cebadores, sondas y amplicón . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.4. Parámetros en PCR a tiempo real . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.5. Análisis cualitativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.5.1. Detección de patógenos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.5.2. Detección de SNPs con sondas TaqMan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.6. Análisis cuantitativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.6.1. Cuantificación absoluta (CA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.6.2. Cuantificación relativa (CR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . PCR-RFLP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Clonación de fragmentos de DNA en Escherichia coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Secuenciación automática del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 66 66 67 67 67 68 68 69 69 69 71 71 73 73 73 73 74 75 76 76 77 77 78 80 80 81 Capítulo 3. DESARROLLO DE DOS MÉTODOS BASADOS EN PCR-RFLP Y PCR A TIEMPO REAL PARA EL ANÁLISIS DE LOS POLIMORFISMOS DEL GEN PrP. ANÁLISIS REPRESENTATIVO DE LA POBLACIÓN OVINA DE LA CAPV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2. Selección de los animales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3. Puesta a punto de la técnica de genotipado por PCR-RFLP . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4. Puesta a punto de la técnica de genotipado por PCR a tiempo real . . . . . . . . . . . . . 3.5. Validación de las técnicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.6. Distribución de genotipos en razas autóctonas de la CAPV . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.7. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 85 86 87 90 93 93 94 2.4. 2.5. 2.6. 2.7. Capítulo 4. ESTABILIDAD Y SELECCIÓN DE GENES ENDÓGENOS EN ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA EN OVINO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 4.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101 24 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 25 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 4.6. Selección de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Extracción de RNA y síntesis de cDNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diseño de cebadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . PCR a tiempo real . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Análisis de la estabilidad de los genes endógenos y selección de genes para la normalización en tejidos ovinos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.7. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 102 103 106 108 112 Capítulo 5. EXPRESIÓN DEL GEN PrP EN TEJIDOS OVINOS Y SU RELACIÓN CON LA SUSCEPTIBILIDAD GENÉTICA A SCRAPIE . . . . . . . . . . . . 5.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2. Selección de los animales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3. Extracción de RNA, diseño de cebadores y puesta a punto de la RT-PCR . . . . . . . 5.4. Normalización de la expresión del gen PrP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.5. Análisis estadístico de los datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.6. Expresión normalizada del gen PrP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.7. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 117 118 118 119 119 120 122 Capítulo 6. PATOGENIA MOLECULAR DEL SCRAPIE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2. Selección de los animales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3. Extracción de RNA, diseño de cebadores y puesta a punto de la RT-PCR . . . . . . . 6.4. Normalización de la expresión génica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.5. Análisis estadístico de los resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.6. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125 127 127 128 130 131 133 CONCLUSIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 RESUMEN, SUMMARY, LABURPENA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 BIBLIOGRAFÍA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149 25 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 27 Capítulo 1 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 29 1.1. EL SCRAPIE Y LAS EETs Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs) son un grupo de enfermedades neurodegenerativas del sistema nervioso central que afectan tanto a animales como al hombre (Tabla 1.1). Estas enfermedades poseen una serie de características comunes como largos periodo de incubación, compartir un agente causal transmisible de forma experimental o natural, ausencia de respuesta inmune y unas lesiones neurológicas características y letales. El scrapie, llamado también prurigo lumbar o tembladera, es la EET que afecta a las especies ovinas, caprinas y al muflón, y está extendida prácticamente por todo el mundo. A mediados del siglo XVIII se describen en el Reino Unido, las características clínicas de una enfermedad en el ganado ovino a la que se le denominó rickets. Algunos autores postulan que estos primeros casos se debieron a la introducción de animales de raza merina provenientes de España en el siglo XV, manera en la que se extendió la enfermedad a otros países de Europa [212]. Sin embargo, los numerosos focos de la enfermedad descritos en las distintas regiones afectadas hicieron pensar en una enfermedad endémica [114]. A partir del año 1750 se describen un gran número de brotes desencadenando un problema de gran magnitud [67]. Curiosamente la enfermedad no afectaba por igual a todas las razas, situación que fue aprovechada a partir de 1810 para emplear machos aparentemente resistentes en un intento de frenar su propagación. De esta manera se consiguió mermar la enfermedad pero no erradicarla. Posteriormente, entre los años 1920 y 1950 comenzaron a darse casos en algunas razas que hasta la fecha no habían presentado la enfermedad. Las primeras descripciones de esta enfermedad en Europa proceden de Alemania y Francia y datan de los años 1750 y 1788 respectivamente. En otras zonas del viejo continente como Escandinavia, Dinamarca, Bélgica y España, la enfermedad se describe por primera vez a mediados del siglo XX. Fuera del continente Europeo como en la India, Australia, Nueva Zelanda, América, Sudáfrica y Kenia, se describen casos de scrapie a principios y mediados del siglo XX por importación de animales procedentes de países con la enfermedad como Francia y Reino Unido. En la actualidad, se considera que Australia y Nueva Zelanda son países libres de scrapie. Además del scrapie, entre las EETs se incluyen enfermedades de más reciente descripción como son la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) y la encefalopatía espongiforme felina (EEF), y otras conocidas por décadas y que afectan al hombre, como son la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob (ECJ) y el Kuru. En noviembre de 1986, en el Reino Unido se describe el primer caso EEB derivando más adelante en una epidemia a gran escala (Figura 1.1). El primer caso aparecido en la Europa Continental se declaró en noviembre de 1990 en Suiza, y posteriormente se fueron detectando casos en otros países europeos y asiáticos. Parece altamente probable que la epidemia de la EEB se inició en el Reino Unido por la transmisión del agente del scrapie del ovino al bovino, a través de la cadena alimentaria mediante el empleo de piensos suplementados con proteínas de origen ovino (harinas de carne y hueso) cuyo proceso de fabricación había sido modificado poco tiempo antes. Posteriormente, el 22 de marzo de 1996 el Ministro de Sani29 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 30 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... Tabla 1.1. Clasificación de las encefalopatías espongiformes transmisibles humanas y animales Enfermedad Hospedador Descripción Scrapie Ovejas, cabras y muflón EET natural. Transmisible experimentalmente a otras especies Encefalopatía transmisible del visón Visón En granjas probablemente como resultado de la ingesta de restos contaminados con scrapie Enfermedad del desgaste crónico (CWD) Ciervo, Venado y Alce En granjas probablemente como resultado de la ingesta de restos contaminados con scrapie Encefalopatía espongiforme bovina (EEB) Vaca Epidemia de las vacas locas probablemente como resultado de la ingesta de harinas contaminadas con scrapie Probablemente como resultado de la ingesta de restos contaminados con scrapie Encefalopatía espongiforme felina Gato (EEF) Encefalopatía de ungulados exóticos (EUE) Antílope (Nyala, Oryx & el gran Kudu) Probablemente como resultado de la ingesta de restos contaminados con scrapie Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob iatrogénico (iECJ) Hombre Transmisión iatrogénica: neurocirugía, transplante corneal, tratamiento con hormona del crecimiento Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob esporádico (sECJ) Hombre No asociada a mutaciones del gen PrP Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob familiar (fECJ) Hombre Asociado a mutaciones del gen PrP Variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (vECJ) Hombre Asociado a ingesta de carne contaminada con EEB Enfermedad de Gerstmann- Sträussler-Scheinker (GSS) Hombre Enfermedad familiar ligada a mutaciones del gen PrP Insomnio Familiar Fatal (FFI) Hombre Desorden familiar asociado a mutaciones del gen PrP Kuru Hombre Enfermedad transmitida por canibalismo. Endémica de Papua Nueva Guinea. dad británico anunció que una nueva variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob (vECJ) había sido descubierta por la Unidad de Vigilancia Especializada creada específicamente para controlar la posibilidad de infección en humanos. Se sugirió que la vECJ estaba relacionada con el consumo de carne contaminada con EEB. Este anuncio provocó una crisis alimentaria nacional y la prohibición de la exportación de carne y todos los productos cárnicos derivados incluyendo productos tan diversos como los utilizados en cosmética. Hasta el año 2005, se han descrito 171 casos de la vECJ (154 en Reino Unido, uno en Irlanda, 11 en Francia, uno en Italia, dos en los Países Bajos, uno en EEUU y uno en Canadá). 30 09:54 Página 31 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 50000 Reino Unido 45000 Número de casos de EEB 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 ta 19 87 19 88 19 89 19 90 19 91 19 92 19 93 19 94 19 95 19 96 19 97 19 98 19 99 20 00 20 01 20 02 20 03 20 04 20 05 0 as 2/3/06 H 01 TESIS 55 Figura 1.1. Casos de EEB en el Reino Unido. (Datos actualizados según la OIE a 16 de mayo de 2005) Desde 1986 el número de casos de EEB en UK sufrió un progresivo aumento hasta llegar al máximo histórico de 37.280 casos en 1992, cifra que hubiera sido mucho mayor de no ser porque se empleó solamente un sistema de vigilancia pasiva. A partir de esta fecha la epidemia comenzó a remitir llegando a los 343 casos del año 2004 (Tabla 1.1). En España, el diagnóstico de la EEB comienza a ser obligatorio en el año 2001 para todos los animales de consumo y en enero de 2002 se extiende también a los animales muertos en granja (vigilancia activa). Los dos primeros casos se diagnosticaron en Galicia a finales de 2000, comunidad autónoma donde más casos han aparecido. La mayoría de los casos de EEB se concentran en el noroeste de la península y en los animales de raza frisona. Esto es debido a que en esta región se concentra un gran número de animales y además, el ganado lechero en su mayoría Frisón, necesita de suplemento alimentario con piensos lo que aumentó el riesgo de contacto con el agente de la EET. También existe un número de casos anormalmente alto en Navarra y Menorca probablemente asociado con distribuidores de piensos específicos. El mayor número de casos se registró en el 2003 con la cifra de 167 casos y posteriormente ha ido en disminución hasta los 137 casos en el año 2004 (Figura 1.2). Esta reducción progresiva ha sido posible gracias a la prohibición del uso de harinas de carne que comenzó en el año 1996 pero que no se hizo totalmente efectiva hasta el año 2001. Respecto al scrapie en España durante el periodo 2000-2004 se han analizado un total de 160.380 animales de los que se han detectado 236 animales positivos pertenecientes a 69 rebaños. En el año 2003 parece haber un aumento del número de casos probablemente debido al aumento del número de animales analizados (Figura 1.3). Los animales sospechosos de scrapie son analizados con las mismas pruebas empleadas en la detección de la EEB. Actualmente, estas pruebas se usan en un programa nacional de muestreo de animales mayores de 18 meses sacrificados para consumo humano y de los animales que mueren en explotación. Ante la aparición de un animal positivo ya no se tiende a sacrificar todo el rebaño sino que se 31 2/3/06 09:54 Página 32 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... 250 España Número de casos de EEB 200 150 100 50 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 Figura 1.2. Casos de EEB en España. (Datos actualizados según la OIE a 26 de mayo de 2005) procede a un sacrificio selectivo en base al riesgo genético de los animales bajo el asesoramiento de los Servicios Veterinarios Oficiales de las Comunidades Autónomas. 250 Número de casos de Scrapie 01 TESIS 55 200 150 100 50 0 2000 2001 2002 2003 2004 Figura 1.3. Casos de scrapie en España Dada la importancia del scrapie a nivel de la sanidad animal y quizás también de la salud humana por su posible implicación en la EEB, se hace necesario el conocimiento profundo de esta enfermedad. Además, la similitud entre las alteraciones neuropatológicas observadas en el scrapie y las obseradas en las EETs humanas y en otras neuropatologías como el Alzheimer y el Parkinson, hacen de esta enfermedad un buen modelo de estudio. 32 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 33 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 1.2. ETIOLOGÍA Los estudios realizados con infecciones experimentales han sido cruciales en el conocimiento de la naturaleza del agente causal de las EETs. Inicialmente, la oveja fue el modelo animal más utilizado. Con él se conseguía reproducir la enfermedad al cabo de uno o más años después de la inoculación del agente por medio de homogeneizados de material nervioso infectado. Posteriormente, el empleo de ratones mejoró y facilitó el trabajo experimental debido a la reducción del periodo de incubación que pasó a ser de 70 a 150 días. Los primeros estudios realizados para conocer la naturaleza del agente causal hicieron pensar en un agente de tipo viral debido a que la infecciosidad se conservaba después del filtrado específico para virus. Sin embargo, diferentes ensayos demostraron que ni el tratamiento con formol [111] ni tratamientos para destruir los ácidos nucleicos como la radiación ionizante y UV afectaban a la infecciosidad del agente [3, 4]. De estos estudios se dedujo que la replicación del agente causal del scrapie no dependía de un ácido nucleico. En contraposición, la existencia de distintas cepas de scrapie con patrones lesionales característicos [92], dejaba la puerta abierta a la existencia de un agente infeccioso con un genoma independiente del hospedador. En 1981, diversos estudios realizados por Merz y cols. [190], descubrieron unas estructuras filamentosas de 100-1000 mm de longitud en el encéfalo de animales con scrapie y en enfermos de ECJ. A estas estructuras se les denominó fibras asociadas a scrapie (SAF), del inglés scrapie-associated fibrils [190] (Figura 1.4). Figura 1.4. Fotocomposición de micrografías electrónicas de las fibras de PrPSc llamadas SAF Sin embargo, la naturaleza exacta del agente causal de las EETs era aún controvertida puesto que se desconocía la existencia o no de un agente desencadenante. Para aclarar esta cuestión, durante los últimos años, los investigadores han realizado numerosos estudios encaminados a evaluar las distintas hipótesis, aunque ninguna ha sido probada de manera concluyente. Existen por tanto dos hipótesis fundamentales; la primera apoya la idea de que el agente infeccioso no posee ningún ácido nucleico y que está formado exclusivamente por 33 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 34 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... proteína (la hipótesis del prión enunciada por Prusiner en 1982) y la segunda, que se decanta por la existencia de un agente viral todavía no descrito (la hipótesis del virino) (Figura 1.5). La hipótesis del prión postula que el agente infeccioso causante de las EETs consiste solamente en una proteína capaz de autoreplicarse, un fenómeno descrito por primera vez en 1967 [116] y posteriormente avalado por Prusiner y colaboradores en 1982 [220]. Según esta hipótesis, la causa de estas enfermedades se encuentra en la conversión de forma espontánea o por inducción exógena de una proteína desconocida (con una conformación normal favorecida energéticamente) a otra conformación anormal. En el año 1982 Stanley Prusiner y sus colaboradores consiguieron un enriquecimiento bioquímico de un extracto de naturaleza proteica con una infecciosidad 1.000 veces superior que el encéfalo infectado de partida, al que consideraron el agente etiológico de la enfermedad. Este enriquecimiento se realizó a través de una serie de etapas que incluyeron precipitación con polietilenglicol, digestión con nucleasa de micrococos, digestión parcial con proteinasa K y centrifugación en gradiente de sacarosa [220, 225]. La mayor actividad infecciosa se encontró en la interfase, entre el 25% y el 60% de sacarosa, donde se observaron agregados compuestos de material amorfo y con aspecto fibrilar que medían 25 nm x 100-200 nm. La infecciosidad del purificado fue inactivada con proteinasa K, dietilpirocarbonato, urea, agentes caotrópicos, fenol y SDS, pero no se eliminó con tratamientos de nucleasas o por radiación UV. Estas propiedades fisicoquímicas típicas de proteínas llevaron a Prusiner y sus colaboradores a proponer el nombre de “prión” para definir la partícula infectiva de naturaleza proteica de manera que se distinguiera de virus, bacterias, hongos y otros agentes patógenos conocidos [220]. Posteriormente, observaron que dicho extracto contenía una sola proteína que presentaba digestión parcial frente a proteinasa K y un tamaño de 27-30 KDa por SDS-PAGE [29], [225], por lo que la denominaron PrPSc (proteína del prión asociada a scrapie), PrP27-30 o PrPres (proteína resistente a la proteinasa K). Inmediatamente se pensó que el prión podía ser un producto de la infección, sin embargo, la purificación de la partícula PrP de 27-30 KDa resistente a proteinasa K y la confirmación de su infecciosidad ofrecía evidencias de su implicación causal en la enfermedad. De forma similar, las estructuras filamentosas descubiertas por primera vez en 1981 por Merz y cols. [190] a partir de encéfalos infectados, presentaban las mismas características de resistencia al tratamiento con proteinasa K y presencia del fragmento de 27-30 de la PrP. La purificación de la PrPSc permitió secuenciar su extremo N-terminal [226] y aislar los clones de cDNA de una librería derivada de hámsters y ratones infectados de scrapie [13, 59, 203]. Sorprendentemente, se descubrió que esta proteína no era el producto de un gen viral sino que era codificada por un gen del hospedador [13, 203]. Se determinó que la PrPSc era la forma resistente a proteasas de una isoforma de 33-35 KDa codificada por el hospedador, la PrPc. Sin embargo quedaba por confirmar si realmente se trataba de una isoforma de una proteína codificada por el hospedador. Con el fin de demostrar esta hipótesis, se realizaron numerosos estudios enfocados a encontrar diferencias fisicoquímicas entre ambas isoformas en términos de modificaciones post-traduccionales. A partir de estos estudios se demostró que ambas isoformas presentaban la misma movilidad electroforética por SDS-PAGE y la misma antigenicidad [12, 203]. Además, ambas isoformas sufren una escisión del fragmento señal N-terminal [13, 133], glicosilación [56] y unión de glicosilfosfatidilinositol en el extremo 34 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 35 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS C-terminal [265]. Sin embargo, a diferencia de la PrPc, la forma patológica PrPSc presentaba insolubilidad en detergentes no desnaturalizantes y resistencia parcial al tratamiento con proteasas. De este modo, quedaba demostrado que tanto los animales sanos como los infectados expresaban la PrPc. También se encontraron diferencias conformacionales entre ambas isoformas. Se determinó como la PrPc presentaba un 42% de a–hélice y un 3% de hoja b, mientras que la PrPSc presentaba un 30% de a–hélice y un 43% de hoja b [209]. Por otro lado, el desarrollo del anticuerpo de la PrPSc [22] permitió detectar su presencia consecutivamente en el encéfalo de pacientes con ECJ, GSS y Kuru [27, 42], en el scrapie natural y experimental [245], en la EEB [134], así como en infecciones experimentales en ratón [70]. Estos estudios demostraron in vivo la relevancia y especificidad de esta proteína en las EETs a pesar de existir diferencias individuales en la acumulación y localización de la misma. Figura 1.5. Representación gráfica de la hipótesis del prión y del virino. (El prión procede del cambio conformacional de una proteína codificada por el hospedador y es capaz de autoreplicarse. El virino es una partícula infecciosa parecida a los viroides de plantas. Está formado por información genética propia, protegida por la PrPSc a modo de envuelta, cuyo precursor es sintetizado por el hospedador. Ilustración tomada de http://coli.usal.es/web/articulos/art17/art17.htm) La hipótesis del prión sin embargo, requiere una explicación para el proceso por el cual la PrPSc es capaz de autoreplicarse. En este sentido se han descrito dos modelos. El primero llamado “modelo conformacional”, propone que la PrPc y la PrPSc son isómeros conformacionales y que el desarrollo de la enfermedad estaría controlado por el cambio conformacional de PrPc a PrPSc. A continuación, una molécula de PrPSc se asociaría a una molécula de PrPc para producir un heterodímero PrPSc-PrPc el cual se transformaría en dos moléculas de PrPSc. Según este modelo, la formación de PrPSc se realiza de forma autocatalítica con propagación exponencial. El “modelo de polimerización nucleada por condensación no covalente” [162] supone que el cambio conformacional está ligado a un equilibrio de asociación, de manera que ambas conformaciones existen en equilibrio pero la estabilización de la isoforma patológica ocurre a través de la formación de un núcleo que constituye la etapa lenta del proceso. Una vez constituido el núcleo, éste crece por adiciones sucesivas y rápidas de nuevas moléculas disparándose el proceso. Cabe destacar como diversos estudios genéticos con ratones 35 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 36 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... han proporcionado la evidencia más fuerte que apoya la idea de que el agente infeccioso se genera a partir de la PrPc del hospedador. Se ha observado desarrollo y transmisión de la enfermedad priónica en ratones que expresan la proteína PrPc de humano con la mutación P101L característica de pacientes con GSS [136, 137]. Estos resultados parecen indicar que todos los componentes necesarios para la formación de partículas infecciosas parecen encontrarse en el propio hospedador por lo que se apoyaría la hipótesis del prión en la que la síntesis de novo produce la PrPSc. El empleo de levadura como modelo experimental, cuyos priones son similares a los priones de mamíferos, permitió a dos grupos de investigación independientes [157, 269] establecer de forma convincente que los priones son proteínas y que no dependen de genes o de otros factores para la transmisión de sus características. Básicamente estos ensayos señalan como los priones de levaduras y de mamíferos transmiten sus características por medio de interacciones entre proteínas, en las cuales un prión plegado anormalmente provoca en su isoforma normal una conformación irregular. La existencia de cepas de priones podría explicarse exclusivamente por la capacidad que tienen las proteínas de plegarse en más de una conformación y con ello poder dar el salto de la “barrera de especie” [269]. La base experimental consiste en la utilización de distintas temperaturas para influir en el plegamiento in vitro de las proteínas, con este método los investigadores demostraron que las conformaciones proteicas producidas a diferentes temperaturas se propagaban a sí mismas como cepas distintas. De esta forma, un prión con una determinada conformación convierte una proteína normal en infecciosa con una alta eficiencia, dando un tiempo de incubación corto, mientras que otro prión con otra conformación lo hace menos eficientemente necesitando un mayor tiempo de incubación. De la misma manera, un prión sería atraído con más facilidad por un cierto tipo de neuronas mientras que otro lo sería por otro tipo, produciendo en ambos casos efectos distintos. Es muy probable que la conversión de la PrPc a la proteína específica de la enfermedad, PrPSc, sea el proceso clave de la patogénesis de las EETs, sin embargo la naturaleza exacta del agente causal de las EETs es aún controvertida puesto que se desconoce la existencia o no de un agente desencadenante. En el camino hacia la búsqueda del agente causal se demostró como además de las preparaciones enriquecidas de SAF, las preparaciones sin filamentos visibles también presentaban infecciosidad [79, 227]. La purificación de estas muestras, permitió determinar el límite de infecciosidad en 105 moléculas. Con esta baja infecciosidad, se pensó en la existencia de otros componentes o modificaciones covalentes necesarias para la infección. En 1992, el estudio de muestras altamente purificadas hizo sugerir la existencia de una molécula de ácido nucleico mayor de 100 pb por partícula infectiva [152]. Por lo tanto, la demostración de la hipótesis de la proteína prión como único agente infeccioso necesita de la producción de partículas infectivas totalmente libres de DNA. En este sentido surge la hipótesis del virino que apoya la existencia de un agente viral. La existencia de múltiples cepas de scrapie sería el argumento principal para sugerir que el agente de las EETs lleva información genética en un ácido nucleico independiente del hospedador y que codifica para el mínimo número de proteínas necesarias para la patogénesis y la replicación [44, 239]. Además la existencia de estas variedades o cepas de un mismo agente infeccioso explicaría de manera convincente la variedad en la patogenia de las enfermedades priónicas, a diferencia de la 36 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 37 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS hipótesis del prión cuya explicación en base a las diferentes estructuras tridimensionales que puede adoptar la PrPSc no es tan sólida. Sin embargo, uno de los puntos flojos de la hipótesis del virino es la ineficacia de la inactivación del agente infeccioso mediante el empleo de reactivos que degradan los ácidos nucleicos. Para solventar este punto, el modelo propone que los reactivos empleados no tienen acceso al ácido nucleico, quizá por la protección de la PrPSc que actuaría a modo de envuelta [76] (Figura 1.5). Dicho modelo de agente infeccioso encaja con un nicho biológico situado entre los virus (que llevan ácido nucleico que codifica para sus propias proteínas) y los viroides (que no necesitan proteínas), y por eso se ha sugerido llamarle “virino”. En base a la radiosensibilidad de varios virus, se ha estimado el tamaño del genoma del agente de las EETs en 1.5 x 106 Da o 0.9 x 106 Da dependiendo de si se trata de cadena doble o simple [239]. En 2002 Somerville y cols. [263] demostraron como las distintas temperaturas de inactivación de una serie de cepas se mantenían tras infecciones experimentales en ratones. Estos resultados apoyaron la idea del virino en la que habría información independiente del hospedador. En conclusión, las investigaciones llevadas a cabo hasta ahora no han encontrado ningún tipo de ácido nucleico, por lo que la hipótesis más aceptada es la hipótesis del prión. 1.3. CEPAS PRIÓNICAS A comienzos de los 60, cuando el scrapie ovino fue transmitido experimentalmente a cabras, se observaron animales con unos síntomas clínicos distintos y bien diferenciados, animales con hiperexcitación por un lado y animales con somnolencia por otro [215]. Las diferencias encontradas entre los síntomas de estos dos grupos de animales se mantuvieron en infecciones consecutivas por lo que se pensó en la existencia de distintas cepas de scrapie. A estos experimentos les siguieron otros sobre transmisión experimental y pases consecutivos de una gran variedad de material infeccioso en ratones mostrando muchas evidencias de la existencia de distintas cepas de scrapie. En el Reino Unido existen aproximadamente 20 cepas de scrapie biológicamente definidas y caracterizadas. La identificación de cepas priónicas se fundamenta en un conjunto de características biológicas y fisicoquímicas. La diana exacta, la distribución y gravedad de los cambios patológicos asociados con las distintas cepas son algunas de las características más enigmáticas de la patogenia de las EETs. Sin embargo, todavía no se conocen los mecanismos biológicos que modulan estas propiedades. Las diferentes cepas pueden además presentar diferencias en el período de incubación, en el perfil de lesiones que provocan en infecciones experimentales con ratones y en el patrón de glicosilación de la PrPSc. Estas infecciones se realizan en varios pases con el fin de demostrar la reproducibilidad del perfil de cada cepa, y cabe destacar que los periodos de incubación en las infecciones experimentales durante los sucesivos pases son altamente reproducibles. Sin embargo, hay que tener en cuenta que algunas características de las cepas pueden variar según la línea de ratón con la que se trabaje, la cantidad inoculada y la ruta 37 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 38 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... de inoculación [45]. El perfil lesional se determina mediante el estudio histológico de la distribución de las alteraciones neuropatológicas así como del patrón de vacuolización producido. El perfil lesional tiene la ventaja añadida sobre el uso del periodo de incubación de que permite la discriminación de las cepas de scrapie independientemente de la dosis [45]. El patrón de glicosilación viene dado por la característica de la PrPSc de presentar glicosilación en dos posiciones de modo que se puede distinguir una forma no glicosilada, otra monoglicosilada y por último la biglicosilada. Estas tres formas de la PrPSc presentan diferente movilidad electroforética en un gel de SDS-PAGE [62] e incluso pueden presentarse en distinta proporción. Otro de los parámetros empleados en la tipificación de cepas es la resistencia a la inactivación térmica [77] e incluso su susceptibilidad a degradación proteolítica [25]. Estas diferencias entre las cepas permiten diferenciar infecciones por cepas de EEB en ovejas y cabras de la infección por scrapie [84, 272] así como las distintas variantes de ECJ [62, 130]. Otra de las aplicaciones del tipado de cepas reside en la diferenciación del scrapie atípico y el scrapie clásico. A diferencia de la forma clásica, el scrapie atípico presenta un perfil lesional localizado en la capa molecular y granular del cerebelo y una ausencia o escasa presencia de depósitos de PrPSc en la región del tronco del encéfalo. Además el patrón de glicosilación de esta cepa, conocida como Nor98, presenta una banda extra de 12 KDa [23]. El conocimiento de estas diferencias ha permitido detectar cepas con características similares en casos de scrapie procedente de localizaciones geográficas diversas [97, 204]. 1.4. SÍNTOMAS CLÍNICOS Y DIAGNÓSTICO El scrapie, es una enfermedad de desarrollo lento cuyos síntomas clínicos aparecen normalmente entre los 2 y 5 años de edad. Las ovejas afectadas pueden vivir entre 1 y 6 meses tras la aparición de los síntomas clínicos pero el desenlace fatal es inevitable. En el scrapie como en otras EETs, el SNC es la diana donde el prión desencadena una serie de alteraciones neuropatológicas. La sintomatología puede variar ampliamente entre los animales afectados, posiblemente debido a diferencias en la región cerebral afectada. Los síntomas clínicos más tempranos incluyen cambios en el comportamiento de los animales seguido de movimientos bruscos, rechinar de dientes, nerviosismo, temor y prurigo que provoca en el animal una tendencia a rascarse y frotarse contra objetos, aparentemente con el objetivo de aliviar el picor dando lugar a la pérdida de lana e inflamación de la piel. También pueden presentarse incordinación motora, posturas anormales y temblor, signos que se desencadenan alrededor de 2-3 meses antes de la muerte. En estados más avanzados se puede observar pérdida de peso, ataxia severa, parálisis y finalmente la muerte del animal [215]. En muchos casos la sintomatología asociada a esta enfermedad permite realizar un primer diagnóstico clínico de sospecha de scrapie. Sin embargo, otras patologías que afectan al SNC pueden dar lugar a un diagnóstico erróneo, por lo que el diagnóstico diferencial es fundamental. Hasta el momento, el diagnóstico confirmatorio solo puede hacerse post-morten. Según la Oficina Internacional de Epizootias (OIE) el diagnóstico de las EETs puede realizarse mediante un análisis histopatológico, inmunohistoquímico, bioquímico (Western blot o 38 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 39 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS inmunotransferencia) y ultraestructural (SAF). A nivel histopatológico, los cerebros de los animales infectados parecen normales pero microscópicamente se puede observar astrogliosis, vacuolización intracelular y pérdida neuronal [19]. También se han descrito alteraciones en el páncreas [302]. La inmunohistoquímica permite mediante el uso de anticuerpos específicos la detección de agregados de PrPSc. Mediante el Western blot y empleando también anticuerpos específicos se pueden detectar las tres formas de glicosilacion (isotipos) de la PrPSc y con ello la tipificación de cepas priónicas. También se han desarrollado tests rápidos basados en la detección de la PrPSc mediante la técnica ELISA tras la digestión de la PrPc con proteinasa K y otra método sin digestión basado en la afinidad específica de un ligando. Estos tests rápidos están homologados por la UE como método de cribado para la detección de la EEB y se emplean también en la detección del scrapie. En la actualidad se está realizando un gran esfuerzo en desarrollar métodos de diagnóstico ante-mortem que puedan dar información acerca del estatus del animal incluso antes de la aparición de los síntomas clínicos. Hoy en día estos métodos permiten la detección de la PrPSc en tejidos linfoides accesibles por biopsia como el tercer párpado, la amígdala o recto. Sin embargo, la dificultad de acceder a este tipo de muestras hace que no puedan aplicarse de manera sistemática a todos los animales destinados al consumo humano como se hace con los tests rápidos. Es por ello que se están intentando identificar marcadores presentes en muestras de más fácil acceso como el suero o la sangre [279]. Este es el caso de la proteína 14-3-3 cuya presencia elevada en el líquido cefalorraquídeo se asocia, aunque no de manera exclusiva, con ECJ [54, 113]. 1.5. PATOGENIA Una vez que el prión consigue entrar en el organismo, se desencadenan un conjunto de mecanismos patogénicos que culminan tras la llegada del agente al SNC. Estudios de infecciones experimentales en ratones con cepas de scrapie, han permitido conocer la evolución del prión a través de los diferentes órganos del animal. Así, se ha observado que tras la infección por vía oral, antes de la llegada del prión al SNC, se puede detectar infecciosidad en el bazo, en el tracto intestinal y en su sistema linfoide asociado como las placas de Peyer y amígdalas [30, 155]. En el caso de infección por vía intraperitoneal el prión sufre una amplificación primaria en el bazo, desde donde es capaz de llegar al sistema nervioso de este órgano, y a través de él infectar el SNC [156]. Otra de las estructuras implicadas en la neuroinvasión son los nódulos linfáticos en los cuales se ha podido detectar PrPSc [187]. El estudio mas detallado de estos órganos infectados permitió determinar la presencia de PrPSc en las células dendríticas foliculares (CDFs) sugiriendo su implicación en la replicación primaria del prión antes de llegar al órgano diana [187, 219, 232]. Estas células serían capaces de replicar el prión e incluso de diseminarlo a otras localizaciones. También se ha mencionado la implicación de otros tipos celulares como los linfocitos B y T, macrófagos y células M, aunque las CDFs parecen ser las principales responsables en el desarrollo inicial de la enfermedad [20, 151]. 