elaboración de un atlas para la descripción macroscópica y
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ELABORACIÓN DE UN ATLAS PARA LA DESCRIPCIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA DE HONGOS FITOPATÓGENOS DE INTERÉS EN ESPECIES DE FLORES DE CORTE CULTIVADAS EN LA SABANA DE BOGOTÁ JULIE KATHERINE ARIAS TAUTA ANDREA DEL PILAR JEREZ RAMIREZ TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar el titulo de Microbiólogas Industriales PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C Noviembre 2008 NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”. ELABORACIÓN DE UN ATLAS PARA LA DESCRIPCIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA DE HONGOS FITOPATÓGENOS DE INTERÉS EN ESPECIES DE FLORES DE CORTE CULTIVADAS EN LA SABANA DE BOGOTÁ JULIE KATHERINE ARIAS TAUTA ANDREA DEL PILAR JEREZ RAMIREZ APROBADO DAVID GÓMEZ MICROBIÓLOGO DIRECTOR ZULMA ARGUELLES BACTERIOLOGA JURADO HUMBERTO IBARRA MICROBIÓLOGO CODIRECTOR OLGA MONTAÑEZ MICROBIOLOGA INDUSTRIAL JURADO ELABORACIÓN DE UN ATLAS PARA LA DESCRIPCIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA DE HONGOS FITOPATÓGENOS DE INTERÉS EN ESPECIES DE FLORES DE CORTE CULTIVADAS EN LA SABANA DE BOGOTÁ JULIE KATHERINE ARIAS TAUTA ANDREA DEL PILAR JEREZ RAMIREZ APROBADO Dra. INGRID SHULER BIOLOGA DECANA ACADÉMICA Dra. JANETH ARIAS BACTERIOLOGA DIRECTORA DE CARRERA DEDICAMOS ESTE TRABAJO A DIOS POR SU GRACIA Y PROTECCIÓN A NUESTROS PADRES, AMIGOS Y FAMILIARES POR SU APOYO, PACIENCIA, AYUDA Y CONFIANZA AGRADECIMIENTOS A: La Corporación MICROS y a Humberto Ibarra por la capacitación que nos brindaron acerca de microscopia y por permitirnos emplear los equipos necesarios en nuestra etapa práctica. Las fincas asociadas a la empresa Americaflor Ltda. distribuidas en la Sabana de Bogotá, que nos permitieron la toma de muestras de plantas infectadas, e igualmente a los grupos MIPE de cada de unas de estas fincas. Todos los empleados del Laboratorio de sanidad vegetal de Americaflor y a Zulma Arguelles por el apoyo y facilitación de materiales para llevar a cabo el procesamiento de las muestras, y por su incondicional colaboración para facilitar la realización de nuestro trabajo. David Gómez y Humberto Ibarra por su apoyo, experiencia y conocimiento sobre el tema. Por ser guías y acompañarnos en nuestro proceso de aprendizaje. TABLA DE CONTENIDO RESUMEN ABSTRACT 1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 3 2. MARCO TEÓRICO ............................................................................................................. 4 2.1 SECTOR FLORICULTOR EN COLOMBIA.................................................................... 4 2.1.1 Antecedentes ........................................................................................................... 4 2.1.2 Flor de corte ........................................................................................................... 5 2.1.2.1 Alstroemeria ................................................................................................... 6 2.1.2.1.1 Enfermedades ........................................................................................ 6 2.1.2.2 Anigozanthus ................................................................................................. 7 2.1.2.2.1 Enfermedades ........................................................................................ 7 2.1.2.3 Antirrhinum majus ......................................................................................... 8 2.1.2.3.1 2.1.2.4 Clavel ............................................................................................................ 9 2.1.2.4.1 2.1.2.5 Enfermedades ..................................................................................... 17 Kales ........................................................................................................... 18 2.1.2.9.1 2.1.2.10 Enfermedades ..................................................................................... 15 Gypsophila .................................................................................................. 17 2.1.2.8.1 2.1.2.9 Enfermedades ..................................................................................... 13 Girasol ......................................................................................................... 15 2.1.2.7.1 2.1.2.8 Enfermedades ..................................................................................... 11 Gerbera ....................................................................................................... 13 2.1.2.6.1 2.1.2.7 Enfermedades ....................................................................................... 9 Delphinium .................................................................................................. 11 2.1.2.5.1 2.1.2.6 Enfermedades ....................................................................................... 8 Enfermedades ..................................................................................... 18 Molucellas ................................................................................................. 18 2.1.2.10.1 Enfermedades ..................................................................................... 18 2.1.2.11 Rosa .......................................................................................................... 19 2.1.2.11.1 2.1.2.12 Solidago .................................................................................................... 20 2.1.2.12.1 2.1.2.13 Enfermedades ................................................................................... 19 Enfermedades ................................................................................... 21 Statice ....................................................................................................... 21 2.1.2.13.1 Enfermedades ................................................................................... 21 2.1.2.14 Stock ......................................................................................................... 22 2.1.2.14.1 Enfermedades .................................................................................... 22 2.2 HONGOS FITOPATOGENOS ..................................................................................... 23 2.2.1 Hongos patógenos vasculares .............................................................................. 23 2.2.2 Hongos causantes de la pudrición de la base del tallo y raíces ........................... 24 2.2.3 Hongos causantes de enfermedades foliares ....................................................... 24 2.2.4 Hongos causantes de enfermedades en flores ..................................................... 24 2.2.5 Fitopatógenos asociados a flor de corte ................................................................ 25 2.2.5.1 Alternaria sp. ................................................................................................. 25 2.2.5.1.1 Taxonomía ............................................................................................. 25 2.2.5.1.2 Características macroscópicas y microscópicas ................................... 26 2.2.5.1.3 Síntomas ................................................................................................ 26 2.2.5.2 Botrytis sp ...................................................................................................... 26 2.2.5.2.1 Taxonomía ............................................................................................. 27 2.2.5.2.2 Características macroscópicas y microscópicas .................................... 27 2.2.5.2.3 Epidemiología y síntomas ...................................................................... 28 2.2.5.3 Cercospora..................................................................................................... 29 2.2.5.3.1 Taxonomía ............................................................................................. 29 2.2.5.3.2 Características macroscópicas y microscópicas ................................... 29 2.2.5.3.3 Patogénesis y Síntomas ........................................................................ 