procedimiento de fabricacion de nanocapsulas con pared a base de

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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kInt. Cl. : B01J 13/04
11 Número de publicación:
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ESPAÑA
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2 108 272
A61K 9/51
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 93909334.0
kFecha de presentación : 27.10.92
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 611 326
kFecha de publicación de la solicitud: 24.08.94
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54 Tı́tulo: Procedimiento de fabricación de nanocápsulas con pared a base de proteı́nas reticuladas;
nanocápsulas ası́ obtenidas y composiciones cosméticas farmacéuticas y alimentarias que
comprenden la aplicación.
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73 Titular/es: Coletica
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72 Inventor/es: Perrier, Eric y
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74 Agente: Ungrı́a López, Javier
30 Prioridad: 31.10.91 FR 91 13522
32, Rue Saint Jean de Dieu
69007 Lyon, FR
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.12.97
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 108 272 T3
16.12.97
Aviso:
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k
Huc, Alain
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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCION
La presente invención se refiere esencialmente
a un procedimiento de fabricación de nanocápsulas con pared a base de proteı́na reticulada ası́
como a las nanocápsulas ası́ obtenidas y a las composiciones cosméticas, farmacéuticas o alimentarias que las contienen.
Se sabe que la encapsulación de substancias
activas es muy importante con miras bien sea de
proteger el principio activo, o de permitir una liberación lenta o diferida del principio activo en el
organismo.
Se ha propuesto encapsular los principios activos en liposomas, constituyendo los liposomas
una forma galénica entusiasmante vista su muy
buena afinidad con las membranas celulares, su
muy buena biocompatibilidad y su tamaño submicrónico.
Sin embargo, estas estructuras presentan numerosas limitaciones, incluso inconvenientes importantes que pueden resumirse en los cuatro
puntos siguientes:
- un mal rendimiento de encapsulación: los
liposomas pueden contener o transportar
diferentes tipos de moléculas: hidrófilos,
lipófilos y anfifilos. Sin embargo, los rendimientos de encapsulación son muy bajos
en todos los casos, lo cual, unido al problema de la difusión de los principios activos, disminuye también la eficacia de los
liposomas y no permite, en muchos de los
casos, considerar su utilización en aplicaciones terapéuticas.
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- una mala reproductibilidad de los preparados liposomales cuando hay que realizar
producciones industriales.
- Una inestabilidad in vitro: la misma puede
manifestarse de diferentes modos: inestabilidad quı́mica de los lı́pidos, inestabilidad
del tamaño de los liposomas, inestabilidad
de su estructura, formación de agregados,
suelta de los agentes activos encapsulados,
etc...
- Una inestabilidad in vivo: la influencia de
los lı́quidos biológicos sobre los liposomas
aumenta muy a menudo las permeabilidades membranares de estos. Según la vı́a de
administración utilizada, los liposomas pueden estar en contacto con lı́quidos biológicos
tan diversos como la sangre, los jugos digestivos, los lı́quidos intersticiales...y deben por consiguiente ser capaces de resistir a numerosas interacciones. Ahora bien,
el contacto con la mayorı́a de los lı́quidos
biológicos conduce a un aumento claro de
la permeabilidad membranar de los liposomas. Por fusión imperfecta con las células,
o por contacto con sales, enzimas, lipasas,
fosfolipasas, acil-transferasas - constituyentes plasmáticos, sales biliares, jugos digestivos, o por simples variaciones de pH, los
liposomas pueden soltar de forma casi instantánea sus agentes activos en el medio
circundante.
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Se ha propuesto igualmente encapsular los
principios activos en partı́culas o cápsulas de dimensión del orden de unas micras. Por ejemplo, el
solicitante ha propuesto en el documento FR-A2.642.329 la preparación de microcápsulas con paredes mixtas de atelocolágenos y de glicosaminoglicanos para la encapsulación de principio activo.
Este método es completamente satisfactorio pero
no permite preparar cápsulas con una dimensión
subcrómica, es decir cápsulas que tengan una dimensión nanométrica, llamada nanopartı́cula.
Se ha propuesto por otro lado particularmente
por Couvreur y col. en Febs Letters (1977), 84,
323-326 nanocápsulas con pared de poliacrilamida
y por los mismos autores en J. Pharm. Pharmacol. (1979), 31, 331-332 nanocápsulas con pared
de polimetilo y polietilo cianoacrilato. De igual
modo, se ha propuesto en EP-A-0274.961 preparar nanocápsulas que forman sistemas coloidales
a base de un copolı́mero de cloruro de vinilo y
acetato de vinilo, poliisobutilcianoacrilato, ácido
poli (d,l) láctico; por policondensación BEESTMAN y col. han propuesto en US-A-4.640.709
la preparación de esferas de pequeño tamaño cuyas membranas están constituidas por un material polimérico como la poliurea, la poliamida, la
polisulfonamida, el poliester, el policarbonato y
el poliuretano.