39 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 40 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... Por lo tanto, la vía de entrada de los priones en el organismo tiene lugar a nivel intestinal donde se produce una primera replicación del prión en el tejido linfoide asociado para infectar posteriormente otros tejidos linfoides como nódulos linfoides, bazo y amígdalas (Figura 1.6). Esta primera etapa suele coincidir con la fase pre-clínica asintomática del scrapie. Después de la replicación en el sistema linfoide y a través de nervios periféricos tiene lugar la invasión del SNC. También se ha descrito invasión axonal directa a través del nervio vago [41] e incluso dada la infecciosidad de la sangre, también se ha sugerido su implicación como vía de diseminación del prión. De cualquier modo, hay que tener en cuenta que el tipo de cepa, la dosis de PrPSc y el hospedador son factores cruciales que pueden dar lugar a distintas formas de neuroinvasión. Figura 1.6. Esquema de los mecanismos de neuroinvasión. Aguzzi y cols. [2] Cuando el prión llega al SNC continúa su replicación en el tronco del encéfalo, concretamente en la región del obex, para luego diseminarse por el resto de las regiones encefálicas dando lugar a la sintomatología nerviosa anteriormente mencionada. A nivel microscópico se observa una astrocitosis y una vacuolización del tejido nervioso como consecuencia de la neurodegeneración. La apoptosis constituye el principal tipo de muerte neuronal que tiene lugar en las EETs [89, 103]. A nivel molecular se puede observar una alteración en la expresión de genes relacionados con el estrés oxidativo, activación de la glía y la apoptosis [65, 301]. Existe una respuesta glial en forma de astrocitosis y secreción de factores derivados de la glía reactiva como citoquinas. Esta activación glial parece tener un papel muy importante en la muerte neuronal y se ha observado como su distribución precede a la muerte por apoptosis [102, 297]. Existen numerosos estímulos que desencadenan la muerte por apoptosis y a su vez otros factores que protegen de la apoptosis (Figura 1.7). En las EETs se ha observado la implicación de numerosos factores pro-apoptóticos y anti-apoptóticos, sin embargo, existe una gran controversia acerca de qué factores son fundamentales y cual es la ruta que siguen las neuronas afectadas con PrPSc. La presencia de PrPSc en el tejido nervioso también provoca un daño oxi40 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 41 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS dativo a través de la formación de especies reactivas del oxigeno (ROS) y nitrógeno (RNS). Esto se traduce en un daño oxidativo directo sobre lípidos, proteínas, DNA y RNA que desencadenan procesos de muerte neuronal por necrosis o por apoptosis [261]. También se ha observado un cambio en el metabolismo del hierro traducido en una mayor concentración de hierro total que posiblemente favorezca el proceso de neurodegeneración [154]. Figura 1.7. Esquema de distintos factores implicación en la apoptosis Uno de los aspectos de la patogenia de las EETs todavía sin resolver es conocer con exactitud los factores que determinan los patrones y la distribución de los depósitos de PrPSc así como la razón por la que se producen las lesiones características. En el caso de sECJ las alteraciones morfológicas parecen depender de las características fisicoquímicas de la PrPSc y del perfil genético del individuo [210]. Otro factor a tener en cuenta sería la sensibilidad de las neuronas ante la PrPSc. Esta sensibilidad podría estar determinada por el nivel de expresión de la PrPc [185], sin embargo existen evidencias que demuestran como neuronas con altos niveles de PrPc muestran resistencia a la infección [104]. También hay que tener presente la existencia de distintas cepas de priones que pueden dar lugar a distintos patrones lesionales [43, 104]. En resumen, los depósitos de PrPSc y el daño tisular están probablemente influenciados por factores propios del hospedador como el genotipo, la distinta vulnerabilidad de cada tipo celular, así como por la cepa de PrPSc 41 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 42 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... 1.6. TRANSMISIÓN DE LAS EETs La primera demostración de la transmisibilidad de las EETs data del año 1938 [64]. Más tarde, un rebaño completo quedó infectado tras ser vacunado contra el virus Louping ill debido a que dicha vacuna procedía de extractos de cerebros de ovejas infectadas de scrapie [111]. A continuación y basándose en las similitudes neuropatológicas entre el scrapie y las encefalopatías humanas (Kuru y ECJ) [119, 159], se realizaron ensayos de transmisión del Kuru y la ECJ a chimpancés [95, 101]. Estos trabajos describieron como el periodo de incubación en la transmisión primaria era más lento que en las sucesivas transmisiones horizontales, e incluso como se podía transmitir la enfermedad a partir de material del SNC o tejidos viscerales por inoculación intracerebral o periférica. En lo que respecta al scrapie, la transmisión horizontal se produce por vía oral por la ingesta del prión contenido en pastos, pienso, y sobre todo en la placenta de ovejas positivas [115, 213, 230]. La presencia de PrPSc en heces y orina también puede actuar como foco de la infección [259]. Tampoco hay que olvidar la posible existencia de reservorios en la naturaleza que podrían intervenir en la transmisión del scrapie actuando a su vez como vectores de la infección. Se ha postulado la infecciosidad de algunos ectoparásitos como los ácaros [53, 179, 299]. La vía de transmisión materna (transmisión vertical) de las EETs no está del todo esclarecida. Se cree que esta forma de infección en la EEB sucede a niveles muy bajos pero no se ha comprobado [294, 295]. Tampoco se ha podido demostrar en casos de ECJ [24]. Sin embargo, existen numerosos estudios epidemiológicos sobre scrapie que apoyan la existencia de transmisión vertical, indicando un mayor riesgo de infección para los fetos cuyas madres tienen scrapie que para los que provienen de madres libres de scrapie [85, 132]. La infecciosidad de la placenta procedente de ovejas y cabras con scrapie ha sido demostrada mediante bioensayos en ratones [205, 214]. Sin embargo, parece que la transmisión vertical no se da en el útero sino en el momento del parto a través de tejidos placentarios, y que el genotipo del feto está implicado, de manera que fetos portadores del alelo ARR no acumulan PrPSc [7, 299]. Numerosos trabajos han puesto de manifiesto la transmisibilidad de las EETs entre una amplia variedad de especies lo cual indica que es posible el salto de la “barrera de especie”. Esta infecciosidad entre especies se caracteriza por un prolongado periodo de incubación derivado de la existencia de diferencias en la secuencia de la PrPc del hospedador y la secuencia de la PrPSc inoculada [28]. A nivel molecular, estas diferencias se traducen en una menor eficiencia de la replicación de novo del agente en presencia de una PrPc distinta de la cual deriva, por lo que cuanto más similares sean las secuencias aminoacídicas de ambas formas menor efecto de barrera de especie. Este hecho parece explicar porque las vacas inglesas desarrollaron EEB por consumo de tejidos de ovejas afectadas de scrapie: las proteínas PrPc de ambas especies únicamente difieren en 7 aminoácidos. En cambio, la PrPc de la vaca y el hombre difieren en más de 30 de los 254 aminoácidos totales. Es quizás por ello, por lo que la transmisión de la vaca al hombre en forma de vECJ se produce con menor frecuencia. 42 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 43 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 1.7. EL GEN PrP 1.7.1. Estructura del gen PrP La proteína del prión está codificada por un gen de copia única [59, 203] que se encuentra localizado en el cromosoma 20 del hombre, 2 del ratón y en el cromosoma 13 de la oveja. El gen PrP se ha identificado en numerosas especies de mamíferos y se ha visto que se encuentra altamente conservado. A pesar de existir pequeñas diferencias en la longitud del gen prión dentro de una misma especie, podemos definir en unas 35.500 bases la longitud de este gen para la especie humana, 38.400 bases para el ratón y 31.400 bases para la oveja. Generalmente está compuesto por dos exones (E1 y E2) separados por un intrón de unas 2 kb, que tras splicing quedan unidos al exón 3 (E3) que contiene la región codificante de aproximadamente 750 pb (Figura 1.8). Figura 1.8. Estructura esquematizada del gen PrP en el humano (a), murino (b), vacuno (c) y ovino (d). (E1, exón 1; E2, exón 2; E3, exón 3) El análisis de la secuencia del gen PrP ha permitido encontrar una serie de mutaciones ligadas a diversas patologías hereditarias [224] así como la descripción de una gran variedad de mutaciones silentes y numerosas posiciones polimórficas [172, 229]. Asimismo ha permitido estudiar diferencias estructurales del gen PrP en distintas especies y las relaciones filogenéticas entre estas. Muchos de los trabajos realizados acerca de la estructura del gen PrP se han basado en el análisis exhaustivo tanto de las regiones codificantes como de las no codificantes (UTR). En el gen PrP el marco de lectura abierto (ORF) que dará lugar a la proteína se encuentra íntegramente en el exón 3. Éste, incluye además en su extremo 5’, una región UTR de 10 pb previas al codón de inicio ATG y que se muestra muy bien conservada al 43 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 44 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... comparar las secuencias del hámster, ratón y oveja. Aproximadamente las primeras 170 pb del ORF presentan una alta proporción de bases GC y codifican para las repeticiones de octapéptidos/nonapéptidos ricas en glicina características de la región N-terminal de todas las PrPc. En estas repeticiones se encuentra la base molecular de las funciones fundamentales de la PrPc que se explicarán con más detalle en el apartado 1.8.1. Cabe destacar la existencia de múltiples regiones ORF con un marco de lectura en sentido opuesto al ORF de la PrP denominadas antisense reading frame [106]. Estudios filogenéticos realizados en numerosas especies de mamíferos han revelado una gran conservación de estos ORF. Este fenómeno no es novedoso ya que también se ha descrito en numerosos genes como los de la proteasa Hsp70 de bacterias y mamíferos [241]. Sin embargo, no se han encontrado mRNA anti-PrP al menos en ratones. Con relación a las regiones intrónicas, el tamaño del intrón 1 presenta una alta similitud en todas las especies y una longitud que en general oscila entre 2 y 2.4 Kb a excepción del hombre donde el intrón 1 posee aproximadamente 12.7 Kb (asumiendo ausencia del exón homologo 2, ver Figura 1.8). A diferencia del intrón 1, la longitud del intrón 2 varía entre las especies e incluso dentro la especie murina se han observado grandes diferencias . Durante un tiempo se pensó que las diferencias en tamaño del intrón 2 del ratón se debía a una deleción, sin embargo, estudios posteriores han determinado que esta diferencia se debe a la existencia de una estructura típica de transposón [172]. Este elemento transponible está flanqueado por duplicaciones del motivo AAGCTT y presenta una gran similitud con el transposón de partículas retrovirales defectivas (IAP) diferenciándose principalmente en una pequeña deleción del gen de la polimerasa. En cualquier caso, dicho elemento transponible presenta una estructura LTR-gag-pol-env-LTR. En relación al intrón de mayor tamaño del gen PrP humano, existe una secuencia análoga al exón 2 de los genes de ratón y de oveja a la que se ha llamado exón 2-like. Este análogo del exón 2 esta flanqueado por secuencias consenso características de splicing, sin embargo, queda por establecer hasta que punto este exón, E2-like, está incluido en algún subconjunto de los mRNAs de la PrP humana. Estos datos sugieren que la organización inicial y ancestral del gen PrP, previa a la evolución de los mamíferos, fue de 3 exones. En el caso del gen ovino, la región 3’ UTR correspondiente al intrón 2 es particularmente larga debido a la presencia de regiones transponibles. Mayoritariamente se debe a la presencia de un trasposón fósil de tipo mariner de 1.2 Kb, ausente en los genes de ratón y de humano [172]. La inestabilidad cromosómica asociada a la presencia de elementos de tipo mariner en el cromosoma 17 humano sugiere que las posiciones adyacentes al gen PrP ovino y, por similitud en el bovino, son compatibles con reorganizaciones del DNA. El elemento fósil transponible mariner contiene siete u ocho frameshifts (mutación, deleción o inserción de una o dos pb) y cinco codones stop lo que sugiere que la inserción es relativamente ancestral y probablemente es compartida por todos los rumiantes. También podemos encontrar otro tipo de secuencias transponibles como elementos LINE (elementos largos dispersos) y SINE (elementos cortos dispersos). En la Tabla 1.2 se resumen los distintos tipos de secuencias transponibles presentes en el gen PrP de humano, ratón, vaca y oveja, así como el porcentaje de pb que las forman respecto al total de la secuencia analizada. 44 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 45 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS Tabla 1.2. Resumen de los elementos transponibles contenidos en el gen PrP humano, murino, bovino y ovino Especie Pb analizadas SINE (%) LINE (%) LTR (%) DNA (%) TOTAL (%) Humano Murino Bovino Ovino 15241 28471 20230 20630 4.6 5.6 5 4.2 40.7 4 15.2 13.6 0 46.6 4.9 6.4 0.9 0 6.1 5.9 46.2 56.2 31.2 30.1 SINE, elementos cortos dispersos; LINE, elementos largos dispersos; LTR, retrotrasposón; DNA, DNA trasposón. 1.7.2. Expresión del gen PrP El tamaño del mRNA del gen PrP puede variar según la especie entre 2.1 y 2.4 Kb en hámster, humano y ratón, hasta 4.6 Kb en ovino y vacuno. Sin embargo, la alta homología del ORF localizada en un solo exón (E3) da lugar a una proteína de unos 250 aminoácidos. La expresión del mRNA y la proteína para la que codifica, está regulada durante el desarrollo y según el tipo celular. En ovino existen dos transcritos del gen PrP de distinta longitud (2.1 y 4.6 Kb) producidos por poliadenilación alternativa en vez de splicing alternativo [110]. Curiosamente, esta poliadenilación parece ser exclusiva de rumiantes ya que no se ha observado ni en el hombre ni en ratón. A diferencia del transcrito de 2.1 Kb, el mRNA de 4.6 Kb contiene unas 2 Kb de secuencias LINE, SINE [172]. La proporción de ambos transcritos varía según el tejido encontrándose los mayores niveles del mRNA de 4.6 Kb en tejidos del SNC y los mayores niveles del mRNA de 2.1 en el bazo. El transcrito de 4.6 Kb parece estar presente en todos los tejidos ovinos y no así el de 2.1 Kb, de manera que nunca se ha observado la presencia única del de 2.1 Kb. Sin embargo, existe una amplia distribución y una alta expresión del transcrito de 2.1 Kb en ovino y en caprino, mientras que en los tejidos bovinos se expresa a niveles marginales. Se ha especulado que la presencia del transcrito de 2.1 Kb en tejidos periféricos se relaciona con una menor expresión de la proteína PrP debido a una menor estabilidad, grado de eficiencia de la traducción o a una regulación de la traducción en estos tejidos [110]. Por lo tanto, parece que la proporción de ambos transcritos es específica de cada tejido. La expresión del gen PrP es crucial para el desarrollo y la transmisión del scrapie. La detección del mRNA del gen PrP en el cerebro de la oveja a un tercio de la gestación junto con la detección de transcritos en la placenta, tejidos fetales, supone un riesgo de infección en estadios tempranos [110]. El empleo de diferentes técnicas de análisis del mRNA ha permitido detectar y cuantificar con mayor o menor precisión la presencia de transcritos de PrP en diferentes tipos tisulares. Los mayores niveles de mRNA en roedores se presentan en el encéfalo y los niveles intermedios en tejidos periféricos como el corazón, pulmón y riñón. Los niveles más bajos se corresponden al bazo e hígado [55, 203, 236]. Asimismo en oveja los mayores niveles se encuentran en tejidos del SNC llegando a presentar hasta 5 veces más que el riñón [110]. En vacuno, el empleo de la técnica de cuantificación absoluta por PCR a tiempo real ha determinado los mayores niveles de expresión del gen PrP en las regiones del 45 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 46 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... encéfalo junto con tejidos linfoides como el bazo, nódulo linfático y timo [274]. En el encéfalo del hámster, las regiones del cortex cerebral, hipocampo y núcleo estriado, se corresponden con los mayores niveles de expresión de la PrPc [252], en el cerebelo los mayores niveles se detectan en células de Purkinje [71] y neuronas del septum y tálamo [184]. Por otro lado, existen zonas del encéfalo donde hay poca o incluso nula inmunoreactividad a PrPc. Además, muchas neuronas pueden presentar mRNA del gen PrP y luego no presentar PrPc, lo cual indica que existe una regulación de la traducción dependiente del tipo celular. También existen diferencias en la velocidad de degradación del mRNA entre las distintas poblaciones neuronales [184]. Sin embargo, cabe destacar que estas diferencias en la detección de mRNA y no de PrPc podrían también deberse a problemas en la sensibilidad de las técnicas empleadas. También se ha detectado mRNA en otras localizaciones no neuronales como las células de la glía, en células epiteliales, eritrocitos, linfocitos B y T [55, 194]. La síntesis de mRNA del gen PrP ocurre constitutivamente en estadios adultos, pero durante el desarrollo se encuentra bajo un control riguroso [59, 203]. En el septum, los niveles de los mRNA del gen PrP y de acetilcolinesterasa durante el desarrollo, aumentan paralelamente [192]. Los niveles más altos de PrPc se encuentran en cerebro, particularmente en el hipocampo, existiendo niveles significativos en corazón y músculo esquelético y, más bajos en la mayoría de los órganos restantes excepto en hígado y en páncreas. 1.7.3. Regulación de la expresión del gen PrP Aunque no se conocen todos los factores que regulan la transcripción del gen PrP, algunos estudios han revelado como algunos factores son capaces de alterar la expresión de este gen. De este modo, el factor de crecimiento neuronal (NGF) provoca una sobreexpresión del gen PrP in vitro [166] e in vivo [192]. También se ha visto un aumento de los niveles de mRNA del gen PrP por efecto de la hormona de crecimiento (GH) recombinante y por el factor de crecimiento similar a la insulina tipo I (IGF-1) [166]. De igual manera se ha observado sobreexpresión de este gen en ausencia de proliferación celular y en respuesta ante una proteína relacionada con el factor inhibidor de migración (MRP8), lo que sugiere un papel potencial de la PrPc en la parada del crecimiento y diferenciación celular [161]. Existen evidencias para sugerir que los elementos que controlan la transcripción del gen PrP residen en la región upstream del exón 1 y en los intrones. Cabe destacar un ensayo realizado con un ratón transgénico sin el intrón 2 del gen PrP en el que se observó una expresión normal del gen PrP en el encéfalo, pero no en las células de Purkinje del cerebelo donde fue indetectable [90], sugiriendo que el intrón 2 contiene secuencias requeridas para la expresión específica de ese tipo celular. Análisis posteriores de los intrones 1 y 2 del gen PrP murino, han descrito la presencia de dos elementos promotores inmediatamente antes de los exones 1 y 2 y un elemento supresor dentro del intrón 2 [16]. De forma similar, una deleción de unas 700 pb en el intrón 1 bovino tiene un efecto atenuante de la actividad del promotor in vitro [148]. Otros estudios han revelado la existencia de múltiples regiones de unión a factores de transcripción conservadas entre las especies. En el caso del ratón, mediante el análisis 46 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 47 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS de la secuencia de los intrones murinos 1 y 2, se han descrito regiones potenciales de unión a los factores de transcripción AP1 y AP2 [16]. También se han encontrado regiones potenciales de unión a otros factores de transcripción como Sp1, AP1 y AP2 en la región promotora de otras especies [13, 16, 288]. Recientemente, la comparación de las secuencias del gen PrP humano, de ratón, ovino, bovino y del canguro, ha permitido describir hasta 51 regiones cortas conservadas con una función potencial reguladora, de las cuales 18 se encuentran en el promotor y 33 en los intrones [218]. En este estudio se han observado a su vez posibles sitios de unión a los factores MZF-1, MEF2, Oct-1, MyT1 y NFAT, altamente conservados entre las secuencias analizadas. Finalmente, respecto a la secuencia del promotor del gen PrP, presenta alto contenido en GC (83%) y no presenta la TATA-box. Estas características junto con la demostración de la existencia de múltiples puntos de transcripción indicarían que el gen PrP se ajusta a la categoría de gen constitutivo o housekeeping [288]. Diversos estudios encaminados a conocer los posibles cambios en la expresión del gen PrP durante la infección, han revelado resultados contradictorios. Por un lado se ha observado expresión constitutiva del gen PrP [65, 170] y por el otro se ha descrito un aumento de los niveles de mRNA del gen PrP en ratones infectados con scrapie [176]. 1.7.4. Susceptibilidad genética La primera evidencia de la influencia genética en esta enfermedad fue descrita en 1964 por Dickinson y cols. [74] al observar como la infección experimental en una línea de ratones (VM/Dk) daba lugar a periodos de incubación diferentes. Estas diferencias fueron observadas mediante estudios de genética clásica y por cruzamientos y fueron atribuidas a un gen denominado Sinc que controlaba el periodo de incubación [75]. Posteriores infecciones experimentales en ratón y análisis del DNA por RFLP, determinaron que el gen del ratón que controlaba el periodo de incubación (Prn-i) presentaba dos alelos, uno responsable de periodos cortos de incubación y otro alelo correspondiente a periodos largos. Más adelante este gen fue asociado al gen que codifica la proteína PrPc [52, 145]. El mismo principio fue usado en la especie ovina, donde se observó que un gen denominado Sip y sus dos alelos sA y pA tenían relación directa con el periodo de incubación [141]. Tanto el gen Sinc, como el Prn-i y el Sip correspondían al mismo gen, el PrP [142, 289]. La secuenciación y posterior comparación del gen PrP de ovejas sanas y enfermas reveló la existencia de tres posiciones polimórficas o SNPs en los codones 136, 154 y 171 [107, 108, 142]. Estas posiciones polimórficas dan lugar a cambios en los aminoácidos 136 (AÆV), 154 (RÆH) y 171 (QÆR), y la presencia de cuatro haplotipos: VRQ, ARR, AHQ y ARQ. Además se encontró diferente distribución de genotipos entre animales sanos y enfermos. El haplotipo VRQ se encontró con mayor frecuencia entre los animales que desarrollaban la enfermedad que en aquellos que no presentaban sintomatología. Más adelante se comprobó que ésto se debía a que los animales homozigotos VRQ presentaban un menor tiempo de incubación que los animales VRQ/ARR y VRQ/AHQ, de manera que la presencia de V en la posición 136 parecía estar asociada a la susceptibilidad. Posteriormente, se encontró una asocia47 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 48 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... ción entre el aminoácido Q en la posición 171 y la susceptibilidad a scrapie, mientras que el aminoácido R parecía conferir resistencia [61, 109, 290]. Aunque no estaba aún muy bien definido, la presencia de H en la posición 154 parecía estar asociada a resistencia. En 1995, se encontró otro polimorfismo para el codón 171 que daba lugar al aminoácido H con el que se describieron hasta 5 haplotipos para el gen PrP ovino de los cuales el ARR correspondía a la mayor resistencia y el VRQ a la mayor sensibilidad frente a scrapie [21], (Tabla 1.3). Tabla 1.3. Secuencias de los alelos identificados para el gen PrP Alelo Codón 136 Codón 154 Codón 171 ARR AHQ ARH ARQ VRQ GCC GCC GCC GCC GTC CGT CAT CGT CGT CGT CGG CAG CAT CAG CAG El continuo estudio de la secuencia del gen PrP en distintas razas ovinas reveló un mayor número de posiciones polimórficas: 101 (Q→R),112 (M→T), 136 (A→V, A→T), 137 (M→T, S→A), 138 (M→T), 141 (L→F), 143 (H→R), 151 (R→C, R→G), 154 (R→H), 171 (Q→R, Q→H, Q→K), 172 (Y→D), 175 (Q→E), 176 (N→K), 211 (R→Q) y 127 (G→S), [1, 86, 277]. Sin embargo, para la mayoría de ellas no se ha encontrado ninguna asociación con la susceptibilidad al scrapie. Respecto a las posiciones 136, 154 y 171, el alelo ARQ es el haplotipo salvaje. En 1997 Elsen y cols. [86] recomiendan una selección genética en función de los polimorfismos del gen PrP para intentar erradicar el scrapie favoreciendo los genotipos resistentes. Sin embargo, no se puede asegurar que los animales resistentes a scrapie no puedan actuar como portadores asintomáticos y representar por tanto un riesgo de infección. Tampoco se puede asegurar que la sensibilidad de los polimorfismos sea extensible a todas las razas. A pesar de estos posibles inconvenientes y basándose en los polimorfismos asociados al periodo de incubación del scrapie (codones 136, 154 y 171), en 1998 se sugiere de forma más detallada la selección genética de los animales en base a su genotipo [68]. Este trabajo agrupa los genotipos del gen PrP en cinco grupos de riesgo con diferente grado de susceptibilidad (Tabla 1.4). A partir de este momento se comenzó el genotipado masivo de las distintas razas ovinas con el fin de establecer el riesgo potencial de padecer la enfermedad, revelando diferencias en la distribución de los genotipos según la raza. El primer trabajo que describe la distribución de genotipos en una raza española fue realizado en el año 2002 por Hurtado y cols. [147], en la raza Latxa. En la actualidad, el genotipado de la cabaña ovina está muy extendido como método para establecer el riesgo a sufrir scrapie, y el genotipo se ha incorporado en distinto grado a la mayoría de los programas de selección y mejora genética. Esta selección genética se 48 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 49 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS basa en aumentar la proporción de los animales resistentes ARR/ARR en detrimento de los animales susceptibles y en los casos más extremos, en obtener un rebaño formado exclusivamente por animales ARR/ARR. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la selección a favor de los animales ARR/ARR podría limitar la variabilidad genética sobre todo en aquellas razas en las que la proporción de animales ARR/ARR sea limitada. Con esta selección se podrían perder caracteres de alto valor comercial debido a una asociación causal o de ligamiento entre el gen PrP y algún gen o genes responsables del carácter de interés. Sin embargo, diversos trabajos han puesto de manifiesto la falta de asociación entre el genotipo de los animales y los caracteres productivos como la producción de leche y de carne [69, 174, 237]. Tabla 1.4. Agrupación de genotipos según Dawson y cols. en 1998 [68] Descripción Grupo de riesgo Genotipos Muy bajo riesgo a scrapie en el individuo y en la progenie R1 ARR/ARR Bajo riesgo a scrapie en el individuo y en la progenie R2 ARR/AHQ AHQ/AHQ Bajo riesgo a scrapie en el individuo; el riesgo de la progenie depende del otro progenitor R3 ARR/ARQ ARR/ARH ARQ/AHQ AHQ/ARH Riesgo ocasional a scrapie individual y en la progenie R4 ARH/ARH ARQ/ARH ARQ/ARQ ARR/VRQ AHQ/VRQ Alto riesgo individual y en la progenie R5 ARH/VRQ ARQ/VRQ VRQ/VRQ Los grupos de riesgo y los genotipos aparecen ordenados de mayor a menor resistencia frente a scrapie, del R1 al R5 y del genotipo ARR/ARR al VRQ/VRQ. Aunque en menor medida que en los genotipos susceptibles, recientemente se han descrito casos de scrapie en animales con genotipos clasificados como de muy bajo (ARR/ARR) o bajo riesgo (ARR/ARQ y AHQ/AHQ) [23, 47, 206], como consecuencia de lo cual se ha puesto en entredicho el uso del genotipado como la mejor forma de erradicar el scrapie [18]. Algunos de estos casos están asociados con una nueva cepa de scrapie (Nor98) implicada en lo que se conoce como scrapie atípico [23]. Como se ha mencionado en el apartado 1.3, el perfil lesional de estos animales difiere del scrapie típico en que los mayores depósitos de PrPSc y las lesiones celulares aparecen en la capa molecular del cerebelo y no en el obex como ocurre con el scrapie clásico. Cabe destacar como el alelo H en la posición 154 parece tener cierta asociación con esta nueva forma clínica [197]. 49 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 50 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... En la actualidad y según el Plan Nacional sobre Scrapie del Reino Unido (UK-NSP), existe una nueva clasificación más ajustada a la realidad en base a los continuos estudios realizados acerca de la susceptibilidad genética frente a scrapie [72], (Tabla 1.5). Tabla 1.5. Agrupación de genotipos según el UK National Scrapie Plan, 2003 [72] Descripción Tipo Genotipos Animales genéticamente muy resistentes a scrapie 1 ARR/ARR Animales genéticamente resistentes a scrapie sujetos a selección para su empleo como reproductores 2 ARR/AHQ ARR/ARH ARR/ARQ Animales con poca resistencia genética a scrapie sujetos a selección genética cuando sean empleados como reproductores 3 AHQ/AHQ AHQ/ARH AHQ/ARQ ARH/ARH ARH/ARQ ARQ/ARQ Animales genéticamente susceptibles a scrapie que no deben ser usados como reproductores excepto en situaciones especiales 4 ARR/VRQ Animales con alto riesgo a scrapie que no deben ser empleados para reproducción 5 AHQ/VRQ ARH/VRQ ARQ/VRQ VRQ/VRQ Los grupos de riesgo y los genotipos aparecen ordenados de mayor a menor resistencia frente a scrapie, del Tipo 1 al Tipo 5 y del genotipo ARR/ARR al VRQ/VRQ. 1.8. LA PROTEÍNA PrP 1.8.1. Estructura y topología de la PrP c La longitud de la estructura primaria de la PrPc puede variar levemente según la especie entorno a los 250 aminoácidos (aa); en el caso de la oveja presenta 256 aa. En la cadena aminoacídica se pueden distinguir una secuencia señal hidrofóbica N-terminal de 22 residuos (PS), una serie de repeticiones de un octapéptido PHGGGWGQ [13], cuatro segmentos altamente conservados, dos señales de localización nuclear (NLS I y II) [118] y una región hidrofóbica C-terminal [222, 254]. Esta cadena sufre un complejo proceso de maduración covalente que supone la escisión proteolítica del péptido señal PS, la adición C-terminal de un glicosilfosfatidilinositol (GPI), la formación de un enlace disulfuro intramolecular entre dos residuos de cisteína y, por último, una doble glicosilación en dos residuos de asparagina [221], (Figura 1.9). Las diferencias existentes en la secuencia de la PrPc de diferentes organismos se reflejan en diferencias de interacción entre la PrPc y la PrPSc. Esta interacción es óptima cuan50 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 51 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS Figura 1.9. Esquema de la secuencia de PrPc. (PS, péptido señal hidrofóbico; NLS-I, señal de localización nuclear I; RO, repeticiones de octapéptidos; NLS-II, señal de localización nuclear II; STE, secuencia efectora de la parada de la transferencia; TM, dominio transmembrana; S-S, puente disulfuro; G, glicosilación; GPI, glicosilfosfatidilinositol) Figura 1.10. Alineamiento de la estructura primaria de la secuencia aminoacídica de PrPc de distintos organismos: Humano, gorila, rata, ratón, hámster, vaca, cabra y oveja. (Se puede apreciar alto grado de homología entre las secuencias alineadas) 51 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 52 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... do las secuencias de las dos isoformas son idénticas como ocurre en la transmisión homóloga dentro de una misma especie [228]. La transmisión heteróloga entre distintas especies requiere un salto de la barrera de especie cuando las secuencias de las dos isoformas son diferentes [258]. El alto grado de similitud entre los ungulados parece indicar que podría existir una facilidad de transmisión del prión ovino al ganado vacuno y viceversa [293], (Figura 1.10). La presencia del gen PrP en multitud de organismos, desde el hombre hasta el pez pasando por el ratón y el pollo, indica que el gen PrP existe antes de la aparición de los mamíferos. Existe una alta homología (90%) en el ORF del gen PrP que se traduce en una alta homología en la secuencia aminoacídica, que en el caso de los primates es mayor del 95% [254]. Esta homología en los primates va disminuyendo a medida que se compara con organismos separados filogenéticamente como los marsupiales (70%) [298] o incluso menor respecto a la PrPc del pollo (30%) [94]. c La estructura secundaria de la PrP solubilizada en detergentes y en ausencia de cationes es mayoritariamente helicoidal (40% a-hélice), mientras que la formación de la isoforma patológica conlleva un aumento del contenido en estructuras extendidas (45% lámina-b y 30% a-hélice) [209], (Figura 1.11). Estudios espectroscópicos de alta resolución con formas recombinantes en ausencia de ligando (Cu) han puesto de manifiesto que la PrPc está constituida por dos dominios, el N-terminal altamente desestructurado y el C-terminal globular [80, 234]. Figura 1.11. Modelo estructural de la proteína prión celular (PrPc) y proteína prión patológica (PrPSc). (En color verde se indican las estructuras α-hélice y en azul las lámina-β) 52 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 53 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS Con relación a la localización celular de la PrPc, diversos estudios de translocación in vitro han identificado la existencia de tres formas topológicas: una forma de secreción (coincidente con la anclada por GPI) y dos formas transmembranas que difieren en su orientación, la N-terminal luminal y la C-terminal luminal [122], distribuidas en la membrana plasmática, en endosomas y en el aparato de Golgi [91, 164]. La forma libre secretada es transportada en vesículas de secreción a la superficie exterior celular donde queda anclada a la membrana citoplasmática por unión GPI en dominios particulares [266, 270]. Una vez allí, algunas moléculas de PrPc son liberadas al espacio extracelular por escisión del GPI mientras que la mayoría quedan internalizadas en el compartimento endocítico [260]. Estas últimas pueden ser recicladas hacia la superficie celular o bien pueden sufrir una ruptura proteolítica en la mitad del N-terminal y sus productos son expulsados al exterior celular [260]. El metabolismo de las formas transmembrana no se conoce con exactitud, pero la acumulación por encima de un umbral de las formas con el C-terminal luminal se correlaciona con la aparición de neuropatologías [122]. También se ha descrito la presencia de PrPc en el citosol de subpoblaciones neuronales del SNC [191]. c Las propiedades bioquímicas de la PrP así como su cantidad pueden variar entre los tejidos de un mismo individuo. Un estudio realizado en ovino ha descrito como la mayor cantidad de PrPc se localiza en el encéfalo, seguido del pulmón, músculo esquelético, corazón, útero, timo y lengua, tejidos que presentan entre 20 y 50 veces menos cantidad que el SNC [195]. El tejido con menor contenido de PrPc fue el hígado con un rango de 546-16.000 veces menos que el SNC y el tejido linfoide presentó una concentración de PrPc con 3 ordenes de magnitud menos que el SNC [195]. Asimismo, este estudio apoya la idea de que los tejidos cuya infecciosidad es alta (amígdala, timo, intestino y bazo) no presentan más PrPc que los tejidos considerados con escasa infecciosidad (músculo esquelético y corazón) [66, 120]. Cabe destacar que la distribución de las tres formas de la PrPc (bi-, mono- y a-glicosilada) es específica de tejido, e incluso para una misma forma puede existir diferente movilidad electroforética dependiendo del tejido [195]. 