30 2.2.5.4 Fusarium sp ................................................................................................... 30 2.2.5.4.1 Taxonomía ............................................................................................. 31 2.2.5.4.2 Características macroscópicas y microscópicas ................................... 31 2.2.5.4.3 Patogénesis y síntomas ........................................................................ 32 2.2.5.5 Heterosporium sp. ......................................................................................... 33 2.2.5.5.1 Taxonomía .............................................................................................. 33 2.2.5.5.2 Características macroscópicas y microscópicas ................................... 33 2.2.5.5.3 Patogénesis y síntomas ........................................................................ 34 2.2.5.6 Itersonilia sp .................................................................................................. 34 2.2.5.6.1 Taxonomía .............................................................................................. 35 2.2.5.6.2 Características macroscópicas y microscópicas ................................... 35 2.2.5.6.3 Patogénesis y síntomas ......................................................................... 35 2.2.5.7 Peronospora sp ............................................................................................. 35 2.2.5.7.1 Taxonomía ............................................................................................. 36 2.2.5.7.2 Características macroscópicas y microscópicas ................................... 36 2.2.5.7.3 Patogénesis y Síntomas ........................................................................ 36 2.2.5.8 Phragmidium sp. ........................................................................................... 37 2.2.5.8.1 Taxonomía ............................................................................................. 37 2.2.5.8.2 Características microscópicas ................................................................ 37 2.2.5.8.3 Patogénesis y síntomas ........................................................................ 38 2.2.5.9 Pythium sp. ................................................................................................... 38 2.2.5.9.1 Taxonomia ............................................................................................. 39 2.2.5.9.2 Características macroscópicas y microscópicas ................................... 39 2.2.5.9.3 Patogénesis y síntomas ........................................................................ 39 2.2.5.10 Rhizoctonia solani ....................................................................................... 40 2.2.5.10.1 Taxonomía ........................................................................................... 40 2.2.5.10.2 Características macroscópicas y microscópicas ................................. 41 2.2.5.10.3 Patogénesis y Síntomas ...................................................................... 41 2.2.5.11 Sclerotinia sp............................................................................................... 42 2.2.5.11.1 Taxonomía ........................................................................................... 42 2.2.5.11.2 Características macroscópicas y microscópicas ................................. 42 2.2.5.11.3 Patogénesis y síntomas ...................................................................... 42 2.2.5.12 Sphaerotheca sp. ........................................................................................ 43 2.2.5.12.1 Taxonomía ........................................................................................... 43 2.2.5.12.2 Características macroscópicas y microscópicas ................................. 44 2.2.5.12.3 Patogénesis y síntomas ...................................................................... 44 2.2.5.13 Verticillium ................................................................................................... 45 2.2.5.13.2 Características macroscópicas y microscópicas ................................. 45 2.2.5.13.3 Patogénesis y síntomas ..................................................................... 45 2.3 MICROSCOPÍA DE LUZ COMO TÉCNICA PARA LA OBSERVACIÓN DE HONGOS FITOPATOGENOS ............................................................................................................. 46 2.3.1 LUZ ........................................................................................................................ 46 2.3.1.1 Propiedades de la luz .................................................................................... 47 2.3.1.2 Tipos de luz .................................................................................................... 47 2.3.2 FORMACIÓN DE IMÁGENES .............................................................................. 48 2.3.3 PLANOS DE IMAGEN Y APERTURA EN EL MICROSCOPIO ............................ 49 2.3.4 ILUMINACIÓN KOEHLER .................................................................................... 50 2.3.5 COMPONENTES OPTICOS DEL MICROSCOPIO DE LUZ ................................. 51 2.3.6 TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA DE LUZ ............................................................. 53 2.3.6.1 Microscopía de campo claro .......................................................................... 54 2.3.6.2 Microscopía de contraste de fases ............................................................... 55 2.3.6.3 Microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) .......................... 57 3. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................ 61 4. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 63 4.1 OBJETIVO GENERAL ................................................................................................. 63 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................ 63 5. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................. 64 5.1 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN .............................................................................. 64 5.1.1 Población de estudio y muestra ............................................................................ 64 5.2 MÉTODOS ................................................................................................................... 64 5.2.1 Localización del área de muestreo ........................................................................ 64 5.2.2 Método de muestreo ............................................................................................. 64 5.3 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS .......................................................................... 65 5.3.1 Aislamiento de microorganismos .......................................................................... 65 5.4 MICROSCOPÍA ............................................................................................................ 66 5.4.1 Obtención de imágenes ........................................................................................ 66 5.5 RECOLECCION DE INFORMACION Y ANALISIS DESCRIPTIVO ............................ 66 5.6 DISEÑO Y ELABORACIÓN DEL ATLAS .................................................................... 67 6. RESULTADOS .................................................................................................................. 68 6.1 Identificación y descripción de enfermedades fúngicas en flores de corte ................. 68 6.1.1 ALSTROEMERIA ................................................................................................... 68 6.1.1.1 Hongos fitopatógenos en Alstroemeria ......................................................... 68 6.1.2 ANIGOZANTHUS ................................................................................................... 71 6.1.2.1 Hongos fitopatógenos en Anigozanthus ...................................................... 71 6.1.4 CLAVEL................................................................................................................. 