Resulta igualmente conocido por el documento Journal of Controlled Release 14 (1990),
111-131, un procedimiento de fabricación de nanocápsulas de albúmina que comprenden la formación de una nanoemulsión y la reticulación
térmica de esta a una temperatura comprendida
entre 80-160◦C, ası́ como un procedimiento modificado que comprende una reticulación quı́mica
de la 2,3-butanodiona.
También es conocido por el documento AU84714/75 nanopartı́culas que comprenden una
matriz reticulada de macromoléculas de origen
natural, en particular proteı́nas, ası́ como su procedimiento de fabricación.
Sin embargo, el método de fabricación descrito
prevé la disolución en un disolvente de la macromolécula que se trata seguidamente con un agente
disolvente en unas condiciones de formación de
partı́culas y luego el tratamiento de las partı́culas
con un agente reticulante (hardening agent), ver
páginas 4 y 7. Los agentes reticulantes se precisan en la página 10, último párrafo, y están
constituidos por aldehidos que conducen a la formación de enlaces inestables de tipo iminas, mientras que en el caso de la presente invención la reticulación tiene lugar con un dicloruro de ácido o
un anhı́drido de ácido.
Sin embargo, aunque con estos últimos documentos se obtienen cápsulas de tamaño nanométrico, un problema principal reside en el hecho de que estas partı́culas tienen generalmente
una mala biocompatibilidad, una mala biodegradación in vitro e in vivo, que puede conducir
en el almacenado a una fuerte concentración de
partı́culas en algunos órganos, a una toxicidad de
algunos monómeros o de algunos subproductos de
polimerización o de algunos subproductos de degradación y a una mala protección de los principios activos cuando solo son absorbidos en la
superficie de las nanopartı́culas que proporcionan
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ası́ un efecto retardo insuficiente.
Ası́, la presente invención tiene por objeto
resolver el nuevo problema técnico que consiste en proporcionar una solución que permita
la fabricación de partı́culas de dimensión nanométrica, llamadas nanopartı́culas, particularmente en forma de nanocápsulas o de nanoesferas
que presentan una buena biocompatibilidad, una
buena biodegradación in vivo, una ausencia de toxicidad o una toxicidad muy débil, ası́ como una
protección muy buena de los principios activos y
un efecto retardo significativo.
La presente invención tiene también por objeto resolver el nuevo problema técnico enunciado
anteriormente de una manera sencilla, poco costosa, utilizable a escala industrial.
La presente invención permite por primera
vez resolver estos problemas técnicos de una manera sencilla, poco costosa, fiable, utilizable a escala industrial y en el ámbito de la cosmética,
de la farmacia, o del agroalimentario, obteniendo
partı́culas o cápsulas de dimensión submicrónica,
por consiguiente de tamaño inferior a 1 µm, y
particularmente comprendida entre 100 y 800 nanometros aproximadamente.
Ası́, según un primer aspecto, la presente invención proporciona partı́culas o cápsulas de dimensión inferior a un micrometro, llamadas nanopartı́culas o nanocápsulas, con pared de proteı́nas
reticuladas, caracterizadas porque se obtienen por
una reacción de reticulación interfacial entre una
proteı́na y un agente reticulante que comprende al
menos dos grupos acilantes que reaccionan con los
grupos reactivos acilables de la indicada proteı́na,
obteniendo ası́ la indicada nanopartı́cula o nanocápsula con pared a base de proteı́na reticulada.
Otras caracterı́sticas de estas nanopartı́culas
o nanocápsulas se enuncian en las sub-reivindicaciones que se incorporan aquı́ en su totalidad por
referencia.
Según un segundo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de fabricación de partı́culas o de cápsulas de dimensión
inferior a un micrometro, llamadas nanopartı́culas o nanocápsulas, con pared a base de proteı́nas
reticuladas, caracterizada porque comprende la
realización de una nanoemulsión que comprende
una fase acuosa que contiene una proteı́na y una
fase aceitosa que contiene un agente de reticulación interfacial que incluye al menos dos grupos acilantes que reaccionan con los grupos acilables de la indicada proteı́na formando ası́ micropartı́culas o microcápsulas cuya pared es a base
de proteı́nas reticuladas por el indicado agente
reticulante.
Según una variante de realización, se añade un
agente modificador de la viscosidad con el fin de
disminuir la diferencia de viscosidad entre las fases lı́quidas en presencia para obtener la indicada
nanoemulsión.