1.8.2. Funciones biológicas de la PrPc La PrPc está altamente conservada entre las especies, una conservación evolutiva que sugiere un papel fundamental en el metabolismo celular. Esta idea estaría también apoyada por las características housekeeping del gen PrP, su amplia distribución en tejidos y tipos celulares así como su regulación durante el desarrollo. La PrPc se localiza fundamentalmente en tejidos del sistema nervioso. Su presencia en las zonas de sinapsis hizo pensar en una función reguladora de la transmisión sináptica [125]. Sin embargo, estudios posteriores demostraron como la PrPc presentaba otras localizaciones celulares sin tener preferencia por las sinapsis [164, 191]. En la actualidad existen numerosos trabajos que describen variadas funciones para la PrPc que pueden resumirse en adhesión celular, señalización celular, funciones metabólicas y neuroprotección. 53 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 54 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... 1.8.2.1. Función antioxidante c El papel antioxidante de la PrP se surgirió cuando al tratar cultivos de células del ce-/rebelo y de la corteza de ratones PrP con xantina oxidasa éstas presentaron mayor sus+/+ ceptibilidad que las células PrP [37, 38]. La adición posterior del antioxidante Vitamina -/c E aumentó la supervivencia de las células PrP indicando que las células que expresan PrP son más resistentes al daño celular provocado por estrés oxidativo. La función primaria de la superóxido dismuta (SOD) es convertir al radical libre superóxido, O2, en peróxido de hidrógeno, un radical libre menos dañino que puede degradarse por mediación de la peroxidasa. La actividad citosólica superóxido dismutasa dependiente de Cu y zinc (Zn) (Cu/ZnSOD) y la actividad mitocondrial superóxido dismutasa dependiente de manganeso +/+ (MnSOD) fue mayor en los cultivos de células PrP tratadas con xantina oxidasa. Por el -/c contrario las células PrP solo mostraron aumento de la MnSOD, sugiriendo que la PrP puede tener actividad Cu/ZnSOD. De este modo la falta de PrPc, y con ello la falta de actividad Cu/ZnSOD ante estrés oxidativo, inducen el aumento de actividad MnSOD con el fin de compensar esa carencia. De hecho diversos estudios [158, 300] han revelado como la c falta de PrP desencadena una serie de alteraciones relacionadas con el estrés oxidativo como la oxidación de lípidos y proteínas en todas las estructuras celulares estudiadas. c Brown y Besinger [37] postularon y demostraron que si la PrP podía actuar como transportador de Cu al citosol, entonces la disminución de la actividad de Cu/ZnSOD sería un c efecto directo de la falta de PrP . Por lo tanto la actividad de esta enzima estaba directac mente relacionada con los niveles de PrP . Trabajos posteriores han aportado resultados similares de los que cabe destacar como la actividad reguladora de la Cu/ZnSOD se encuenc tra localizada en una repetición de un octapéptido (residuos 51-90 de la PrP murina) y en c una región hidrofóbica (residuos 112-145 de la PrP murina) [251]. También se ha obserc vado actividad SOD propia de la PrP , sin embargo se trata de una actividad un 10% menor que la Cu/ZnSOD [39]. c La capacidad de la PrP de regular el contenido del Cu citosólico tiene un doble efecto antioxidante. Por un lado puede actuar sobre la actividad de la Cu/ZnSOD como se acaba de explicar, y por otro lado puede actuar además a nivel de la eliminación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Este segundo mecanismo antioxidante se basa en la oxidación catalítica del Cu (Figura 1.12). Cu+ + O2 ⇔ Cu++ + O2– 2O2– + 2H+ ⇔ O2 + H2O2 Figura 1.12. Generación de ROS por el cobre. (El Cu+ puede oxidarse para producir dos formas reactivas del oxígeno, el radical superóxido y el peróxido de hidrógeno) 54 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 55 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 1.8.2.2. Homeostasis mineral del cobre y del calcio intracelular c La relación de la PrP con el cobre y su posible implicación en la regulación del calcio (Ca) intracelular, indican una implicación reguladora de la homeostasis de estos dos minerales. Un estudio realizado con sinaptosomas de rata reveló un aumento del Ca intracelular en presencia de PrPc recombinante [291]. Dicho efecto fue anulado por el bloqueo de los canales voltaje-dependientes de Ca sugiriendo la existencia de interacción entre la PrPc con estos canales para regular activamente la entrada de calcio libre a la célula. Sin embargo, parece poco probable que la PrPc interactúe con el Ca del mismo modo que lo puede hacer con el cobre. 1.8.2.3. Implicación en el ritmo circadiano y en el sueño c El análisis de los cambios fenotípicos de dos líneas de ratones deficientes de PrP (línea IFMB y NPU), ha puesto de manifiesto cambios en el ritmo circadiano y en el sueño de estos animales. Por un lado, el ritmo circadiano de los animales PrP-/- fue menor que en los ratones PrP+/+ y por otro lado, el sueño de los PrP-/- se alteró en el sentido de un aumento en el número de veces que se despertaban, en la disminución de los movimientos oculares durante el sueño y en la menor movilidad durante el sueño [276]. Estas alteraciones desaparecían cuando se restablece la PrPc por transgénesis. Por lo tanto, aunque el proceso que regula ambas funciones es muy complejo y es poco probable que esté controlado por un único gen, la observación del mismo fenotipo en dos líneas de ratones diferentes sugiere que la PrPc está implicada en el ritmo circadiano y en el mantenimiento e intensidad del sueño. Cabe destacar que estas alteraciones fenotípicas también se han descrito en el insomnio familiar fatal (IFF). La diana de actuación de la PrPc para controlar ambas funciones se localizaría en el núcleo supraquiasmático del hipotálamo. 1.8.2.4. Señalización celular c Dado que la localización de la PrP en la membrana citoplasmática se realiza a través de la unión GPI, se ha propuesto como en otras proteínas con unión de membrana GPI, una función transductora de señales celulares [149]. En este sentido se ha observado interacción con la tirosín-quinasa Fyn y con el receptor de laminina, ambos implicados en el crecimiento dendrítico [57, 112, 196]. También se ha observado interacción entre la PrPc y la sinapsina Ib, una proteína cuya implicación en la formación de sinapsis y en la regulación de la liberación de los neurotrasmisores promueve la supervivencia [264]. Asimismo, se ha observado interacción con la proteína Grb2, una proteína que media receptores de factores de crecimiento y que también está implicada en la supervivencia neuronal [264]. Con estos resultados parece posible que la implicación de la PrPc en la señalización celular esté enfocada a la supervivencia neuronal a través del mantenimiento de la transmisión sináptica. Sin embargo, hay cierta controversia respecto a la alteración de la sinapsis en ratones knock-out para el gen PrP [63, 177, 183, 292]. 55 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 56 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... Aparte de la neuroprotección a través del mantenimiento de la sinapsis neuronal se ha descrito activación de señales transductoras de protección en neuronas granulares del cerebelo de ratón crecidas sobre placas de cultivo con PrPc. Esta activación incluye proteínas como la PKA, tirosín-quinasas relacionadas con Src, fosfatidilinositol kinasa 3/Akt y quinasas MAPK/ERK [57]. También se ha observado interacción con el factor pro-apoptótico Proteína X asociada a Bcl-2 (Bax) y con el anti-apoptótico B-cell CLL/lymphoma 2 (Bcl-2) [244]. 1.8.2.5. Otras funciones protectoras En los apartados anteriores se han descrito varios mecanismos protectores de la PrPc, el efecto antioxidante y la neuroprotección mediada por la transducción de señales desde la membrana celular. Además de estos mecanismos defensivos, existen numerosos estudios que han descrito otras vías mediante las cuales la PrPc puede mantener la integridad neuronal. La proteína Doppel se expresa específicamente en las células de Purkinje donde su sobreexpresión en ratones knock-out del gen PrP causa muerte celular y ataxia [6, 98, 193]. En el año 2004, Anderson y cols. [6] demostraron mediante transgénesis como el daño neuronal provocado por la sobreexpresión de Doppel puede ser atenuado por la co-expresión de la PrPc, indicando de este modo una función neuroprotectora frente a Doppel. La estructura de la PrPc presenta ciertas similitudes con la familia de proteínas Bcl-2. La región correspondiente con las repeticiones de octapéptidos en la región N-terminal de la PrPc resulta muy similar al dominio BH2 de la familia de proteínas Bcl-2 por lo que se ha sugerido que la PrPc podría actuar como una proteína de la familia Bcl-2 [171]. El dominio BH2 del Bcl-2 es fundamental en la función protectora frente a la muerte por apoptosis mediada por Bax y también en su interacción con Bax, una proteína inductora de la apoptosis [304]. En la PrPc, al igual que el dominio BH2, la región de octapéptidos es relevante en la función anti-apoptótica. La deleción de cuatro repeticiones de octapéptidos, la mutación D178N asociada al IFF y la mutación T183A ligada a la encefalopatía espongiforme familiar atípica eliminan parcial o completamente las propiedades protectoras frente a Bax [34, 201]. En un grupo de estudios relacionados con la privación de suero en cultivos neuronales, se observó como neuronas PrP-/- aumentaban su sensibilidad a la apoptosis con respecto a las neuronas PrP+/+, y como la transfección de Bcl-2 y PrPc hacía recobrar la supervivencia de las células PrP-/- [153, 163]. La falta de PrPc y suero, inducían un aumento de proteínas pro-apoptóticas (p53, Bax y caspase-3) así como un aumento del citocromo C citosólico y una disminución del potencial de membrana de la mitocondria [153]. Estos resultados apoyaron por tanto la función protectora de la PrPc frente a la apoptosis y en concreto la apoptosis iniciada en la mitocondria. La maduración de la PrPc a través del aparato de Golgi es fundamental para su función anti-apoptótica, sin embargo la unión GPI no es necesaria manteniéndose la propiedad anti-Bax de la PrPc citosólica [243]. Estos resultados son consistentes con los hallazgos obtenidos en 1999 por Kuwahara y cols. [163]. Sin 56 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 57 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS embargo, esta protección frente a Bax no puede extenderse a todas las líneas celulares ya que resulta ineficaz en las líneas celulares SK-N-SH, BE(2)-M17, N2a y la línea celular 293 de riñón [242]. La función anti-apoptótica de la PrPc también se ha descrito en células no nerviosas. Un trabajo realizado con dos líneas celulares de cáncer de pecho MCF-7, unas sensibles y otras resistentes al factor de necrosis tumoral a (TNFa), reveló como las células resistentes presentaron un incremento de la PrPc endógena 10 veces superior a la línea celular sensible a TNFa [73]. Posteriormente, la introducción de PrPc en las células sensibles a TNFa a través de un vector viral las transformó en células resistentes. Por lo tanto, de este trabajo se concluyó que la PrPc protege frente a la muerte por TNFa al menos en su acción sobre el mecanismo que induce la liberación de citocromo C de la mitocondria y sobre la condensación nuclear [73]. Todos los trabajos realizados in vitro e in vivo sugieren que este efecto anti-apoptótico de la PrPc tiene lugar a nivel de la muerte celular mediada por Bax iniciada en la mitocondria, previniendo la permeabilidad de su membrana. La diana molecular de la PrPc no se conoce pero se sabe que puede interaccionar con Bax directamente a través de su forma citosólica o a través de señales enviadas al citosol por mediación de la PrPc anclada a la superficie celular [244]. En las enfermedades por priones, Roucou y cols. [244] han sugerido que estas funciones de la PrPc desaparecerían por la conversión a PrPSc, de modo que la protección frente al daño producido por Bax quedaría relegada únicamente al efecto anti-apoptótico de Bcl-2. Hasta ahora se han descrito las propiedades protectoras de la PrPc, sin embargo existen evidencias que muestran como en determinadas circunstancias la PrPc puede resultar tóxica. En este sentido, se ha descrito como la sobreexpresión de PrPc tiene un efecto tóxico en la línea celular embrionaria 293 de riñón, en células epiteliales de conejo Rov9 y en células corticales TSM1 de ratón. La toxicidad se presenta como una susceptibilidad a apoptosis inducida por estaurosporina [207, 208]. Estos trabajos contrastan con la demostrada protección anti-apoptótica de la PrPc en células cultivadas sin suero, sin embargo, este efecto contradictorio podría tener explicación. En primer lugar la sobreexpresión de la PrPc podría interferir en la síntesis de otras proteínas debido a la saturación de la maquinaria de síntesis proteica [244]. En segundo lugar, la sobreexpresión de PrPc podría dar lugar a la formación de formas de PrPc tóxicas [180]. En tercer lugar, el efecto de la PrPc podría ser diferente según el tipo celular. Por último, puesto que la PrPc posee un sitio para la acción de la caspasa-3, al igual que Bcl-2, la PrPc podría dar lugar a formas tóxicas mediante lísis proteica mediada por la caspasa-3 [60]. 57 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 58 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... 1.9. OBJETIVOS La finalidad del presente trabajo se puede dividir en dos partes fundamentales. Por un lado la correspondiente a la investigación aplicada al desarrollo de métodos de tipado genético de scrapie y su posterior aplicación a la raza Latxa. Por otro lado, tres objetivos de investigación básica encaminados a aumentar el conocimiento de las bases moleculares del scrapie y con ello, contribuir al conocimiento general de las encefalopatías espongiformes transmisibles. A continuación se describen de forma más concreta los objetivos específicos de esta Tesis Doctoral. Objetivo 1 Estudiar la susceptibilidad genética frente a scrapie en las razas ovinas de la Comunidad Autónoma del País Vasco (CAPV). Para ello se desarrollarán métodos moleculares que permitan la determinación de los polimorfismos en los codones 136, 154 y 171 de gen PrP y se aplicarán a una muestra representativa de la cabaña ovina de la CAPV. Objetivo 2 Obtener un método de RT-PCR a tiempo real y cuantificación relativa que permita medir la expresión génica de forma reproducible, fiable y ajustada a la realidad. Se evaluará la estabilidad de la expresión de genes endógenos en seis tejidos ovinos de animales sanos y de animales con scrapie clínico con el fin de encontrar los mejores genes de referencia en cada situación. Objetivo 3 Evaluar una posible explicación a la susceptibilidad genética frente a scrapie. La hipótesis de partida se basa en que la susceptibilidad genética tiene una relación directa con la expresión del gen PrP, de tal forma que los animales susceptibles presentarían mayor expresión del gen PrP y con ello mayor predisposición al scrapie por presentar más proteína PrPc precursora de PrPSc. Para evaluar esta hipótesis se cuantificarán los niveles de mRNA del gen PrP en seis tejidos de animales sanos con distinta susceptibilidad genética a scrapie por medio RTPCR a tiempo real y cuantificación relativa utilizando como referencia los genes endógenos seleccionadas en el objetivo anterior. Objetivo 4 Analizar la patogenia del scrapie a nivel molecular. Se estudiarán las posibles alteraciones en los niveles de expresión de nueve genes implicados en diversos aspectos de la patogenia del scrapie en tres regiones del SNC de animales sanos y animales enfermos. Se analizarán genes asociados a la activación de la glía, el mantenimiento de la homeostasis y la apoptosis, así como el gen PrP mediante RT-PCR a tiempo real y cuantificación relativa. 58 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 59 Capítulo 2 MATERIALES Y MÉTODOS 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 61 2.1. OBTENCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 2.1.1. Obtención de DNA Dado que todas las células de un ser vivo comparten la misma secuencia de DNA, cualquier parte de un organismo puede ser útil para la obtención de su DNA. La sangre es una de las muestras más usada dada su fácil obtención y procesado. En este trabajo se han utilizado muestras de sangre principalmente, además de tejidos frescos y tejidos incluidos en parafina. A la hora de trabajar con DNA hemos de extremar las precauciones para evitar contaminaciones que puedan interferir en su posterior análisis. Para ello trabajaremos con guantes, material estéril y autoclavado si es posible, libre de DNasas (enzimas que degradan el DNA) y puntas con filtro. 2.1.1.1. Extracción de DNA a partir de muestras de sangre La sangre ha de recogerse directamente del animal en tubos estériles con anticoagulante. En caso de no ser procesada inmediatamente puede conservarse a 4°C varios días, a -20°C por unos meses o incluso a -80°C por años manteniendo de esta forma el DNA en las condiciones óptimas necesarias para su posterior análisis. La extracción del DNA se ha realizado empleando el kit Nucleospin®96 Blood (Macherey-Nagel, Düren, Alemania). Se trata de un kit adaptado a su automatización con el robot Biomek 2000 (Beckman-Coulter, CA, USA) que permite la extracción de 96 muestras en 2 horas (Tabla 2.1). Las fases principales de dicho protocolo consisten en una lísis celular y proteica con un tampón de lísis y proteinasa K, la unión por adsorción del DNA a una matriz sólida en una placa de 96 columnas, lavados sucesivos del DNA unido a la matriz y posterior liberación del DNA. Tabla 2.1. Extracción de DNA de sangre 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. Añadir 25 µl de solución de proteinasa K (20mg/ml) a 200 µl de sangre Añadir 200 µl de tampón de lísis BQ1 e incubar 10 min a temperatura ambiente (Ta) Añadir 200 µl etanol (70%) Añadir 300 µl de tampón de dilución B5 Aplicar la mezcla anterior a las columnas Aplicar vacío Lavar las columnas con 600 µl de tampón de lavado BW y aplicar vacío Lavar las columnas con 900 µl de tampón de lavado B5 y aplicar vacío Lavar las columnas con 900 µl de tampón de lavado B5 y aplicar vacío Añadir 50 µl de tampón de elución BE e incubar 5 min a Ta Aplicar vacío para obtener el DNA Guardar a -20°C 2.1.1.2. Extracción de DNA a partir de muestras de tejido En determinadas circunstancias la disponibilidad de sangre para la extracción del DNA es un problema, como alternativa se puede extraer DNA a partir de muestras de tejido. La ex61 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 62 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... tracción del DNA de tejidos puede hacerse mediante protocolos caseros o mediante kits de extracción de tejidos. Para la extracción de DNA de tejido fresco se ha empleado el DNeasy tissue kit (Qiagen, Hilden, Alemania) (Tabla 2.2). Tabla 2.2. Extracción de DNA de muestras de tejido fresco 1. Obtener 25 mg de tejido y cortarlo en pequeños trozos 2. Añadir 180 µl de tampón de lísis ATL y 20 ml de proteinasa K (0.35 mg). Incubar 1 h a 55°C agitando cada 15 min 3. Añadir 200 µl de tampón de dilución AL e incubar 10 min a 70°C 4. Añadir 200 µl de etanol (100%) y mezclar con vortex 5. Añadir la mezcla anterior sobre una columna y centrifugar 1 min a 6000 g 6. Añadir 500 µl de tampón de lavado AW1 y centrifugar 1 min a 6000 g 7. Añadir 500 µl de tampón de lavado AW2 y centrifugar 3 min a 13000 g 8. Añadir 50 µl de tampón de elución AE y centrifugar 1 min a 6000 g para recuperar el DNA en dilución 9. Guardar a -20°C 2.1.1.3. Extracción de DNA a partir de muestras de tejido en parafina En el caso de muestras de tejido en parafina la extracción se realiza de forma manual usando un protocolo convencional basado en fenol-cloroformo (Tabla 2.3). Tabla 2.3. Extracción de DNA de muestras de tejido en parafina 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Obtener 30 µm de cortes de parafina (3 x 10 mm) como material de partida Añadir 400 µl de TE (10mM Tris-HCl 1, mM EDTA pH 8.0) para rehidratar el tejido Añadir 45 µl SDS (10%) más 12 µl de proteinasa K (20mg/ml) y agitar con vortex Incubar durante 1 h a 56°C Incubar durante 10 min a 96°C Añadir 400 µl fenol:cloroformo:alcohol-isoamílico 25:24:1 y emulsionar con vortex Centrifugar a 9000 g 10 min y recoger la fase acuosa Añadir 400 µl de cloroformo:alcohol-isoamílico 24:1 a la fase acuosa y centrifugar a 9000 g durante 10 min Añadir 45 µl de acetato sódico 3M y 1 ml etanol (100%) a la fase acuosa, voltear y mantener a -20°C toda la noche o un mínimo de 1.5 h Centrifugar 15 min a 9000 g y eliminar el sobrenadante Lavar el pellet con 1 ml de etanol (70%) Centrifugar 15 min a 9000 g y eliminar el sobrenadante Secar entre 30 min y 1 h Resuspender en 50 µl de TE (10 mM Trs-HCl, 1 mM EDTA, ph 8.0) o H2O Guardar a -20°C 2.1.1.4. Purificación de plásmidos Se ha empleado el FastPlasmid Mini kit (Epperdorf, Amburgo, Alemania) basado en un sistema de columnas formadas por una matriz sólida con afinidad por los plásmidos y posterior lavado y elución de los mismos (Tabla 2.4). 62 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 63 2. MATERIALES Y MÉTODOS Tabla 2.4. Purificación de plásmidos 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Obtener un cultivo bacteriano de 1.5 ml y centrifugar 1 min a 12000 g Añadir 400 µl del tampón de lísis al decantado de bacterias y mezclar con vortex durante 30 seg Incubar durante 3 min a Ta Transferir la mezcla a una columna y centrifugar 1 min a 13000 g Añadir a la columna 400 ml de tampón de lavado y centrifugar 1 min a 13000 g Añadir a la columna 50 ml de tampón de elución sobre la columna Guardar a –20°C 2.1.2. Obtención de RNA La molécula de RNA es muy estable, sin embargo, la presencia de RNasas (enzimas que degradan el RNA) hacen que su integridad se vea seriamente dañada hasta el punto de inutilizarla para su análisis. Por lo tanto, el problema viene dado por la presencia de RNasas. Estas enzimas pueden estar presentes en todo el material en contacto con las muestras de RNA, pero la principal contaminación con estas enzimas proviene de la propia muestra a procesar. En este sentido y además de las precauciones que se toman cuando se trabaja con DNA, la manipulación del RNA requiere unas condiciones adicionales para evitar la presencia de RNasas. Para eliminar la posible contaminación en pipetas, botellas y en la mesa de trabajo bastará con limpiar las superficies con SDS 1%. Deben usarse guantes a lo largo de todo el proceso y reducir al máximo el tiempo de manipulación, con el fin de evitar la degradación del RNA durante el proceso. La contaminación del agua, puntas y viales se soluciona con el empleo de reactivos “libres de RNasa” certificado por la casa comercial. Con el fin de obtener los mejores rendimientos, deben usarse muestras frescas como material de partida. Como alternativa, las muestras pueden ser congeladas en nitrógeno líquido y almacenadas a -80°C. Una vez que las muestras han sido homogeneizadas en el tampón de lísis, pueden ser almacenadas a -80°C sin necesidad de congelación en nitrógeno líquido. Alternativamente, y para guardar tejido de una forma eficaz previo a su extracción, se recomienda usar RNA later (Ambion, TX, USA), producto que permite el almacenamiento de muestras a 4°C por una semana o un mes a -20°C. La extracción del RNA puede realizarse mediante procedimientos clásicos o mediante kits comerciales. En nuestro caso se ha empleado el RNasy Protect Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany). Este kit se basa en una lísis tisular seguida de la unión por adsorción del RNA total a una matriz sólida y posterior lavado y elución del RNA (Tabla 2.5). Es importante utilizar RNA purificado recientemente o en su defecto RNA guardado a -80°C. Las trazas de DNA genómico extraído junto con el RNA pueden dar lugar a falsos positivos en RT-PCR por la amplificación del propio DNA genómico o incluso de pseudogenes. Por ello, el análisis del RNA requiere en muchos casos partir de un RNA libre de DNA genómico, lo cual se consigue con el uso de DNasas (Tabla 2.6). En este estudio se ha empleado la nucleasa DNase I (Ambion, TX, USA). 63 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 64 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... Tabla 2.5. Extracción de RNA total de tejido 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Pesar 30 mg de tejido y añadir 600 µl del tampón de lísis RLT Homogeneizar el tejido mecánicamente con el equipo Rybolyser (Hybaid, Ashford, UK): 3 pulsos de 20 seg a intensidad 4.5. Reposar 2 min a Ta entre pulso y pulso. Reposar 2 min a Ta para que se desnaturalicen todos los complejos proteicos Centrifugar 3 min a 9000 g Recoger el sobrenadante en un tubo nuevo. En tejidos con alto contenido en grasas (SNC) evitar la capa superficial de lípidos. Añadir 1 volumen de etanol (70%) y mezclar con la pipeta Añadir el sobrenadante sobre la columna y centrifugar 1 min a 9000 g Añadir 700 µl de tampón de lavado RW1 y centrifugar 1 min a 9000 g Añadir 500 µl de tampón de lavado RPE y centrifugar 1 min a 9000 g Añadir 500 µl de tampón de lavado RPE y centrifugar 1 min a 9000 g Eliminar restos de RPE con una centrifugación de 1 min a 9000 g Añadir 35 µl de H2O dejando incubar de 5-10 min a Ta. Centrifugar 1 min a 9000 g Guardar el RNA a -80°C Tabla 2.6. Tratamiento del DNA genómico 1. 2. 3. 4. 5. Partir de 50 µl de RNA contaminado con DNA Añadir 2 unidades de DNase I y 5 ml del tampón de digestión Incubar 30 min a 37°C Añadir 5 µl de tampón de inactivación de DNase I y centrifugar 1 min a 9000 g Guardar el sobrenadante a –80°C 2.2. CONCENTRACIÓN, PUREZA E INTEGRIDAD DE ÁCIDOS NUCLEICOS En determinados casos el análisis de los ácidos nucleicos requiere conocer la cantidad y calidad de los mismos. Dada las características fisicoquímicas de la molécula de DNA y RNA, éstas pueden absorber luz cuando se encuentran en disolución. Esta propiedad permite aplicar la ecuación de la Ley de Lambert-Beer que en el caso de ácidos nucleicos queda expresada según la Ecuación 1. La concentración de ácidos nucleicos (ng/ml) se calcula multiplicando la absorbancia a 260nm (A260) por el coeficiente de extinción molar C, que en el caso del DNA en solución acuosa es 50 y de 40 para el RNA [253]. La calidad o pureza se puede estimar mediante el ratio de absorbancia 260/280nm. Las proteínas por su composición pueden absorber a 280nm, propiedad que viene dada principalmente por los aminoácidos aromáticos (triptófano, fenilalanina y tirosina). Se considera una pureza alta cuando el ratio es de 1.8 para DNA y de 2.0 para RNA. Ratios menores indican presencia de proteínas, fenol u otros contaminantes. [Ac. Nucleicos] = A260 x C 64 Ecuación 1 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 65 2. MATERIALES Y MÉTODOS También podemos conocer la integridad de los ácidos nucleicos mediante su separación en geles de agarosa y posterior visualización UV. De este modo, una muestra degradada presenta un fondo característico de pequeños fragmentos de ácidos nucleicos. En el caso de muestras de DNA debe aparecer una sola banda mientras que para el RNA deben aparecer dos bandas bien nítidas correspondientes al RNA ribosómico 18S y 28S en el caso de RNA eucariótico y 16S y 23S para procariotas. 2.3. PCR CUALITATIVA 2.3.1. Fundamento teórico La Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR fue inventada por Kary Mullis a mediados de los 80 [198], una técnica para la síntesis in vitro de secuencias de DNA. Con esta técnica la escasez de cantidad de DNA ya no es un problema en los procedimientos de Biología Molecular ni en los procedimientos de diagnóstico basados en el estudio de DNA. Así, la PCR se ha convertido en una herramienta fundamental en campos tan diversos como la investigación (clonación de genes, detección de clones recombinantes, estudio de DNA fósil), medicina forense y criminalística (determinación de la paternidad, identificación de individuos), sanidad animal y mejora genética (detección de enfermedades genéticas e infecciosas, pureza de razas) y medicina (diagnóstico de enfermedades humanas). La técnica se basa en la replicación del DNA realizada por la DNA polimerasa. Esta enzima realiza la síntesis de una cadena complementaria de DNA en el sentido 5’→ 3’ usando un molde de cadena sencilla a partir de un fragmento de doble cadena. Para iniciar la reacción se usan los denominados iniciadores, también llamados cebadores o primers. Son una pareja de oligonucleótidos (fragmentos de DNA de cadena sencilla de entre 15 y 30 pb) complementarios a cada uno de los extremos del fragmento de DNA que se desea amplificar. Partiendo de este principio, la PCR se basa en la repetición de un ciclo formado por tres etapas: 1ª Desnaturalización del DNA de doble cadena, 2ª Hibridación de los cebadores a las zonas complementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar y 3ª Extensión de la hebra complementaria por la DNA polimerasa, obteniéndose así un fragmento de doble cadena. La amplificación del fragmento de DNA sigue una progresión geométrica de forma que al final de “n” ciclos se obtienen 2n copias hasta el momento en que se alcanza el efecto meseta. Las primeras reacciones se realizaban manualmente cambiando las muestras de un baño María a otro según la temperatura requerida en cada etapa y añadiendo DNA polimerasa continuamente. El proceso resultaba demasiado tedioso y era difícil alcanzar las temperaturas y los tiempos correctos. Sin embargo, la comercialización de la enzima Taq polimerasa [249] que es una enzima termoestable, junto con la aparición en el mercado de los primeros termocicladores que realizaban los cambios de temperatura automáticamente en los tiempos y temperaturas programadas de forma exacta, permitió el uso de la PCR como herramienta de laboratorio. 65 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 66 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... 2.3.2. Componentes y optimización de la reacción de amplificación 2.3.2.1. Calidad del DNA molde Existen una serie de reglas sencillas para que el DNA molde no sea un problema en la reacción: – Integridad del DNA: no puede estar fragmentado en trozos más pequeños de lo que queremos amplificar. – Origen de la muestra y proceso de extracción: la muestra no debe tener determinados factores sanguíneos, fenol, detergentes, etc., que inhiben la actividad de la polimerasa. – Cantidad de la muestra: la cantidad de DNA necesaria varía según el número de copias del gen diana. Si se dispone de suficiente cantidad para la amplificación de DNA genómico de copia única se usan cantidades de 100-500 ng, mientras que en el caso de zonas repetidas se puede reducir esta cantidad a 10-50 ng o a incluso picogramos. 2.3.2.2. Diseño de los cebadores Para la elección de los cebadores, existen una serie de normas que nos pueden ayudar, aunque hay que indicar también que existen programas informáticos que nos facilitan esta tarea (DNAsis, Primer3, Primer Express, Vector NTI, etc.). – El contenido en G + C debe ser aproximadamente del 50%. – No se deben seleccionar cebadores que en su extremo 3’ tengan una importante estructura secundaria. – Se recomienda que en los extremos las últimas bases sean G o C. – Se debe evitar la complementariedad entre la pareja de cebadores. Si ésta existe entre los extremos 3’ existe la posibilidad de que se formen dímeros de cebadores (PD). – Normalmente deben tener un tamaño de 18-30 nucleótidos. – La temperatura de disociación (Tm), definida como la temperatura a la cual la mitad de las moléculas de DNA están disociadas, deberá ser similar en ambos cebadores. La Tm depende de la secuencia de los cebadores y generalmente oscila entre los 45 y 60°C. La Tm se puede calcular mediante los programas anteriormente mencionados o de manera menos exacta según la formula Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T), siendo G, C, T y A, el número de cada una de las bases que forman cada uno de los cebadores. 2.3.2.3. DNA Polimerasa Existen diferentes tipos de DNA polimerasa que llevan a cabo la replicación del DNA. Se pueden clasificar en termolábiles (Tª óptima de 37-42°C, se desnaturalizan con el calor) y ter66 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 67 2. MATERIALES Y MÉTODOS moestables (Tª óptima de 74°C, resiste durante 40-50min a 96°C). Habitualmente se utiliza la Taq polimerasa, una enzima termoestable aislada de la bacteria termófila Thermus aquaticus. 2.3.2.4. Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) Los cuatro dNTPs (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) se deben añadir en la solución de la reacción en concentraciones que normalmente oscilan entre los 20 y los 200 mM cada uno. 2.3.2.5. Sales de la reacción Es necesaria la existencia de un tampón que amortigüe la reacción, por lo general está formado por 10 mM tris-HCl (pH=8.4), 50 mM KCl, 0.1% w/v gelatina y 1.5 mM MgCl2. Algunos autores recomiendan el uso de adyuvantes, los cuales ayudarían en la práctica a aumentar la especificidad y fidelidad de la reacción. El dimetilsulfóxido (DMSO) añadido al tampón de la reacción en un 10% contribuye a la disminución de la estructura secundaria del DNA. También se pueden usar detergentes como el tween 20, laureth 12 (0.1%) o Tritón, que ayudan a estabilizar la enzima. Existen también protocolos que incorporan polietilenglicol (PEG), glicerol, formamida, seroalbúmina bovina (BSA), etc, aunque no son imprescindibles. Otro aspecto importante es la presencia y concentración de dos cationes, el K+ y el Mg++. El cloruro potásico (KCl) influye en la desnaturalización del DNA. Elevadas concentraciones del ión K+ favorecen la desnaturalización de secuencias cortas de DNA, mientras que concentraciones bajas ayudan a la desnaturalización de secuencias largas de DNA. El cloruro de magnesio (MgCl2) aumenta la temperatura de hibridación del DNA. La presencia de Mg++ es imprescindible para la actividad de la Taq polimerasa y su concentración resulta fundamental para la optimización de la reacción. Altas concentraciones de Mg++ disminuyen la especificidad de la reacción, bajas concentraciones de Mg++ aumentan la especificidad de la reacción. 2.3.2.6. Temperatura y número de ciclos Como se ha explicado anteriormente la PCR se realiza en tres etapas que constituyen un ciclo, que se repite durante un número determinado de veces. El tiempo, la temperatura y el número de ciclos son factores determinantes en los resultados de la PCR, por lo tanto, modificándolos podemos optimizar la reacción. – Desnaturalización: Se recomiendan temperaturas de 94°C durante 30 segundos a 1 minuto. Si el DNA molde tiene alto contenido de G + C puede aumentar el tiempo o la temperatura necesarios. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la actividad de la DNA polimerasa decrece de manera muy rápida a partir de los 95°C, por lo que a estas temperaturas o superiores es aconsejable disminuir el tiempo de incubación. En la práctica se suele añadir un período de desnaturalización antes de comenzar los ci67 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 68 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... clos para asegurarnos que se produce a lo largo de toda la muestra de DNA. Esta etapa suele ser de 5 min a 94°C. – Hibridación: la temperatura y el tiempo van a depender de tres factores relacionados con los cebadores: la composición de bases, el tamaño y la concentración. En la práctica, la temperatura de hibridación se establece a 4-5°C por debajo de la Tm de los cebadores pudiendo oscilar entre 45-65°C, y un tiempo comprendido entre 30 segundos y 1 minuto. Un aumento de temperatura o una disminución del tiempo favorecen la especificidad ya que disminuye las uniones inespecíficas de los cebadores con la hebra molde. – Extensión: El tiempo de extensión depende del tamaño del fragmento a amplificar. Se puede estimar un tiempo de 1 minuto para elongar 1 Kb. En la mayoría de las reacciones, la etapa de extensión se realiza a 72°C. Teóricamente esta temperatura puede variar entre 68-72°C. El número de ciclos depende de la cantidad de DNA diana que existe en la muestra una vez que el resto de factores han sido optimizados. Es importante no realizar un número alto de ciclos ya que puede dar lugar a la amplificación de productos no deseados debido a hibridaciones no específicas. Hay que tener en cuenta que la reacción está producida por una enzima que sufre el efecto meseta. Una vez seleccionadas de manera teórica las condiciones de reacción teniendo en cuenta todos los factores mencionados anteriormente, las condiciones seleccionadas deben de evaluarse de manera empírica para poder determinar las condiciones óptimas. 