74 6.1.4.1 Hongos fitopatógenos en Clavel ................................................................... 75 6.1.5 DELPHINIUM ........................................................................................................ 80 6.1.5.1 Hongos fitopatógenos en Delphinium .......................................................... 80 6.1.6 GERBERA ............................................................................................................. 83 6.1.6.1 Hongos fitopatógenos en Gerbera ................................................................ 84 6.1.7 GIRASOL .............................................................................................................. 87 6.1.7.1 Hongos Fitopatógenos en Girasol ................................................................ 87 6.1.8 GYPSOPHYLA ...................................................................................................... 89 6.1.8.1 Hongos Fitopatógenos en Gypsophyla ......................................................... 89 6.1.9 KALES ................................................................................................................... 91 6.1.9.1 Hongos fitopatógenos en Kales .................................................................... 92 6.1.10 MOLUCELLA ...................................................................................................... 93 6.1.10.1 Hongos Fitopatógenos en Molucella .......................................................... 93 6.1.11 ROSA .................................................................................................................. 94 6.1.11.1 Hongos Fitopatógenos del Rosal ................................................................ 95 6.1.12 SOLIDAGO ....................................................................................................... 101 6.1.12.1 Hongos Fitopatógenos en Solidago .......................................................... 101 6.1.13 STATICE ........................................................................................................... 104 6.1.13.1 Hongos Fitopatógenos en Statice ............................................................. 104 6.1.14 STOCK .............................................................................................................. 106 6.1.14.1 Hongos Fitopatógenos en Stock ............................................................... 106 6.2 Características macroscópicas y microscópicas de hongos fitopatógenos ................ 109 6.2.1 Alternaria sp. ........................................................................................................ 109 6.2.2 Botrytis sp ........................................................................................................... 110 6.2.4 Fusarium oxysporum ............................................................................................ 112 6.3.5 Fusarium roseum ................................................................................................. 113 6.3.6 Heterosporium sp ................................................................................................. 114 6.3.7 Itersonilia .............................................................................................................. 115 6.3.8 Peronospora sp. ................................................................................................... 116 6.3.9 Pragmidium sp. .................................................................................................... 117 6.3.10 Pythium sp. ........................................................................................................ 119 6.3.11 Rhizoctonia sp .................................................................................................... 120 6.3.12 Sclerotinia sp. ..................................................................................................... 121 6.3.13 Sphaerotheca pannosa ...................................................................................... 122 6.3.14 Verticillium sp. .................................................................................................... 123 7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS ...................................................................................... 124 8. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 129 9. RECOMENDACIONES ..................................................................................................... 130 10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS .............................................................................. 131 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Alternaria sp. ............................................................................................................ 25 Figura 2. Botrytis cinerea ........................................................................................................ 27 Figura 3. Conidios de Cercospora .......................................................................................... 29 Figura 4. Macroconidias de Fusarium oxysporum .................................................................. 30 Figura 5. Heterosporium sp..................................................................................................... 33 Figura 6. Esporas de Itersonilia sp. ........................................................................................ 34 Figura 7. Esporangios y esporas de Peronospora sp. ............................................................ 35 Figura 8. Esporas de Phragmidium sp .................................................................................... 37 Figura 9. Pythium oligandrum ................................................................................................. 38 Figura 10. Micelio de Rhizoctonia solani ................................................................................ 40 Figura 11. Sclerotinia sp. ........................................................................................................ 42 Figura 12. Conídios Sphaerotheca pannosa .......................................................................... 43 Figura 13. Conidióforos y conidios de Verticillium .................................................................. 45 Figura 14. Representación de la luz como Quantos, Ondas, Vectores, Rayos. .................... 46 Figura 15. Configuración de los planos focales conjugados en el microscopio de luz. ......... 50 Figura 16. Especificaciones del objetivo ................................................................................. 53 Figura 17. Mecanismo óptico del microscopio de campo brillante. ........................................ 54 Figura 18. Esquema descriptivo de contraste de fase Positivo (a) y Negativo (b) ................. 56 Figura 19. Configuración esquemática para microscopía de contraste de fases. .................. 57 Figura 20. Incidencia al azar de los rayos de luz en un polarizador ...................................... 58 Figura 21. Representación esquemática del Prisma Wollaston Modificado ........................... 59 Figura 22. Ilustración esquemática de la configuración del microscopio para contraste diferencial de interferencia. ..................................................................................................... 59 Figura 23. Trayectorias de onda alterando el espécimen de áreas adyacentes de acuerdo con el grosor e índice de refracción ........................................................................................ 60 Figura 24. Alstroemeria ........................................................................................................... 68 Figura 25. Síntomas iniciales de enfermedad por Alternaria sp. en hojas de Alstroemeria ... 69 Figura 26. Formación de manchas aceitosas por infección con Alternaria sp ....................... 69 Figura 27. Deterioro de tejidos y formación de micelio de Botritys sp. en tallo ...................... 70 Figura 28. Anigozantus ........................................................................................................... 