Otras variantes resultan de las subreivindicaciones de procedimiento y de la descripción siguiente:
Según otra variante de realización, este procedimiento se caracteriza porque el agente modificador de viscosidad es capaz de modificar la
viscosidad de al menos 4 veces y de preferencia
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de al menos 10 veces, con relación a la fase a la
cual el indicado agente se añade.
Según otra variante, este procedimiento se caracteriza porque, en el caso de la formación de una
emulsión de agua-en-aceite, el indicado agente
modificador de viscosidad se añade o substituye
en la fase aceitosa con el fin de aumentar la viscosidad de al menos 4 veces con relación a la viscosidad de la fase aceitosa utilizada clásicamente
(FR-A-2642329).
De acuerdo con otra variante, este procedimiento se caracteriza porque en el caso de
una emulsión de aceite-en-agua, se disminuye la
viscosidad de la fase acuosa bien sea disminuyendo la proporción en proteı́na, o añadiendo un
agente modificador de viscosidad en la fase acuosa
(agente fluidificante de viscosidad) con el fin de
disminuir su viscosidad y de preferencia de al menos 4 veces con relación a la viscosidad de la fase
acuosa utilizada clásicamente (FR-A-2.642.329).
Según otra variante este procedimiento se caracteriza porque se utiliza como proteı́na una proteı́na de efecto filmógeno, de preferencia elegida
entre el grupo que consiste en una proteı́na animal tal como elastina, queratina, seda, albúmina,
proteı́nas de la leche, proteı́nas de estructura tales
como colágeno, particularmente colágeno sin telopéptido o atelocolágeno o un glicosaminoglicano;
una proteı́na vegetal tal como proteı́na de trigo,
de maı́z, de avena, de almendra; y una proteı́na
procedente del medio marino particularmente extraı́da de pescados, de algas o también del placton
o microplacton.
Según otra variante este procedimiento se caracteriza porque la proteı́na anteriormente citada
tiene un peso molecular al menos igual a 50 000
Daltons, siendo esta proteı́na utilizada sola o mezclada.
Según otra variante, este procedimiento se caracteriza porque la proporción de proteı́na en la
solución de emulsión varı́a entre 0,1 y 5% en peso
con relación al peso total de la emulsión.
Según otra variante este procedimiento se caracteriza porque la proteı́na se disuelve primeramente en una solución acuosa tamponada con un
pH ligeramente básico, de preferencia comprendido entre aproximadamente 7,5 y aproximadamente 10,5.
Según otra variante este procedimiento se caracteriza porque el agente modificador de viscosidad anteriormente citado es un aceite viscoso, en
particular seleccionado entre el aceite de vaselina
viscoso, cuya viscosidad es preferentemente de al
menos 80 cp, de preferencia todavı́a de al menos
200 cp; o un agente modificador de viscosidad de
los aceites tales como el estearato de magnesio.
Según otra variante este procedimiento se caracteriza porque, durante la etapa de emulsión, se
utiliza un agente tensioactivo o emulsionante capaz de formar una nanoemulsión, de preferencia
glicerol sorbitan hidroxiisoestearato.
Según otra variante este procedimiento se caracteriza porque la etapa de emulsión se realiza
bajo una agitación con efecto cizallante, de preferencia de al menos 20000 r/min, o con efecto de
cavitación.
Según otra variante este procedimiento se caracteriza porque se realiza una emulsión muy fina
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pasando la emulsión por un homogeneizador bajo
una presión de por lo menos 400 bares, siendo
este homogeneizador preferentemente una prensa
French.
Según otra variante este procedimiento se caracteriza porque la proteı́na anteriormente citada
comprende colágeno.
Según otra variante este procedimiento se caracteriza porque la proteı́na anteriormente citada
comprende atelocolágeno.
Según otra variante este procedimiento se caracteriza porque la proteı́na anteriormente citada
comprende una mezcla de atelocolágeno y de glicosaminoglicano.
Según otra variante este procedimiento se caracteriza porque una de las fases contiene un principio activo cosmético o farmacéutico, o alimentario, hidrosoluble, liposoluble, o insoluble.
De acuerdo todavı́a con otra variante de realización, en el caso de la utilización de una substancia activa hidrosoluble, se utiliza una relación
de emulsificación de aceite/agua próxima a 6.
Según otra variante de realización, para el
caso en que se utilice un principio activo liposoluble, se utiliza una proteı́na con alto o muy alto
peso molecular, es decir de al menos 50 000 Daltons, a una concentración tal que la viscosidad de
la solución obtenida sea baja, es decir inferior a
20 cp (mPa.s).
Por otro lado, en este caso, se prefiere utilizar una relación de emulsificación de agua/aceite
próxima a 20.
Por otro lado, se utiliza en el marco del procedimiento, cualquier agente reticulante bien conocido del experto en la materia, tal como se ha
descrito particularmente en FR-2.642.329.