2.3.3. Contaminaciones en la PCR La PCR es una técnica muy sensible, por lo que es de gran importancia evitar contaminaciones, ya que es posible que el DNA no deseado (aunque se encuentre en una cantidad muy pequeña) se amplifique y obtengamos un resultado erróneo. Vemos que una de las mayores ventajas de la técnica, se convierte a la vez en el principal inconveniente. Existen una serie de normas que ayudan a evitar las contaminaciones. Neiker dispone de un lugar físico exclusivo para realizar la mezcla de los reactivos de PCR, otro para la adición del DNA molde y un tercero donde se encuentran los termocicladores, perfectamente separadas de las áreas donde se trabaja con DNA amplificado. Además las salas de preparación de la PCR se irradian con UV antes y después de su uso. Todo el instrumental que se utiliza es de uso exclusivo para la PCR. También se utilizan reactivos y tubos estériles, guantes y controles negativos (se añade agua en lugar de DNA y por tanto no debe existir amplificación). 2.3.4. Detección del producto de PCR. Electroforesis La detección del producto de PCR se realiza normalmente mediante electroforesis de los productos de la reacción en geles. El fundamento de esta separación está basado en que 68 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 69 2. MATERIALES Y MÉTODOS las moléculas de ácidos nucleicos están cargadas negativamente (al pH y condiciones del tampón en el que se encuentran) y al someterlas a un campo eléctrico migran hacia el polo positivo de éste a través del gel a velocidades que dependen de sus tamaños. Un gel es una malla compleja de moléculas poliméricas formada por agarosa o poliacrilamida. La agarosa es conveniente para separar fragmentos de ácidos nucleicos en el rango desde unos pocos cientos, hasta aproximadamente 20.000 pares de bases. La poliacrilamida es preferible para la separación de fragmentos más pequeños de ácidos nucleicos. El polímero empleado, su concentración, el tiempo, y el voltaje determinan la resolución de la electroforesis. La agarosa es el polímero más empleado dada su inocuidad y sus prestaciones. La posterior visualización se puede realizar mediante tinción con bromuro de etidio, tinción de plata, fluorescencia o radioactividad. 2.3.5. Purificación de productos de PCR La presencia de sales, enzimas, nucleótidos, cebadores y otros componentes derivados de la amplificación por PCR pueden interferir en procesos posteriores como son la secuenciación del DNA o la clonación. Por lo tanto se requiere partir de un producto de PCR de alta pureza y calidad. En el caso en que el producto de partida esté limpio, es decir, la muestra no presenta amplificaciones inespecíficas, la purificación puede hacerse directamente a partir de la muestra de PCR en solución. En caso contrario habrá que proceder a la separación del fragmento a purificar en un gel de agarosa, la escisión del la banda y la posterior purificación del DNA a partir de la banda. En este trabajo se ha empleado el GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) basado en un sistema de columnas formadas por una matriz sólida con afinidad por el DNA, posterior lavado y elución del mismo (Tabla 2.7). Tabla 2.7. Purificación de productos de PCR a partir de geles de agarosa 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Obtener un taco de agarosa que contenga el fragmento de PCR que se desea purificar Añadir 10 µl del tampón de captura por cada 10 mg de gel Incubar durante 1 min a Ta Transferir la solución a una columna y centrifugar 30 seg a 13000 g Añadir a la columna 500 µl de tampón de lavado y centrifugar 30 seg a 13000 g Añadir a la columna 50 µl de tampón de elución y centrifugar 30 seg a 13000 g Guardar el DNA a -20°C 2.4. PCR A TIEMPO REAL 2.4.1. Fundamento teórico A diferencia de la PCR convencional, la PCR a tiempo real permite monitorizar el transcurso completo de la reacción de PCR mediante la lectura de la fluorescencia emitida 69 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 70 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... durante la reacción, la cual es indicativa de la producción del amplicón en cada ciclo de la PCR [128, 129]. Esta técnica ofrece una gran variedad de aplicaciones al ser capaz de cuantificar de manera absoluta o relativa moléculas de DNA o RNA. Esta cuantificación se realiza de forma precisa y reproducible gracias a la medición de la fluorescencia generada durante la fase de crecimiento exponencial del producto de PCR en lugar de utilizar medidas de punto final. De este modo, la PCR a tiempo real se emplea para determinar la carga vírica y el título de gérmenes en alimentos, sangre u otro tipo de muestras, la expresión génica en distintos tejidos, seguimiento de tratamientos o estadios del desarrollo, la discriminación alélica, y la deleción o el grado de amplificación de los genes, la respuesta a medicamentos en cánceres humanos, el perfil de citoquinas en la respuesta inmune, la detección de polimorfismos, y la validación de los resultados de experimentos con microarrays de DNA, entre otras aplicaciones. Con la PCR a tiempo real, el empleo de geles de agarosa queda eliminado lo cual, unido a que se han desarrollado termocicladores capaces de procesar 386 muestras y el continuo desarrollo de equipos más rápidos, hacen de esta técnica una sofisticada herramienta para estudios de DNA que requieran un elevado procesado de muestras. Para la detección y cuantificación de la fluorescencia emitida durante la amplificación, el equipo consta de un termociclador convencional al que se le ha acoplado una cámara CCD capaz de registrar en todo momento la fluorescencia que se va produciendo en cada pocillo (Figura 2.1). La detección de la fluorescencia se realiza mediante filtros de emisión optimizados para el uso de un amplio rango de fluoróforos. El equipo de PCR a tiempo real empleado en este trabajo ha sido el ABI Prism 7000 (Applied Biosystems), (Figura 2.2). Figura 2.1. Esquema general del sistema fluorescente en un equipo de PCR a tiempo real. (El sistema consta de una lampara halógena de tugsteno emisora de luz que incide sobre cada muestra a través de una serie de espejos. Una vez que la luz incide sobre los fluoróforos presentes en cada muestra se produce luz fluorescente la cual a través de un sistema de espejos y filtros específicos llega a una cámara CCD que capta la señal fluorescente producida en cada muestra) 70 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 71 2. MATERIALES Y MÉTODOS Figura 2.2. Equipo de PCR a tiempo real ABI Prism 7000 (Applied Biosystems). [Este equipo permite una alta capacidad de procesamiento de muestras, gran reproducibilidad, precisión y un amplio rango dinámico, características necesarias para el análisis cinético de la PCR. Se pueden usar placas ópticas o tubos individuales ópticos. Posee un sistema de detección fluorescente consistente en un bloque integrado de 96 pocillos con una unidad interna de calentamiento/enfriamiento controlada por el sistema peltier en un rango de 4.0°C a 99.9°C. El sistema de detección de la fluorescencia se realiza mediante distintos filtros de emisión lo cual permite el empleo de varios fluoróforos en reacciones multiplex (FAM, VIC, JOE, NED, TAMRA, ROX y SYBR Green)] 2.4.2. Detección del producto de PCR El marcaje del producto en PCR a tiempo real puede conseguirse mediante el empleo de sondas de DNA (TaqMan, molecular beacons, scorpions, etc) o mediante reactivos de unión a la doble cadena de DNA (SYBR Green). A continuación se describen los métodos de marcaje empleados en este trabajo. 2.4.2.1. Sondas TaqMan Las sondas TaqMan son oligonucleótidos de entre 20-40 pb diseñadas para que hibriden con una región interna del producto de PCR. Una sonda TaqMan esta constituida por un marcador fluorescente en el extremo 5’ llamado reporter (R) y un quencher (QR) en el extremo 3’ (Figura 2.3). Existen diversas moléculas que pueden hacer de R y de QR (Tabla 2.8) pero sólo son válidas aquellas combinaciones en la que el espectro de emisión del R esté dentro del espectro de absorción del QR. De esta forma, cuando la sonda es excitada con la longitud de onda adecuada, la energía emitida por el R es absorbida por el QR (a este fenómeno se le conoce como FRET, Transferencia de Energía Fluorescente mediante Resonancia). La proximidad del R y del QR evita cualquier tipo de emisión fluorescente mientras la sonda esté intacta. Al comienzo de la reacción los cebadores hibridan en la región complementaria al DNA y la Taq polimerasa se encarga de añadir nucleóticos desde los extremos 3’ de los cebadores, al mismo tiempo que la sonda TaqMan ha hibridado en su región específica situada entre los cebadores. Una vez que la Taq polimerasa alcanza el extremo 5’ de la sonda y gracias su actividad 5’-exonucleasa, la sonda es fragmentada separando el R del QR con la consiguiente producción de luz fluorescente cuando la muestra sea excitada. En el caso de que la sonda no hibride perfectamente, la Taq polimerasa libera la sonda sin fragmentarla y por lo tanto no se producirá emisión de luz. 71 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 72 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... Figura 2.3. Producción de señal fluorescente mediante sondas TaqMan. [(a) la Taq polimerasa (rojo) añade nucleótidos a partir de los extremos 3’ de los cebadores. La sonda marcada con el reporter (verde) y el quencher (azul) hibrida en una posición interna entre los cebadores. (b) la Taq polimerasa avanza y cuando llega a la sonda la desplaza. (c) la actividad 5’ exonucleasa de la Taq polierasa rompe la sonda. El R queda separado del QR dando lugar a la emisión de luz. (d) la Taq polimerasa termina de amplificar la secuencia existente entre los cebadores] Tabla 2.8. Principales moléculas fluorescentes empleadas como marcadores en PCR a tiempo real Fluorocromo Máx absorción (nm) Máx emisión (nm) SYBR Green I FAM TET JOE VIC HEX NED TAMRA ROX 497 495 522 525 528 530 553 560 580 520 535 550 555 546 560 575 580 605 El empleo de sondas permite aumentar la especificidad obtenida previamente por los cebadores evitando de este modo falsos positivos por amplificaciones inespecíficas. Además facilita la identificación de mutaciones y permite el uso de reacciones multiplex (realizar múltiples experimentos simultáneamente) al poder utilizar varias sondas con fluoróforos distintos a la vez (FAM, VIC, TET, HEX o JOE). Alternativamente se pueden emplear sondas TaqMan MGB. Éstas, permiten el empleo de secuencias más cortas que las sondas TaqMan, lo que resulta muy útil en ensayos de dis72 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 73 2. MATERIALES Y MÉTODOS criminación alélica donde una muestra se somete a amplificación en presencia de dos sondas cuya secuencia se diferencia en una sola base. Esto es posible gracias al empleo de un QR especial denominado MGB, capaz de aumentar la Tm de la sonda. 2.4.2.2. SYBR Green Este fluoróforo se une con gran afinidad al surco menor del DNA bicatenario, aumentando su fluorescencia unas 1.000 veces. De este modo la fluorescencia producida en el transcurso de la PCR aumenta de forma proporcional a la cantidad de producto amplificado. El SYBR Green es una alternativa más económica y más versátil frente al empleo de sondas ya que su unión inespecífica hace factible su empleo en la detección de cualquier DNA amplificado y además evita el diseño y la puesta a punto de las sondas. Sin embargo, esta unión inespecífica a DNA de doble hebra no distingue entre DNA amplificado, dímeros de cebadores y/o productos inespecíficos, por lo que puede dar lugar a falsos positivos. Para evitar ésto, se ha de tener especial cuidado en el diseño de los cebadores y comprobar la Tm del producto final (ver apartado 2.4.4). 2.4.3. Componentes y optimización de la reacción de amplificación En general, el fundamento y los principios básicos de los componentes de la PCR convencional, así como la optimización de la reacción descrita en el apartado 2.3.2 son perfectamente aplicables a la PCR a tiempo real. Por lo tanto, únicamente se van a describir algunas particularidades de esta técnica. 2.4.3.1. Componentes de la reacción La alternativa más rápida y cómoda para poner a punto un protocolo de PCR a tiempo real es el empleo de reactivos comerciales que incluyen todos los componentes necesarios para la reacción tales como el tampón, las sales, la Taq polimerasa y los nucleótidos. Estos reactivos preparados suelen contener un fluoróforo pasivo de referencia, generalmente ROX, que permite ajustar las posibles variaciones entre las muestras debidas a errores en el pipeteo. De este modo podemos encontrar en el mercado el TaqMan Buffer para el empleo de sondas y el SYBR Green Buffer para el empleo de SYBR Green. 2.4.3.2. Diseño de cebadores, sondas y amplicón – Cebadores: Para optimizar los recursos y poder usar las mismas condiciones de ciclado en diferentes ensayos es conveniente diseñar cebadores con una Tm entre los 58-60°C. Al contrario que en la PCR convencional se deben evitar las G/Cs en el ex- 73 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 74 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... tremo 3’. Es también importante evitar la complementariedad en la secuencia de los cebadores para que no se formen dímeros y si no es posible usar concentraciones entre 50 y 300 nM. – Sondas: La Tm ha de ser 10°C mayor que la Tm de los cebadores. Nunca debe haber una G en el extremo 5’ ya que puede hacer de quencher natural y captar la fluorescencia emitida por el reporter. Debe haber menos de 4 G/Cs contiguas para evitar una unión inespecífica fuerte. – Amplicón: Ha de ser pequeño, entre 50 y 150 pb para aumentar la eficiencia de la PCR y para reducir el tiempo del ensayo. Los fragmentos pequeños se amplifican con mayor eficiencia que los grandes ya que tienen gran facilidad de desnaturalizarse a 95°C y porque tan solo 15 segundos son suficientes para su polimerización dado que la Taq polimerasa coloca entre 30 y 70 bases en un segundo. Además, a diferencia con lo que ocurre en la PCR convencional el pequeño tamaño no dificulta la detección. En caso de usar SYBR Green, se recomienda que la longitud del amplicón proporcione una Tm mayor de 75°C para que no coincida con la Tm típica de un dímero de cebadores. 2.4.4. Parámetros en PCR a tiempo real A la hora de trabajar con PCR a tiempo real es necesario conocer una serie de parámetros: – Curva de amplificación. Corresponde a la señal fluorescente resultante de la amplificación de la secuencia de DNA diana (Figura 2.4a). – Baseline o línea base. Ciclos iniciales donde no hay un cambio sustancial de la fluorescencia. Se establece entre los ciclos iniciales y 2 ciclos antes de que se de un aumento de la fluorescencia debido a la amplificación (Figura 2.4a). – Threshold o umbral. Nivel de fluorescencia determinado por el usuario situado en la zona de amplificación exponencial de la reacción (Figura 2.4a). – Threshold cycle (Ct). Corresponde con el ciclo de PCR en el que la curva de amplificación corta al threshold. Es inversamente proporcional a la cantidad inicial de moléculas molde. Este parámetro es el que nos permitirá realizar análisis cuantitativos (Figura 2.4a). – Temperatura de disociación (Tm). Está directamente relacionada con la secuencia nucleotídica del fragmento amplificado (Figura 2.4b) y se puede calcular mediante un software específico (Primer Express software, Applied Biosystems, CA, USA). La Tm se utiliza como parámetro de determinación de la especificidad de la reacción cuando se utiliza SYBR Green como sistema de detección. Al finalizar la reacción, el equipo de PCR aplica un gradiente de temperaturas creciente y monitoriza la cinética de disociación del fragmento amplificado. De este modo y conociendo la Tm 74 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 75 2. MATERIALES Y MÉTODOS teórica del amplicón se puede comprobar no solo la Tm de la secuencia amplificada sino que también permite descartar la presencia de dímeros de cebadores y amplificaciones inespecíficas que en general tienen una Tm diferente a la del amplicón (Figura 2.4c). – Eficiencia de la amplificación (E). Nos indica la efectividad con la que se amplifica el DNA diana. Se calcula mediante la Ecuación 2 [233], donde “pdte” se corresponde con la pendiente de la recta patrón. Un valor de 2 indica una eficiencia del 100%. E = [10 (-1 / PDTE)] Ecuación 2 Figura 2.4. Representación gráfica de parámetros en PCR a tiempo real. [(a) Curva de amplificación de un ensayo de PCR a tiempo real. La primera parte de la curva de amplificación comienza con unos ciclos iniciales (baseline) donde el aumento de la fluorescencia no es detectable, continúa con el aumento detectable de la fluorescencia producida (fase exponencial) seguido de una fase de meseta donde no hay aumento de a fluorescencia porque la reacción se ha saturado. La baseline, el threshold y el Ct quedan representados gráficamente. (b) Ejemplo de representación gráfica de los picos de disociación de tres productos de PCR con distintas Tm. (c) Ejemplo de representación gráfica de la detección de PD en un control negativo de PCR. La Tm de los PD suelen estar entorno a los 75°C a diferencia de la Tm de un producto de PCR que suele ser mayor de 80°C] 2.4.5. Análisis cualitativo Los resultados en PCR a tiempo real pueden ser analizados de forma cualitativa o de forma cuantitativa. El análisis cualitativo se realiza a tiempo final y de forma similar a la PCR 75 01 TESIS 55 2/3/06 09:54 Página 76 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... convencional clásica basada en la presencia o ausencia de una secuencia de DNA o RNA. La diferencia radica en que para la detección del producto amplificado ya no es necesario el uso de geles de agarosa sino que la detección de fluorescencia indica presencia del fragmento buscado. 2.4.5.1. Detección de patógenos Una de las aplicaciones de la PCR a tiempo real es la detección e identificación de patógenos por medio de la amplificación de secuencias específicas de DNA. Esta aplicación ha mejorado enormemente con la PCR a tiempo real gracias a que permite la detección de múltiples fluoróforos en un mismo tubo. De este modo, podemos detectar más de un patógeno en una misma muestra e incluso incluir controles positivos internos utilizando sondas marcadas con fluoróforos de distinto máximo de emisión. Cabe destacar que el hecho de realizar todo el proceso en tubo cerrado reduce la posibilidad de contaminaciones posteriores. 2.4.5.2. Detección de SNPs con sondas TaqMan Una de las aplicaciones de la PCR a tiempo real es la detección SNPs. Para el caso de un polimorfismo puntual con dos variantes, la muestra es sometida a la amplificación de un fragmento de PCR en presencia de dos sondas marcadas con fluoróforos diferentes y cuya secuencia se diferencia únicamente en la base del polimorfismo en estudio. Al término de la reacción de PCR se lee la fluorescencia existente en la muestra con los filtros de emisión específicos de los dos fluorocromos usados de tal forma que la detección de una única señal fluorescente indica homozigosis de uno u otro alelo mientras que dos señales fluorescentes indican heterozigosis (Figura 2.6). El software del equipo ABI Prism 7000 permite obtener gráficamente y de forma intuitiva el genotipo final de las muestras (Figura 2.6). También podemos analizar los SNPs en base a la curva de amplificación observando la fluorescencia de cada una de las sondas. Figura 2.5. Representación de un ensayo de discriminación alélica. [La fluorescencia final de cada reacción es leída (a) y representada gráficamente en un diagrama de nubes según el software del equipo ABI Prism 7000 (b)] 76 01 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 77 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.4.6. Análisis cuantitativo La principal característica definitoria de la PCR a tiempo real es la posibilidad de obtener resultados cuantitativos. El análisis cuantitativo de ácidos nucleicos puede realizarse de dos formas, mediante cuantificación absoluta (CA) o mediante cuantificación (CR) relativa (Figura 2.6). Figura 2.6. Estrategias de cuantificación en PCR a tiempo real. (HK, gen constitutivo de expresión constante en todas las muestras en estudio) 2.4.6.1. Cuantificación absoluta (CA) La CA permite conocer la cantidad exacta del número de moléculas de DNA o RNA que presenta una muestra. Mientras que el análisis cualitativo se realiza a tiempo final, la cuantificación en PCR a tiempo real se realiza en la fase exponencial de la reacción de amplificación. En esta fase se obtiene el Ct de la muestra a partir del cual se puede cuantificar con gran precisión el número de copias del fragmento diana al inicio de la reacción. Para ello es necesario incluir en la misma tanda de amplificación unos controles externos de concentraciones conocidas y crecientes de DNA diana (recta patrón) (Figura 2.7). La cantidad de DNA de una muestra desconocida se obtiene por tanto interpolando en la recta patrón el valor de su Ct. La precisión de la cuantificación dependerá de la correcta elección de la recta patrón. Se ha de calcular de forma exacta la cantidad de moléculas de cada una de las diluciones que la componen. Además, tiene que permitir una alta especificidad, reproducibilidad y estabilidad en los distintos ensayos. Una recta se puede obtener a partir de un DNA standard, plásmidos recombinantes, DNA genómico o de un producto de RT-PCR. Adicionalmente, para lograr una cuantificación correcta, la E de los patrones y las muestras problema deben ser si77 01 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 78 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... milares, lo que implica una intensiva puesta a punto previa de la PCR. El rango de detección de una recta patrón puede abarcar hasta 9 ordenes de magnitud dependiendo del material empleado, permitiendo detectar desde 1 hasta 1010 copias. Figura 2.7. Gráfica de una recta patrón obtenida a partir de diluciones seriadas de concentraciones conocidas de un producto de PCR. (El software permite obtener de forma automática los parámetros relacionados con la recta patrón tales como el valor de R2 (coeficiente de determinación) y la pendiente de la recta) 2.4.6.2. Cuantificación relativa (CR) La CR se emplea para estudiar los cambios relativos en los niveles de mRNA de un gen. Este procedimiento consiste en dos etapas que pueden realizarse en un mismo tubo o en tubos diferentes. La primera etapa es la fase de retrotranscripción en la que todo el RNA se transcribe a cDNA por la transcriptasa inversa, seguido de la etapa de amplificación especifica del gen diana. Al conjunto de estas dos etapas se le denomina RT-PCR. Posteriormente, se realiza la cuantificación relativa mediante la normalización del mRNA del gen problema frente a una o varias referencia/s interna/s o alternativamente utilizando una curva patrón externa basada en diluciones seriadas de cDNA. Para la normalización de la expresión del gen diana se emplea un gen de referencia, también llamado gen interno, gen constitutivo o gen housekeeping (HK). En 1965, Watson y cols. [286] definieron el término “housekeeping genes” como aquellos genes que se expresan en todos los tejidos para mantener las funciones celulares básicas. Existen multitud de genes HK que podemos agrupar en las siguientes funciones biológicas: metabolismo, división celular, defensa y apoptosis, señalización y comunicación, expresión génica y transcripción, expresión proteica, proteínas ribosómicas, estructura y mobilidad. Un estudio realizado en 19 tejidos de 49 individuos reveló la existencia de 451 genes entre los 7.000 genes analizados y como el perfil de expresión de los genes HK variaba en función del tipo de tejido [138]. Por lo tanto, para una correcta cuantificación los genes HK han de tener una expresión constante e invariable en todas las muestras objeto del estudio, independientemente de las condiciones del ensayo (tratamiento con fármacos, estado de salud, edad, tipo de tejido, etc). 78 01 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 79 2. MATERIALES Y MÉTODOS A diferencia de la CA, la normalización mediante genes HK permite obtener resultados muy ajustados que no se ven afectados por las variaciones que pueden existir entre las distintas muestras y que afectan a los resultados del ensayo, como son la cantidad de muestra empleada, la integridad del RNA y variaciones en la E de la síntesis de cDNA, entre otras. Aunque históricamente se ha venido empleado un único gen HK (ACTB, 18S o GAPDH) para la normalización del gen problema [117, 124, 168], estudios recientes han demostrado que la expresión de estos genes HK puede mostrar variaciones inter-individuales así como variaciones en determinadas condiciones de ensayo [50, 271, 273, 285]. Por lo tanto, algunos autores recomiendan el empleo de más de un gen HK para obtener una correcta normalización [216, 283]. La precisión de esta normalización dependerá por tanto de una buena elección de los genes HK ya que no existe un gen o genes universales que puedan ser usados en todos los ensayos por lo que, es necesario evaluar la estabilidad de los genes HK en cada escenario. Existen diversos métodos para seleccionar los mejores genes HK [5, 217, 268, 283]. En el presente trabajo se ha empleado la aplicación de Microsoft Excel GeNorm 3.4. desarrollada por Vandesompele y cols. en 2002 [283]. Este método se basa en la comparación de la expresión de una serie de genes HK entre si, de tal forma que partiendo de un número mínimo recomendado de 5 genes HK podemos determinar la estabilidad de estos genes (M) y el número mínimo de genes HK necesario para una correcta normalización (Vn/n+1). De este modo, los genes con menor M presentan la mayor estabilidad dentro del grupo de muestras que estamos analizando y el valor umbral de 0.15 para el parámetro Vn/n+1 determina el número mínimo de genes a usar. Esta alternativa propone el uso de al menos 3 genes HK para una correcta normalización. Como hemos mencionado anteriormente, es necesario que se evalúe la estabilidad de los genes HK en cada escenario. Una vez seleccionados los mejores genes HK se ha de normalizar la expresión del gen problema en relación a los genes HK, para lo cual se han desarrollado varios modelos matemáticos [216, 283]. En el presente trabajo se ha utilizado el método descrito por Vandesompele y cols. [283]. Para ello, se ha de calcular la cantidad de mRNA (Q) de un gen mediante su Ct. Se puede utilizar una recta patrón relativa obtenida a partir de diluciones seriadas de cDNA e interpolando el valor del Ct a dicha recta, o alternativamente, se puede aplicar la Ecuación 3, donde “Min Ct” es el mínimo valor de Ct para un grupo de muestras y “Ct muestra” es el Ct de la muestra en estudio (manual de usuario GeNorm, http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/geNorm_manual.pdf). Esta ecuación incluye la corrección de la E de reacción de PCR obtenida a partir de diluciones seriadas de cDNA según la Ecuación 2. Q = E (Min Ct – Ct muestra) Ecuación 3 Finalmente, la expresión normalizada del gen problema se obtiene mediante la Ecuación 4, donde se calcula el ratio entre el nivel de mRNA del gen problema (QGP) y el factor normalizador (FN). Este FN específico para cada muestra y es la media geométrica de la cantidad de mRNA de los genes HK (QHK) de referencia empleados (Ecuación 5). 79 01 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 80 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... Expresión relativa = QCP / FN Ecuación 4 QHK1 × QHK 2 × QHK n Ecuación 5 FN = n 2.5. PCR-RFLP El término PCR-RFLP proviene del inglés Restriction Fragment Lenght Polymorphism que traducido significa, polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción. Es una técnica muy usada en biología molecular y consiste en el análisis de los patrones de bandas que aparecen en un gel de agarosa producidos por la digestión enzimática de una secuencia de DNA que puede haber sido previamente amplificada por PCR. Estas enzimas se conocen con el nombre de endonucleasas y son capaces de cortar la molécula de DNA en determinadas secuencias nucleotídicas específicas para cada endonucleasa. Esta secuencia de corte se llama diana de restricción y suele estar compuesta generalmente por 4 a 6 pb. Generalmente cuanto mas corta sea la secuencia diana más fragmentos de restricción se pueden generar. La existencia de diferencias en la secuencia nucleotídica de las moléculas de DNA a estudiar, puede dar lugar a la presencia o ausencia de sitios de restricción, lo que a su vez se traduce en diferencias de tamaño entre los fragmentos resultantes. Estos fragmentos son separados en un gel por electroforesis y los patrones resultantes pueden ser analizados y comparados. Se han aislado gran variedad de enzimas de restricción a partir de procariotas donde se piensa que forman parte de los mecanismos de defensa contra virus bacterianos. La nomenclatura de estos enzimas comienza con la primera letra del genero de la bacteria y continúa con las dos letras siguientes corresponden a la especie y un número que se relaciona con el orden del descubrimiento. 2.6. CLONACIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA EN Escherichia coli Consiste en la obtención de un gran número de copias de fragmentos de DNA idénticos a partir de uno original. De forma resumida, la clonación de fragmentos de PCR comienza con la obtención de un producto de PCR y sigue con su posterior inserción en un plásmido sintético, transformación de las células competentes de E. coli, y amplificación del fragmento por crecimiento de un cultivo de células transformadas. Finalmente, esas copias se aíslan mediante la purificación de los plásmidos (apartado 2.1.1.4.) con el fragmento insertado, que si es necesario puede ser separado del vector por digestión enzimática. En nuestro estudio, el empleo de plásmidos ha permitido la secuenciación de fragmentos pequeños de hasta 75 pb así como la obtención de diluciones seriadas para poder calcular la E de amplificación de ensayos de PCR (apartado 2.4.6.1). Los productos de PCR se han clonado en el vector pCR®4-TOPO empleando el TOPO TA Cloning® kit (Invitrogen, CA, USA). El plásmido 80 01 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 81 2. MATERIALES Y MÉTODOS pCR®4-TOPO tiene dos genes que confieren resistencia a kanamicina y a ampicilina permitiendo seleccionar específicamente aquellas colonias de E. coli que poseen el plásmido con el inserto (Figura 2.8). Figura 2.8. Representación circular del plásmido comercial pCR®4-TOPO (Invitrogen). (El producto de PCR queda ligado al plásmido en la zona de inserción por medio de extremos cohesivos con T. Existen diferentes dianas de restricción que flanquean a la zona del inserto así como genes asociados a resistencia a los antibióticos ampicilina y kanamicina. También presenta las secuencias complementarias a cebadores universales M13, T3 y T7 cercanas a la zona de inserción) 2.7. SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA DEL DNA La secuenciación del DNA es la determinación de la sucesión precisa de nucleótidos de un fragmento de DNA. Este proceso se puede realizar de forma automatizada y el método más popular para hacerlo se llama el método de terminación por dideoxinucleótidos. El DNA se sintetiza con cuatro deoxinucleótidos trifosfato adenina (A), timina (T), citosina (C) y guanina (G). El método de dideoxi recibe su nombre del papel crítico de los nucleótidos sintéticos que carecen del grupo hidroxilo (OH) en el carbono del extremo 3’. El dideoxinucleótido trifosfato (ddNTP) puede agregarse a la cadena creciente de DNA pero cuando esto ocurre la elongación de la cadena se detiene debido a la falta del grupo OH en el extremo 3’ necesario para que continúe la elongación. Por esta razón, el método del dideoxi también se denomina el método de terminación de la cadena. El DNA molde que se necesita para secuenciar tiene que ser de cadena sencilla por lo que se desnaturaliza el DNA durante 5 minutos a 94°C, si el DNA que se quiere secuenciar es de doble cadena. Además del DNA se agrega una mezcla de los cuatro deoxinucleótidos normales (dNTP) en suficiente cantidad (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), una mezcla de los cuatro dideoxinucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP), cada uno en cantidades limitantes y marcados con fluorescencia de diferente color (fluoresceina, NBD, tetrametilrodamina y rojo texas) y Taq polimerasa tipo I de DNA. La elongación de la cadena se produce de forma nor81 01 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 82 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... mal gracias a los deoxinucleótidos hasta que, por casualidad, la polimerasa de DNA inserta un dideoxi en lugar del deoxinucleótido normal y entonces se detiene la elongación. Si la proporción dNTPs / ddNTPs es lo bastante alta, algunas de las cadenas de DNA tendrán éxito agregando varios cientos de nucleótidos antes de la inserción de un ddNTP que detiene el proceso. Los fragmentos se separan por electroforesis capilar, de las cadenas más largas a las más cortas. La resolución es tan buena que una diferencia de un nucleótido es suficiente para distinguir entre una cadena y la siguiente cadena con un nucleótido de más. Cada uno de los cuatro dideoxinucleótidos fluorescentes, es iluminado por una rayo láser y el ordenador archiva la secuencia dando lugar a un cromatograma como el que se muestra en la Figura 2.9. La secuenciación de productos de PCR puede servir para confirmar si el fragmento de secuencia conocida que estamos amplificando es lo que realmente buscamos. Para ello, bastará con comparar la secuencia obtenida con la secuencia del producto esperado mediante alineamientos con un software específico como Vector NTI Suite (Informax Inc., North Bethesda, MD) o frente a todas las secuencias depositas en las bases de datos (GenBank) mediante búsquedas tipo Blast en el servidor del National Center for Biotechnology Information (NCBI). También nos permite conocer la secuencia de fragmentos de DNA desconocidos, detectar mutaciones, realizar un diagnóstico prenatal, etc. Figura 2.9. Cromatograma representativo de la secuenciación automática de DNA. (El color de cada pico corresponde con el color del nucleótido dideoxi incorporado en la posición indicada durante la amplificación de la secuencia de DNA en estudio) 82 01 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 83 Capítulo 3 DESARROLLO DE DOS MÉTODOS BASADOS EN PCR-RFLP Y PCR A TIEMPO REAL PARA EL ANÁLISIS DE LOS POLIMORFISMOS DEL GEN PrP. ANÁLISIS REPRESENTATIVO DE LA POBLACIÓN OVINA DE LA CAPV 01 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 85 3.1. INTRODUCCIÓN El scrapie es una EET que afecta a ovejas y cabras [140, 223]. Como en otras EETs, existe una proteína celular inocua cuya modificación estructural la convierte en una proteína patógena para el individuo, PrPSc, acumulándose ésta en el SNC y en tejidos linfoides [9, 280]. La edad de aparición de los síntomas clínicos está influenciada genéticamente pero las razones de esta relación no están todavía bien esclarecidas. Existen numerosos polimorfismos en el gen PrP que dan lugar a un total de 30 variantes aminoacídicas en ovino y 20 en cabras [17, 21, 108, 165, 277]. Sin embargo, solo unos pocos polimorfismos presentan relación con la resistencia o susceptibilidad genética frente a scrapie. Los polimorfismos con una relación clara se encuentran en los codones 136, 154 y 171 de los que se han descrito distintas combinaciones alélicas con diferentes grados de susceptibilidad a scrapie [72]. Aunque también se ha descrito la presencia de K en el codón 171 en algunas razas ovinas del mediterráneo, no se ha constatado todavía relación alguna con la enfermedad [277]. En relación a los codones 136, 154 y 171, la mayor resistencia parece estar asociada al genotipo ARR/ARR mientras que el genotipo VRQ/VRQ confiere la mayor susceptibilidad frente a scrapie. De este modo, el conocimiento de la distribución de genotipos dentro de un rebaño puede dar una idea del riesgo de los animales a padecer la enfermedad. En el año 2002, la Unión Europea recomendó a todos los países miembros la determinación de la distribución de genotipos en sus razas ovinas selectas [51], con objeto de evaluar la viabilidad de la aplicación de programas de selección encaminados a favorecer los genotipos resistentes en detrimento de los susceptibles. La principal raza ovina de la CAPV es la Latxa, una raza lechera empleada para la producción de queso [93]. También existe una raza genéticamente emparentada a la Latxa llamada Carranzana cuya población representa el 6% de la cabaña ovina de la CAPV. En los años 80 comenzó el análisis de los datos relativos a la producción lechera, momento en el que se implantó un sistema de mejora genética por medio del empleo de machos de alto valor genético e inseminación artificial. Respecto a la incidencia de scrapie en las razas autóctonas vascas solo se han descrito 30 casos en la raza Latxa de los cuales 26 correspondieron a un mismo brote y el resto a 4 brotes con un único animal afectado. La incidencia es muy baja si la comparamos con la alta proporción de casos que presenta la raza Manech de los Pirineos Atlánticos (Francia) que es genéticamente similar a la Latxa [86]. Aunque se desconoce la razón de la distinta prevalencia de scrapie en dos razas tan similares, el conocimiento de la susceptibilidad genética en la raza Latxa podría ser muy útil para conocer el riesgo potencial de esta raza. En este sentido, en 1998 se comenzó el genotipado de las razas de la CAPV en una muestra relativamente pequeña de animales. En este primer estudio, la técnica utilizada no permitió discernir entre Q e H en el codón 171 [147]. Se han empleado diversas metodologías para conocer los polimorfismos del gen PrP en los codones 136, 154 y 171, entre las cuales podemos encontrar protocolos basados en la técnica de Southern blot, PCR-RFLP y secuenciación de DNA [143, 307, 311]. Sin embargo, estos protocolos son muy laboriosos por lo que como parte de este trabajo se han desarrollado dos nuevos protocolos que proporcionan resultados más fiables reduciendo el tiempo y los 85 01 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 86 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... costes. El primer protocolo está basado en un análisis por PCR-RFLP descrito por Yuzbasiyan-Gurkan y cols. en 1999 [307] y el segundo emplea la PCR a tiempo real [123, 129]. Ambos protocolos se han aplicado al estudio de la distribución de los polimorfismos en los codones 136, 154 y 171 del gen PrP en una muestra representativa de la población ovina de la CAPV realizado entre los años 2001-2002. 