71 Figura 29. Manchas causadas por Botritys sp.en hojas de Anigozhantus ............................. 71 Figura 30. Snapdragon ........................................................................................................... 72 Figura 31. Pudrición de tejidos con presencia de micelio del patógeno. ................................ 73 Figura 32. Lesión inicial de tejidos de Snapdragon por Sclerotinia sp. .................................. 73 Figura 33. Decaimiento generalizado de la planta con aparición de micelio de Sclerotinia sp. en tallos ................................................................................................................................... 74 Figura 34. Clavel ..................................................................................................................... 74 Figura 35. Plantas de clavel afectadas por Botritys sp. Decaimiento de ramas y presencia de micelio en flor. ......................................................................................................................... 75 Figura 36. Infección avanzada de Fusarium roseum presentando muerte de tejidos ............ 76 Figura 37. Síntomas iniciales de enfermedad por Heterosporium sp. en hojas de clavel ...... 77 Figura 38. Boton de clavel afectado por Heterosporium sp. ................................................... 77 Figura 39. Corte transversal de un tallo de clavel afectado por Fusarium oxysporum ........... 78 Figura 40. Síntomas avanzados de infección por Sclerotinia en rama de clavel ................... 79 Figura 41. Delphinium ............................................................................................................. 80 Figura 42. Corona en Delphinium afectada por Botritys sp. ................................................... 80 Figura 43. Atrofia y pudrición de tejidos con formación de micelio algodonoso de Botritys sp. en Delphinium ......................................................................................................................... 81 Figura 44. Síntomas de Mildeo Polvoso sobre el haz de una hoja en Delphinium ................ 82 Figura 45. Tallo con necrosis por infección de Mildeo Polvoso .............................................. 82 Figura 46. Haz de una hoja con manchas causadas por Alternariaen Delphinium ................ 83 Figura 47. Gerbera .................................................................................................................. 83 Figura 48. Mancha en pétalo de Gerbera afectado con Botritys sp ....................................... 84 Figura 49. Manchas acuosas causadas por Alternaria sp. en pétalos .................................. 85 Figura 50. Lesiones características de Itersonilia sp en pétalos de Gerbera ......................... 86 Figura 51. Girasol .................................................................................................................... 87 Figura 52. Hoja de girasol afectada con Mildeo Polvoso ........................................................ 87 Figura 53. Decaimiento y pudrición de una rama de Girasol afectada con Scerotinia sp. ..... 88 Figura 54. Gypsophila ............................................................................................................. 89 Figura 55. Síntomas avanzados de enfermedad en tallos de Gypsophila. Atrofia de órganos y presencia interna de esclerocios ............................................................................................ 89 Figura 56. Síntomas característicos de enfermedad por Pythium en brotes de gypsophila . 90 Figura 57. Síntomas avanzados de enfermedad por Phytium sp. Atrofia y necrosis de raíces y tallos ..................................................................................................................................... 91 Figura 58. Kyles ...................................................................................................................... 91 Figura 59. Síntomas iniciales de mildeo velloso en hojas de Kyles ....................................... 92 Figura 60. Mollucellas ............................................................................................................. 93 Figura 61. Mancha causada por Cercospora sp en etapas iniciales de enfermedad............. 93 Figura 62. Hojas de Mollucella infectadas con Cercospora sp. Debilitamiento y ruptura de tejidos ...................................................................................................................................... 94 Figura 63. Rosa ....................................................................................................................... 94 Figura 64. Envés de una hoja mostrando pústulas de roya en rosa ...................................... 95 Figura 65. Areas cloróticas en el haz de hojas de rosa causadas por la esporulación del patógeno en el envés .............................................................................................................. 95 Figura 66. Esporulación del patogeno sobre hojas de rosa ................................................... 96 Figura 67. Síntomas avanzados de enfermedad afectando follaje en rosas .......................... 97 Figura 68. Síntomas iniciciales de mildeo velloso en la base de la cabeza floral del rosal. .. 97 Figura 69. Curvatura y enrojecimiento de tejidos de rosa afectados por Peronospora sp. ... 98 Figura 70. Síntomas característicos de enfermedad generados por Botritys en pétalos de rosa ......................................................................................................................................... 98 Figura 71. Infección severa del patógeno con producción de micelio en flor ......................... 99 Figura 72. Clorosis y enrojecimiento parcial del tallo por Verticillium sp. ............................. 100 Figura 73. Síntomas avanzados de enfermedad presentando necrosis unilateral y formación de micelio en tallos ................................................................................................................ 100 Figura 74. Solidago ............................................................................................................... 101 Figura 75. Manchas foliares de mildeo polvoso en solidago ................................................ 101 Figura 76. Clorosis y presencia de pústulas de Phragmium sp. en hojas de solidago ....... 102 Figura 77. Síntoma de infección por Sclerotinia sp. en ramas de solidago .......................... 103 Figura 78. Síntomas avanzados de enfermedad. Atrofia y amarillamiento de tejidos. Presencia de esclerocios ...................................................................................................... 103 Figura 79. Statice .................................................................................................................. 104 Figura 80. Atrofia y pudrición de tejidos de Statice por Botritys sp. ..................................... 104 Figura 81. Haz de hojas de Statice presentando manchas causadas por Cercospora sp. .. 105 Figura 82. Lesiones características de Cercospora sp. con presencia de esporas sobre hojas de statice. .............................................................................................................................. 105 Figura 83. Stock .................................................................................................................... 106 Figura 84. Pudrición de tejidos con presencia de micelio del patógeno ............................... 106 Figura 85. Síntomas característicos de infección por Rhizoctonia sp. ................................. 107 Figura 86. Muerte de plántulas por contaminación de Rhizoctonia sp. en suelo ................. 107 Figura 87. Planta afectada por Sclerotinia sp . ..................................................................... 108 Figura 88. Síntomas avanzados de enfermedad con presencia de micelio. ........................ 108 Figura 89. Crecimiento de Alternaria sp. en medio V8 ......................................................... 109 Figura 90. Conídios de Alternaria sp. empleando DIC. Objetivo: 100 x AN: 1.3 .................. 