El agente reticulante descrito en FR - A 2.642.329 es un dicloruro de ácido o un anhı́drido
de ácido o un ácido carboxı́lico di- o poli-básico.
Según una caracterı́stica preferida, el agente
reticulante es elegido entre el cloruro de tereftaloilo, el cloruro de ácido ftálico, el cloruro de
ácido sebácico, el cloruro de ácido succı́nico, el
cloruro de un ácido tricarboxı́lico como el ácido
cı́trico, o un anhı́drido de ácido como el anhı́drido
succı́nico.
Según un tercer aspecto, la presente invención
cubre igualmente una composición cosmética, farmacéutica o alimentaria, caracterizada porque
comprende nanocápsulas con pared a base de
proteı́nas reticuladas tales como las anteriormente definidas, de preferencia obtenidas por el
procedimiento definido. De preferencia, estas nanocápsulas contienen al menos en parte un principio activo, en particular un principio activo
cosmético, farmacéutico o alimentario, hidrosoluble, liposoluble o insoluble.
Otros fines, caracterı́sticas y ventajas de la invención aparecerán claramente a la luz de la descripción explicativa que sigue realizada con referencia a diversos ejemplos de realización de la invención dados simplemente a tı́tulo de ilustración
y que no limitarı́an por consiguiente en modo alguno el alcance de la invención. En los ejemplos,
todos los porcentajes se facilitan en peso salvo
indicación contraria.
Ejemplo 1 según la invención
Preparación de nanocápsulas con pared de proteı́4
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nas a base de una mezcla atelocolágeno/glicosaminoglicanos
a) Fabricación de la mezcla necesaria para la fabricación de las nanocápsulas
Esta mezcla se preparó según un procedimiento descrito en FR-A-2.642.329, ejemplo 1
etapas a) a c).
- A partir de pieles de terneros recién sacrificados, el colágeno fue extraı́do y luego se
eliminaron los telopéptidos para obtener el
atelocolágeno.
- A partir de tabiques nasales de terneros, se
extrajo la condroitina-4-sulfato, se dializó y
luego se liofilizó.
- Los dos preparados precedentes se colocaron ventajosamente en tampón básico tal
como carbonato o fosfonato o cualquier otra
substancia que permita obtener un poder
tampón entre 7,5 y 10,5. Luego las soluciones se mezclaron con el fin de obtener por
ejemplo, las concentraciones finales siguientes:
Atelocolágeno:
1,6%
Condroitina 4-sulfato:
0,6%
Carbonato de sodio anhidro:
4,8%
Parahidroxibenzoato de metilo:
0,4%
Agua permutada:
csp
El pH del conjunto se llevó entre 7,5 y 10,5,
por ejemplo a 8,5, mediante aporte de HCl, 6N o
de NaOH,6N.
Un kilo de esta solución ası́ preparada se utilizó en la siguiente fabricación.
b) Preparación del agente reticulante
400 g de cloruro de tereftaloilo se trituraron
en un mortero y se añadieron a 1 l de vaselina
viscosa CODEX.
El conjunto se agitó mediante agitación mecánica.
c) Emulsificación
En una cuba de acero inoxidable refrigerada,
se introdujeron 6 l de aceite de vaselina viscosa CODEX con ı́ndice de viscosidad de 250 cp
(mPa.s) y de preferencia 320 ml de un agente tensioactivo por ejemplo el glicerol sorbitan hidroxiisoestearato (Arlacel 780, ICI). El conjunto se
agitó durante unos minutos.
La solución de atelocolágeno y de condroitina
sulfato preparada se añadió entonces y la emulsificación se realizó en unos minutos a 20 000 rpm
con la ayuda de un aparato Ultra-TuraxR
d) Reticulación
La solución que contiene el agente reticulante
preparado en la etapa b se introdujo entonces en
la emulsión. Las partı́culas sólidas presentes en
esta se añaden igualmente, y se disolvieron con el
transcurso del tiempo.
Después de 5 min de agitación a 20 000 rpm
en el aparato Ultra-TuraxR , la solución se puso
bajo agitación mecánica a velocidad de rotación
reducida, durante 18 h al menos.
Las nanocápsulas se separaron por centrifugación en discontinuo y el sobrenadante se eliminó
(4000 rpm durante 15 min).
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e) Lavados
Las nanocápsulas se lavaron mediante cinco
soluciones sucesivas de una fase orgánica miscible
con el aceite de vaselina. Citemos por ejemplo
el DRAGOXATR (DRAGOCO), el MYRISTATE
D’ISOPROPYLE (STEARINIERIE DUBOIS),
los triglicéridos (STEARINERIE DUBOIS), etc.