3.2. SELECCIÓN DE LOS ANIMALES Para el presente estudio se seleccionaron animales procedentes de razas autóctonas de la CAPV. La raza Latxa es la raza ovina más representativa de la cabaña de la CAPV. Comprende unos 300.000 animales y presenta dos variedades, la de cabeza oscura conocida como Latxa Cara Negra (LCN) con un porcentaje aproximado del 55% y la de cabeza rubia llamada Latxa Cara Rubia (LCR) representada en un 39%. Asimismo, existe una segunda raza muy similar a la LCR denominada Carranzana cuya población supone un 6% y su distribución queda restringida al territorio de Carranza en Bizkaia. Para obtener una muestra representativa de la población ovina de la CAPV, se seleccionaron un número de animales de cada raza y variedad proporcional a su censo (1999) y a su distribución geográfica procedentes de rebaños comerciales. En el caso de animales LCR debido a que es una variedad que esta básicamente localizada en Gipuzkoa, se eligieron rebaños exclusivamente de dicha provincia. Por la misma razón los rebaños de Carranzana seleccionados procedían de Bizkaia, mientras que los rebaños de LCN pertenecían a las tres provincias. Dentro de cada territorio histórico la selección de los rebaños se hizo proporcionalmente a los censos de cada comarca, y dentro de cada comarca los rebaños se seleccionaron mediante la técnica de números aleatorios. Se decidió recoger sangre de aproximadamente 10 ovejas mayores de un año de cada uno de los 53 rebaños selecciona- Figura 3.1. Distribución geográfica de 53 rebaños comerciales seleccionados para el estudio de la susceptibilidad genética a scrapie. (Mapa del territorio histórico de la CAPV donde aparece representada mediante puntos verdes la localización de cada rebaño) 86 01 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 87 3. DESARROLLO DE DOS MÉTODOS BASADOS EN PCR-RFLP Y PCR A TIEMPO REAL PARA EL ANÁLISIS... dos (8 de Álava, 14 de Bizkaia y 31 de Gipuzkoa, (Figura 3.1) con lo que se obtuvieron un total de 525 sangres distribuidas de la siguiente manera: 332 LCN, 143 LCR, 50 Carranzana. Además, se seleccionaron también animales de interés comercial dentro del proceso de selección de ARDIEKIN: 573 machos pertenecientes a ganaderías y al Centro de Selección de ARDIEKIN, y 199 madres de corderos que se incorporan al Centro de Selección. En resumen, se han analizado un total de 1297 sangres de 906 animales LCN, 341 LCR y 50 CAR. 3.3. PUESTA A PUNTO DE LA TÉCNICA DE GENOTIPADO POR PCR-RFLP El primer procedimiento desarrollado es el resultado de la combinación y mejora de dos protocolos previamente descritos [144, 307]. El método descrito por Hunter y cols. en 1994 [144], se basa en una amplificación por PCR de un fragmento de 707 pb del gen PrP que incluye los tres codones. Posteriormente, este fragmento se digiere con la enzima de restricción BspHI para determinar los polimorfismos en los codones 136 y 154. Y finalmente, para analizar el codón 171, el mismo producto de PCR se somete a hibridación con sondas específicas de alelo marcadas con digoxigenina. El protocolo descrito por Yuzbasiyan-Gurkan y cols. en 1999 [307], comprende dos amplificaciones por PCR y tres digestiones con las enzimas de restricción BspHI, AccI y BslI. El protocolo desarrollado en este estudio consiste en dos PCRs similares a las descritas por Yuzbasiyan-Gurkan y cols. [307] (denominadas PCR-A y PCR-B) con el mismo programa de ciclos y posterior digestión enzimática. Una de las mejoras introducida consiste en la eliminación del sitio de restricción AccI introducido en la PCR-B con el cebador forward por Yuzbasiyan-Gurkan y cols. Este sitio de restricción era generado artificialmente para tener un control positivo de la digestión por AccI. Sin embargo, la localización de esta diana próxima a un extremo del amplicón puede causar digestiones parciales (Figura 3.2). La razón de esas posibles digestiones parciales es que para una correcta digestión por la endonucleasa AccI es Figura 3.2. Ejemplo de digestión parcial del producto de la PCR-B con la enzima AccI. [Calle 1, producto de la PCR-B (161 bp) no digerido. Calles 2, 5, 6 y 8, digestiones parciales de muestras QH en 171. Calles 3, 4 y 7, digestiones completas de muestras QH en 171. M, marcador de peso molecular 25 pb Ladder (Invitrogen, CA, USA)] 87 01 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 88 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... necesaria la presencia de un mínimo de 13 pb a ambos lados del punto de corte y en este caso solo hay 12 pb (5’ - GGCCTTGGTGGT↓CTACATGCT - 3’). Por lo tanto, para evitar problemas en la interpretación de los resultados debidos a digestiones parciales, se diseñó un cebador forward perfectamente complementario a la secuencia del gen PrP, desapareciendo así ese sitio de restricción para AccI (Tabla 3.1). Tabla 3.1. Secuencias de los cebadores empleados en el protocolo de PCR-RFLP PCR-A (159 pb) PCR-B (161 pb) F1 5’-GTGTACTACAGACCCGTGGA-3’ R1 5’-CATTTGCTCCACCACTCGCT-3’ F2 5’-GCCTTGGTGGCTACATGCT-3’ R2 5’ -TGCACAAAGTTGTTCTGGTTAGTA-3’ Cada reacción de PCR (15 ml y 25 ml de volumen de reacción para la PCR-A y PCR-B, respectivamente) incluye 100 ng de DNA molde, 0.1 mM de cada cebador, 150 mM de dNTPs, 1.5 mM de Mg++ y 1 U de Taq polimerasa. Ambas reacciones se someten al mismo programa de PCR: después de una desnaturalización a 94°C durante 4 min, se repiten 35 ciclos de una etapa a 94°C durante 30 seg, otra de 30 seg a 57°C y otra de 30 seg a 72°C. A continuación, los productos de PCR se someten a digestión enzimática con endonucleasas que reconocen los polimorfismos del gen PrP en estudio (Figura 3.3). Para determinar los polimorfismos de los codones 136 y 154, el producto de la PCR-B es digerido con BspHI (T↓CATAG) a 37°C durante 2 horas al igual que en el protocolo de Hunter y cols. [144]. En el caso del codón 136 esta enzima corta la secuencia nucleotídica que codifica para el aminoácido V y no corta en caso de existir A. Para el codón 154, BspHI corta el producto de PCR en caso de existir H y no corta si hay R. Los polimorfismos para el codón 171 se determinan de la misma forma que Yuzbasiyan-Gurkan y cols. [307] mediante la combinación Figura 3.3. Diagrama comparativo de tres protocolos de PCR-RFLP para el genotipado del gen PrP. [(*) Amplicón de la PCR-B difiere en 1 pb en tamaño debido a una modificación del cebador forward] 88 01 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 89 3. DESARROLLO DE DOS MÉTODOS BASADOS EN PCR-RFLP Y PCR A TIEMPO REAL PARA EL ANÁLISIS... de los resultados obtenidos por la digestión del producto de la PCR-A con BslI (CCNNNNN↓NNGG) a 55°C durante 2 horas y del producto de la PCR-B con AccI (GT↓MKAC) a 37°C durante 2 h. La enzima BslI corta la secuencia que codifica para R pero no así en el caso de Q o H, mientras que AccI corta R y Q pero no H. Los fragmentos de restricción generados son separados por electroforesis en un gel de agarosa al 3%. La detección de los fragmentos se realiza por tinción con bromuro de etidio (0.5 µg/mg) y fotografiado bajo luz UV. Los patrones de bandas generados tras la digestión enzimática se muestran en la Figura 3.4 y su interpretación se describe en la Tabla 3.2. Figura 3.4. Electroforesis en gel de agarosa de los fragmentos generados por la digestión enzimática de los productos de las PCRs A y B con tres endonucleasas para la determinación de los polimorfismos en los codones 136, 154 y 171 del gen PrP. [Calles 1 y 12, producto de la PCR-B (161 bp) no digerido. Calle 8, producto de la PCR-A no digerido (159 bp). Calles 2-7, patrones de digestión producidos por BspHI para determinar los polimorfismos en los codones 136 y 154: calle 2, AR/AR; calle 3, AH/AH; calle 4, VR/VR; calle 5, AR/AH; calle 6, VR/AR y calle 7, VR/AH. Calles 9-11 y 1315, patrones de restricción generados con las enzimas BslI y AccI respectivamente, empleados para determinar los polimorfismos en el codón 171: calle 9, RR; calle 10, RQ o RH; calle 11, QQ, HH o QH; calle 13, RR, QQ o RQ; calle 14, HH y calle 15, RH o QH. M, marcador de peso molecular 25 pb ladder (Invitrogen, CA, USA)] Tabla 3.2. Interpretación de los patrones generados en el protocolo de PCR-RFLP para la determinación de los polimorfismos en los codones 136, 154 y 171 de gen PrP a b Codones 136, 154 PCR-B Tamaño (pb) BspHI Calle AR/AR AH/AH VR/VR AR/AH VR/AR VR/AH 162 80, 82 132, 30 162, 80, 82 162, 132, 30 132, 80, 82, 30 2 3 4 5 6 7 a PCR-A Codón 171 Tamaño (pb) BslI RR QQ HH RQ RH QH Callea PCR-A Tamaño (pb) AccI Callea 9 11 11 10 10 11 136, 28b 136, 25b 161 136, 25b 161, 136, 25b 161, 136, 25b 13 13 14 13 15 15 81, 58, 20b 101, 58 101, 58 101, 81, 58, 20b 101, 81, 58, 20b 101, 58 El número de calle se corresponde con la numeración de calles en la Figura 3.4. Bandas no siempre detectables en un gel de agarosa al 3%. 89 01 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 90 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... 3.4. PUESTA A PUNTO DE LA TÉCNICA DE GENOTIPADO POR PCR A TIEMPO REAL Este protocolo se basa en 4 reacciones de PCR a tiempo real empleando 7 sondas fluorogénicas TaqMan MGB. El diseño de los cebadores y las sondas cuyas secuencias se muestran en la Tabla 3.3, ha sido realizado con ayuda del software Primer Express v2.0 (Applied Biosystems, CA, USA). Para la determinación de los polimorfismos en los codones 136 y 154 se requiere una sola reacción de PCR para cada uno. La discriminación de las variantes alélicas en 171 se resuelve por medio de la combinación de dos reacciones, una para identificar los polimorfismos R/Q y otra para R/H. Cada ensayo de PCR se compone de dos sondas TaqMan MGB correspondientes a los dos polimorfismos en estudio a una concentración de 250 nM cada una, además de dos cebadores a 900 mM cada uno y el reactivo TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA, USA). Las reacciones se llevan a cabo en placas de 96 pocillos donde se analizan 92 muestras. Además se incluyen un control negativo de PCR y tres controles correspondientes a cada una de las combinaciones alélicas. Tras realizar una mezcla de todos los reactivos comunes manualmente, ésta se reparte en la placa con ayuda del robot Biomek 2000 (Beckman-Coulter, CA, USA) y finalmente se añade el DNA molde. Tabla 3.3. Cebadores y sondas diseñadas para la detección de los polimorfismos del gen PrP por PCR a tiempo real Codón Cebadores Sonda TaqMan MGB* 136 136F: 5’-CTGCAGCTGGAGCAGTGGTA-3’ 136R:5’-ATAGTAACGGTCCTCATAGTCATTGC-3’ 154 154F: 5’-CATGAGCAGGCCTCTTATACATTTT-3’ Sonda R: FAM 5’-CCGTTACTATCGTGAAAA-3’ 154R: 5’-GATCCACTGGTCTGTAGTACACTTGG-3’ Sonda H: VIC 5’-TACTATCATGAAAACATG-3’ 171 171F: 5’-GTTACCCCAACCAAGTGTACTACAGA-3’ Sonda R: FAM 5’-CCAGTGGATCGGTATA-3’ 171R: 5’-TGTTGACACAGTCATGCACAAAG-3’ Sonda Q: VIC 5’-ACCAGTGGATCAGTATA-3’ Sonda H: VIC 5’-TGGTTACTATAATGATCC-3’ Sonda A: FAM 5’-TCATGGCACTTCC-3’ Sonda V: VIC 5’-CTCATGACACTTCC-3’ a MGB Minor groove binding. A, Alanina; V, Valina; R, Arginina; H, Histidina; Q, Glutamina. F, cebador forward; R, cebador reverse. Las bases correspondientes a los SNPs se muestran subrayadas Las reacciones de PCR se llevan a cabo en el equipo ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, CA, USA) bajo las condiciones universales: 95°C durante 10 min y 40 ciclos a 95°C durante 15 s y 60°C 1 min. La normalización de la señal fluorescente se realiza mediante el empleo del fluoróforo pasivo de referencia ROX incluido en el tampón de la reacción, y la interpretación de los resultados se lleva a cabo mediante la opción de discriminación alélica del software ABI Prism 7000 y posterior comprobación de las curvas de amplificación. La interpretación de las curvas y gráficas obtenidas en cada reacción se explica en las Figura 3.5 y Figura 3.6. 90 01 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 91 3. DESARROLLO DE DOS MÉTODOS BASADOS EN PCR-RFLP Y PCR A TIEMPO REAL PARA EL ANÁLISIS... Figura 3.5. Interpretación de las curvas de amplificación y diagramas de discriminación alélica para la detección de polimorfismos en los codones 136 (A/V) y 154 (R/H) del gen PrP mediante sondas TaqMan MGB. (Figuras a-c, e-g, curvas de amplificación de los ensayos 136 y 154, respectivamente. Figuras d y h, diagramas de discriminación alélica para los ensayos 136 y 154, respectivamente. NTC, control negativo) 91 01 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 92 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... Figura 3.6. Curvas de amplificación y diagramas de discriminación alélica para la detección de polimorfismos en los codones 171 (R/Q/H) del gen PrP mediante sondas TaqMan MGB. (Figuras a-c, e-g, curvas de amplificación de los ensayos 171 (R/Q) y 171 (R/H), respectivamente. Figuras d y h, diagramas de discriminación alélica para los ensayos 171 (R/Q) y 171 (R/H), respectivamente. NTC, control negativo) 92 01 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 93 3. DESARROLLO DE DOS MÉTODOS BASADOS EN PCR-RFLP Y PCR A TIEMPO REAL PARA EL ANÁLISIS... 3.5. VALIDACIÓN DE LAS TÉCNICAS Con el fin de confirmar los resultados obtenidos y detectar otros posibles polimorfismos en los codones estudiados, se han secuenciado 34 muestras correspondientes a una muestra de cada una de las combinaciones alélicas además de 25 muestras genotipadas como QQ en el codón 171 por las dos técnicas. Para ello, se amplifica un fragmento de 270 pb con los cebadores F2 y R1 usando las condiciones de ciclado descritas en el apartado 3.3. Los productos de PCR se purifican y posteriormente se envian a un servicio de secuenciación automática. Además, se han analizado 160 muestras por ambas técnicas (PCR-RFLP y PCR a tiempo real). Los resultados obtenidos de la secuenciación y el análisis paralelo por las dos técnicas confirmaron los resultados obtenidos por ambos métodos. Asímismo no se ha observado ninguna mutación adicional en los codones estudiados ni en las regiones adyacentes. 3.6. DISTRIBUCIÓN DE GENOTIPOS EN RAZAS AUTÓCTONAS DE LA CAPV La frecuencia genotípica de las razas Latxa y Carranzana se ha obtenido por uno de los dos métodos descritos anteriormente (848 muestras por PCR-RFLP y 289 por PCR a tiempo real), o por ambas técnicas (160 muestras). La distribución genotípica obtenida se presenta en la Tabla 3.4. Las frecuencias alélicas y genotípicas entre las dos variedades de raza Latxa han sido comparadas estadísticamente mediante Chi cuadrado con el software EpiInfo 6 (CDC, Atlanta, USA). Del mismo modo se han contrastado las frecuencias alélicas y genotípicas entre hebras y machos. Raza Latxa El análisis genético de 1247 animales de raza Latxa ha revelado la presencia de los 5 alelos descritos para los codones 136, 154 y 171. El alelo ARQ ha sido el más frecuente (70.3%), seguido del ARR (22.5%) y ARH (3.9%). El alelo asociado con una alta susceptibilidad VRQ se ha presentado en un 2.5% de los animales y el restante 0.8% ha presentado el alelo AHQ. El análisis estadístico ha revelado diferencias estadísticas (p<0.05) entre la variedad LCN y LCR para los alelos ARQ, ARH y VRQ. Se han encontrado 14 genotipos diferentes de los cuales el genotipo AHQ/AHQ ha estado representado por un solo animal de la variedad LCR. El genotipo más frecuente en la raza Latxa ha sido el ARQ/ARQ (49.3%), seguido del ARR/ARQ (32.6%) y ARH/ARQ (5.8%). Se han encontrado diferencias significativas (p<0.05) entre las dos variedades de raza Latxa para los genotipos ARR/ARH, ARH/ARH, AHQ/ARQ, ARQ/ARQ y ARR/VRQ. Cuando estos genotipos se agrupan por su grado de susceptibilidad según la clasificación UK-NSP [72], la prevalencia del grupo de mayor riesgo denominado Tipo 5 (ARQ/VRQ, ARH/VRQ y VRQ/VRQ), ha sido significativamente menor en LCN (2.9%) que en LCR (5.0%). La frecuencia genotípica asociada a bajo riesgo, Tipo 1 (ARR/ARR), ha sido similar en ambas variedades, LCN (5.1%) y LCR (4.7%). Las diferencias de distribución de alelos y genotipos entre machos y hembras no han sido significativas (p>0.05). 93 01 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 94 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... Raza Carranzana El estudio genético de la raza Carranzana ha sido realizado en una muestra de 50 hembras pertenecientes a 5 rebaños. El análisis de los polimorfismos ha revelado la presencia de todos los polimorfismos analizados para los codones 136 (A/V) y 171 (R/Q/H), a diferencia del codón 154 donde solo se ha observado uno de los dos polimorfismos descritos (R/H), el aminoácido R. El alelo mas frecuente ha sido el ARQ (62.0%) seguido del ARR (25.0%), ARH (10.0%) y VRQ (3.0%). Las combinaciones alélicas han dado lugar a 7 genotipos diferentes siendo el ARQ/ARQ (38.0%) el genotipo más frecuente, seguido por el ARR/ARQ (30.0%) y AHQ/ARQ (14.0%). Aunque el número de animales analizados ha sido bajo, no se han encontrado animales susceptibles VRQ/VRQ dentro de esta muestra de raza Carranzana, mientras que el genotipo resistente ARR/ARR ha estado presente en un 6.0% de los animales. Tabla 3.4. Distribución de genotipos en las razas autóctonas de la CAPV: LCN, LCR y Carranzana Tipo a Genotipo LCN N (%) LCR N (%) Latxa N (%) Carranzana N (%) 1 ARR / ARR 46 (5.1) 16 (4.7) 62 (5.0) 3 (6.0) 2 ARR / AHQ ARR / ARH ARR / ARQ 4 (0.4) 5 (0.6) 304 (33.6) 1 (0.3) 6 (1.8) 102 (29.9) 5 (0.4) 11 (0.9) 406 (32.6) – 3 (6.0) 15 (30.0) 3 AHQ / AHQ AHQ / ARH AHQ / ARQ ARH / ARH ARH / ARQ ARQ / ARQ – 2 (0.2) 9 (1.0) – 34 (3.8) 468 (51.7) 1 (0.3) – 2 (0.6) 3 (0.9) 39 (11.4) 146 (42.8) 1 (0.1) 2 (0.2) 11 (0.9) 3 (0.2) 73 (5.8) 614 (49.3) – – – – 7 (14.0) 19 (38.0) 4 ARR / VRQ 7 (0.8) 8 (2.3) 15 (1.2) 1 (2.0) 5 AHQ / VRQ ARH / VRQ ARQ / VRQ VRQ / VRQ – 4 (0.4) 21 (2.3) 2 (0.2) – 1 (0.3) 15 (4.4) 1 (0.3) – 5 (0.4) 36 (2.9) 3 (0.2) – – 2 (4.0) – 906 (100.0) 341 (100.0) 1247 (100.0) 50 (100.0) Total a Grupos de riesgo según la clasificación UK-NSP [72] de menor riesgo Tipo 1 a mayor riesgo Tipo 5. N, número de animales 3.7. DISCUSIÓN El análisis de los polimorfismos en los codones 136, 154 y 171 del gen PrP en ovino puede realizarse mediante diferentes protocolos según las necesidades de cada laboratorio. El presente trabajo describe dos nuevos protocolos, uno más laborioso pero que requiere menos 94 01 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 95 3. DESARROLLO DE DOS MÉTODOS BASADOS EN PCR-RFLP Y PCR A TIEMPO REAL PARA EL ANÁLISIS... equipamiento (PCR-RFLP) y un segundo método más rápido y simple pero que requiere una inversión inicial en equipamiento (PCR a tiempo real). El primer protocolo surge de la combinación de dos protocolos previamente descritos y está basado en la técnica de PCR-RFLP. Este protocolo incorpora una mejora en el diseño de los cebadores descritos por Yuzbasiyan-Gurkan y cols. [307] para eliminar problemas de interpretación posteriores. Además, mientras estos autores necesitan cuatro reacciones de PCR para la determinación de los polimorfismos en los tres codones, el nuevo protocolo consta únicamente de dos PCRs gracias a al empleo de una enzima utilizada por Hunter y cols. [144]. Todo protocolo basado en la técnica de PCR-RFLP puede presentar un pequeño inconveniente. Mientras una digestión indica la presencia de la diana de restricción en la secuencia analizada, un resultado negativo, es decir, la ausencia de diana de restricción, puede esconder una mutación en la secuencia reconocida por la endonucleasa que puede estar localizada en la posición en estudio o en otra base de la región adyacente. En esta circunstancia, se produciría una interpretación incorrecta. En nuestro caso hay que tener presente la posibilidad de la presencia de K en el codón 171 descrito en algunas razas ovinas mediterráneas [277]. La presencia de este polimorfismo daría lugar a la falta de digestión y por tanto este resultado se interpretaría como Q en vez de K. Sin embargo, los resultados obtenidos por secuenciación y el análisis en paralelo de muestras por las dos técnicas sugieren la ausencia de estas mutaciones adicionales, así como del alelo K en 171 dentro de las razas ovinas autóctonas de la CAPV. El segundo protocolo desarrollado en el presente trabajo es rápido, poco laborioso y permite analizar un gran número de muestras. Hay que tener en cuenta que todo el proceso puede ser automatizado con el empleo de un robot, lo cual permite analizar hasta 92 muestras de sangre en una jornada de trabajo de 8 horas. La PCR a tiempo real es una técnica que permite determinar polimorfismos de una sola base usando sondas marcadas con fluorescencia. Para este protocolo se han empleado sondas TaqMan MGB que aumentan la especificidad de la hibridación en ensayos de discriminación de SNPs. Los resultados se obtienen directamente después de 4 reacciones de PCR a tiempo real sin necesidad de geles de agarosa, disminuyendo de este modo el tiempo de obtención de los resultados. Sin embargo este protocolo requiere una alta inversión inicial en la adquisición de un equipo altamente sofisticado como es la PCR a tiempo real. Asimismo, los reactivos pueden resultar caros, sin embargo, el volumen final de las reacciones pueden reducirse para abaratar el coste final. En este estudio se han conseguido reducir estos volúmenes a 5 µl para las reacciones de los codones 136 y 154, y a 20 µl para las dos reacciones del codón 171 sin que esto suponga una disminución de la fluorescencia final y consecuentemente una difícil interpretación de los resultados. Esta técnica proporciona unos resultados muy precisos y reproducibles y es recomendable para laboratorios de diagnóstico que necesiten procesar un número relativamente alto de muestras. Cabe destacar que recientemente y con posterioridad al trabajo publicado con los resultados presentados en este capítulo [96], se ha publicado un nuevo método muy similar basado en la PCR a tiempo real. El nuevo protocolo se ha servido de la capacidad que tienen los nuevos equipos de PCR a tiempo real de leer más de 3 colores diferentes. De este modo se emplean 95 01 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 96 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... 7 sondas fluorogénicas ASO y dos reacciones de PCR a tiempo real para determinar los polimorfismos en los codones 136, 154 y 171 [282]. Desde que se conoce la asociación entre los polimorfismos del gen PrP y la susceptibilidad frente a scrapie se han genotipado un gran número de razas ovinas en todo el mundo. A pesar de existir una gran variabilidad en la distribución de los genotipos según la raza, se sigue aceptando que los animales con ciertos genotipos tienen mayor predisposición a desarrollar scrapie clínico mientras que otros tienen menos probabilidades de padecer la enfermedad. Con relación a la raza Latxa, los primeros datos sobre frecuencias genotípicas del gen PrP fueron publicados con anterioridad a este trabajo en el año 2002 por Hurtado y cols. [147], sin embargo, la técnica empleada en dicho estudio no permitía la discriminación entre los polimorfismos Q y H del codón 171 y ambos fueron considerados como Q. Con los protocolos descritos en este trabajo se solventa este problema revelando la presencia de H en 171 en forma de alelo ARH y presente en un 3.9% de los animales analizados. Asimismo este estudio ha revelado una alta variabilidad genética en la raza Latxa con 8 nuevos genotipos aumentando la variabilidad genética de esta raza a un total de 14 genotipos. El genotipo salvaje ARQ/ARQ incluido en el grupo de animales con poco resistencia genética a scrapie [72] fue el genotipo más frecuente en los individuos analizados (49.3%). En comparación con otras razas como la Suffolk, Texel, Charollais o la German Ehite Headed Mutton [83, 202], la raza Latxa presenta un mayor porcentaje de este genotipo. El segundo genotipo más frecuente fue el ARR/ARQ, asociado a baja susceptibilidad frente a scrapie a nivel individual pero que a su vez presenta diferentes grados de susceptibilidad si tenemos en cuenta que puede segregar el alelo ARQ. Por otro lado, los genotipos asociados con muy alto riesgo como son el ARQ/VRQ y VRQ/VRQ presentaron bajas frecuencias (2.9% y 0.2%, respectivamente). La frecuencia de H en 171 dentro de la raza Latxa es comparable a otras razas estudiadas como la Texel, Belclare, Galway y Suffolk donde este polimorfismo se presenta en una baja proporción de animales [83, 202]. El nivel de resistencia o susceptibilidad asociada al alelo ARH no esta claro aunque parece ser que H en 171 presenta recesividad por lo que la susceptibilidad del animal dependerá del otro alelo [86]. Las variedades LCN y LCR no solo se diferencian fenotípicamente, también presentan diferencias (p<0.05) en la proporción de determinados genotipos (ARR/ARH, ARH/ARH, AHQ/ARQ, ARQ/ARQ y ARR/VRQ). En general, podemos decir que individuos LCN presentan una ligera mayor resistencia genética a desarrollar scrapie que la variedad LCR. Estas diferencias pueden compararse con las frecuencias genotípicas existentes en la raza Manech antes de que se implantasen los sistemas de mejora genética frente a scrapie. En esta raza la variedad Manech Cara Negra (similar a LCN) es genéticamente más resistente que la variedad Manech Cara Rubia (similar a LCR). Cabe destacar que la proporción del alelo ARR es de un 50.8% en los animales Manech Cara Negra en comparación con el 17.1% en Manech Cara Rubia [131], variedad donde se concentran la mayoría de los animales con scrapie. Este trabajo analiza por primera vez los polimorfismos del gen PrP en la raza Carranzana en la que solo se identificaron 7 genotipos, probablemente debido al tamaño de la muestra. Sin embargo, el número de animales analizados fue representativo de esta población y se 96 01 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 97 3. DESARROLLO DE DOS MÉTODOS BASADOS EN PCR-RFLP Y PCR A TIEMPO REAL PARA EL ANÁLISIS... ajusta a las condiciones que determina la Unión Europea (UE) para el estudio de los polimorfismos del gen PrP en una raza pura [51]. Los resultados mostraron que el 42.0% de los animales presentó uno de los genotipos asociados a bajo riesgo (ARR/ARR, ARR/ARQ y ARR/ARH), el 54.0% presentó un genotipo asociado a baja resistencia frente a scrapie (ARH/ARQ, ARQ/ARQ y ARR/VRQ) y el 4.0% presentó un genotipo asociado con alto riesgo (ARQ/VRQ) [72]. Un 10.0% de los individuos presentó el alelo ARH, un alto porcentaje en comparación con el 3.9% de la raza Latxa. Sin embargo, cabe destacar que todos los animales con este alelo pertenecían a dos rebaños. Ninguno de los animales analizados presentó el genotipo de alto riesgo VRQ/VRQ. Los análisis genéticos realizados en el presente trabajo muestran como las razas Latxa y Carranzana tienen un riesgo genético relativamente alto a desarrollar scrapie, sin embargo, la incidencia de la enfermedad no parece ser un problema. La baja incidencia de scrapie (30 casos hasta Junio de 2005) hace pensar en la existencia de factores ambientales tales como una escasa presencia del agente, la existencia de otras cepas, el manejo de los animales o en factores ecológicos asociados con la transmisión del agente patógeno. Hasta el momento no existe ningún método que permita dar un diagnóstico fiable del estatus de los animales in vivo. Una de las estrategias más empleadas es la detección del agente patógeno en el sistema linfoide como el tercer párpado, la amígdala o el ganglio retrofaringeo. De este modo se puede conseguir detectar scrapie en animales que no presentan síntomas clínicos de la enfermedad. Sin embargo, este método además de ser difícilmente aplicable en un programa de vigilancia aplicado a la totalidad de la población, no es 100% fiable ya que la vía de diseminación del prión, así como las diferentes presentaciones de la enfermedad pueden dar lugar a falsos negativos. Con todo esto, la estrategia del genotipado sigue siendo una buena forma de prevención en base al conocimiento del riesgo individual y el riesgo de transmisión del scrapie. El riesgo individual está determinado por la susceptibilidad o resistencia a scrapie [72], pero el riesgo de transmisión parece estar estrechamente ligado al genotipo de la progenie. Diversos estudios han demostrado que la transmisión vertical se puede dar en el momento del parto por contacto con la placenta infectada o a través del útero [7, 278]. Sin embargo, parece ser que los priones solo pueden acumularse en la placenta si el genotipo del feto es ARQ/VRQ, VRQ/VRQ, o posiblemente ARQ/ARQ, y no así en el caso de fetos con el alelo ARR [7, 278]. Los resultados presentados en este trabajo han sido empleados para el diseño de un hipotético programa de selección y mejora genética que permita obtener una cabaña ovina en la que todos los animales presenten el genotipo resistente ARR/ARR. De este modo, se han desarrollado dos modelos, el primero más restrictivo en el que serían necesarios entre 6 y 10 años y supondría una pérdida en los valores productivos. El segundo sería más laxo y tendría una duración de entre 12 y 15 años reduciéndose así las perdidas de caracteres productivos. Hasta el momento se ha llevado a cabo una selección más suave consistente en eliminar los machos portadores del alelo VRQ. Cabe destacar que la aparición de casos de scrapie en animales con genotipos asociados a bajo riesgo [18, 47, 206], ha reabierto el debate sobre la utilidad de la selección de animales resistentes ARR/ARR y la política de mejora genética frente a scrapie. 97 01 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 98 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... En este trabajo se describe un protocolo de PCR-RFLP que puede ser usado en cualquier laboratorio y una segunda alternativa para el genotipado de los polimorfismos del gen PrP (PCR a tiempo real) que requiere una alta inversión pero que puede ser automatizada para analizar un gran numero de muestras en poco tiempo de manera rentable. Estos métodos se han aplicado al análisis de los polimorfismos del gen PrP en 1297 animales de dos razas puras autóctonas de la CAPV, entre los que se incluyen los machos empleados para inseminación artificial en el Programa de Mejora desde 1998. Sin embargo, dada la baja incidencia de scrapie en estas razas la selección genética que se ha seguido ha sido muy suave. 98 02 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 99 Capítulo 4 ESTABILIDAD Y SELECCIÓN DE GENES ENDÓGENOS EN ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA EN OVINO 02 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 101 4.1. INTRODUCCIÓN El análisis de la expresión de los genes tiene una gran importancia en numerosos campos de la investigación biomédica. El conocimiento de los patrones de expresión génica dentro de la complejidad de los procesos biológicos proporciona un mayor conocimiento de las bases moleculares de las enfermedades y puede contribuir al desarrollo de fármacos muy específicos o a la mejora del diagnóstico de una enfermedad. Para ello, se han desarrollado diversos métodos que permiten medir la cantidad de mRNA con mayor o menor exactitud. La técnica de Northern blot ha sido una de las herramientas clásicas más empleadas para el análisis de la expresión génica. Esta técnica, basada en el análisis por densitometría de las bandas generadas tras la electroforesis e hibridación del mRNA con sondas marcadas es larga y tediosa, por lo que no permite el análisis de un número elevado de muestras. Además, requiere partir de grandes cantidades de RNA y en cualquier caso no permite una cuantificación muy exacta, por lo que su utilidad para medir pequeños cambios de expresión es muy limitada. Otra de las metodologías desarrolladas para medir la expresión génica es la de los biochips, arrays o microarrays, que han permitido un salto cuantitativo y cualitativo debido a la posibilidad de analizar el comportamiento de miles de genes de forma simultánea [256]. Por otro lado, la técnica de RT-PCR a tiempo real ofrece una gran reproducibilidad, alta sensibilidad y resultados muy precisos. En la actualidad, la PCR a tiempo real se emplea como técnica de confirmación de los resultados obtenidos por microarrays. Sin embargo, es una técnica muy compleja que puede presentar varios problemas derivados de sus ventajas. Existen dos estrategias de cuantificación por PCR a tiempo real: la cuantificación absoluta y la relativa. La cuantificación absoluta permite conocer el número absoluto de moléculas de mRNA existentes por comparación con una recta patrón externa [49]. En expresión relativa se obtiene un ratio a partir de la expresión del gen problema y la expresión del llamado gen de referencia o housekeeping. El empleo de estos genes de referencia permite obtener resultados más fiables que en la cuantificación absoluta debido a que se tienen en cuenta artefactos inherentes al procesado de las muestras. Sin embargo, esta fiabilidad en los resultados va a depender de la selección de los genes de referencia. Con frecuencia los genes HK se obtienen de la literatura y se emplean en diferentes condiciones experimentales sin tener en cuenta que ciertas condiciones pueden inducir una alteración en la expresión del gen HK [267]. Un cambio indetectable en la expresión de este gen deriva en resultados erróneos que pueden llevar a conclusiones falsas. Para evitar esto, previo a cualquier experimento de cuantificación relativa se ha de realizar un análisis de la estabilidad de la expresión de los genes HK que se quieren emplear en la normalización en unas condiciones concretas. Además, es también recomendable normalizar la expresión de un gen problema por medio de más de un gen de referencia [216, 283]. De este modo, las alteraciones debidas a posibles artefactos quedan solventadas más eficazmente que si se emplea un único gen de referencia. Los análisis de expresión génica realizados en ovino se han basado en la técnica de Northern blot y en la RT-PCR a tiempo real. Sin embargo, muchos de los trabajos basados en cuantificación relativa han empleado un solo gen de referencia sin previa comprobación de 101 02 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 102 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... su estabilidad [117, 124, 168]. Por lo tanto, el estudio de la estabilidad de algunos genes HK en ovino aportaría información muy útil para cualquier estudio de expresión relativa. En este sentido, en este capítulo se analizará la estabilidad de la expresión de genes endógenos en seis tejidos ovinos de animales sanos y de animales con scrapie clínico con el fin de encontrar los mejores genes de referencia en cada situación. 