109 Figura 91. Crecimiento de Botritys sp. en medio PDA ......................................................... 110 Figura 92. Botrytis sp. Campo claro. Objetivo: 100 x AN: 1.3 ........................................... 110 Figura 93. Hifas Botrytis sp. Campo claro Objetivo: 100 X AN: 1.3 .................................... 110 Figura 94. Crecimiento de Cercospora sp. en medio V8 ...................................................... 111 Figura 95. Conidios de Cercospora sp. Campo Claro Objetivo: 100 x AN: 1.3 ................... 111 Figura 96. Crecimiento de Fusarium oxysporum en medio PDA.......................................... 112 Figura 97. Fusarium oxysporum. empleando campo claro. Objetivo: 100 x AN: 1.3 .......... 112 Figura 98. Crecimiento de Fusarium roseum en medio PDA ............................................... 113 Figura 99. Fusarium roseum, empleando DIC. Objetivo: 100 x AN: 1.3 ............................ 113 Figura 100. Crecimiento de Heterosporium sp. en medio V8. .............................................. 114 Figura 101. Heterosporium sp. Campo Claro Objetivo: 40 x AN: 0.65 ................................. 114 Figura 102. Crecimiento de Itersonilia sp. en medio PDA .................................................... 115 Figura 103. Itersonilia sp. empleando DIC Objetivo:60X AN: 1.3 ........................................ 115 Figura 104. Envés de una hoja de rosa contaminada con Peronospora sp. Muestra enfocada en estereo. Microscopio Olympus BX 51 .............................................................................. 116 Figura 105. Peronospora sp. empleando campo claro Objetivo: 40x AN: 0.65 .................. 116 Figura 106. Envés de una hoja de solidago infectada con Pragmidium sp. Imagen enfocada en Estereo Microscopio Olympus BX51 ............................................................................... 117 Figura 107. Esporas de Pragmidium sp. empleando contraste de fases. Objetivo 60 x. A.N: 0.65 ....................................................................................................................................... 118 Figura 108. Esporas de Pragmidium sp empleando Campo claro. Objetivo 40x. A.N: 1.3 .. 118 Figura 109. Esporas de Pragmidium sp. empleando DIC. Objetivo: 100 x AN: 1.3 ........... 118 Figura 110. Crecimiento de Pythium en medio V8 ............................................................... 119 Figura 111. Zoosporas de Pythium sp. empleando Campo Claro. Objetivo: 60x A.N: 0.65 119 Figura 112. Crecimiento de Rhizoctonia sp. en medio PDA ................................................. 120 Figura 113. Hifas de Rhizoctonia sp. empleando contraste de fases. Objetivo 40x A.N: 0.65 .............................................................................................................................................. 120 Figura 114. Crecimiento de Sclerotinia sp. en medio PDA .................................................. 121 Figura 115. Esclerocios de Sclerotinia sp. tomados a partir de una planta infectada ......... 121 Figura 116. Micelio de Sclerotinia sp. empleando campo claro Objetivo: 40x AN: 0.65 ..... 121 Figura 117. Envés de una hoja de rosa contaminada con Sphaerotheca sp. Muestra enfocada en estéreo, microscopio Olympus. BX 51 ............................................................. 122 Figura 118. Conídios Sphaerotheca pannosa empleando Campo Claro Objetivo: 40 x ...... 122 Figura 119. Crecimiento de Verticillium sp. en medio PDA .................................................. 123 Figura 120. Conidióforos y conídios de Verticillium sp empleando Campo claro Objetivo: 100 x AN: 1.3 ........................................................................................................................ 123 RESUMEN Las enfermedades causadas por hongos son algunos de los principales problemas que afectan a las flores de corte cultivadas en la Sabana de Bogotá. Algunos de estos hongos presentan similitudes en cuanto a los síntomas manifestados en las plantas, lo cual conlleva a una difícil identificación del patógeno y así mismo a la adopción de medidas adecuadas de prevención y control. Debido a esto, se propuso la elaboración de un atlas descriptivo e ilustrativo acerca de las principales enfermedades fúngicas causadas en flores de corte cultivadas en esta área. Para la identificación de los principales hongos fitopatógenos de interés se realizaron visitas a diferentes fincas vinculadas a la empresa Americaflor Ltda., donde se tomo material infectado, que luego fue procesado y analizado. Estos hongos luego fueron evaluados microscópicamente llevando a cabo diferentes técnicas de microscopía óptica, que permitieron la identificación y la toma de micrografías de las diferentes características morfológicas de los microorganismos. Se determinó que el hongo con mayor incidencia fue Botrytis sp. evidenciando ataques sobre diversos órganos en todas las especies de plantas colectadas en las diferentes fincas. La técnica de campo claro resultó ser mas empleada para la obtención de la mayoría de micrografías, con respecto a otras técnicas. ABSTRACT Diseases caused by fungi, are one of the mayor troubles that affect cut flowers cultivated in Sabana de Bogotá. Some of this fungus presents similarities in the symptoms displayed in the plants which entails to a difficult identification of the pathogen as well as the adoption of suitable prevention and control measures. Due to several problems, like the exposed ones previously, it is decided to make a descriptive and illustrative atlas about main diseases caused in flowers cultivated in this area. To fungus identify cause of disease, visits to different farms of Americaflor Ltda. Company, were made, to take samples of infected material, for its processing and analysis. Strains were then evaluated microscopically, using different optical microscopy techniques, which allowed differentiation and micrographs taking of typical morphologic characteristics. The most incident fungus was Botrytis sp., demonstrating attacks on diverse organs in all plant species collected in the farms. Significantly influencing in this aspect, diversity of factors like environmental conditions, plant type and strain nature. The technique of brilliant field turned out being most useful for the micrographs obtaining, in relationship to other techniques. 1. INTRODUCCIÓN La producción de flores en Colombia se destina principalmente a la exportación, siendo una actividad de significativa importancia en el ámbito internacional, ya que posiciona al país en el segundo lugar a nivel mundial después de Holanda. Existe una alta variedad de plantas cultivadas de interés y uso ornamental, incluyendo dentro de las más conocidas, rosa, clavel, alstroemeria, áster, statice, solidago, gérbera y girasol, entre otras, las cuales se caracterizan por ser altamente distribuidas como flores de corte. En la Sabana de Bogotá se produce el 92% del total de la producción que en gran medida se comercializa a nivel nacional e internacional. No obstante, el sector floricultor se ve afectado por la presencia de hongos patógenos encontrados en el suelo o como consecuencia de diversas fuentes de contaminación, los cuales generan un alto impacto debido a la variedad de formas en que se presentan, así como la diversidad de climas en los que se desarrollan y el amplio número de especies de plantas a las que pueden afectar, teniendo en su rango de hospederos a todas las familias de plantas conocidas; situación que ocasiona una gran vulnerabilidad del sector al ataque en ecosistemas que conllevan a daños irreparables, lo que constituye un factor limitante en la productividad provocando la sustitución o erradicación de una gran variedad de cultivos, afectando por tanto el fortalecimiento sectorial. Dentro de los microorganismos más incidentes, se encuentran hongos como Fusarium sp., Botrytis sp., Alternaria sp., Peronospora sp., Rhizoctonia sp., y Phytium sp. entre otros, los cuales son de gran relevancia por su capacidad para atacar diversos cultivos, por las representativas lesiones y el daño generado en la planta y su facilidad de propagación. La investigación orientada a la identificación de microorganismos fitopatógenos, es de vital importancia para el desarrollo de planes de contención en cultivos de interés, siendo fundamental que el acceso a material de soporte de calidad, el cual es actualmente deficiente debido al celo con el que los técnicos y directrices del sector floricultor conservan su información, y a la falta de aportes públicos por parte de quienes desarrollan estudios referentes al tema. Lo que requiere acceso a equipos con técnicas avanzadas de observación, obteniendo un excelente material gráfico, que sirva como herramienta para la identificación y caracterización morfológica, evitando confusiones entre microorganismos y asegurando la obtención de diagnósticos confiables y la toma de medidas de control efectivas. 