En el transcurso de cada lavado, se añadieron
100 ml de nanocápsulas a 500 ml de fase orgánica.
El conjunto se agitó durante unos minutos luego
se centrifugó (4000 rpm durante 15 minutos).
Las nanocápsulas obtenidas pueden ponerse
en suspensión por ejemplo en geles de proteı́na o
de polisacárido, o en una fase aceitosa.
Ejemplo 2 de la invención
Preparación de nanocápsulas que contienen un
principio activo hidrosoluble o insoluble
Se procede como se ha descrito en el ejemplo 1 solo que a la solución fabricada en a) se
pueden añadir numerosos principios activos, como
por ejemplo:
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Ej 2A: 64 g de GLYCENTANER (Bioética)
Ej 2B: 64 g de GINKGO BILOBA (Alban
Muller Int.)
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b) se añadieron a 25 ml de aceite de borraja,
5 ml de dicloruro de sebacoilo y se mezcló
el conjunto mediante agitación mecánica.
Ej 2E: 32 g de CAFEINE (SIGMA)
Ejemplo de la invención
Preparación de nanocápsulas con pared de proteı́nas a base de atelocolágeno
Se procedió como se ha descrito en el ejemplo
1. Sin embargo, se utilizó como única proteı́na
macromolecular, el atelocolágeno a una concentración del 2%.
Ejemplo 4 de la invención
Nanocápsulas a la elastina
Se procedió como se ha descrito en el ejemplo
1 solo que se utilizó como proteı́na la elastina.
Se puede igualmente elegir una proteı́na entre las proteı́nas animales tales como la elastina,
la queratina, la seda, la albúmina, las proteı́nas
de la leche, las proteı́nas vegetales tales como
proteı́nas de trigo, de maı́z, de avena, de almendra o las proteı́nas procedentes del medio marino
tales como colágeno u otras proteı́nas extraı́das
de pescados, proteı́nas de algas, microplacton.
Ejemplo 5 de la invención
Todos los ejemplos descritos anteriormente
pueden ser modificados utilizando otros métodos
de emulsificación.
Ası́, en el ejemplo 1 en particular, la etapa
de emulsificación c) se modifica y después de un
ligero removido por agitación mecánica, el conjunto se pasa una o varias veces a un homogeneizador de alta presión.
Las presiones utilizadas pueden situarse entre
400 y 1000 bares pero se sitúan preferentemente
alrededor de 700 bares. Los homogeneizadores
de simple y doble efecto pueden ser utilizados indistintamente pero los simples se preferirán para
proteı́nas muy filmógenas.
Los ejemplos de homogeneizadores de alta
presión que han sido utilizados son el Lab 60
(APV), el SHL 05 (ALPHA-LAVAL), o SODEXIM 2720 o 2735 (SODEXIM). Después de un
tratamiento de homogeneización a 700 bares por
ejemplo, se obtienen nanocápsulas con una dimensión inferior a 1 µm, comprendida entre 200
y 800 nanometros.
De igual modo, otros aparatos que utilizan
otros principios, pueden igualmente permitir la
obtención de fuerzas de cavitación elevadas. Con
la ayuda de estas, resulta entonces posible obtener nanoemulsiones (ejemplos: SONICATEURR
BRADSON, SONOLATORR de SONIC Corp.).
Ejemplo 6 de la invención
En la etapa de emulsificación del ejemplo 1,
se utilizó un agente viscosante de los aceites para
aumentar la viscosidad de la solución de emulsificación por ejemplo el estearato de magnesio a
una proporción del 2% en peso. Se obtienen nanocápsulas de dimensión comprendida entre los
200 y 800 nanometros.
Ejemplo 7
Preparación de nanocápsulas que contienen agentes activos liposolubles
a) A 250 ml de la solución descrita en el
ejemplo 1 en a), se añadieron 750 ml de agua
desmineralizada.
Ej 2C: 32 g de GLUCOSE (MERCK)
Ej 2D: 32 g de un ácido aminado tal como
la L-Glutamina
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c) Las soluciones a) y b) se adicionaron en
continuo y se enviaron a un homogeneizador
de alta presión del tipo Lab 60 (APV). Las
presiones de homogeneización utilizadas se
encuentran comprendidas entre 300 y 1000
bares, por ejemplo 800 bares, y se realizaron varias homogeneizaciones sucesivas, con
válvulas de simple y doble efecto. Las esferas obtenidas son de tamaño inferior a un
micrón, son notablemente estables y visto
su escaso tamaño no se decantan en un medio diluido de almacenado.