4.2. SELECCIÓN DE LAS MUESTRAS El estudio de estabilidad de la expresión de los genes HK seleccionados se ha realizado en dos grupos de muestras: el grupo A, formado exclusivamente por animales sanos, y el grupo B, formado por los animales del grupo A al que se le han añadido animales con scrapie clínico. El grupo A se compone de 22 ovejas sanas de raza Latxa con distintos genotipos y con edades comprendidas entre 3 y 12 años. En el grupo B se incluyeron además cuatro hembras de raza Latxa con scrapie clínico pertenecientes a un brote ocurrido en Diciembre de 2003. Los animales mostraban síntomas clínicos de un estadio tardío de scrapie consistentes en incordinación de las patas traseras, caídas, respuesta exagerada a estímulos externos, rechinar de dientes, temblores y pérdida de peso. Los cuatro animales presentaban el genotipo ARQ/ARQ, y su edad era de 3, 4, 5 y 8 años. Todos los animales incluidos dentro del grupo de los sanos fueron negativos al test rápido de detección de priones Platelia®BSE (Bio-Rad, CA, USA) realizado en una muestra de óbex, mientras que los animales con scrapie clínico dieron positivo. De cada animal se obtuvo asépticamente una muestra de tejido de la misma zona del cerebro (neocortex), cerebelo, óbex, bazo, íleon terminal y nódulo linfático mesentérico (NLM). Todas las muestras fueron conservadas a –80°C para preservar el RNA en condiciones óptimas hasta su posterior extracción. 4.3. EXTRACCIÓN DE RNA Y SÍNTESIS DE cDNA Las muestras de tejido fueron homogeneizadas mecánicamente con Ribolyzer (Hybaid, Ashford, UK) y el RNA total obtenido fue aislado con el RNasy Protect Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany). Posteriormente el RNA total se trató con DNasa I (Ambion, TX, USA) para evitar la amplificación del DNA genómico y el cDNA se sintetizó usando hexámeros al azar y la transcriptasa reversa MultiScribeTM de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, CA, USA). Asimismo se comprobó la eficiencia del tratamiento con DNasas mediante el análisis de muestras RT negativas. El cDNA obtenido de la retrotranscripción se diluyó para obtener una cantidad suficiente que nos permitiera usarlo en sucesivas amplificaciones por PCR a tiempo real. Todas las alícuotas de cDNA fueron conservadas a –20°C hasta su posterior procesado. 102 02 TESIS 55 2/3/06 09:55 Página 103 4. ESTABILIDAD Y SELECCIÓN DE GENES ENDÓGENOS EN ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA EN OVINO 4.4. DISEÑO DE CEBADORES Se seleccionaron genes pertenecientes a grupos funcionales diferentes con el fin de reducir las posibilidades de que existiera co-regulación entre ellos. De este modo se diseñaron cebadores para ocho genes HK usados comúnmente en la normalización de la expresión génica: el gen de la b-actina, (ACTB), tirosina 3-monooxigenasa (YWHAZ), proteína ribosomal L19 (RPL19), gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH), succinato deshidrogenasa (SDHA), hidroximetilbilano sintasa (HMBS) y ubiquitina C (UBC) (Tabla 4.1). Tabla 4.1. Funciones principales de los genes HK seleccionados Gen Función ACTB Proteína estructural del citoesqueleto. YWHAZ Transducción de señales por unión a residuos fosforilados de serinas de múltiples moléculas señalizadoras. RPL19 Componente estructural de la subunidad ribosómica 60S. GAPDH Oxidoreductasa en la glucólisis y gluconeogénesis. G6PDH Oxidoreductasa al inicio de la ruta de las pentosas fosfato. SDHA Transportador de electrones el ciclo de Krebs y en la cadena respiratoria. HMBS Síntesis del grupo hemo y metabolismo de porfirinas. UBC Degradación de proteínas. Los cebadores fueron diseñados para amplificar una región dentro de un mismo exón usando el software Primer Express (Applied Biosystems, CA, USA) y teniendo en cuenta los requerimientos necesarios para trabajar con PCR a tiempo real y SYBR Green. Para el diseño de los cebadores de los genes ACTB, GAPDH, RPL19 y G6PDH se analizaron secuencias ovinas depositadas en la base de datos pública GenBank. En el caso de los genes SDHA, YWHAZ, HMBS y UBC no existían secuencias publicadas de ovino por lo que los cebadores se diseñaron en regiones muy conservadas tras analizar múltiples alineamientos de estos genes en diferentes especies animales (Bos taurus, Mus musculus, Rattus norvegicus y Homo sapiens) con el programa AlingX (Vector NTI 8.0 suite, Informax Inc., MD, USA). En cualquier caso, la secuencia bovina sirvió de referencia en caso de presentarse alguna variación entre las secuencias comparadas (Figura 4.1 y Figura 4.2). Además de los ya mencionados se seleccionaron otros dos genes para ser evaluados como potenciales genes HK (el gen de la proteína de unión de la TATAbox TBP y el gen de la beta 2 microglobulina B2M) para los cuales se intentó diseñar cebadores. Sin embargo la comparación de las secuencias de distintos organismos reveló una muy baja homología entre ellas y dificultad para cumplir los requerimientos exigidos para el diseño de cebadores para PCR a tiempo real y el uso SYBR Green. 103 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 104 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... Figura 4.1. Alineamiento de las secuencias nucleotídicas de un fragmento del gen SDHA de distintas especies. [(a) Homo sapiens NM_004168, (b) Rattus norvegicus NM_130428, (c) Mus musculus NM_023281 y (d) Bos taurus NM_174178. Las flechas representan los cebadores diseñados en regiones muy conservadas para amplificar un fragmento de 90 pb del gen ovino] Figura 4.2. Alineamiento de las secuencias nucleotídicas de un fragmento del gen YWHAZ de distintas especies. [(a) Homo sapiens NM_003406, (b) Rattus norvegicus NM_013011, (c) Mus musculus NM_011740, y (d) Bos taurus NM_174814. Las flechas representan los cebadores diseñados en regiones muy conservadas para amplificar un fragmento de 120 pb del gen ovino] 104 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 105 4. ESTABILIDAD Y SELECCIÓN DE GENES ENDÓGENOS EN ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA EN OVINO Se evaluaron 3 concentraciones de cebadores (100 mM, 200 mM y 300 mM) y la formación de dímeros de cebadores se analizó mediante curvas de disociación (Figura 4.3). De este modo, y para los posteriores análisis se emplearon aquellas concentraciones de cebadores más altas que no presentaron dímeros de cebadores (Tabla 4.2). Figura 4.3. Control de la formación de dímeros de cebador para la PCR del gen GAPDH. [(a), curva de amplificación; (b) curva de disociación. 1, PCR de una muestra de cDNA con cebadores a 200 mM; 2, 3 y 4, PCRs de controles negativos con 100, 200 y 300 mM de cebadores, respectivamente. Se observó la formación de dímeros de cebadores (Tm de 77.7°C) en los controles negativos cuando la concentración de cebadores fue de 300 mM. Se seleccionó la concentración de 200 mM para la amplificación del gen GAPDH (Tm de 82.0°C)] Tabla 4.2. Secuencias de los cebadores y características de los productos de PCR Gen* Cebador forward 5’→ 3’ Cebador reverse 5’→ 3’ [C] pb Tmt Tmr ACTB ATGCCTCCTGCACCACCA GCATTTGCGGTGGACGAT 300 125 85 84.3-84.8 YWHAZ TGTAGGAGCCCGTAGGTCATCT TTCTCTCTGTATTCTCGAGCCATCT 100 102 79 78.9-79.4 RPL19 CAACTCCCGCCAGCAGAT CCGGGAATGGACAGTCACA 200 76 83 80.0-80.5 GAPDH ATGCCTCCTGCACCACCA AGTCCCTCCACGATGCCAA 100 76 84 81.9-82.5 G6PDH TGACCTATGGCAACCGATACAA CCGCAAAAGACATCCAGGAT 300 76 81 78.7-78.9 SDHA CATCCACTACATGACGGAGCA ATCTTGCCATCTTCAGTTCTGCTA 200 90 82 81.0-81.7 HMBS CTGCAGCGCATGGGCT CTGACCCACAGCATACATGCA 300 75 86 86.1-86.3 UBC TGCAGATCTTYGTGAAGACTCTGA CCTGGATCTTTGCCTTGACATT 300 75 80 ND a símbolo del gen: ACTB, b-actina; YWHAZ, tyrosina 3-monooxigenasa isoforma zeta; RPL19, proteína ribosómica L19; GAPDH, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa; G6PDH, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa; SDHA, succinato deshidrogenasa; HMBS, hidroximetilbilano sintasa; UBC, ubiquitina C. [C], concentraciones de ambos cebadores en mM; pb, longitud del amplicón en pb; Tmt, temperatura de disociación teórica según Primer Express (Applied Biosystems, CA, USA); Tmr, temperatura de disociación real expresada en rango de temperaturas obtenido según los picos de disociación de 78 muestras; ND, no determinado 105 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 106 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... 4.5. PCR A TIEMPO REAL Se tuvo especial cuidado en el diseño de las reacciones de PCR para evitar problemas en la comparación de los resultados entre las distintas muestras. Para ello, todas las muestras (26 animales) correspondientes a un tejido fueron incluidas en la misma placa de 96 pocillos junto con un control negativo y sometidas a PCR a tiempo real para la amplificación de un único gen por triplicado. Cada reacción de PCR se realizó en un volumen final de 10 µl y estaba compuesta por 10 ng de cDNA, el tampón 2xSYBRGreen (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) más la cantidad necesaria de cebadores de acuerdo a la concentración requerida (Tabla 4.2). Para dispensar la premezcla de la PCR y las muestras de cDNA en las placas se empleó el robot Biomek 2000 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA, USA). Todas las reacciones se llevaron a cabo en el termociclador ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, Figura 4.4. Curvas de disociación de los 8 genes HK estudiados. [(a) ACTB; (b) YWHAZ; (c) RPL19; (d) GAPDH; (e) G6PDH; (f) SDHA; (g) HMBS; (h) UBC] 106 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 107 4. ESTABILIDAD Y SELECCIÓN DE GENES ENDÓGENOS EN ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA EN OVINO Foster City, CA, USA) usando las condiciones universales de ciclado: 10 min a 95°C y 40 ciclos de 15 seg a 95°C y 1 min a 60°C. A continuación de la reacción de PCR, se aplicó el protocolo de disociación para comprobar la Tm del producto amplificado (Figura 4.4). El análisis de los resultados de PCR obtenidos para el gen HMBS reveló una alta desviación de los triplicados de cada muestra así como unos valores de Ct muy altos, por encima de 33, sugiriendo que se trataba de un gen de baja expresión. Por otro lado, la curva de disociación del gen UBC mostró un comportamiento extraño al presentar dos máximos de fuorescencia, uno correspondiente al fragmento de 75 pb del gen UBC (81.7°C) y otro a 79.1°C (Figura 4.4h). El análisis de los cebadores sugirió la existencia de hibridación de los cebadores a regiones en tandem del gen UBC como causa del comportamiento de la curva de disociación. Por lo tanto, estos dos genes fueron descartados y no se incluyeron en los análisis posteriores. De este modo, fueron seis los genes HK amplificados para cada uno de las muestras problema. Así, para la obtención de los Cts correspondientes a todas las muestras se analizaron un total de 2808 reacciones de PCR repartidas en 36 placas (26 animales x triplicado x 6 genes x 6 tejidos). Los productos de PCR de los seis genes HK fueron clonados en el vector pCR®4-TOPO usando el TOPO TA Cloning® kit (Invitrogen, CA, USA) y enviados a un servicio de secuenciación automática. La especificidad de las reacciones de PCR quedó confirmada mediante el análisis de la Tm de los productos generados, así como por el tamaño de los mismos en un gel de agarosa al 3% y la comparación mediante Blast de las secuencias generadas con las existentes en la base de datos de GenBank. Las nuevas secuencias determinadas en este estudio para los genes ovinos SDHA y YWHAZ fueron depositadas en GenBank bajo los números de acceso AY970969 y AY970970, respectivamente. Las secuencias ovinas revelaron una similitud del 100% con las secuencias bovinas (Figura 4.1y Figura 4.2). Los valores de los Cts fueron obtenidos utilizando el mismo valor de threshold para cada gen, y el valor del Ct para cada muestra se obtuvo calculando la media aritmética de los triplicados. A los valores de Ct obtenidos se les aplicó la ecuación Q=E(Ct min – Ct muestra), donde la potencia viene dada por la resta entre el menor Ct del grupo de muestras en estudio y el Ct de la muestra problema. La E indica la eficiencia de la reacción de PCR, la cual fue calculada a partir de curva de amplificación por PCR de diluciones seriadas de una misma muestra de cDNA y la ecuación E= [10(-1/pendiente)] [233] (Tabla 4.3). Las eficiencias obtenidas en las distintas amplificaciones estuvieron próximas al 100%. Tabla 4.3. Parámetros de las rectas patrón de los seis genes endógenos seleccionados Gen ACTB YWHAZ RPL19 GAPDH G6PDH SDHA Baseline Threshold Puntosa R2 Pendiente Eficiencia 6-20 3-18 6-16 6-16 6-24 6-26 0.250 0.300 0.300 0.150 0.300 0.200 6 6 6 8 5 7 0.999 0.988 0.992 0.991 0.965 0.992 -3.597 -3.335 -3.342 -3.485 -3.363 -3.643 1.897 1.995 1.992 1.936 1.983 1.881 a número de puntos de la recta patrón, correspondiente al número de diluciones de cDNA empleadas. R2, coeficiente de determinación. 107 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 108 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... 4.6. ANÁLISIS DE LA ESTABILIDAD DE LOS GENES ENDÓGENOS Y SELECCIÓN DE GENES PARA LA NORMALIZACIÓN EN TEJIDOS OVINOS La selección de los genes HK para la normalización de la expresión de un gen problema puede variar con el tipo de muestra, con las condiciones del ensayo y con la edad, entre otros factores. De este modo, se analizó la estabilidad de los genes HK en los dos grupos de muestras de forma independiente: animales sanos (grupo A) y caso-control (grupo B). La estabilidad de los genes endógenos se determinó en base al método descrito por Vandesompele y cols. [283] y empleando la aplicación MS Excel geNorm 3.3. (ver apartado 2.4). En un primer abordaje se analizó la estabilidad de los genes HK en el conjunto de muestras de cada grupo con el fin de encontrar un grupo de genes HK suficientemente estable para comparar la expresión de cualquier gen problema entre tejidos. El segundo abordaje analizó la estabilidad de los genes HK en el grupo de muestras pertenecientes a un mismo tejido. Grupo A: Animales sanos El análisis geNorm para el conjunto de todas las muestras de todos los tejidos mostró unos valores de M y Vn/n+1 superiores a los establecidos como límite [283], por lo que con los genes analizados en este trabajo no se pudo obtener un grupo común de genes HK para la normalización de todos los tejidos. Sin embargo el análisis de estabilidad de los genes HK en cada tejido por separado permitió identificar distintos grupos de genes HK para la normalización en los distintos tejidos. Se obtuvieron unos valores de estabilidad M cercanos al 0.5 lo cual indicó una estabilidad relativamente buena para estos 6 genes, observándose a su vez, una gran variabilidad asociada al tipo de tejido (Tabla 4.4). Por ejemplo, el gen G6PDH presentó el menor valor de M en el cerebelo (M=0.457), es decir, resultó ser el gen más estable de los analizados en ese tejido, sin embargo, en el bazo resultó ser el gen menos estable (M=0.569). De este análisis resulta interesante observar Tabla 4.4. Valores de estabilidad de la expresión (M) de 6 genes HK en el grupo A Tejido ACTB YWHAZ RPL19 SDHA GAPDH G6PDH Cerebro Cerebelo Obex Bazo NLM Íleon Media a SD b CV (%) 0.602 0.477 0.534 0.436 0.556 0.757 0.560 0.113 20.133 0.757 0.480 0.493 0.413 0.691 0.652 0.581 0.137 23.669 0.634 0.452 0.593 0.550 0.542 0.696 0.578 0.084 14.543 0.540 0.518 0.541 0.427 0.525 0.610 0.527 0.059 11.192 0.510 0.473 0.451 0.448 0.502 0.517 0.484 0.030 6.268 0.660 0.457 0.479 0.569 0.624 0.511 0.550 0.081 14.771 NLM, nódulo linfático mesentérico a Desviación estándar (SD) b Coeficiente de variación (CV) 108 2/3/06 09:56 Página 109 4. ESTABILIDAD Y SELECCIÓN DE GENES ENDÓGENOS EN ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA EN OVINO cómo el gen GAPDH, usado frecuentemente como gen normalizador, mostró la menor variación del valor de M entre los tejidos analizados (SD=0.030). Por otro lado, otro gen tradicionalmente empleado en estudios de expresión, el gen ACTB, mostró una alta desviación estándar (SD=0.113) colocándose en penúltima posición detrás del gen YWHAZ con una desviación estándar de 0.137 (Tabla 4.4). A continuación, y de acuerdo con la aplicación geNorm, se realizó la exclusión consecutiva del gen menos estable para cada tejido observándose como el valor medio de estabilidad M de los genes restantes iba disminuyendo en mayor o menor medida (Figura 4.5). 0,8 Cerebro Obex GLM N n 0,7 Valor medio de M 02 TESIS 55 Cerebelo Bazo Ileon 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 6 5 4 Número de genes HK 3 2 Figura 4.5. Media de los valores de la estabilidad de la expresión (M) de los genes disponibles durante la exclusión del gen menos estable en 6 tejidos de animales sanos. (NLM, nódulo linfático mesentérico. A menor valor de M mayor estabilidad) Una vez que los genes HK quedaron ordenados de acuerdo a su estabilidad, el número de genes HK necesarios para la normalización fue calculado mediante el parámetro Vn/n+1, que indicó la necesidad de emplear seis grupos de genes HK distintos según el tejido (Figura Tabla 4.5. Series de estabilidad de 6 genes endógenos para 22 animales sanos Cerebro Cerebelo Obex Bazo GAPDH-SDHA G6PDH-ACTB GAPDH-YWHAZ GAPDH-SDHA ACTB YWHAZ G6PDH ACTB G6PDH RPL19 SDHA YWHAZ RPL19 GAPDH ACTB RPL19 YWHAZ SDHA RPL19 G6PDH NLM Ileon SDHA-RPL19 GAPDH-G6PDH GAPDH SDHA ACTB YWHAZ G6PDH RPL19 YWHAZ ACTB Cada serie de estabilidad se muestra ordenada desde el gen de mayor estabilidad en la parte superior al de menor estabilidad en la parte inferior. Los dos primeros genes no se pueden ordenar debido al empleo de ratios para las medidas de estabilidad de la expresión según geNorm. Los genes HK necesarios para una correcta normalización se muestran en negrita. NLM, nódulo linfático mesentérico. 109 2/3/06 09:56 Página 110 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... 4.6 y Tabla 4.5). De éste modo, para una correcta normalización fueron suficientes los tres genes más estables correspondientes a las muestras de cerebro, cerebelo, obex, bazo y nódulo linfático mesentérico, mientras que para muestras de íleon fueron necesarios cuatro. 0,20 V2/3 V3/4 V4/5 V5/6 0,18 0,16 Valores de Vn/n+1 02 TESIS 55 ¯ ¯ 0,14 ¯ ¯ ¯ ¯ 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 Cerebro Cerebelo Obex Bazo GLM N Ileon Figura 4.6. Determinación del número mínimo de genes HK para la normalización de la expresión según el tejido. (↓, indica el número óptimo de genes HK necesarios en cada tejido. NLM, nódulo linfático mesentérico. El número de genes HK a utilizar se establece con el primer grupo de genes cuyo valor de Vn/n+1 es inferior a 0.15) Grupo B: Caso-control Para el análisis de estabilidad de los genes HK en este grupo de muestras se eliminó el gen YWHAZ por su supuesta implicación en enfermedades priónicas [14, 139, 279]. El análisis geNorm para el conjunto de todas las muestras y tejidos mostró unos valores de M y Vn/n+1 superiores a los establecidos para una correcta normalización (datos no mostrados). Sin embargo, el análisis llevado a cabo en cada tejido permitió el empleo de estos genes HK para la normalización. Se obtuvieron unos valores de estabilidad M cercanos al 0.5 (Tabla 4.6) lo cual indicó una estabilidad relativamente buena para estos cinco genes HK aunque a su vez se observó una gran variabilidad asociada a la naturaleza de las muestras. Al igual que en el grupo A, el gen GAPDH, mostró también en este caso la menor variación del valor de M entre los tejidos analizados (SD=0.043), mientras que el gen ACTB mostró la mayor desviación estándar (SD=0.094) en comparación con los otros genes HK analizados. La eliminación consecutiva del gen menos estable (Figura 4.7) para cada tejido permitió obtener seis series de estabilidad para los genes HK (Tabla 4.7). A continuación y mediante el parámetro Vn/n+1 se determinó el número de genes HK normalizadores para cada tejido, siendo necesarios los tres genes HK más estables en el cerebelo, óbex, bazo y nódulo linfático mesentérico mientras que para el cerebro e íleon hicieron falta cuatro genes (Tabla 4.7 y Figura 4.8). 110 2/3/06 09:56 Página 111 4. ESTABILIDAD Y SELECCIÓN DE GENES ENDÓGENOS EN ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA EN OVINO Tabla 4.6. Valores de estabilidad de la expresión (M) de 5 genes HK en el grupo B Tejido ACTB RPL19 SDHA GAPDH G6PDH Cerebro Cerebelo Obex Bazo NLM Íleon 0.618 0.466 0.558 0.451 0.514 0.696 0.680 0.459 0.584 0.527 0.471 0.657 0.517 0.490 0.547 0.426 0.444 0.600 0.561 0.461 0.514 0.463 0.446 0.502 0.589 0.450 0.495 0.567 0.579 0.493 Media SD a CV (%) b 0.551 0.094 17.108 0.563 0.093 16.558 0.504 0.065 12.867 0.491 0.043 8.751 0.529 0.057 10.795 NLM, nódulo linfático mesentérico a Desviación estándar (SD) b Coeficiente de variación (CV) 0,8 Cerebro Obex N GLM 0 , 7 0,7 V alor m edio de M 02 TESIS 55 Cerebelo Bazo Ileon 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 5 4 3 2 Número de genes HK Figura 4.7. Media de los valores de la estabilidad de la expresión (M) de los genes disponibles durante la exclusión del gen menos estable en 6 tejidos de animales sanos y con scrapie. (NLM, nódulo linfático mesentérico. A menor valor de M mayor estabilidad) Tabla 4.7. Series de estabilidad de 5 genes HK en el grupo caso-control Cerebro Cerebelo Obex Bazo NLM Ileon GAPDH-SDHA G6PDH -ACTB GAPDH- SDHA GAPDH- SDHA SDHA-RPL19 GAPDH -G6PDH G6PDH RPL19 G6PDH ACTB GAPDH SDHA ACTB GAPDH ACTB RPL19 ACTB RPL19 RPL19 SDHA RPL19 G6PDH G6PDH ACTB Cada serie de estabilidad se muestra ordenada desde el gen de mayor estabilidad en la parte superior al de menor estabilidad en la parte inferior. Los dos primeros genes no se pueden ordenar debido al empleo de ratios para las medidas de estabilidad de la expresión según geNorm. Los genes HK necesarios para una correcta normalización se muestran en negrita. NLM, nódulo linfático mesentérico. 111 2/3/06 09:56 Página 112 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... 0,20 V2/3 V3/4 V4/5 0,18 0,16 Valores de Vn/n+1 02 TESIS 55 ¯ 0,14 ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 Cerebro Cerebelo Obex Bazo GLM N Ileon Figura 4.8. Determinación del número mínimo de genes HK para la normalización de la expresión según el tejido. (↓, indica el número óptimo de genes HK necesarios en cada tejido. NLM, nódulo linfático mesentérico. El número de genes HK a utilizar se establece con el primer grupo de genes cuyo valor de Vn/n+1 es inferior a 0.15) 4.7. DISCUSIÓN Entre las distintas metodologías desarrolladas para cuantificar la cantidad de mRNA, la RT-PCR a tiempo real proporciona la mayor sensibilidad y exactitud a la hora de estudiar perfiles de expresión génica [50, 123]. Se pueden seguir dos protocolos básicos; la cuantificación absoluta y la cuantificación relativa. Esta última, se ajusta más a las necesidades requeridas en estudios de expresión ya que el empleo de genes HK de referencia permite tener en cuenta posibles artefactos derivados de la preparación de las muestras y por tanto realizar una comparación entre muestras. En los últimos años se han realizado diversos trabajos en expresión génica relacionados con el ovino mediante cuantificación relativa y RT-PCR a tiempo real, pero en todos ellos se ha seguido la estrategia empleada tradicionalmente de usar un único gen de referencia: 18S, GAPDH o ACTB [117, 124, 168]. Sin embargo, incluso muchos de los genes comúnmente considerados como invariables pueden presentar variaciones interindividuales lo suficientemente altas como para provocar una medida errónea cuando la expresión del gen problema se normaliza frente a un solo gen HK. Por esta razón se ha de realizar un análisis previo de la estabilidad de los genes HK que se quieren usar, de modo que la sensibilidad de esta técnica va a depender de una correcta elección de los genes HK de referencia. En este estudio se ha seguido el método de Vandesompele y cols. [283] donde se requiere un mínimo de tres genes HK para una correcta normalización de la expresión del gen problema. Hay que tener en cuenta que la estabilidad de un gen HK es un concepto relativo en el sentido de que no siempre ha de cumplirse para todas las muestras en estudio. Es decir, no existen genes de referencia universales debido a que el tipo de tejido, la edad, el estado de salud, los tratamientos y muchos otros parámetros pueden alterar la expresión de los mismos. Por esta razón, el análisis de la estabilidad de los genes HK se debe realizar en cada grupo de 112 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 113 4. ESTABILIDAD Y SELECCIÓN DE GENES ENDÓGENOS EN ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA EN OVINO muestras. En este trabajo, el estado de salud y el número de los animales fueron suficientes como para necesitar que este análisis se realizase por separado en el grupo A y el grupo B. El primer análisis de la estabilidad de los genes HK realizado en el conjunto de datos no permitió la normalización de la expresión frente a un grupo común de genes HK en ninguno de los dos grupos de estudio, por lo tanto, la comparación de la expresión de genes problema entre los tejidos seleccionados no fue factible. Este resultado se debe probablemente a la heterogeneidad de las muestras empleadas ya que cada gen puede presentar una regulación específica de tejido. Esta variabilidad encontrada en muestras de diferente origen es consistente con trabajos previos [50, 271, 273, 285] y refleja la existencia de un metabolismo específico de tejido y/o factores específicos de tejido desconocidos hasta el momento. Cabe destacar, un estudio de microarrays realizado sobre la estabilidad de 8.000 genes HK en 60 líneas celulares donde se observó como ninguno de los genes analizados tenía un ratio de expresión menor de dos, es decir, todos variaron en mayor o menor medida [240]. Aunque esta heterogeneidad inherente a la naturaleza de las muestras pueda ser un impedimento, no se descarta la posibilidad de que otros genes HK diferentes a los estudiados en este trabajo permitan la normalización entre tejidos. En un segundo abordaje, se analizó la estabilidad de la expresión de los mismos genes HK en cada tejido de ambos grupos de muestras. Los resultados confirmaron la variabilidad dependiente de tejido observada en el primer análisis ya que se observaron seis series distintas de estabilidad y con ello seis grupos de genes normalizadores dependientes del tipo de tejido. Esta variabilidad demuestra una vez más, que no existen genes universales válidos para todos los tejidos o tipos celulares. Cabe destacar la coincidencia del grupo de genes HK (GAPDH, SDHA y ACTB) seleccionados para la normalización de muestras de cerebro y bazo en el grupo A, lo cual podría inducir a pensar en la posibilidad de comparar la expresión normalizada de un gen problema entre ambos tejidos. Sin embargo, dicha comparación no es posible porque el análisis geNorm con el conjunto de los Cts correspondientes a las muestras de ambos tejidos mostró unos parámetros por encima de los valores umbrales. Por lo tanto, al no mantenerse esta estabilidad, podemos sugerir la existencia de un comportamiento diferente dependiente del tejido. Si comparamos las series de estabilidad de las muestras de animales sanos (eliminando el gen YWHAZ) y las series del grupo caso-control, podemos observar que existe una alta similitud. Todas las series son idénticas, a excepción del cerebro y obex donde solo cambia la posición de dos genes entre sí, los genes G6PDH y ACTB en el cerebro y los genes G6PDH y SDHA en el obex. Asimismo tampoco se observa un cambio sustancial en los valores medios de la estabilidad (M) de ambos grupos. Estos resultados sugieren que en este grupo concreto de muestras, tanto el aumento del tamaño de la muestra de 22 a 26 individuos, así como el estatus de los animales sano/scrapie, no ha repercutido en la expresión de estos seis genes HK. Los genes GAPDH y ACTB han sido tradicionalmente considerados como genes de expresión constante independientemente del tipo de muestras y por tanto han sido ampliamente usados como genes de referencia en muchos trabajos [267, 271]. Sin embargo, se ha observado como la expresión de estos genes puede variar de 7 a 23 veces dependiendo del tipo 113 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 114 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... celular o del tipo de tejido [285]. En el presente trabajo, el gen GAPDH mostró la menor variabilidad dentro de los seis tejidos analizados en ambos grupos de muestras. Por otro lado, el gen ACTB ocupó la penúltima posición en el ranking de estabilidad del grupo A y la última en el grupo B. Esta inestabilidad del gen ACTB ha sido descrita previamente en un estudio realizado con células intersticiales de válvulas del corazón ovino donde se observó como la variabilidad de su expresión invalidaba su uso como gen de referencia [306]. El gen SDHA, ha resultado tener la mayor estabilidad en muestras de cerebro, bazo y nódulo linfático en ambos grupos y en muestras de óbex dentro del grupo B. Cabe destacar como en un estudio similar a este trabajo realizado en muestras humanas [283], el gen SDHA fue incluido como gen de referencia dada su estabilidad en neuroblastos. Por otro lado, se ha empleado como gen de referencia en muestras del epitelio de la glándula mamaria [168] y en fluido linfático intestinal [124]. Por lo tanto, parece ser un gen muy bueno a tener en cuenta como posible gen de referencia en futuros estudios de expresión en tejidos ovinos. Por otro lado, el gen YWHAZ presentó la mayor desviación estandar y el mayor valor de media de estabilidad M (menos estable), y a pesar de que se ha empleado como gen de referencia en muestras de cerebelo, óbex e íleon, solo presentó la primera posición en la serie de estabilidad del óbex. Este gen ha sido usado como gen de referencia en muestras de médula ósea y fibroblastos [283]. En resumen, podemos decir que los resultados derivados de este estudio pueden proporcionar información de referencia muy útil para posteriores trabajos de expresión génica en animales sanos o bien para el estudio de la patogenia molecular en scrapie natural. No obstante, hay que recordar la necesidad de una evaluación previa sobre la estabilidad de estos genes en cada escenario de estudio. 114 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 115 Capítulo 5 EXPRESIÓN DEL GEN PrP EN TEJIDOS OVINOS Y SU RELACIÓN CON LA SUSCEPTIBILIDAD GENÉTICA A SCRAPIE 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 117 5.1. INTRODUCCIÓN Las lesiones características y predominantes en el scrapie se presentan en el sistema Sc nervioso en forma de vacuolas desencadas por la presencia de PrP que se acumula de forma patológica [167, 223]. Aunque el origen exacto de la enfermedad es controvertido y no está bien determinado, la hipótesis más aceptada es la de la proteína PrPSc como único agente infeccioso causante de las enfermedades por priones [223]. En este sentido, se ha demostrado que la presencia de PrPc es esencial para el desarrollo del scrapie [26, 35, 105]. Sin embargo, se conoce poco acerca del papel que juega esta proteína celular así como de sus mecanismos de regulación. Como se indica en el apartado 1.7.4, el desarrollo de síntomas clínicos de scrapie está asociado a ciertos polimorfismos del gen PrP [21, 33, 141] y de acuerdo con el perfil genético, los animales se agrupan en 5 grupos de riesgo desde el Tipo 1 hasta el Tipo 5 en orden creciente de susceptibilidad a padecer la enfermedad [72]. Esta asociación con el genotipo del gen PrP se apoya en numerosos estudios epidemiológicos pero todavía no se conocen bien sus bases moleculares. En este sentido, diversos estudios han realizado ensayos in vitro para comparar la eficiencia de conversión de PrPc a PrPSc entre los distintos genotipos, demostrando la existencia de bajas eficiencias de conversión para los genotipos resistentes en comparación con los genotipos susceptibles [31, 32, 247]. Sin embargo, la existencia de factores individuales, otros genes o proteínas moduladoras, podrían estar implicados en esta susceptibilidad genética. En condiciones naturales la vía oral es la ruta de entrada de los priones. Una vez que el agente infeccioso ha entrado en el hospedador, se produce una amplificación inicial en el sistema linforeticular seguida de la subsecuente diseminación del prión a múltiples tejidos a través de la ruta linfática, sangre o sistema nervioso periférico. Esta situación tiene lugar antes de la replicación del prión en el SNC [9, 160, 182, 281]. Teniendo en cuenta que la presencia de PrPc es esencial para el desarrollo del scrapie [26, 35, 105], sería interesante conocer la distribución de la PrPc en tejidos linfoides y nerviosos para entender mejor la patogenia de la enfermedad. Diversos estudios realizados para conocer la distribución de la PrPc en tejidos ovinos, han encontrado como esta proteína se encuentra mayoritariamente en el SNC, seguido de pulmones, músculo esquelético, corazón, útero, timo y lengua [40, 135, 195]. De la misma manera, los niveles de mRNA del gen PrP y por lo tanto los subsecuentes niveles de la proteína, podrían jugar un papel muy importante en la transmisión y el desarrollo de la enfermedad. En este sentido, un estudio previo realizado en tejidos bovinos mediante cuantificación absoluta, reveló la existencia de altos niveles de transcritos del gen PrP tanto en tejidos del SNC como en tejidos del sistema linfoide [274], sin embargo, estos resultados deben tomarse con cautela debido a los inconvenientes que presenta el método de cuantificación empleado. Con el fin de encontrar evidencias que apoyen la hipótesis de que la expresión del gen PrP está ligada a la susceptibilidad genética, se han cuantificado por medio de RT-PCR a tiempo real y cuantificación relativa, los niveles de mRNA del gen PrP en animales sanos con distinta susceptibilidad genética a scrapie. 117 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 118 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... 5.2. SELECCIÓN DE LOS ANIMALES Las muestras empleadas en este trabajo fueron las correspondientes a los 22 animales sanos utilizados en el estudio de la estabilidad y selección de genes HK para la normalización de genes del grupo A según se describe en el capítulo 4. La selección de los 22 animales sanos de raza Latxa se realizó de acuerdo con la distribución de genotipos para el gen PrP en la población de la CAPV [96] y su susceptibilidad frente a scrapie asociada a esos genotipos [72]. De este modo, se han incluido animales de los Tipos de riesgo 1, 2, 3 y 5 destacando como los genotipos más frecuentes están representados por más de un individuo. De esta forma, se han seleccionado y sacrificado bajo condiciones controladas tres animales con genotipo ARR/ARR, cinco ARQ/ARQ, uno VRQ/VRQ, uno ARH/ARH, cinco ARR/ARQ, cinco ARQ/VRQ, uno AHQ/ARQ y un animal ARH/VRQ. El genotipado de los animales se realizó por el método de PCR a tiempo real descrito anteriormente [96] y que se detalla en el apartado 3.4. La edad de los animales estaba comprendida entre 3 y 12 años. Todos los animales fueron negativos al test rápido de detección de priones Platelia®BSE (Bio-Rad, CA, USA) realizado en una muestra de obex. De cada animal se obtuvo asépticamente una muestra de tejido de la misma zona del cerebro (neocortex), cerebelo, obex, bazo, íleon y nódulo linfático mesentérico. Todas las muestras fueron conservadas a –80°C para preservar el RNA en condiciones óptimas hasta su posterior extracción. 5.3. EXTRACCIÓN DE RNA, DISEÑO DE CEBADORES Y PUESTA A PUNTO DE LA RT-PCR Las muestras de RNA y cDNA para este estudio han sido las mismas que las empleadas en el análisis de estabilidad de genes HK como condición indispensable para estudios de expresión relativa, por lo que los procedimientos empleados han sido los mismos que en el capítulo 4. Los cebadores para el gen PrP, fueron diseñados para amplificar una región de 95 pb dentro del exón 3 del gen PrP ovino, utilizando el software Primer Express (Applied Biosystems, CA, USA) y teniendo en cuenta los requerimientos necesarios para trabajar con PCR a tiempo real y SYBR Green (Tabla 5.1). La retrotranscripción se realizó con un programa de tres ciclos: 10 min a 25°C, 45 min a 37°C y 5 min a 95°C. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en el termociclador ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) usando las condiciones universales de ciclado: 10 min a 95°C y 40 ciclos de 15 Tabla 5.1. Secuencias de los cebadores y características del producto amplificado del gen PrP F R Cebadores 5’→ 3’ [C] pb Tmt Tmr GCCAAAAACCAACATGAAGCAT TGCTCATGGCACTTCCCAG 300 95 83 83.3-83.9 [C], concentraciones de ambos cebadores en mM; pb, longitud del amplicón en pb; Tmt, temperatura de disociación teórica según Primer Express (Applied Biosystems, CA, USA); Tmr, temperatura de disociación real; F, cebador forward; R cebador reverse 118 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 119 5. EXPRESIÓN DEL GEN PRP EN TEJIDOS OVINOS Y SU RELACIÓN CON LA SUSCEPTIBILIDAD GENÉTICA A SCRAPIE seg a 95°C y 1 min a 60°C. A continuación de la reacción de PCR, se aplicó el protocolo de disociación para analizar la formación de dímeros de cebador y la especificidad de la reacción mediante el análisis de la Tm (Figura 5.1). El tamaño del amplicón en gel de agarosa al 3% y la secuenciación completaron la confirmación de la especificidad de la PCR. Figura 5.1. Curva de disociación del gen PrP. (La amplificación del fragmento de 95 pb con los cebadores diseñados permitió obtener una amplificación sin dímeros de cebadores) 5.4. NORMALIZACIÓN DE LA EXPRESIÓN DEL GEN PrP La normalización se realizó en base al estudio de estabilidad de genes HK realizado en el capítulo 4 en el que se identificaron distintos genes HK de referencia según el tipo de tejido. La normalización de la expresión de cada muestra se realizó mediante el ratio obtenido a partir de la expresión del gen PrP y el factor normalizador para esa muestra. Los factores normalizadores se calculan por medio de la media geométrica de la expresión de cada uno de los genes HK necesarios según el tejido del que se trate: GAPDH, SDHA y ACTB para el cerebro y el bazo, G6PDH, ACTB y YWHAZ para el cerebelo, GAPDH, YWHAZ y G6PDH para el obex, SDHA, RPL19 y GAPDH para el linfonodo, GAPDH, G6PDH, SDHA y YWHAZ para el íleon. 5.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS DATOS Con el fin de aprovechar toda la información disponible, se diseñaron dos estrategias para estudiar si la susceptibilidad genética tiene los mismos efectos en todos los tejidos analizados de cada animal con un determinado perfil genético, o si existe alguna interacción entre el tipo de tejido y la susceptibilidad genética. En este tipo de análisis donde se compara la expresión de un gen entre diversos tejidos es necesario que exista un grupo de genes HK único para la normalización, desafortunadamente, en este conjunto de muestras no fue posible. Sin embargo sí se pudieron obtener distintos grupos de genes HK para la normalización del gen problema según el tipo de tejido. Por lo tanto, para poder comparar entre tejidos se comprobó si los FN correspondientes a cada tejido no afectaban a las medidas del mRNA. Para ello, se realizó un análisis de varianza con los FN aplicando el procedimiento General Linear Model del programa estadístico SAS (SAS institute, Cary, NC, USA). Una vez que los resultados de este modelo no mostraron diferencias significativas entre tejidos, los ratios PrP/FN (nPrP) fueron transformados según la fórmula [arc sin √ (nPrPx100-1)] como se recomienda 119 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 120 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... para el uso de test paramétricos de datos relativos. Los valores de nPrP junto con todas las variables independientes (sexo, edad, tejido y susceptibilidad genética) así como sus interacciones, fueron analizadas mediante el procedimiento General Linear Model del programa estadístico SAS (SAS institute, Cary, NC, USA). Este análisis mostró como las variables independientes sexo y edad no presentaban un efecto significativo por lo que en el modelo final solo se incluyeron las variables tipo de tejido y susceptibilidad genética. Esta susceptibilidad genética fue considerada de dos formas, como genotipos individuales y agrupados en Tipos de riesgo [72]. Las comparaciones de medias se realizaron mediante una t de Student con el programa estadístico SAS (SAS institute, Cary, NC, USA). 5.6. EXPRESIÓN NORMALIZADA DEL GEN PrP En la Tabla 5.2 se muestran los resultados finales equivalentes a los valores de la expresión relativa del gen PrP clasificados por grupos de riesgo y por genotipos. La representación gráfica de los valores de nPrP agrupados por grupos de riesgo se representa en la Figura 5.2. El análisis global en el que se incluyeron todos los niveles de riesgo y genotipos, mostró la existencia de una fuerte asociación entre los valores de la expresión del gen PrP y el tipo de tejido (p<0.0001) siendo el obex el tejido con mayor expresión (38.05) seguido del íleon (35.73), nódulo linfático mesentérico (33.51), bazo (29.99), cerebelo (28.89) y cerebro (21.58). Cuando se analizó el efecto del grupo de riesgo y del genotipo, no se encontró significación estadística alguna entre ninguno de estos factores y los niveles de mRNA del gen PrP. El modelo, tampoco mostró ninguna interacción entre el tipo de tejido y el grupo de riesgo o entre el tipo de tejido y el genotipo. Cuando los valores de la expresión del gen PrP fueron analizados en cada tejido, muchas de las comparaciones realizadas (pairwise comparisons) fueron significativas (p<0.05) o marginalmente significativas (p<0.10). En las muestras de cerebro, los animales del grupo de riesgo 1 (T1) mostraron la menor expresión seguido de los animales del T5, T3 y T2, pero únicamente la menor expresión del T1 frente al T2 fue marginalmente significativa (p=0.0700). En el mismo análisis realizado según el genotipo, la expresión del gen PrP en animales ARR/ARR fue menor que en animales ARR/ARQ (p=0.0561). En el cerebelo, la expresión del T1 fue marginalmente menor que en el T3 (p=0.0668). En el obex, el T1 mostró la menor expresión seguida de T5, T2 y T3. Una vez más, el nivel de expresión en T1 fue marginalmente menor que en T3 (p=0.0633). La expresión en animales ARR/ARR fue marginalmente menor que en animales ARQ/ARQ (p=0.0948). En el bazo, el T1 mostró la mayor expresión seguido de T3, T5, y T2. La expresión en T1 fue significativamente mayor que en T2 (p=0.0281) y que en T5 (p=0.0671), y en animales del grupo T2 menor que en los animales del T3 (p=0.0937). La expresión en animales ARQ/ARQ fue significativamente mayor que en los ARR/ARQ (p=0.0441) y ARQ/VRQ (p=0.0557). Además, el nivel de expresión en animales ARR/ARR fue mayor que en los ARR/ARQ (p=0.0208). En el íleon, las muestras del grupo de riesgo T1 mostraron la mayor expresión seguido del T3, T5, y T2. Las muestras del nódulo linfoide mesentérico de los animales del grupo T1 mostraron la menor expresión seguida de T2, T5, y T3. 120 5 7 7 2 3 5 121 20.293 18.856 22.190 14.712 3 ARQ/ARQ 5 5 ARH/VRQ 1 5 ARQ/VRQ 5 5 VRQ/VRQ 1 5.991 – 5.129 – 5.239 – – 4.830 4.279 5.092 5.869 4.830 4.279 SD 28.885 27.667 28.072 39.065 30.442 33.811 45.592 26.632 21.202 29.584 33.088 26.632 21.202 nPrP 6.055 – 1.817 – 3.962 – – 3.495 3.052 4.439 6.515 3.495 3.052 SD 38.054 53.416 33.309 41.020 41.081 35.539 56.099 37.897 29.892 37.283 42.435 37.897 29.892 nPrP nPrP 26.628 33.468 24.504 8.841 – 5.306 – 5.073 – – 6.930 29.989 23.691 24.019 42.611 35.511 45.282 11.441 24.504 12.223 38.851 8.811 7.598 6.930 nPrP 29.673 63.868 46.208 32.413 29.004 15.268 35.725 – 9.236 – 18.651 32.137 – – 16.953 33.659 16.115 42.048 10.323 33.897 18.426 36.318 16.953 33.659 31.424 nPrP 31.424 32.051 36.372 32.089 27.537 37.955 37.185 31.838 11.328 33.506 – 9.370 – 6.932 – – 13.712 31.940 8.800 9.467 13.434 36.971 5.621 – 6.509 – 7.218 – – 4.088 3.496 5.895 6.320 4.088 3.496 SD Nódulo linfoide 13.712 31.940 8.800 SD Ileon 16.115 42.048 SD Bazo 12.223 38.851 SD Obex 29.508 31.932 27.857 32.981 30.606 28.531 43.721 30.554 22.308 29.171 32.183 30.554 22.308 nPrP SD 8.903 30.035 12.551 37.442 10.470 30.859 35.586 13.054 30.035 12.551 37.442 10.470 nPrP Tejidos linfoides 29.507 8.816 8.312 9.736 33.073 11.517 19.701 35.424 11.289 6.213 7.807 35.201 11.580 12.271 33.051 9.842 10.676 37.381 13.413 35.716 26.428 7.267 9.057 9.247 11.001 7.267 9.057 SD Tejidos nerviosos Los grupos de riesgo y los genotipos aparecen ordenados de mayor resistencia (parte superior) a mayor susceptibilidad (parte inferior). Tipo, nivel de riesgo según UK-NSP [72]. n, número de animales nPrP, niveles normalizados de mRNA del gen PrP SD, Desviación estándar 22 21.584 16.243 3 ARH/ARH 1 Total 29.470 27.132 2 ARR/ARQ 5 3 AHQ/ARQ 1 15.829 20.645 21.025 27.132 15.829 1 ARR/ARR 3 Tipo Genotipo 3 1 n nPrP Cerebelo 09:56 Tipo Cerebro 2/3/06 Tabla 5.2. Niveles de expresión relativa del gen PrP (unidades arbitrarias) 02 TESIS 55 Página 121 5. EXPRESIÓN DEL GEN PRP EN TEJIDOS OVINOS Y SU RELACIÓN CON LA SUSCEPTIBILIDAD GENÉTICA A SCRAPIE 2/3/06 09:56 Página 122 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... 60 T1 PrP mRNA (unidades arbitrarias) 02 TESIS 55 50 T2 T3 40 T5 30 20 10 0 Cerebro Cerebelo Obex Bazo Ileon NLM Tejidos Nerviosos Tejidos Linfoides Linfáticos Figura 5.2. Niveles de expresión del gen PrP en los diferentes tejidos de 22 animales agrupados según el UK-NSP [72]. (Los niveles de mRNA del gen PrP se obtuvieron por RT-PCR a tiempo real y cuantificación relativa empleando los genes HK más estables en cada tejido. Las barras de error representan la desviación estándar) Cuando la variable dependiente nPrP se agrupó en tejidos del SNC (cerebro, cerebelo y obex) frente a tejidos linfoides (bazo, íleon y nódulo linfoide mesentérico), el modelo estadístico reveló la existencia de una relación entre la cantidad de mRNA del gen PrP y el efecto tipo de tejido (p=0.0160). Se encontró además, una asociación estadística marginal para la interacción entre el tipo de tejido y el grupo de riesgo (p=0.0623), mientras que la interacción entre el tipo de tejido y genotipo fue muy débil (p=0.2060). El nivel de mRNA del gen PrP en tejidos linfoides fue significativamente mayor que en tejidos del sistema nervioso (p=0.0160). Dentro del grupo de tejidos nerviosos, los animales del grupo T3 mostraron los mayores niveles de expresión seguidos de los del T2, T5, y T1. El nivel de expresión encontrado en animales T1 fue menor que en T2 (p=0.0496), T3 (p=0.0174), y T5 (p=0.0863). Los animales ARR/ARR mostraron una menor expresión que animales con genotipos ARR/ARQ (p=0.0520) o ARQ/ARQ (p=0.0571). Respecto a tejidos linfoides, los animales del grupo T1 mostraron la mayor expresión seguida de T3, T5, y T2. La expresión del T1 fue mayor que en T2 (p=0.0840). Además, los animales ARR/ARR mostraron una mayor expresión que los animales ARR/ARQ (p=0.0871) y ARQ/VRQ (p=0.0839). 5.7. DISCUSIÓN La hipótesis de partida de este trabajo se ha basado en dos premisas fundamentales. Por un lado se conoce la existencia de una susceptibilidad genética a scrapie [21, 33, 141] y por otro lado se sabe que la presencia de PrPc es necesaria para el desarrollo de la enfermedad [26, 35, 105]. Con estas dos realidades, este trabajo ha estudiado la hipotética relación entre los niveles de expresión del gen PrP y la susceptibilidad genética asociada a este gen, como una 122 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 123 5. EXPRESIÓN DEL GEN PRP EN TEJIDOS OVINOS Y SU RELACIÓN CON LA SUSCEPTIBILIDAD GENÉTICA A SCRAPIE explicación a nivel molecular de la susceptibilidad genética a scrapie. Para ello, se analizaron los niveles de mRNA del gen PrP en seis tejidos de gran relevancia para el desarrollo y transmisión del scrapie en 22 animales con distinta susceptibilidad genética. Entre las distintas metodologías existentes se eligió la PCR a tiempo real debido a su alta sensibilidad y precisión. Los resultados revelaron diferencias estadísticas en la expresión del gen PrP entre los distintos tejidos. El mayor nivel de expresión en las muestras del SNC correspondió al obex seguido del cerebelo y cerebro. Esta expresión elevada en el obex podría estar indicando altos niveles de PrPc que a su vez indicaría altos niveles de agregados de PrPSc en el hipotético caso en que el prión hubiese entrado en el organismo y considerando la PrPc como sustrato para la conversión a la isoforma patógena. De este modo, las diferencias en la cantidad de PrPc en los tres tejidos del SNC podrían tener cierta relación con la aparición espacio-temporal de agregados de PrPSc y a su vez, podría apoyar la idea de que el obex sea la mejor fuente de material para la detección de la PrPSc con los test rápidos de TSEs. Sin embargo, cabe destacar que a diferencia de lo que ocurre en el scrapie clásico, en la región del obex de los llamados casos atípicos, se observa una baja absorbancia en la prueba Platelia®BSE ELISA (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) y una falta de depósitos de PrPSc por inmunohistoquímica en comparación con el cerebelo donde se localizan los principales depósitos de PrPSc [23, 48]. También se debe descartar la existencia de factores inherentes a la naturaleza de cada tejido como son la estabilidad de los transcritos o la regulación postranscripcional del gen PrP. En este contexto, diversos estudios sobre el mRNA del gen PrP han revelado la existencia de dos transcritos del gen PrP de distinto tamaño (4.6 y 2.1 kb), con una distribución específica de tejido, distintos grados de estabilidad y distinta eficiencia de traducción [110, 135, 146]. Por otra parte, el patrón de glicosilación de las isoformas de la PrPc así como la cantidad de ésta, responden a un patrón específico en cada tejido, encontrando la menor cantidad de PrPc en tejidos linfoides (tres ordenes de magnitud) que en tejidos del SNC [195]. Curiosamente, en el presente trabajo se han encontrado mayores niveles de mRNA del gen PrP en tejidos linfoides que en SNC lo cual sugiere la existencia de una fuerte regulación postranscripcional en tejidos linfoides. En cualquier caso, la comparación de la expresión del gen PrP entre tejidos de distinta naturaleza puede resultar muy compleja y difícil de interpretar por lo que el realizar un análisis independiente en cada tejido o al menos en cada grupo de tejidos (linfoides vs. nerviosos) podría ser de gran ayuda. Por esta razón, los valores de expresión de los tejidos nerviosos fueron agrupados y comparados con los valores agrupados obtenidos para los tejidos linfoides. En general, se observó una tendencia hacia el incremento de los niveles de mRNA del gen PrP en paralelo a la susceptibilidad genética a scrapie en tejidos del SNC. En estos tejidos, los animales pertenecientes al T1 mostraron los menores niveles de expresión, observándose un incremento gradual hacia el grupo T3. Curiosamente, los animales del T3 mostraron más mRNA del gen PrP que el grupo T5, sin embargo, no se encontraron diferencias significativas. Por otro lado, en bazo e íleon, el grupo T1 presentó los mayores niveles de expresión mientras que se encontraron resultados contradictorios cuando se realizó el análisis por genotipos. Cabe pensar como la existencia de artefactos derivados de los inhibidores de la PCR existentes en el bazo o la distribución heterogénea del sistema inmune en el íleon de distintos animales, podrían contribuir a la alta variabilidad encontrada en estas muestras. 123 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 124 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... En general, la mayoría de las diferencias encontradas en este estudio fueron significativamente marginales. Aunque se podría pensar que el análisis de un mayor número de animales podría contribuir a aumentar el poder estadístico del análisis, los resultados presentados en este trabajo no apoyan la existencia de una relación entre los niveles de mRNA del gen PrP y la susceptibilidad genética a scrapie. En estudios posteriores a este, se ha observado una relación entre los niveles de PrPc y el genotipo en una pequeña muestra de células mononucleares de sangre periférica ovina [121], y con la cantidad de PrPSc (pero no PrPc) en el encéfalo de ovejas infectadas experimentalmente [188]. Sin embargo, diferentes mecanismos tejido-específicos que controlen los procesos de transcripción, traducción y síntesis proteica, podrían explicar estas diferencias asociadas al genotipo no detectadas a nivel de los transcritos de PrPc. Dada la importancia de la PrPc como sustrato para formación de la isoforma patógena, el conocimiento del gen PrP a nivel de sus transcritos puede ser de gran relevancia, y en este sentido, los resultados presentados en este trabajo proporcionan información valiosa para posteriores estudios. Sin embargo, el scrapie es una enfermedad muy compleja y multifactorial. La existencia de otros factores como la regulación postranscripcional, la influencia de otros genes desconocidos hasta ahora y factores específicos asociados a las distintas cepas circulantes pueden influir de forma decisiva en el proceso global de la patogénesis del scrapie. 124 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 125 Capítulo 6 PATOGENIA MOLECULAR DEL SCRAPIE 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 127 6.1. INTRODUCCIÓN Todas las enfermedades por priones comparten una serie de alteraciones neurológicas comunes como son la activación de la glía, la vacuolización y la neurodegeneración progresiva del tejido nervioso con la consiguiente pérdida de neuronas. A pesar de que se han realizado numerosos estudios para llegar a comprender el complejo mecanismo molecular del scrapie, todavía siguen sin esclarecerse muchos aspectos de esta patología. En este sentido, se ha descrito la existencia de una gliosis reactiva y una secreción de citoquinas como consecuencia de la acumulación patológica de PrPSc [102, 181, 257]. Asimismo diversos estudios realizados en infecciones experimentales en modelos animales, han descrito como tiene lugar una alteración en la regulación de la expresión génica observándose una sobreexpresión de hasta 121 genes diferentes [65, 235, 301] [36]. Entre estos, podemos encontrar genes asociados con la astrocitosis, la activación de la microglía e indicadores de estrés celular como la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) o la catepsina-S. También se han encontrado alterados genes de mantenimiento de la homeostasis como el gen Cu/ZnSOD. Otra de las alteraciones observadas ha sido la relacionada con la familia de proteínas 14-3-3. Estas proteínas están siendo estudiadas como posibles marcadores de enfermedad priónica desde que se conoce su expresión diferencial en el líquido cerebroespinal de pacientes con Creutzfeldt-Jakob [14, 139, 279]. La apoptosis es el principal mecanismo de muerte neuronal que sufren las neuronas tanto en infecciones experimentales como en la forma natural de las EETs. [89, 103, 178, 255, 296], pudiéndose observar a nivel molecular una alteración de la expresión de genes relacionados con la apoptosis. También se ha descrito como la activación de la microglía y su distribución espacio-temporal refleja el patrón determinado por los depósitos de PrPSc y como a su vez precede a la detección de muerte neuronal por apoptosis [102]. En este sentido, diversos trabajos sobre infecciones experimentales de scrapie en ratón han descrito la existencia de una alteración en la expresión de genes relacionados con la apoptosis como los genes Bcl-2, Bax o caspasa-3 [150, 211]. La mayoría de la bibliografía existente relacionada con la expresión génica en el scrapie se ha realizado con infecciones experimentales y modelos animales, sin embargo, existen pocos trabajos publicados sobre el scrapie en su forma natural. Por lo tanto, teniendo en cuenta estudios realizados anteriormente, en este trabajo se analiza la expresión de nueve genes relacionados con diversos aspectos de la patogenia del scrapie. Se han analizado genes asociados a la activación de la glía, el mantenimiento de la homeostasis, la apoptosis, así como el gen PrP, en tres áreas relevantes del SNC de cuatro animales con scrapie natural y 22 animales control mediante RT-PCR a tiempo real y cuantificación relativa. 6.2. SELECCIÓN DE LOS ANIMALES Tanto los animales como las muestras empleadas en este trabajo fueron las mismas que en el estudio de la estabilidad y selección de genes HK descrito para el grupo B del capítulo 4 127 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 128 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... formado por animales sanos y con scrapie. A modo de recordatorio, los animales con scrapie correspondieron a cuatro hembras de raza Latxa con scrapie clínico pertenecientes a un brote que tuvo lugar en Diciembre de 2003. Los animales mostraban síntomas clínicos de un estadio tardío de scrapie consistentes en incoordinación de las patas traseras, caídas, respuesta exagerada a estímulos externos, rechinar de dientes, temblores y pérdida de peso. Todos los animales presentaban el genotipo ARQ/ARQ determinado según el protocolo previamente descrito [96] y que se detalla en el apartado 3.4. La edad de estos animales era de 3, 4, 5 y 8 años. Como animales control se analizaron 22 animales sanos de diferentes genotipos y pertenecientes a rebaños libres de scrapie. La edad de estos animales osciló entre 3 y 12 años. Todos los animales sanos fueron negativos al test rápido de detección de priones Platelia“BSE (Bio-Rad, CA, USA) realizado en una muestra de obex, mientras que los cuatro animales con síntomas clínicos fueron positivos. De cada animal se obtuvo asépticamente una muestra de tejido de la misma zona del cerebro (neocortex), cerebelo y obex, bazo, íleon y nódulo linfático mesentérico. Todas las muestras fueron conservadas a –80°C para preservar el RNA en condiciones óptimas hasta su posterior extracción. 6.3. EXTRACCIÓN DE RNA, DISEÑO DE CEBADORES Y PUESTA A PUNTO DE LA RT-PCR Las muestras de RNA y cDNA para este estudio han sido las mismas que las empleadas en el análisis de estabilidad de genes HK como condición indispensable para estudios de expresión relativa, por lo que los procedimientos empleados han sido los mismos que en el capítulo 4. Se diseñaron cebadores específicos para los genes GFAP (proteína ácida fibrilar glial), catepsina-S, SOD (Cu/Zn superóxido dismutasa), caspasa-3, Bcl-2 (B-cell CLL/lymphoma 2), Mcl-1 (Myeloid cell leukemia 1) y Bax (Proteína asociada a Bcl-2 x) (Tabla 6.1). Para el diseño de los cebadores de los genes GFAP, catepsina-S, caspasa-3, Bcl-2, Mcl-1 y Bax se analizaron secuencias ovinas depositadas en la base de datos pública GenBank. En el caso de los genes catepsina-S y SOD no existían secuencias publicadas de ovino por lo que los cebadores se diseñaron en regiones muy conservadas tras analizar múltiples alineamientos de estos genes en diferentes especies animales (Bos taurus, Mus musculus, Rattus norvegicus y Homo sapiens) con el programa AlingX (Vector NTI 8.0 suite, Informax Inc., MD, USA). Los cebadores para los genes 14-3-3 zeta, también llamado YWHAZ (tirosina 3-monooxigenasa), y PrP fueron diseñados anteriormente según se describe en el 4.4 y 5.3 respectivamente. La retrotranscripción se realizó con un programa de tres ciclos: 10 min a 25°C, 45 min a 37°C y 5 min a 95°C. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en el termociclador ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) usando las condiciones universales de ciclado: 10 min a 95°C y 40 ciclos de 15 seg a 95°C y 1 min a 60°C. A continuación de la reacción de PCR, se aplicó el protocolo de disociación para comprobar la Tm del producto amplificado. 128 09:56 Página 129 83.5ºC h 85.9ºC e b 78.0ºC 79.1ºC i c f 80.5ºC 83.6ºC 6. PATOGENIA MOLECULAR DEL SCRAPIE 79.7 ºC g d 79.7ºC a 2/3/06 84.9ºC 02 TESIS 55 Figura 6.1. Curvas de disociación de 9 genes empleados en el análisis. [(a), GFAP; (b), catepsina-S; (c), PrP; (d), SOD (e), 14-3-3 zeta;(f), caspasa-3; (g), Bcl-2; (h), Mcl-1; (i), Bax] Para todas las parejas de cebadores diseñadas se analizó la formación de dímeros de cebador y la especificidad de la reacción se confirmó mediante el análisis de la Tm de la curva de disociación (Figura 6.1), tamaño en gel de agarosa al 3% y secuenciación. 129 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 130 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... Se analizaron todos los genes descritos exclusivamente en el cerebro, cerebelo y obex por tratarte de genes más relacionados con el sistema nervioso. Solo en el caso del gen PrP se incluyeron los tejidos restantes pertenecientes al sistema linfoide por su implicación en la transmisión del prión. Tabla 6.1. Secuencias de los cebadores y características de los productos amplificados Gena GFAP Catepsina-S PrP SOD 14-3-3 zeta Caspasa-3 Bcl-2 Mcl-1 Bax Cebador Forward 5’→ 3’ TGCCTATCGACAGGAAGCAGAT AAAGAAGCCGTGGCCAATAAA GCCAAAAACCAACATGAAGCAT GATGAAGAGAGGCATGTTGGAGA TGTAGGAGCCCGTAGGTCATCT CCAATGGACCCGTCGATCT TTCGCCGAGATGTCCAGTC CTAGCAGAAAGCATCACAGATGTTCT TGTCTGAAGCGCATTGGAGAT Cebador Reverse 5’→ 3’ TGGACGCCACTGCCTCATA AGGCCCCAGCTGTTTTTCA TGCTCATGGCACTTCCCAG TCATTTCCACCTCTGCCCAA TTCTCTCTGTATTCTCGAGCCATCT GTCTGCCTCAACTGGTATTTTCTGA TTGACGCTCTCCACACACATG GCCTTCTAGGTCCTCTACACGGA AGGGCCTTGAGCACCAGTTT [C] pb Tmt Tmr 300 300 300 300 100 300 300 300 300 233 191 95 170 102 188 155 111 191 83 80 83 79 79 79 85 79 82 84.5-85.0 79.3-79.8 83.3-83.8 79.6-79.8 78.9-79.4 80.3-80.6 85.5-85.9 77.8-78.1 83.3-83.6 a símbolo del gen; GFAP (proteína ácida fibrilar glíal), PrP (proteína prión), SOD (Cu/Zn superóxido dismutasa), 14-3-3 zeta (tirosina 3-monooxigenasa), Bcl-2 (B-cell CLL/lymphoma 2), Mcl-1 (Myeloid cell leukemia 1) y Bax (Proteína X asociada a Bcl-2). [C], concentraciones de ambos cebadores en mM; pb, longitud del amplicón en pb; Tmt, temperatura de disociación teórica según Primer Express (Applied Biosystems, CA, USA); Tmr, temperatura de disociación real expresada en rango de temperaturas obtenido según los picos de disociación de 78 muestras. 6.4. NORMALIZACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA La normalización se realizó en base al estudio de estabilidad de genes HK realizado en el capítulo 4 en el que se identificaron distintos genes HK de referencia según el tipo de tejido. La normalización de la expresión de cada gen para cada muestra se realizó mediante el Tabla 6.2. Valores normalizados de los niveles mRNA de nueve genes en animales sanos y en animales con scrapie natural Cerebro Gen Control mRNA SD PrP GFAP Catepsina-S Bcl2 Mcl-1 Bax Caspasa-3 SOD 14-3-3 z 25.28 4.80 25.34 23.50 25.22 26.08 30.27 29.35 37.38 7.49 1.82 23.18 8.11 10.35 9.73 12.88 14.05 16.80 Scrapie mRNA SD Cerebelo Control mRNA SD Scrapie mRNA SD Obex Control mRNA SD Scrapie mRNA 21.51 1.40 30.61 6.18 40.34 4.08 36.79 8.46 39.90 22.91 13.83 21.62 9.46 23.50 3.91 30.01 13.72 64.26 33.33 13.66 35.34 19.00 41.23 9.97 29.51 19.87 57.12 18.52 0.90 29.26 9.14 38.81 14.27 33.72 20.19 46.19 31.10 9.11 24.76 13.03 32.21 7.75 26.55 14.25 37.36 28.15 14.18 25.99 8.02 24.04 6.31 24.15 18.37 21.85 11.83 3.83 19.65 9.32 22.10 2.24 19.31 16.68 15.46 22.17 6.41 32.00 9.73 41.67 3.05 20.11 13.61 13.86 18.89 3.92 31.77 7.87 40.26 7.33 42.88 9.52 31.61 SD, desviación estándar 130 SD 0.47 20.31 20.06 23.19 10.52 8.08 11.13 5.14 7.24 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 131 6. PATOGENIA MOLECULAR DEL SCRAPIE ratio obtenido a partir de la expresión del gen problema y el FN para cada muestra. Los FN se calculan por medio de la media geométrica de la expresión de cada uno de los genes HK necesarios según el tejido del que se trate: GAPDH, SDHA, G6PDH y ACTB para el cerebro, G6PDH, ACTB y RPL19 para el cerebelo, GAPDH, SDHA y G6PDH para el obex, GAPDH, SDHA y ACTB para el bazo, SDHA, RPL19 y GAPDH para el linfonodo, GAPDH, G6PDH, SDHA y RPL19 para el íleon. Los valores obtenidos para los distintos genes agrupados en sanos y enfermos se presentan en la Tabla 6.2 y en la Figura 6.2. 6.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS Las diferencias estadísticas entre los grupos control y afectados por scrapie fueron calculadas con el test no paramétrico Mann Whitney y el programa estadístico SAS versión 8 (SAS institute, Cary, NC, USA). Este estadístico está recomendado para la comparación de grupos con un número de muestras bajo (n~20). Por otro lado, los test no paramétricos no requieren que los valores a analizar se ajusten a una distribución normal. Los valores de p<0.10, fueron considerados como diferencias marginalmente significativas, valores de p<0.05 indicaron diferencias significativas y p<0.01 como diferencias altamente significativas. El análisis de los valores de expresión normalizada para los genes GFAP, catepsina-S, PrP, SOD, 14-3-3 zeta y caspasa-3 mostró la existencia de diferencias significativas entre animales sanos y enfermos al menos en uno de los tejidos analizados (Tabla 6.3, Figura 6.2). Por el contrario, los niveles de expresión de los genes Bcl-2, Mcl-1 y Bax no mostraron diferencias significativas en ninguno de los tejidos. Respecto a los genes relacionados con la glía, la expresión del gen GFAP presentó niveles de expresión significativamente mayores en el cerebro y obex de los animales con scrapie respecto de los animales control (incrementos de 4.8 veces, p=0.0022, y de 2.1 veces, p=0.0069, respectivamente). Para el gen de la catepsinaS, se observó un aumento de la expresión de 1.9 veces en el obex de animales enfermos respecto a los animales sanos (p=0.0230). Los niveles de mRNA del gen PrP en el cerebelo de animales con scrapie fue 1.3 veces mayor (p=0.0129) en comparación con los animales control. El gen que codifica para la enzima antioxidante SOD mostró un incremento de 1.3 veTabla 6.3. Diferencias de expresión entre animales sanos y animales con scrapie Tejido GFAP catepsina-S PrP SOD 14-3-3 zeta caspasa-3 Bcl-2 Mcl-1 Bax Cerebro ↑4.8 ↑1.3 ↓1.2 ↓1.3 ↓2.0 ↓2.6 ↓1.3 ↑1.2 ↑1.1 p=0.0022 p=0.1179 p=0.3198 p=0.3556 p=0.0550 p=0.0069 p=0.2387 p=0.1029 p=0.9433 Cerebelo ↑1.1 ↑1.2 ↑1.3 ↑1.3 ↑1.3 ↑1.1 ↑1.3 ↑1.3 ↓1.1 p=0.4344 p=0.4344 p=0.0129 p=0.0393 p=0.0646 p=0.1552 p=0.1021 p=0.1356 p=0.5224 Obex ↑2.1 ↑1.9 ↑1.1 ↓1.5 ↓1.4 ↓1.2 ↑1.4 ↑1.4 ↓1.1 p=0.0069 p=0.0230 p=0.2008 p=0.6698 p=0.0393 p=0.7223 p=0.2555 p=0.1179 p=0.7762 Los números indican el incremento de una sobreexpresión (↑) o desregulación (↓) entre los animales con scrapie y el grupo control. Los valores de p se calcularon por medio del test Mann Withney. Los valores de p <0.10 se indican en negrita. 131 2/3/06 09:56 Página 132 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... Obex Cerebelo Cerebro 0 20 40 Scrapie 60 Control 80 100 Obex Cerebelo 40 20 0 40 20 0 60 Scrapie Control 80 100 0 0 Cerebro Mcl-1 Cerebelo 20 20 Cerebelo 60 Cerebro Scrapie 80 100 Control Bcl-2 Cerebelo Cerebro ** 60 Scrapie 80 Control SOD 100 Obex Obex 40 40 60 * Cerebro * Scrapie Control 80 100 Bax Cerebelo Cerebro 0 Obex 20 40 *** Scrapie ** 60 Control 14-3-3 zeta Cerebelo Cerebro Obex Cerebelo Cerebro *** 40 60 80 Scrapie GFAP Control 80 100 0 0 0 60 Scrapie Control 80 *** 100 Caspasa 3 Cerebro 20 20 20 Obex 40 40 Scrapie 60 80 Catepsina S ** 100 Control PrP ** Cerebelo Obex Obex ces (p=0.0393) en las muestras de cerebelo de animales con scrapie. El gen para la isoforma zeta de la proteína 14-3-3 mostró una sobreexpresión en el cerebelo de los animales con scrapie (1.3 veces, p=0.0646) mientras se observó una desregulación en el cerebro y en el obex 100 02 TESIS 55 Figura 6.2. Representación gráfica de la comparación de los valores normalizados de los niveles de mRNA entre el grupo control (columna gris) y el grupo de animales con scrapie (columna negra). [En el eje de abscisas se representan los niveles medios del mRNA normalizado obtenido por RT-PCR a tiempo real y cuantificación relativa empleando los genes HK más estables en cada tejido. Las barras de error representan la desviación estándar. (*), diferencia marginalmente significativa p<0.10; (**), diferencia significativa p<0.05 y (***), diferencia altamente significativa p<0.01 (Mann Whitney U test)] 132 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 133 6. PATOGENIA MOLECULAR DEL SCRAPIE de animales afectados de scrapie (2.0 veces, p=0.0550 y 1.4 veces, p=0.0393, respectivamente). Respecto a los genes implicados en la apoptosis, únicamente el gen de la caspasa-3 mostró una expresión significativamente menor en los animales con scrapie (2.6 veces, p=0.0069). El resto de genes, Bcl-2, Mcl-1 y Bax, no mostraron diferencias significativas. 6.6. DISCUSIÓN La patogenia de las enfermedades por priones en el SNC comprende una serie de mecanismos comunes todavía lejos de una buena caracterización molecular. Con el fin de conocer mejor las posibles alteraciones moleculares que tienen lugar en el SNC de animales con scrapie natural, se han analizado los niveles de expresión (mRNA) de nueve genes asociados con la activación de la glía, apoptosis y neuroprotección. Los resultados obtenidos en este trabajo, confirmaron la sobreexpresión previamente descrita por otros autores del gen GFAP y además, han permitido describir por primera vez la alteración de nuevos genes como el de la catepsina-S, PrP, SOD, 14-3-3 zeta y caspasa-3 en scrapie natural. El gen GFAP es el principal componente de los filamentos intermedios de la astroglía y se emplea como marcador histológico de activación astrocítica [87]. Los astrocitos, como parte de la glía, juegan un papel fundamental en el desarrollo del sistema nervioso y en el mantenimiento de la homeostasis del tejido neural. En relación con el scrapie, se ha observado la inducción de gliosis en infecciones experimentales en ratones. Los astrocitos han sido implicados en la formación y replicación del prión [78, 303]. Se ha descrito también como el desarrollo temporal y la distribución espacial de la activación astrocítica recuerda al patrón seguido por los depósitos de PrPSc [102]. Diversos estudios han demostrado una sobreexpresión del gen GFAP en homogeneizados de encéfalos de ratones infectados con scrapie [65, 81, 169, 235, 257, 301]. De hecho, se ha sugerido que la región reguladora de 2 kb del promotor del gen GFAP presenta los elementos necesarios para los mecanismos de acción del prión [275]. En el presente trabajo, se ha observado una sobreexpresión altamente significativa del gen GFAP en el obex y cerebro de animales con scrapie natural indicando la presencia de actividad astrocítica. Este incremento de mRNAs del gen GFAP se correlaciona con la distribución espacial de los depósitos de PrPSc encontrados por inmunohistoquímica, la cual mostró depósitos en el cerebro y en el obex pero no así en el cerebelo (datos no mostrados). Sin embargo, otros autores [8, 99, 173] han descrito alteración del gen GFAP también en el cerebelo de animales con scrapie natural. Estas pequeñas discrepancias podrían tener relación con el estadio de la enfermedad, la cepa de scrapie y/o el método de detección empleado. Para confirmar estas suposiciones sería necesario realizar una serie de análisis exhaustivos adicionales. La catepsina-S es una proteasa lisosomal de la glía esencial para el reciclaje de las proteínas intracelulares y a la que se le atribuye cierta implicación en procesos relacionados con la destrucción y remodelado del tejido nervioso. Además, se ha sugerido su implicación en el desarrollo de placas amiloides [175, 199]. También se ha descrito un aumento en los niveles de mRNA de catepsina-S en modelos animales de scrapie y Creutzfeldt-Jakob [10, 65, 301]. 