3 2. MARCO TEÓRICO 2.1 SECTOR FLORICULTOR EN COLOMBIA 2.1.1 Antecedentes Las actividades de floricultura en Colombia tienen su inicio a mediados de la década de los 60s, cuando los costos y condiciones de producción del sector permitieron encontrar elementos altamente competitivos respecto a otros actores del comercio mundial. Las principales áreas de cultivo como la Sabana de Bogotá y la zona de Rionegro en Antioquia, representaban tierras fértiles que acompañadas de una temperatura adecuada (de 13ºC a 21ºC), la uniformidad entre las horas de luz y sombra y la ausencia de estaciones, permitían obtener un alto nivel de cosechas por año. La actividad en el país también tenía la ventaja de contar con bajos costos salariales, lo que permitió que a comienzos de los 70s el 80% de las flores producidas en el país fueran exportadas a los Estados Unidos (BAÑON et al 1993). La floricultura fue convirtiéndose en una actividad destacada dentro del sector agropecuario colombiano caracterizándose por el uso intensivo de recursos, el máximo aprovechamiento de la tecnología y la mayor optimización posible del espacio, conservando una gran incidencia social puesto que es la actividad agrícola con más mano de obra trabajando por hectárea (BAÑON et al 1993). El crecimiento de la actividad floricultora en Colombia ha permitido generar beneficios económicos importantes para el país como fuente de generación de divisas: actualmente, Colombia es el segundo exportador de flores frescas cortadas en el mundo, con una participación del 13% en el comercio total después de Holanda, que cuenta con una participación del 56%. Adicionalmente, la floricultura es el primer renglón de exportaciones no tradicionales del país. Estados Unidos es hasta el momento el primer cliente de flores de Colombia con una participación del 75% del total importado (BAÑON et al 1993). . 4 2.1.2 Flor de corte Las flores se caracterizan por ser generalmente, terminales solitarias, con sépalos en número de cinco y presentan lóbulos laterales; por tanto la disposición y el número de pétalos, se distingue en varias clases incluyendo: - Apuntada o con centro elevado: en donde sus pétalos centrales siguen erectos y no se extienden. - Globosa o centro globoso: todos los pétalos tienen forma de plato, incursados por arriba, presentan además pétalos centrales erectos formando una esfera. - Forma de copa: el centro permanece libre al abrir y los pétalos se extienden, formando una copa. - Llana: los pétalos se abren horizontalmente o ligeramente reflejos. Ocurre frecuentemente en flores sencillas o semidobles. - Imbricadas: solo se produce en flores muy dobles, con pétalos cortos, reflexos, que se solapan, formando una roseta como una camelia. - Informal: Irregular en línea, arreglo y tamaño de pétalos. - Forma de estrella: habitual en flores semidobles, con pétalos horizontales, pero los bordes laterales se enrollan hacia abajo. - Forma de clavel: pétalos dentados en el borde superior. - Fino: expansión gradual del cáliza al centro, luego el capullo se afina hacia la parte superior. - Puntiagudo: extendido del todo en la base, con punta clara en la parte alta. - Ovoide: forma de huevo. Los frutos poseen un receptáculo carnoso, que rodea numerosos carpelos monospermos situados en su pared interna. Algunas variedades son estériles, y por ello no tiene fruto. (FERRER 1995) Las flores, pueden ser de color blanco, púrpura, rosa, amarillo; solitarios o reunidos en corimbo terminal. No obstante, por medio de los cruces e hibridaciones actualmente es posible obtener nuevas formas y colores, así como diversos números de pétalos (BAÑON et al 1993). 5 2.1.2.1 Alstroemeria Se trata de plantas perennes, raramente anuales, con rizomas cilíndricos simple o ramificados, de color parduzco con raíces delgadas o las nutricias cilíndricas, blancas, carnosas, en ocasiones con alto contenido de almidón. Los tallos aéreos erectos, a veces decumbentes, en general son de dos tipos: estériles, con muchas hojas desarrolladas y fértiles, generalmente con hojas reducidas, como escamas alargadas. Hojas alternas, resupinadas (con torsión cerca de la base o algo más arriba) o no, separadas o agrupadas en rosetas, láminas gruesas o delgadas, de borde entero, liso o encrespado, glabras o con papilas, de forma linear, lanceolada, elíptica u ovalada, agudas u obtusas (MUÑOZ et al 2003). 2.1.2.1.1 Enfermedades Pudriciones de tallo y raíz (Pythium sp.) Podredumbre de raíz y del tallo tienen típicamente como resultado el amarillamiento, raquitismo o marchitamiento de las partes áreas de las plantas. Las raíces pueden tener lesiones diferenciadas y se pueden pudrir las raíces laterales y las puntas de las raíces, sin embrago con frecuencia se pudren grandes partes del sistema radicular. (DIAZ et al 2002) Pudriciones de tallo y raíz (Phythophthora sp.) Causa podredumbre de la raíz y de la corona, que se traduce en raquitismo o marchitamiento de la planta, consiste en lesiones superficiales blandas, hundidas y áreas internas blandas necróticas, de color pardo oscuro. (DAUGHTREY et al 2001) Los tallos enfermos tienen lesiones hundidas y acuosas que pueden ser bastante estrechas y están verticalmente dispuestas, o bien pueden ser muy grandes y rodear el tallo. Las hojas infectadas son acuosas, de colores pardos oscuros y flácidos. (DAUGHTREY et al 2001) Pudriciones de tallo y raíz (Rhizoctonia solani) Causa la pudrición de las plántulas, los tallos se oscurecen en la línea del suelo y se encogen hasta tener una apariencia de tallo de alambre. En condiciones cálidas y húmedas 6 el hongo crecerá por toda la plántula, a veces englobando grandes partes de las bandejas de plántulas. (DAUGHTREY et al 2001) Manchas en las hojas (Alternaria sp.) En las hojas se presentan pequeñas manchas circulares de color café frecuentemente rodeadas de un halo amarillo. Las manchas tienen la característica de tener anillos concéntricos de color oscuro. Usualmente las manchas a parecen en las hojas mas viejas y de estas suben al resto de la planta. (DAUGHTREY et al 2001) 2.1.2.2 Anigozanthus Planta herbácea perenne de hasta 3 metros de altura, con tallos altos y ramificados. Rizomas horizontales más o menos alargados, algunas veces con un látex rojo. Las hojas son principalmente basales, muy largas, con unas pocas hojas pequeñas en el tallo. Las flores, dispuestas en grupos, son tubulares y están densamente cubiertas de pelos; presentan una escotadura que llega hasta la mitad de su longitud. Son de color verde amarillento, destacando el color naranja de los estambres. El género Anigozanthos comprende 11 especies que habitan de forma natural únicamente en el sudoeste de Australia (GOODWIN 1993). 