Ejemplo 8
Otros agentes activos liposolubles
En el ejemplo 7, los 25 ml de aceite de borraja
pueden ser substituidos por:
Ej 8a: 25 ml de miristato de etilo
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Ej 8b: 25 ml de miristato de isopropilo
Ej 8c: 25 ml de aceite de vaselina fluida
Ej 8d: 25 ml de oleato de etilo
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Ej 8e: 25 ml de acetato de vitamina E
Ej 8f: 25 ml de benzoato de bencilo.
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Ejemplo 9
Ensayo de objetivación
La liberación in vivo de una substancia encapsulada en nanocápsulas según la invención con
relación a las microcápsulas.
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Los resultados de los ensayos de objetivación
más convincentes proporcionados por las nanocápsulas sin desde luego los relacionados con una
modificación de la distribución espacio-temporal
de la substancia activa. Esta modificación puede
estar unida al tamaño de las partı́culas que se
encuentran entonces especı́ficamente transportadas en algunas partes del organismo (sistema
reticulo-endotelial, tejidos hepáticos), pero la
misma puede estar igualmente unida al papel de
depósito de agentes activos que pueden jugar las
nanocápsulas. En este último caso, una liberación
temporizada del agente activo puede permitir alcanzar una fuerte biodisponibilidad del principio
activo, una asimilación más intensa, ası́ como una
eliminación mucho más progresiva de los desechos
procedentes de la metabolización del principio activo.
El estudio comparativo descrito a continuación ha permitido a los inventores evaluar la presencia y la intensidad del efecto retardo, obtenido
con cápsulas de tamaño micrométrico y con cápsulas de tamaño nanométrico según la invención.
a) Materiales y métodos
La piel dorsal de ratas (WISTAR macho, de
aproximadamente 300 g), se trató con la ayuda
de una emulsión de agua en aceite, siendo la fase
aceitosa el aceite de vaselina viscosa codex con
ı́ndice de viscosidad de aproximadamente 250 cm
(mPa.s) (TISCCO) y siendo la fase acuosa representada por una u otra de las soluciones dadas a
continuación:
- una mezcla de colágeno/glicosaminoglicano (en abreviatura Coll/GAG) que incluye ácido para-aminobenzóico radioactivo
(PABA∗ )
- microcápsulas de tipo A que incluye PABA∗
(tamaño medio 50 µm) tales como se han
preparado según el método descrito en el
ejemplo 1 de la patente FR-A-2.642.329
- nanocápsulas que incluyen PABA∗ (tamaño
comprendido entre 100 y 800 nm) preparadas según el método del ejemplo 1 indicado
anteriormente,
Después de la aplicación sobre una superficie
constante, del producto que se ha de someter a
ensayo, la liberación del ácido ha sido seguida
por medición de la radioactividad contenida en
la orina recogida diariamente para cada animal.
Para cada una de las tres soluciones descritas anteriormente, se trataron dos ratas mediante
0,3 g de emulsión, teniendo una radioactividad especı́fica próxima a 3.106 cpm/g en el caso de la solución de colágeno/GAG y de las microcápsulas,
y próxima a 6.105 cpm/g en el caso de las nanopartı́culas de la invención.
b) Resultados
Después de la aplicación del compuesto radioactivo, encapsulado o no encapsulado, la radioactividad se midió cada dı́a en la orina de las
ratas. Las curvas muestran la evolución de esta
radioactividad en función del tiempo (en dı́as)
están representadas en la figura 1.
Los valores relacionados con este gráfico representan la radioactividad medida en las orinas,
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dividida por la radioactividad total recuperada en
las orinas y en la piel. Esta radioactividad total
recuperada se contabilizó después de los 17 dı́as
de mediciones y después del sacrificio de los animales.
Este gráfico describe el efecto retardo observado con las microcápsulas y las nanocápsulas en
la liberación del PABA∗ . La fuerte liberación
de los primeros dı́as, observada con la solución
de colágeno/GAG es menos intensa con las microcápsulas y muy baja con las nanocápsulas. El
PABA∗ se elimina mucho más lentamente cuando
se encapsula en las microcápsulas y aún menos rápidamente cuando se encapsula en las nanocápsulas.
17 dı́as después del tratamiento, las ratas se
sacrificaron, la piel que ha recibido la aplicación
se hidroliza, luego se midió la radioactividad. Los
resultados obtenidos han sido indicados en la figura 2 y muestran que la radioactividad contenida en los tejidos cutáneos es baja (próxima al
4%) cuando el PABA∗ no ha sido encapsulado,
mucho más fuerte (próximo al 10%) cuando las
microcápsulas han sido utilizadas, y aún más intensa (>20%) cuando las nanocápsulas han encapsulado la substancia radioactiva.