133 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 134 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... En este trabajo se ha encontrado por primera vez una sobreexpresión del gen catepsina-S en muestras de obex de animales con scrapie natural, sugiriendo su participación en la formación de las vacuolas presentes en el scrapie debido a su actividad proteolítica. Además, el hipotético papel modulador propuesto para la catepsina-S en la formación y persistencia de b-amiloide en las placas seniles de algunos desordenes neurológicos podría también aplicarse al scrapie, de manera que favoreciese la formación de agregados de PrPSc. En resumen, los perfiles de expresión obtenidos en este estudio para los genes GFAP y catepsina-S, sugieren la existencia de mayor actividad glial en el obex que en el cerebro de animales afectados de scrapie. Aunque la función biológica de la PrPc no está del todo clara, existen numerosos trabajos que sugieren una función neuroprotectora [244]. Entre otras propiedades, se ha observado actividad protectora ante la toxicidad provocada por la proteína Doppel, un papel defensivo en el estrés oxidativo y un efecto antiapoptótico contra muchos tipos de daño celular como la apoptosis mediada por Bax. En este sentido, se ha descrito una sobrexpresión del gen PrP en isquémia cerebral humana y de ratón [189] o bajo diferentes lesiones del SNC humano [88]. En relación al scrapie, mientras que empleando la técnica de Northern blot no se observó alteración alguna en infecciones experimentales de ratones [65, 170], Li y cols. [176], describieron sobreexpresión empleando la técnica de RT-PCR. Estas diferencias podrían atribuirse a la técnica empleada o bien a diferencias en la respuesta del hospedador. Asimismo un trabajo muy reciente ha demostrado un aumento a nivel de proteína PrPc en células mononucleares de sangre periférica ovina de animales sanos [121]. En el presente trabajo, se ha observado una sobreexpresión del gen PrP en el cerebelo de animales con scrapie natural. Esta sobreexpresión también se ha observado para el gen SOD en el cerebelo de animales con scrapie. La principal función antioxidante atribuida a la PrPc se basa en su capacidad de regular la actividad de la enzima SOD [37, 250, 251]. Por un lado, la actividad de SOD depende de la disponibilidad del Cu2+ y por otro lado se conoce la capacidad de la PrPc de unir Cu2+ e internalizarlo en el citoplasma. En 1998, Brown y cols. [37] demostraron la relación entre la PrPc y la SOD en el sentido de que la actividad de SOD aumenta bajo una sobreexpresión de PrPc y por el contrario, una falta de PrPc provoca una disminución de la actividad de SOD. Cabe destacar como el aumento de la PrPc no refleja necesariamente un aumento de los niveles de la proteína SOD o de su mRNA [37, 231]. En este trabajo, se ha observado un aumento de los niveles de SOD en las muestras de cerebelo de animales con scrapie, sugiriendo una doble defensa antioxidante a través del aumento de la presencia del enzima SOD y mediante el aumento de su actividad enzimática por medio del incremento de la PrPc. La familia de las proteínas 14-3-3 comprende un conjunto de proteínas altamente conservadas, con múltiples funciones reguladoras y con implicación en diversos procesos celulares [82, 186]. Cabe destacar su función protectora de promover la supervivencia neuronal ante la apoptosis por medio de su interacción con otras proteínas [308] [46] [309] [305]. En mamíferos, se han descrito hasta siete isoformas diferentes con distinta distribución, localización celular o distinta regulación de la expresión, pero que comparten el mismo dominio de interacción con otras proteínas. Se desconoce el papel de esta familia en enfermedades por priones, sin embargo, se ha detectado la presencia de estas proteínas en el líquido cerebroes134 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 135 6. PATOGENIA MOLECULAR DEL SCRAPIE pinal de enfermedades priónicas humanas y animales, por lo que han sido consideradas como posibles marcadores de enfermedad priónica [14, 139, 279]. Cabe destacar la existencia de una regulación diferencial de estas proteínas en ratones con scrapie experimental, dependiente de la isoforma de la que se trate y de su localización tisular [15]. En el presente estudio, mientras que en las muestras del cerebelo y obex de animales afectados de scrapie se ha observado una desregulación del gen 14-3-3 zeta, en el cerebelo ha tenido lugar una sobreexpresión. La sobreexpresión de los genes PrP, SOD y 14-3-3 zeta observada en el cerebelo de los animales con scrapie podría estar indicando una respuesta global de neuroprotección. Sin embargo, no se han detectado depósitos de PrPSc en esta región. Esta situación induce a pensar en la existencia de depósitos iniciales de PrPSc aún indetectables por inmunohistoquímica que serían insuficientes para activar el mecanismo glial pero capaces de activar el mecanismo neuroprotector mediado por los genes PrP, SOD y 14-3-3 zeta para contrarrestar una toxicidad primaria desencadenada por esas partículas aún indetectables de PrPSc. En contraposición, el cerebro y el obex, donde se detectaron depósitos de PrPSc, lesiones neuronales y glía reactiva, mostraría la situación contraria. La expresión constitutiva observada para los genes PrP y SOD podría interpretarse como una situación de neuroprotección reducida, la desregulación del gen 14-3-3 zeta podría tener un efecto negativo en la supervivencia neuronal y la sobreexpresión de los genes GFAP y catepsina-S confirmaría la activación de la glía. Además, la pérdida del papel neuroprotector de la PrPc debida a su conversión en PrPSc debería tenerse en cuenta en el obex y en el cerebro de los animales con scrapie. Numerosos estudios basados en infecciones experimentales por priones, en cultivos celulares o en scrapie natural han demostrado como la apoptosis es la principal vía de muerte neuronal en las EETs [89, 103, 255]. Existen una serie de estímulos pro-apoptóticos que a través de señales en cascada llevan a las neuronas hacia una muerte por apoptosis (TNF, Fas, Bax o caspasa-3) o hacia la supervivencia a través de citoquinas, factores de crecimiento y genes anti-apoptóticos como el Bcl-2 y el Mcl-1. El presente trabajo ha revelado un cambio en el perfil de expresión de los genes pro-apoptóticos como la caspasa-3 en scrapie natural y una expresión constitutiva de los genes Bcl-2, Mcl-1 y Bax. Las caspasas son un grupo de cistein aspartil proteasas que intervienen en el mecanismo de la apoptosis. Muchas de las señales apoptóticas convergen en la activación de la caspasa-3, la cual es la responsable de los cambios morfológicos y bioquímicos de la muerte por apoptosis. Aunque se conoce la inducción de la apoptosis por PrPSc a través de la caspasa-3 [126, 127, 150, 262], no se pueden descartar otras vías alternativas [248]. Se ha propuesto una asociación entre la activación de la caspasa-3 y la formación de b-amiloide [11, 100, 238]. Además la caspasa-3 puede romper enzimáticamente las proteínas Bcl-2 y Mcl-1 eliminando sus propiedades anti-apoptóticas y a su vez liberando señales pro-apoptóticas similares a Bax [58, 60, 287]. En contra de lo que se esperaba, en el presente trabajo se ha detectado una desregulación altamente significativa del gen de la caspasa-3 en las muestras de cerebro de los animales con scrapie. Esta desregulación podría traducirse en bajos niveles de caspasa-3 susceptible de ser activada, retrasando de esta forma las consecuencias de la apoptosis. La proteína Bcl-2 está considerada como anti-apoptótica contrarestando el estrés mitocondrial mediado por Bax, y de este modo pre135 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 136 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... viniendo la liberación del citocromo C y la subsiguiente activación de las caspasas [200, 246, 284, 310]. Aunque no se han encontrado diferencias significativas en el trabajo presentado, se ha observado una menor expresión del gen Bcl-2 y una mayor expresión del gen Bax en el cerebro de animales afectados por scrapie en comparación con el grupo control. Park y cols. [211] mediante la técnica de RT-PCR, encontraron resultados similares en ratones infectados con la cepa de scrapie 263K. Analizando de forma conjunta todos los resultados obtenidos, se puede pensar que los diferentes perfiles de expresión observados en las distintas áreas del encéfalo de los animales con scrapie podrían reflejar la distribución espacio-temporal de la patogenia molecular del scrapie. Una vez que el prión alcanza el SNC, la aparición de lesiones en el obex precede a su detección en cerebro y posteriormente en el cerebelo. Puesto que no se detectaron depósitos de PrPSc en el cerebelo de estos cuatro animales en una fase clínica de la enfermedad, la situación observada en el cerebelo podría extrapolarse a lo que sucedería en los estadios iniciales de la patogenia del scrapie, primero en el obex y después en el cerebro. De esta forma, mientras el cerebelo mostró una respuesta global neuroprotectora en un intento de mantener la homeostasis celular contra los efectos tóxicos de los depósitos iniciales de PrPSc, el perfil de expresión observado en el obex y cerebro corresponderían a un estadio patológico más avanzado. Por lo tanto, en un estadio temprano de la enfermedad, el obex y el cerebro mostrarían un perfil similar al encontrado por este estudio en el cerebelo. Sin embargo, para confirmar esta deducción, serían necesarios posteriores ensayos con infecciones experimentales controladas. Además, no se puede descartar la participación de otros mecanismos como la existencia de una respuesta específica de tejido. En resumen, los resultados presentados en este trabajo proporcionan información adicional para comprender la complejidad de la patogenia molecular del scrapie natural. Conocer el papel de estos genes en las enfermedades por priones puede ser muy util para el desarrollo de terapias de control, tratamientos y para en el desarrollo de tests diagnósticos ante-morten. 136 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 137 CONCLUSIONES 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 139 1. Se han desarrollado dos protocolos para la determinación de los polimorfismos en los codones 136, 154 y 171 del gen PrP. El primer protocolo basado en el método de PCR-RFLP es sencillo, no requiere una inversión elevada y se puede implantar en cualquier laboratorio de biología molecular. El segundo protocolo, basado en la detección de SNPs mediante la técnica de PCR a tiempo real, requiere cierta inversión económica inicial que se ve compensada por la capacidad de procesar un gran número de muestras en poco tiempo, resultando idóneo para laboratorios de diagnóstico con una carga de trabajo media-alta. 2. Las razas autóctonas de la CAPV presentan una susceptibilidad genética frente a scrapie relativamente alta. Así, aunque la frecuencia de los genotipos asociados a mayor riesgo (T5) fue relativamente baja (3.5%), el genotipo asociado con susceptiblidad ARQ/ARQ presentó la mayor prevalencia (49.3% en Latxa y 38.0% en Carranzana). 3. El análisis de estabilidad de la expresión de seis genes endógenos en seis tejidos ovinos, ha permitido obtener diferentes grupos de genes de referencia para los seis tejidos estudiados. El procedimiento seguido y los resultados obtenidos sirven de referencia para otros estudios de expresión génica en animales sanos o con scrapie. 4. Existe cierta tendencia al aumento en los niveles de mRNA del gen PrP a medida que aumenta la susceptibilidad genética, sin embargo, los resultados obtenidos no apoyan de manera clara la existencia de una relación entre la expresión del gen PrP y la susceptibilidad genética a scrapie. 5. Además de la sobreexpresión del gen GFAP previamente descrita por otros autores, se ha descrito por primera vez en scrapie natural la alteración de genes relacionados con la glía (catepsina-S), el estrés oxidativo (SOD), la apoptosis (caspasa-3), así como de los genes 14-3-3 zeta y PrP. 6. Los diferentes perfiles de expresión observados en las distintas áreas del encéfalo de los animales enfermos podrían reflejar la distribución espacio-temporal de la patogenia molecular del scrapie. La respuesta global neuroprotectora observada en el cerebelo de animales en una fase clínica de la enfermedad pero sin depósitos de PrPSc, podría extrapolarse a lo que sucedería en los estadios iniciales de la patogenia del scrapie, primero en el obex y después en el cerebro. El perfil de expresión observado en el obex y cerebro donde se detectaron depósitos de PrPSc, lesiones neuronales y glía reactiva, corresponderían a un estadio patológico más avanzado. 139 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 141 RESUMEN, SUMMARY, LABURPENA 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 143 RESUMEN El scrapie es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a ovejas y cabras, que se incluye dentro del grupo de Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (EETs). Según la hipótesis más aceptada hasta el momento, el agente causal es una única proteína llamada prión o PrPSc. Esta proteína sería el resultado de un cambio conformacional de una proteína de idéntica estructura primaria y codificada por el hospedador, la PrPc. Antes de la aparición del primer caso de Encefalopatía Espongiforme Bovina (EEB) en el año 1986, la preocupación por el scrapie se debía a las pérdidas económicas y el interés por esta encefalopatía se centraba en conocer su transmisibilidad con el fin de erradicarla. Sin embargo, a partir de su posible implicación en la aparición de la EEB y más aún, indirectamente con la aparición de casos humanos asociados al consumo de carne contaminada con EEB, se produjo una crisis alimentaria de gran magnitud que incrementó la preocupación y el interés por el scrapie. La incidencia del scrapie a nivel mundial es muy variable siendo en el Reino Unido donde se han concentrado la mayor parte de los casos. En la CAPV el número de casos es muy bajo y no parece suponer un problema de primer orden (5 brotes hasta junio de 2005). Sin embargo, la mayor incidencia del scrapie en otras comunidades así como el alto número de casos en una raza similar de los Pirineos Atlánticos, alimentan y mantienen la preocupación por el scrapie. Una de las estrategias más extendidas para erradicar el scrapie consiste en la selección genética de animales resistentes a la enfermedad. Esta predisposición genética se encuentra ligada a una serie de polimorfismos del gen PrP que confieren susceptibilidad o resistencia a scrapie. Los animales con el genotipo ARR/ARR para los codones 136, 154 y 171 presentan la mayor resistencia en comparación a los animales con el genotipo VRQ/VRQ de mayor susceptibilidad. En este sentido en el presente trabajo se han desarrollado dos métodos para la detección de estos polimorfismos que han permitido conocer el riesgo hipotético frente a scrapie en las razas autóctonas de la CAPV (Latxa y Carranzana). El análisis de una muestra representativa de estos animales ha revelado como estas razas poseen una sensibilidad genética media-alta a scrapie, sin embargo, la baja incidencia de casos positivos en las mismas hace que la selección genética en estos animales deba realizarse con cautela. Una de las razones de esta susceptibilidad genética parece encontrarse en la secuencia aminoacídica de la proteína PrPc. Diversos estudios han demostrado la existencia de diferencias en la velocidad del cambio conformacional de PrPc a PrPSc dependiendo de su combinación aminoacídica. La variante resistente ARR/ARR presenta menor velocidad de cambio conformacional que la variante susceptible VRQ/VRQ. En este trabajo se han estudiado las bases moleculares de la susceptibilidad genética desde otro punto de vista. Se han analizado y comparado los niveles de expresión del gen PrP con la susceptibilidad genética a scrapie con el fin de testar la hipótesis de que en los animales de mayor sensibilidad genética tuviera lugar una mayor expresión del gen PrP y con ello una mayor presencia de precursor PrPc susceptible de ser transformado en PrPSc. Para ello, se ha empleado un método de cuantificación de mRNA muy preciso, la RT-PCR a tiempo real unido a la cuantificación relativa. En primer lugar se ha llevado a cabo un análisis de la estabilidad de genes endógenos susceptibles de ser usados como genes de referencia. Como resultado, se han identificado diferentes 143 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 144 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... grupos de genes endógenos para la normalización de la expresión en cada uno de los seis tejidos estudiados (cerebro, cerebelo, obex, bazo, nódulo linfático mesentérico e íleon). Una vez normalizada su expresión utilizando los genes endógenos correspondientes se ha observado cierta tendencia a un aumento en los niveles del mRNA del gen PrP a medida que aumenta la susceptibilidad genética a scrapie en los tejidos del sistema nerviosos central. Sin embargo, las diferencias encontradas han sido marginales por lo que no se ha podido concluir que exista una relación entre la susceptibilidad genética a scrapie y los niveles de mRNA del gen PrP. Como último abordaje experimental de este trabajo, se han estudiado también algunos aspectos de la patogenia molecular del scrapie. En esta encefalopatía así como en otras EETs tienen lugar una serie de lesiones y alteraciones comunes a nivel microscópico tales como una activación de la glía, el estrés oxidativo y la neurodegeneración por apoptosis. Parte de estas alteraciones se presentan también en otras enfermedades neurodegenerativas humanas como el Parkinson y el Alzheimer por lo que el estudio del scrapie podría ayudar a comprender mejor este grupo de enfermedades. Se ha realizado un análisis de los niveles de expresión de nueve genes relacionados con la activación de la glía, el mantenimiento de la homeostasis, la apoptosis, así como del gen PrP, en el cerebro, cerebelo y obex de animales sanos y con scrapie clínico. El empleo de la RT-PCR a tiempo real y cuantificación relativa ha permitido detectar alteración de genes relacionados con la glía (GFAP y catepsina-S), el estrés oxidativo (SOD), la apoptosis (caspasa-3), el gen 14-3-3 zeta y el gen PrP en los animales con scrapie. Los diferentes perfiles de expresión observados en las distintas áreas del encéfalo de los animales con scrapie podrían reflejar la distribución espacio-temporal de la patogenia molecular del scrapie. La respuesta global neuroprotectora observada en el cerebelo de animales en una fase clínica de la enfermedad pero sin depósitos de PrPSc, podría extrapolarse a lo que sucedería en los estadios iniciales de la patogenia del scrapie, primero en el obex y después en el cerebro. El perfil de expresión observado en el obex y cerebro donde se detectaron depósitos de PrPSc, lesiones neuronales y glía reactiva, corresponderían a un estadio patológico más avanzado. Estos resultados proporcionan valiosa información para comprender mejor la complejidad de la patogenia molecular del scrapie natural. 144 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 145 RESUMEN, SUMMARY, LABURPENA SUMMARY Scrapie is a neurodegenerative disease included in the group of Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSE) that affects sheep and goats. According to the most accepted hypothesis, the prion protein PrPSc is the only causative agent. This protein is the result of a conformational change of a protein with the same primary structure coded by the host, PrPc. Prior to the first case of Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) occurred in 1986, scrapie concern focused on the economical losses caused by the disease and scientific interest centred on the study of its transmissibility with the aim of eradicating it. However, the food safety crisis occurred after the hypothetical implication of scrapie in BSE and indirectly in the appearance of human cases associated to the consumption of meat from cows with BSE, increased the concern and the interest in scrapie. The incidence of scrapie varies significantly in different countries, but most of the cases have been recorded in the United Kingdom. In the Basque Country, the number of cases is quite low and it does not seem to be a problem (five outbreaks up to June 2005). However, due to the higher incidence in other regions of Spain, and the high number of scrapie cases in a similar breed of the Atlantic Pyrenees, the problem of scrapie cannot be ignored. One of the most extended strategies to eradicate the disease is based on the genetic selection of scrapie resistant animals. This genetic resistance is linked to several polymorphisms of the PrP gene which confer different levels of susceptibility or resistance to the disease. Animals with ARR/ARR genotype for 136, 154 and 171 codons show the highest resistance to scrapie in opposition to those with VRQ/VRQ genotype, which has been associated to the highest risk. In this sense, in the present work two methods have been developed to detect these polymorphisms. These methods were applied to a representative sample of the sheep population of the Basque Country breeds (Latxa and Carranzana). The results showed that these breeds have a medium-high susceptibility to suffer scrapie, although the low incidence of clinical cases calls for caution in the application of genetic selection. This genetic susceptibility seems to be linked to the aminoacidic sequence of the PrPc protein. Several studies have revealed the existence of differences in the rate of PrPc conversion into PrPSc associated to different aminoacidic combinations. This conformational change has been demonstrated to be slower in animals with the resistant variant ARR/ARR than in those with the susceptible VRQ/VRQ genotype. In this work the molecular bases of this genetic susceptibility have been studied from another point of view. The expression levels of the PrP gene were compared with the genetic susceptibility to scrapie with the aim to test the hypothesis that animals with the highest susceptibility show the highest expression levels of PrP mRNA and thus, a higher presence of precursor PrPc susceptible of being transformed into PrPSc. For this purpose, an accurate quantification method to measure the mRNA was used, real time RT-PCR and relative quantification. Previous to the PrP gene expression analysis the stability of six housekeeping (ACTB, GAPDH, SDHA, G6PDH, YWHAZ and RPL19) genes was assessed in order to select the best ones for relative quantification. This analysis showed a large tissue-associated variation and identified a different and specific set of HK genes for each tissue. The normalised PrP gene expression showed a tendency towards in- 145 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 146 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... creased PrP mRNA levels and genetic susceptibility in central nervous system. However, the differences found were only marginal and therefore, the results did not support the hypothesis that PrP mRNA levels vary between genotypes. Finally, some aspects of the molecular pathogenesis of scrapie were also investigated as part of this study. Several lesions and alterations like glial activation, oxidative stress and neurodegeneration via apoptosis are common to this and other TSEs. Some of these alterations do also occur in human neurodegenerative diseases like Parkinson and Alzheimer, and therefore, studies on scrapie could help to better understand these important human diseases. As part of this study, the levels of nine genes related to glial activation, homeostasis maintenance, apoptosis as well as the PrP gene, were analysed in the cerebrum, cerebellum and obex of healthy and scrapie affected animals. The results showed an alteration in genes related to glia (GFAP and cathepsin-S), oxidative stress (SOD), apoptosis (caspase-3) and changes in 14-3-3 and PrP genes in animals with natural scrapie. The different expression profiles found in the three brain areas of scrapie-affected animals might reflect the spatial-temporal distribution of scrapie molecular pathogenesis. The global neuroprotective response observed in cerebellum of animals with a clinical stage of the disease where PrPSc aggregates were not found, could be extrapolated to what could occur in the initial stages of scrapie pathogenesis firstly in obex and after in cerebrum. The expression profile observed in obex and cerebrum where PrPSc aggregates, neuronal lesions and reactive glia were found, would correspond to a later pathological stage. These results provide additional information to understand the complexity of natural scrapie molecular pathogenesis. 146 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 147 RESUMEN, SUMMARY, LABURPENA LABURPENA Scrapie-a ardi eta ahuntzei endekapen neurologikoa eragiten dien, Entzefalopatia Espongiforme Transmitigarri taldeko gaixotasuna da. Oraindaino hipotesi onartuena kontutan harturik, prioi edo PrPSc deituriko proteina baten eragina litzateke berau. Proteina hau ostalariak berak kodifikaturiko PRPc proteinaren aldaketa konformazionalaren ondorioa litzateke, oinarrizko egitura bera luketelarik biek. Hasiera batean, Behi Entzefalopatia Espongiforme lehen kasua 1986. urtean agertu aurretik, Scrapie-ak eragiten zuen kezka nagusia sor zitzakeen galera ekonomikoen araberakoa zen eta entzefalopatia honen interesaren funtsa, erradikatzeko asmotan, transmititzeko moduaren ezagutzan legoke. Interes eta kezka hau berriz, ikaragarri areagotu zen Behi Entzefalopatia Espongiformearen agerpenean izan zezakeen eraginarengatik eta kutsaturiko haragiaren kontsumoarekin erlazionaturiko gizaki kasu agerpenekin bat, Scrapie-aren mundu zeharreko hedapena oso aldakorra da, Erresuma Batua izanik kasu gehien pairatzen duen herrialdea. Euskal Autonomia Erkidegoan berriz, kasu kopurua oso baxua da (2005ko ekaina arte 5 agerraldi) oinarrizko arazoa izatetik urrun dagoelarik. Hala ere, ezin begi bistaz galdu behar, beste komunitate batzuetan eta Pirinio Atlantikoan antzerako arraza batek jasaten duen kasu kopuru altua kontutan hartuz. Scrapie-a erradikatzeko darabilten estrategia zabalduena gaixotasunarekiko erresistentzia duten animalien hautespen genetikoan oinarritzen da. PrP genean gertzen diren polimorfismo batzuk dira animaliek gaixotasunarekiko erresistentzia edo sentikortasun gehiago izatearen gakoa. 136, 154 eta 171 kodoietarako ARR/ARR genotipodun animaliek dute erresistentzia gehien, VRQ/VRQ sentikortasun gehien duten animalien aurrean. Bide hau jorratuz, lan honetan polimorfismo hauek detektatzeko bi metodo garatu dira, bide batez, Elkarte Autonomikoan dauden bertako arrazek (Karrantzakoa eta latxa) Scrapie-a jasateko duten arrisku hipotetikoa ikuskatuz. Animalia hauen lagin adierazgarria aztertuz, arraza hauek sentsibilitate genetiko ertain-altua dutela ondoriozta daiteke, hau Elkarte Autonomikoan jasaten den kasu kopuru baxuarekin kontrajarriz eta beraz, hemen behintzat, selekzio genetikoaren estrategia bidezko erradikapena kontu handiz bideratuz. Sentikortasun genetiko honen arrazoietako bat PRPc aminoazido sekuentzian legoke. Lan desberdinek, aminoazido sekuentzien araberako PrPc –tik PrPSc –rako aldaketa konformazionalaren abiaduran desberdintasunak frogatu dituzte. ARR/ARR aldaki- erresistenteak VRQ/VRQ aldaki-sentikorrak baino aldaketa konformazional abiadura geldoagoa du. Lan honetan, sentikortasun genetikoaren oinarri molekularrak beste ikuspuntu batetik aztertu dira. PrP genearen espresio mailak aztertu eta Scrapie-arekiko sentikortasun genetikoarekin alderatu dira, honela sentsibilitate genetiko handiagoa duten animaliek, PrP genearen espresio handiagoa eta beraz, PRPSc egoerara aldatzeko aukera handiagoa duten PrPc prekurtsorearen presentzia handiagoa luketen hipotesia landuz. Horretarako RNA mezularia kuantifiatzen duen metodo oso zehatza erabili da; denbora errealeko RT-PCRa kuantifikazio erlatiboarekin bat. Lehenik, erreferentzi gene bezela erabiltzeko, gene endogenoen egonkortasun-analisia burutu da. Ehunaren arabera gene endogeno talde deserdinak lortu dira, gene normalizatzai147 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 148 DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE LA RESISTENCIA GENÉTICA Y... le gisa erabiliz. Honek, PrP geneko RNA mezulari mailaren handitze joera dagoela sentikortasun genetikoaren handitzearekin batera behatzea ahalbideratu du. Hala ere, aurkikuntzaren diferentzia eskasiak ez du erlazioa dagoenaren ondorioztatzea suposatu. Lan honen azken txanpa gisa, Scrapie-aren patogenia molekularraren zenbait atal aztertu dira. Beste hainbat Entzefalopatia Espongiforme Transmitigarrietan bezala entzefalopatia honetan, maila mikroskopikoan, lesio eta asaldura amankomun batzuk ageri dira, hala nola, gliaren aktibazioa, estres oxidatiboa eta apoptosi bidezko neuroendakapena. Gizakiek pairatzen dituzten Parkinson eta Alzheimer gisako endekapen neurologikozko hainbat gaixotasunetan ere antzerako asaldurak agertzen direnez, Scrapie gaixotasunaren ikasketak, gisa honetako hainbat gaixotasun hobeto ezagutzen lagun lezake. Gliaren aktibazioan, homeostasiaren mantenuan eta apoptosian eragina duten bederatzi generen eta animalia osasuntsu zein Scrapie klinikoa duten PrP genearen garun, zerebelo eta obex espresio mailako azterketa burutu da. Denbora errealeko RT-PCRak eta kuantifikazio erlatiboak, gliaren aktibazioarekin zerikusia duten genetan (GFAP eta catepsina-S), estres oxidatiboarekin zerikusia dutenetan (SOD), apoptosiarekin (caspasa-3), 14-3-3 zeta genean eta Scrapie gaixotasunadun PrP genean gertaturiko alterazio genetikoak detektatzea ahalbideratu dute. Scrapie-dun animalien entzefalo gune desberdinetan ikusitako espresio profil desberdinek, Scrapie-aren patogenia molekularraren espazio-denbora kokapena adieraz lezake. PrPSc metaketa gabeko gaixotasunaren fase klinikoan, zerebeloan ikus daitekeen erantzun neurobabesle orokorra, Scrapie patogeniaren hasierako estadioetan, lehenik obexean eta ondoren garunean gerta daitekeenaren adierazle zatekeen. PrPSc metaketak antzeman diren obex eta garunean ikusitako espresio perfilak, lesio neuronalak eta berraktibatutako glia, estadio patologiko aurreratu baten adierazle lirateke. Emaitza hauek Scrapie naturalaren patogenia molekularraren konplexutasuna hobe ulertzen lagun dezakete. 148 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 149 BIBLIOGRAFÍA 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 151 [1] Acin C, Martin-Burriel I, Goldmann W, Lyahyai J, Monzon M, Bolea R, Smith A, Rodellar C, Badiola JJ, Zaragoza P. Prion protein gene polymorphisms in healthy and scrapie-affected Spanish sheep. J Gen Virol (2004), 85:2103-2110. [2] Aguzzi A. Peripheral prion pursuit. J Clin Invest (2001), 108:661-662. [3] Alper T, Cramp WA, Haig DA, Clarke MC. Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid? Nature (1967), 214:764-766. [4] Alper T, Haig DA, Clarke MC. The exceptionally small size of the scrapie agent. Biochem Biophys Res Commun (1966), 22:278-284. [5] Andersen CL, Jensen JL, Orntoft TF. 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Análisis financiero de proyectos de inversión en repoblaciones forestales. ÁLVARO AUNOS GÓMEZ 9. Desarrollo y evaluación del sistema integrado de diagnóstico y recomendación (DRIS) para la fertilización de las praderas permanentes. MARTA RODRÍGUEZ JULIA 10. Estudio de las mieles producidas en la Comunidad Autónoma del País Vasco. MARÍA TERESA SANCHO ORTIZ 11. La biomasa microbiana como agente de las transformaciones de nitrógeno en el suelo tras el enterrado de la paja de cereal. JESÚS ÁNGEL OCIO ARMENTIA 12. Análisis jurídico y económico de la implementación de la política agraria comunitaria en la Comunidad Autónoma del País Vasco. BEATRIZ PÉREZ DE LAS HERAS 13. Nemátodos formadores de quistes (Globodera spp.) en patata (Solanum tuberosum L.): caracterización taxonómica, reproducción y actividad de las formas juveniles. AZUCENA SALAZAR BAYONA 14. Ensayo comparativo de tres métodos de tratamiento antihelmítico estratégico en rebaños de ovejas latxas. ANA LUISA GRACIA PÉREZ 15. Estudio sobre una encefalitis vírica similar al Louping-ill en el ganado ovino de la Comunidad Autónoma Vasca. DANIEL FERNÁNDEZ DE LUCO MARTÍNEZ 16. Análisis de caracteres involucrados en la selección y mejora de Lupinus hispanicus Boiss. et Reuter. VERÓNICA ARRIETA PICO 17. Contribución al estudio de fermentaciones artesanales e industriales de Rioja Alavesa. MILAGROS VIÑEGRA GARCÍA 18. Estudio del manejo de la alimentación en los rebaños ovinos de raza Latxa y su influencia sobre los resultados reproductivos y de producción de leche. LUIS Mª. OREGUI LIZARRALDE 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 176 19. El sector pesquero vizcaíno, 1800-1960. Análisis de la interacción de los elementos ambiental, extractivo y comercial en la pesquería. JOSÉ AGUSTÍN MAIZ ALCORTA 20. Epidemiología, diagnóstico y control de la paratuberculosis ovina en la Comunidad Autónoma del País Vasco. J.J. ADURIZ RECALDE 21. Agrupación de poblaciones locales de maíz (Zea mays L.) mediante caracteres morfológicos y parámetros ambientales. JOSÉ IGNACIO RUIZ DE GALARRETA GÓMEZ 22. Estudio del potencial melífero de Bizkaia. AMELIA CERVELLO MARTÍNEZ 23. Influencia de los procesos de salado y ahumado sobre las características fisicoquímicas del queso Idiazabal (compuestos nitrogenados). FRANCISCO C. IBAÑEZ MOYA 24. El Euskal Artzain Txakurra (el perro pastor vasco) descripción y tipificación racial. Mariano GÓMEZ FERNÁNDEZ. 25. Evaluación de diferentes ciclos de selección recurrente en dos poblaciones sintéticas de maíz. GOTZONE GARAY SOLACHI 26. Valoración agronómica de la gallinaza: Compostaje. ADOLFO MENOYO PUELLES 27. Relación clima-vegetación en la Comunidad Autónoma del País Vasco. AMELIA ORTUBAY FUENTES 28. Influencia de los procesos de salado y ahumado tradicional sobre las características microbiológicas y organolépticas del queso Idiazabal. FRANCISO J. PÉREZ ELORTONDO 29. Mastitis en la oveja Latxa: epidemiología, diagnóstico y control. JUAN C. MARCO MELERO 30. Contribución al conocimiento anatomopatológico y diagnóstico de la tuberculosis caprina y ovina por Mycobacterium bovis. Mª MONTSERRAT GUTIÉRREZ CANCELA 31. Estudio de factores que pueden influir en la calidad de la pluma de gallos Eusko-oiloa (Variedad Marradune) para la fabricación de moscas artificiales utilizadas en la pesca de la trucha. ROSA Mª ECHARRI TOMÉ 32. Estudio de la fracción lipídica durante la maduración del queso Idiazabal. Influencia de los procesos tecnológicos del tiempo de permanencia en salmuera y ahumado. ANA ISABEL NÁJERA ORTIGOSA 33. Influencia del tipo de cuajo y adición de cultivo iniciador sobre los compuestos nitrogenados durante la maduración del queso Idiazabal. Mª SOLEDAD VICENTE MARTÍN 34. Estudio de la infección por Borrelia burgdorferi, grupo Ehrlichia phagocytophila y virus de la encefalitis ovina en las poblaciones de ixódidos de la Comunidad Autónoma Vasca. MARTA BARRAL LAHIDALGA 35. Lipolisis en el queso Idiazabal: efecto de la época de elaboración, del cultivo iniciador, de la pasteurización y del tipo de cuajo. FELISA CHAVARRI DÍAZ DE CERIO 36. Aspectos inmunopalógicos de la paratuberculosis de los pequeños rumiantes. Respuesta inmune asociada a la vacunación. JUAN MANUEL CORPA ARENAS 37. Desarrollo y evaluación de nuevas técnicas de diagnóstico del Maedi-Visna. ANA BELÉN EXTRAMIANA ALONSO 38. Estudios sobre Patogenia y Diagnóstico de la Adenomatosis Pulmonar Ovina. MARÍA MERCEDES GARCÍA GOTI 39. Análisis de los factores de explotación que afectan a la producción lechera en los rebaños de raza Latxa de la CAPV. ROBERTO J. RUIZ SANTOS 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 177 40. Crecimiento y producción de repoblaciones de Pinus radiata D. Don en el Territorio Histórico de Gipuzkoa (País Vasco). LUIS MARIO CHAUCHARD BADANO 41. Puesta a punto de técnicas PCR en heces y de Elisa para el diagnóstico de la Paratuberculosis. Estudio de prevalencia en ganado bovino. JOSEBA M. GARRIDO URKULLU 42. Epidemiología y diagnóstico de la leptospirosis y la neosporosis en explotaciones de bovino lechero de la CAPV. RAQUEL ACHAERANDIO GALDOS 43. Relaciones aire-agua en sustratos de cultivo como base para el control del riego. Metodología de laboratorio y modelización. VALENTÍN TERÉS TERÉS 44. Zonas endémicas de enfermedad de Lyme en la CAPV: estudio del papel de los micromamíferos en el mantenimiento de Borrelia burgdorferi sensu lato en el medio natural. HORACIO GIL GIL 45. Optimización del esquema de mejora de la raza Latxa: análisis del modelo de valoración e introducción de nuevos caractéres en el objetivo de selección. ANDRÉS LEGARZA ALBIZU 46. Influencia de las condiciones de almacenamiento, reimplantación y lluvia ácida en la viabilidad de Pinus radiata D. Don. MIREN AMAIA MENA PETITE 47. Estudio sobre encefalopatías en peces: patogenicidad del nodavirus causante de la enfermedad y retinopatía vírica (ERV) y transmisión experimental del prión scrapie a peces. RAQUEL ARANGUREN RUIZ 48. Enfermedades transmitidas por semilla en judía-grano (Phaseolus vulgaris L.): detección, control sanitario y mejora genética. ANA MARÍA DÍEZ NAVAJAS 49. Pastoreo del ganado vacuno en zonas de montaña y su integración en los sistemas de producción de la CAPV. NEREA MANDALUNIZ ASTIGARRAGA 50. Aspectos básicos de la mejora genética de patata (Solanum tuberosum L.) a nivel diploide. LEIRE BARANDALLA URTIAGA 51. El cuajo de cordero en pasta: preparación y efecto en los procesos proteolíticos y lipolíticos de la maduración del queso de Idiazabal. Mª. ÁNGELES BUSTAMANTE GALLEGO 52. Dinámica de la población de atún blanco (Thunnus alalunga Bonnaterre 1788) del Atlántico Norte. Josu Santiago Burrutxaga 53. El pino radiata (Pinus radiata D.Don) en la historia forestal de la Comunidad Autónoma de euskadi. Análisis de un proceso de forestalismo intensivo. MARIO MICHEL RODRIGUEZ 54. Balance hídrico y mineral del pimiento de Gernika (Capsicum annuum L., “cv Derio”) en cultivo hidropónico. Relaciones con la producción. HUGO MACÍA OLIVER 55. Desarrollo de Métodos Moleculares y su Aplicación al Estudio de la Resistencia Genética y Patogenia Molecular del Scrapie. DAVID GARCÍA CRESPO 02 TESIS 55 2/3/06 09:56 Página 178