2.1.2.2.1 Enfermedades Alternaria sp Los síntomas de Alternaria aparecen sobre tallos, follaje durante períodos lluviosos. Después del inicial moteado, las hojas se tornan quebradizas y cambian de color amarillocafé a café oscuro. Las manchas se agrandan y forman aros concéntricos, con apariencia rizada; y por último todo el follaje es destruido. Si la humedad persiste los botones florales y flores se infectan. La temperatura óptima para la enfermedad es de 30°C. En estados avanzados la enfermedad destruye la planta. (AGRIOS 1997) 7 Fusarium sp Los síntomas de la enfermedad aparecen de forma unilateral; se acompaña de un amarillamiento parcial de las hojas, a veces se observa una mitad clorótica y la otra verde normal y el doblamiento de los brotes hacia el lado de la planta enferma. (AGRIOS 1997) Pudriciones de tallo y raíz (Pythium sp) Ocasiona lesiones graves en raíz y en tallo, dependiendo la edad de desarrollo de la planta, siendo más severa la infección al comienzo de su desarrollo, se habla entonces de la etapa de enraizamiento; o mas leve en la etapa adulta en la cual hay más fortaleza en la planta logrando contrarrestar la enfermedad ( AGRIOS 1997) Podredumbre Gris (Botrytis sp.) Produce podredumbres blandas, y se puede observar un característico moho de color grisáceo. En hojas se puede observar una necrosis, alrededor del punto de entrada, pudiendo avanzar al resto de la hoja si las condiciones son favorables para el hongo. (AGRIOS 1997) 2.1.2.3 Antirrhinum majus Planta erecta, leñosa por debajo de la familia de las escrofulariáceas de hasta 2 m. Hojas opuestas o esparcidas de forma lanceolada de hasta 7 cm. Flores de color púrpura de 3 a 4 cm agrupadas en espigas pegajosas. A veces flores de color amarillento claro, rosa, roja, violeta, etc. Florecen desde primavera a otoño, dependiendo de la fecha de siembra En paredes abandonadas en rocas y sitios secos. Con una altura de 40-60 cm la mayoría de variedades y hasta 1 m (ALVAREZ 2006). 2.1.2.3.1 Enfermedades Roya (Puccinia antirrhini.) Las hojas presentan pequeñas pústulas parduzcas. En los tallos y flores en primavera, aparecen otras pústulas negras, la planta pierde las hojas y se debilita. (DAUGHTREY et al 2001) 8 Mildeo Velloso (Peronospora antirrhini.) Las hojas presentan en el haz manchas irregulares de color amarillo pálido. En el envés, si el ambiente es húmedo y cálido, aparece un moho blanco-grisáceo. (DAUGHTREY et al 2001) Podredumbre del cuello (Fusarium sp., Verticillium sp., Phytophthora sp.) Produce la muerte de plantas en semillero a consecuencia de diversos hongos que necrosan el cuello. (DAUGHTREY et al 2001) Pudriciones de tallo y raíz (Sclerotinia sp.) Produce marchitamiento causado por las germinación de los esclerocios; y la pudrición foliar, de tallos, de flores es el resultado de la infección de las ascosporas. (DAUGHTREY et al 2001) 2.1.2.4 Clavel Esta planta se caracteriza por ser herbácea, con núcleos muy marcados en el tallo, posee hojas sencillas, enteras, con frecuencia estrechas, opuestas y sin estipulas. La flor es actinomorfa, hermafrodita, con perianto diferenciado en el cáliz de cinco sépalos concrescentes y en corola, que casi nunca falta, de pétalos libres. Posee estambres en uno o dos verticilios, cada uno de cinco piezas, posee cárpelos concrescentes en un ovario supero unilocular. El fruto suele ser una cápsula que muchas veces se abre por dientes apicales (FONTQUER, 1991). 2.1.2.4.1 Enfermedades Alternaria (Alternaria dianthi) Se presenta sobre las hojas, pequeñas manchas translúcidas, luego sobre la base de las hojas, se forman manchas de 1.5 cm de diámetro, inicialmente son grisáceas y se recubren de puntas negras bien visibles. A nivel del nudo el ataque provoca un blanqueado y 9 desecamiento de las hojas laterales, también la muerte de la ramificación axilar. (GAMBOA 1998) Maya del clavel (Fusarium oxysporum) Induce una marchitez vascular caracterizada por el amarillamiento progresivo del follaje, que finalmente conduce a la muerte de las plantas. El hongo invade las raíces y se disemina a través del xilema, causando además una pudrición del cuello. (ARBELAEZ 1998) Enfermedad de la rama (Fusarium roseum) Es bastante común en lugares de mucha humedad y puede matar completamente la planta. En una planta adulta que aparenta estar sana en el tallo a nivel del nudo, aparece una mancha rosácea con el centro blanco y un poco amarillento. La apariencia de una planta atacada por esta enfermedad es semejante a la de una planta atacada por Fusarium oxysporum Sin embargo, en el cuello se observa fácilmente unas motas algodonosas color rosado, además, se observa cierto estrangulamiento del cuello con una pudrición, provocando finalmente la muerte de la planta (GAMBOA 1998) Pudriciones de tallo y raíz (Rhyzoctonia sp.) Ataca principalmente en los primeros días de la plantación, se agrava si los esquejes se siembran muy enterrados. El hongo se favorece con altas temperaturas y vive a nivel del suelo. La planta se pone de color verde grisáceo y toma un aspecto de flacidez hasta que se marchitan completamente. Generalmente al arrancar la planta se separa fácilmente el sistema radicular del cuello de la planta, donde se nota una pudrición. (GAMBOA 1998) Podredumbre gris (Botrytis sp.) Es muy grave y aunque a veces se encuentra en las hojas y tallos en el clavel, afecta más las flores y a nivel del corte de la flor. En este último caso, es común en invernaderos que riegan con manguera y que mojan el punto donde se cortaron las flores, es aquí donde se desarrolla una pudrición que va corriendo hasta la base de la planta provocando su muerte. 10 En la flor es aun más problemática, su detección a simple vista se dificulta, principalmente cuando se inicia en los pétalos internos (GARCÉS 1986). En algunas variedades de color oscuro, a veces es casi imposible detectar la enfermedad en su inicio. Generalmente empieza con un moho de color gris sobre los pétalos, luego se va formando una pudrición suave color café amarillenta hasta cubrir completamente la flor (PIE et al 1991). Mancha anillada (Heterosporium sp.) Se ha reportado como un patógeno que ataca las hojas, tallos y flores del clavel. Los síntomas iniciales se manifiestan por manchas blanquecinas que van evolucionando hasta convertirse en círculos manchados de color pardo grisáceo con un anillo exterior pardo oscuro, cuya apariencia le ha dado a la enfermedad el nombre típico de “mancha anillada” (BRICEÑO, G 1990). Verticillium sp. Clorosis, bronceamiento o enrojecimiento parcial de la lámina foliar y escaldadura marginal de las hojas. Los síntomas aparecen unilateralmente en la planta (LATORRE 1999). 2.1.2.5 Delphinium El género Delphinium, perteneciente a la familia Ranunculáceas, agrupa alrededor de 200 especies originarias de Europa, Asia, África y América. Comprende herbáceas que pueden comportarse como anuales, bianuales o perennes, en dependencia del clima, alcanzando una altura máxima de 2 m. Poseen hojas alternas, pecioladas, sumamente divididas, de color verde brillante. De entre ellas surgen los tallos o espigas florales, grandes y erectos. Las flores, simples o dobles, tienen forma de espolón y los colores más frecuentes son blanco, rosado, rojo, púrpura, azul y violeta. (KEHDI 2003) 2.1.2.5.1 Enfermedades Las enfermedades más severas son causadas por hongos habitantes del suelo que pudren la región de la corona llegando a producir el colapso de la planta. 11 Entre estos se destacan: Pudriciones de tallo y raíz (Pythium sp.) Ataca principalmente plantas jóvenes, sobre todo en suelos demasiado húmedos y que no están bien drenados. Tras la presencia de Pythium, las plantas tendrán tallos muy húmedos y se colapsarán. Aparentemente sin razón, las plantas ya crecidas y plantas madres comenzarán a marchitarse y cogerán un color amarillento (que a menudo se identifica erróneamente como una deficiencia nutricional), y a veces las hojas tenderán a enrollarse hacia abajo. Las plantas tendrán un crecimiento pobre y el rendimiento se reducirá; hasta se puede llegar a una pérdida de la planta. No es fácil detener un ataque de Pythium a tiempo, especialmente cuando se cultiva en suelo, ya que los primeros síntomas de estrés en la planta no aparecen inmediatamente en la parte que está sobre la tierra. Sólo después de algunos días las plantas se verán afectadas. Pero en el ámbito de las raíces el desarrollo de la enfermedad ha empezado hace tiempo. (KEHDI 2003). Pudriciones de tallo y raíz (Sclerotinia sp) Que pueden distinguirse por la presencia de masas fungosas blancas, en el cuello de la planta. Fusarium oxysporium Que causa un chancro de la corona y marchites (NOTICIAS BALL, 2003). Podredumbre gris (Botrytis sp.) Las infecciones que se origina o que parten de las conidias, al llegar al tejido permanecen quiescentes (campo), pero se convierten en agresivas cuando el tejido entra en senescencia o es estresado. En contraste, infecciones iniciadas por micelio en residuos de plantas, tales como pétalos muertos adheridos al tejido sano, inician