Esta diferencia muy clara ha sido confirmada
en otra prueba que se ha realizado donde ratas
rapadas macho de 300 g han sido utilizadas en el
mismo tipo de prueba.
c) Conclusiones
- La velocidad de eliminación de la radioactividad encontrada en las orinas al estar
directamente relacionada con la velocidad
de absorción cutánea, cualquier retardo en
la eliminación puede ser considerado como
debido al efecto retardo de las esferas que
encapsulan el elemento radioactivo. Este
efecto retardo observado in vivo sobre la
rata es muy claro con microcápsulas de
50 µm pero es aún más intenso con nanocápsulas (cuyo tamaño varı́a entre los 800
nm y los 100 nm).
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- La radioactividad medida a nivel del tejido cutáneo, después de la aplicación de
un elemento radioactivo, encapsulado o no,
es una medición de la biodisponibilidad de
este elemento, es decir de su capacidad para
ser integrado en el metabolismo cutáneo.
Después de la aplicación de una cantidad
demasiado fuerte de PABA∗ , la eliminación
es muy rápida, pudiendo solo aceptar los
tejidos cutáneos una fracción alicuota del
producto aplicado.
Cuando se utilizan las microcápsulas o nanocápsulas, existe una liberación temporizada de
PABA∗ que puede entonces metabolizarse además de las grandes cantidades en los tejidos cutáneos.
Es lo que se observa con las nanocápsulas de
la invención y en una menor medida con las microcápsulas.
Si el tamaño de las cápsulas es suficientemente
pequeño para que no se produzca estallido durante la aplicación (diámetro inferior a 100 µm),
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resulta por consiguiente posible obtener gracias a
las nanocápsulas una mejora de la biodisponibilidad de los agentes activos cosméticos.
La presente invención cubre todos los medios
que constituyen equivalentes técnicos de los me-
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dios descritos. En particular, en la descripción
y las reivindicaciones, la palabra “nanocápsula”
no se limita a cápsulas propiamente dichas sino
que cubren esferas o partı́culas cuya dimensión es
nanométrica.
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REIVINDICACIONES
1. Partı́cula o cápsula de dimensión inferior a
1 µm, llamada nanopartı́cula o nanocápsula, con
pared de proteı́na reticulada, caracterizada porque se obtiene por una reacción de reticulación
interfacial entre una proteı́na y una agente reticulante que comprende al menos dos grupos acilantes que reaccionan con los grupos reactivos acilables de la indicada proteı́na, obteniendo ası́ la
indicada nanopartı́cula o nanocápsula con pared
a base de proteı́na reticulada.
2. Nanopartı́cula o nanocápsula según la reivindicación 1, caracterizada porque la proteı́na
anteriormente citada tiene un peso molecular
al menos igual a 50 000 Daltons, siendo esta
proteı́na utilizada sola o en mezcla.
3. Nanopartı́cula o nanocápsula según la
reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque la
proteı́na anteriormente citada es elegida entre
el grupo que consiste en una proteı́na animal
tal como la elastina, la queratina, la seda, la
albúmina, la proteı́na de la leche, proteı́na de estructura tal como el colágeno, particularmente
colágeno sin telopéptido o atelocolágeno; una
proteı́na vegetal tal como la proteı́na de trigo,
de maı́z, de avena, de almendra; y una proteı́na
procedente del medio marino particularmente de
pescado o de alga o incluso del placton o microplacton.
4. Nanopartı́cula o nanocápsula según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la proteı́na anteriormente citada comprende colágeno,
atelocolágeno o una mezcla de atelocolágeno y de
glicosaminoglicano.
5. Nanopartı́cula o nanocápsula según una
de las reivindicaciones anteriores, caracterizada
porque contiene un principio activo cosmético,
farmacéutico o alimentario, hidrosoluble, liposoluble o insoluble.
6. Nanopartı́cula o nanocápsula según la
reivindicación 4 o 5, caracterizada porque el
glicosaminoglicano anteriormente citado es el
condroitina-4-sulfato.
7. Nanopartı́cula o nanocápsula según una
de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el agente reticulante que comprende al menos
dos grupos acilantes capaces de reaccionar con los
grupos acilables de la proteı́na es elegido entre el
grupo que consiste en un dicloruro de ácido, en
particular el cloruro de tereftaloilo, el cloruro de
ácido ftálico, el cloruro de ácido sebácico, el cloruro de ácido succı́nico, el cloruro de un ácido tricarboxı́lico como el ácido cı́trico, o un anhidrido
de ácido tal como el anhı́drido succı́nico.
8. Composición cosmética, farmacéutica o alimentaria, caracterizada porque comprende una
nanopartı́cula o una nanocápsula tal como la definida en una cualquiera de las reivindicaciones
anteriores.
9. Procedimiento de fabricación de partı́culas
o de cápsulas de dimensión inferior a 1 µm llamadas nanopartı́culas o nanocápsulas, de pared
a base de proteı́na reticulada, caracterizado
porque comprende la realización de una nanoemulsión que comprende una fase acuosa que contiene una proteı́na y una fase aceitosa que contiene un agente de reticulación interfacial que
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comprende al menos dos grupos acilantes que
reaccionan con los grupos acilables de la indicada
proteı́na formando ası́ las micropartı́culas o microcápsulas cuya pared es a base de proteı́na reticulada por el indicado agente reticulante.
10. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado porque se añade un agente modificador de viscosidad en una de las dos fases con
el fin de disminuir la diferencia de viscosidad entre las fases lı́quidas en presencia para obtener la
indicada nanoemulsión.
11. Procedimiento según la reivindicación 8
o 9, caracterizado porque se realiza la nanoemulsión pasando una emulsión de la fase acuosa
y de la fase aceitosa por un homogeneizador a una
presión de por lo menos 400 bares.
12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque se realiza
la nanoemulsión bajo una agitación con efecto cizallante, de preferencia al menos 20000 r/min, o
con efecto de cavitación.
13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque la proteı́na anteriormente citada tiene un peso molecular al menos igual a 50 000 Daltons, siendo esta
proteı́na utilizada sola o en mezcla.
14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque el agente
modificador de viscosidad es capaz de modificar
la viscosidad de al menos 4 veces y de preferencia
de al menos 10 veces, con relación a la fase a la
cual se ha añadido el mencionado agente.
15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 14, caracterizado porque en el
caso de la formación de una emulsión de agua-enaceite, el indicado agente modificador de viscosidad es añadido a o constituye la fase aceitosa con
el fin de aumentar la viscosidad de al menos 4 veces con relación a la viscosidad de la fase aceitosa
utilizada clásicamente.
16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 14, caracterizado porque en el caso
de una emulsión de aceite-en-agua, se disminuye
la viscosidad de la fase acuosa bien sea disminuyendo la proporción en proteı́na, o por el aporte
de un agente modificador de viscosidad con el fin
de disminuir su viscosidad, preferentemente en al
menos 4 veces, con relación a la viscosidad de la
fase acuosa utilizada habitualmente.
17. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 16, caracterizado porque se utiliza
como proteı́na una proteı́na con efecto filmógeno,
de preferencia elegida entre el grupo que consiste en una proteı́na animal tal como la elastina,
la queratina, la seda, la albúmina, las proteı́nas
de leche, las proteı́nas de estructura tal como
el colágeno, particularmente el colágeno sin telopéptido o atelocolágeno o un glucosaminoglicano; una proteı́na vegetal tal como la proteı́na
de trigo, de maı́z, de avena, de almendra; y una
proteı́na procedente del medio marino particularmente de pescados o de algas o incluso del placton
o microplacton.
18. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 17, caracterizado porque la proporción de proteı́na en la solución de emulsión
varı́a entre 0,1 y 5% en peso con relación al peso
total de la emulsión.
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19. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 18, caracterizado porque el agente
modificador de viscosidad anteriormente citado es
un aceite viscoso, en particular seleccionado entre el aceite de vaselina viscosa, cuya viscosidad es
preferentemente de al menos 80 cp, de preferencia
aún de al menos 200 cp; o un agente modificador
de viscosidad de los aceites tal como el estearato
de magnesio.
20. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 19, caracterizado porque, durante
la etapa de emulsión, se utiliza un agente tensioactivo o emulsionante capaz de formar una nanoemulsión, de preferencia glicerol sorbitan hidroxiisoestearato.
21. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 20, caracterizado porque la proteı́na anteriormente citada comprende colágeno,
atelocolágeno, una mezcla de atelocolágeno y glicosaminoglicano.
22. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 21, caracterizado porque una de las
fases contiene un principio activo cosmético, far-
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macéutico o alimentario, hidrosoluble, liposoluble
o insoluble.
23. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 22, caracterizado porque cuando
el principio activo es hidrosoluble, se utiliza una
relación de emulsión aceite/agua próxima a 6.
24. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 23, caracterizado porque cuando
el principio activo es liposoluble, se utiliza una
relación de emulsión de agua/ aceite próxima a
20.
25. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 24, caracterizado porque, cuando
el principio activo es liposoluble, se utiliza una
proteı́na de alto peso molecular al menos igual a
50 000 Daltons, la concentración de la proteı́na es
tal que la viscosidad de la solución acuosa obtenida sea inferior a 20 cp (m.Pa.s).
26. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 25, caracterizado porque el agente
reticulante es tal como el definido en la reivindicación 7.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva
del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD
2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación
del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del
7-10-1992, no producirán ningún efecto en España
en la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como tales.
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Esta información no prejuzga que la patente esté o
no incluı́da en la mencionada reserva.
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