una infección inmediata y agresiva. La esporulación de Botrytis en los residuos colonizados requiere de periodos favorables de temperatura y humedad. (SUTTON 1995) 12 Manchas en las hojas (Alternaria sp) En las hojas se presentan pequeñas manchas circulares de color café frecuentemente rodeadas de un halo amarillo. Las manchas tienen la característica de tener anillos concéntricos de color oscuro. Usualmente las manchas a parecen en las hojas mas viejas y de estas suben al resto de la planta. Mildeo Polvoso (Sphaerotheca sp) Manchas blancas con aspecto harinoso aparecen en forma aislada sobre las hojas más jóvenes, son el primer síntoma. Según las variedades, poco a poco todo el follaje puede ser infestado, igualmente los pedúnculos y las flores, afectando el aspecto decorativo del producto. (EXPOFLORES, 1999) 2.1.2.6 Gerbera Las formas cultivadas están disponibles con flores rayadas en tonos intensos de amarillos, salmón, rosa y rojo. Son propagadas a partir de cultivos de tejidos, así como de semilla. Son propensas a deficiencias de boro, magnesio y hierro cuando se cultivan en mezcla de nutrientes sin suelo. Se desarrollan muy bien con altas intensidades de luz. (DAUGHTREY et al 2001) 2.1.2.6.1 Enfermedades Manchas en las hojas (Alternaria sp.) Formación de pequeñas manchas acuosas y con forma de ampollas parecen en el envés de las hojas inferiores. Cuando las manchas maduran los centros aparecen hundidos de color marrón y pueden mostrar halos difusos amarillos. Finalmente las manchas aparecen en el haz de las hojas. Si las condiciones siguen siendo apropiadas para el desarrollo de la enfermedad, las manchas se agrandan. En ciertos casos, las lesiones muestran anillos concéntricos y las lesiones próximas pueden unirse. (VALENZUELA 2001) 13 Podredumbre gris (Botrytis sp.) La infección puede aparecer directamente o a través de aberturas naturales o heridas por medio de los tubos germinativos conidiales, o por el crecimiento hifal sobre las plantas. En gerbera causa podredumbre de las plántulas (damping off), punteado, marchitamiento de hojas y flores y podredumbre de la corona. Las hojas desarrollan lesiones zonada, y los pétalos de la flor muestran manchas marrones y necrosis de las puntas o se marchitan enteramente. (VALENZUELA 2001) Cercospora brunkii Las lesiones foliares, son al principio manchas hundidas de color verde pálido, con el tempo las manchas se vuelven grises y la acumulación de esporas causa que las lesiones se oscurezcan y que parezca que tienen centros salientes. Cuando las lesiones se unen, se desarrollan áreas necróticas, puede desarrollarse clorosis en las proximidades de las heridas, las hojas fuertemente infectadas se caen. (VALENZUELA 2001) Rhizopus sp. El tejido de hojas, flores y tallos, se marchita y se puede desarrollar telarañas de micelio sobre los tejidos muertos en condiciones húmedas. Los esporangios del hongo aparecen a simple vista como manchitas en las blancas telarañas miceliales. (VALENZUELA 2001) Pudriciones de tallo y raíz (Fusarium sp.) Las lesiones presentan un color negro oscuro y son blandas, se causa una podredumbre de la raíz y de la corona y finalmente mata la planta. (VALENZUELA 2001) Pudriciones de tallo y raíz (Rhizoctonia solani) Causa la pudrición de las plántulas, los tallos se oscurecen en la línea del suelo y se encogen hasta tener una apariencia de tallo de alambre. En condiciones cálidas y húmedas el hongo crecerá por toda la plántula, a veces englobando grandes partes de las bandejas de plántulas. (VALENZUELA 2001) 14 Mildeo Polvoso Las hojas se cubren completamente con micelio blanco y conidias, dando a la superficie de la hoja una apariencia pulverulenta. Las hojas gravemente infectadas se ponen amarillas y se mueren. (VALENZUELA 2001) 2.1.2.7 Girasol El girasol es una planta anual, diploide y alegama cuya polinización es realizada preferiblemente por insectos. Las flores se reúnen en una inflorescencia llamada capítulo, cuya dimensión varia entre 8 y 50 cm de diámetro (AGUDELO et al 1993). Se presentan numerosas flores sobre un receptáculo discoide. El capítulo puede tener una configuración plana, cóncava o convexa. (ARISMENDY et al 1990). La florescencia se inicia en la parte periférica de la flor, y continúa en círculos concéntricos. En condiciones normales del cultivo, cada flor demora dos días para desarrollarse y cada día florecen de tres a cuatro círculos para un período de florecimiento del capítulo de cinco a diez días, igual al número de círculos concéntricos o zonas de florescencia. (ARISMENDY et al 1990). 2.1.2.7.1 Enfermedades Pudriciones de tallo y raíz (Fusarium sp.) Las plantas afectadas presentan, flacidez de las hojas, con marchitamiento y secamiento de estas, con una incidencia relativamente baja en la época cercana a la floración. Al observar la parte basal del tallo y hasta 10 cm hacia arriba, se nota un secamiento de la epidermis o corteza, la cual debe ser desprendida fácilmente, algunas veces acompañado de un micelio blanco o rosado anaranjado que cubre la lesión. (ARISMENDY et al 1990). Podredumbre gris (Botrytis sp.) Ataca el tallo, a la base y en la inserción del mismo con el capítulo, penetrando el hongo mecánicamente a través de la cutícula y enzimáticamente por las paredes celulares, destruyendo el tejido de la planta apareciendo manchas marrones que después se secan. 15 En la parte inferior del capítulo apareen primero manchas amarillas y luego marrones, que se van cubriendo de un tejido algodonoso gris. (ARISMENDY et al 1990). Pudriciones de tallo y raíz (Sclerotinia sp.) Es una enfermedad cuyos síntomas aparecen en diversas fases del desarrollo de la planta, el primer síntoma parece durante la mascencia y se manifiesta en que el tallo bajo los cotiledones se vuelve blanco y estos decaen hasta el suelo. La infección se produce por micelios, los cuales han invernado sobre las semillas y también por contacto de la semilla con esclerocios del capítulo. (ARISMENDY et al 1990) El segundo síntoma aparece en la época de formación de botones florales percibiéndose en el tallo y en la base del capítulo se van pudriendo superficies blandas, apareciendo en estos lugares micelios blancos que después de poco tiempo empiezan a secarse y se forman esclerocios oscuros. El tallo se vuelve débil, las hojas se secan y se caen si sopla el viento fuerte. (ARISMENDY et al 1990) El tercer síntoma sería la infección del capítulo, cuya parte inferior se vuelve blanda, mas tarde toma un color marrón y aparece un tejido algodonoso blanquecino. (ARISMENDY et al 1990). Mildeo Polvoso (Sphaerotheca sp) Sus síntomas se manifiestan por la presencia de un micelio blanco o grisáceo en el haz de las hojas viejas y ocasionalmente en tallos, puede llegar a cubrir toda la lámina foliar. (ARISMENDY et al 1990) Pudriciones de tallo y raíz (Pythium sp.) Los síntomas se caracterizan por la pudrición en la parte de la unión del tallo con la flor manifestando abundante micelio blanco algodonoso, el cual atraviesa el tejido para afectar la semilla; en estado avanzado el hongo descompone todo el capítulo induciendo mal olor. (AGUDELO et al 1993). 16 Manchas en las hojas (Alternaria sp.) Se presenta en las hojas bajeras en forma de pequeñas manchas necróticas rodeadas de un halo clorótico, distribuidas en todo el folíolo. (AGUDELO et al 1993). 2.1.2.8 Gypsophila La gypsophila (Gypsophila paniculata L) es una de las flores de corte de mas demanda y popularidad en Estados Unidos y Europa es utilizada como complemento en arreglos florales. De los requisitos de suelo y las necesidades fertilización, se sabe muy poco sobre esta planta. La gypsophila es originaria de regiones templadas y se adapta muy bien a suelos desde ligeramente ácidos a alcalinos. El pH optimo oscila entre 6,5 y 7,5 (WARREN, 1980). 2.1.2.8.1 Enfermedades Manchas en las hojas (Alternaria sp.) Produce manchas pardo- grisáceas y halo púrpura. Masas negras de esporas. (WARREN, 1980) Podredumbre gris (Botrytis sp.) Pudrición húmeda y café en flor. Moho gris crece en tejido afectado. Ataca base de tallos. (WARREN, 1980) Fusarium oxysporum Clorosis y marchites foliar. Similares a las de Pythium. Pudriciones de tallo y raíz (Phytophthora sp.) Las plantas se marchitan y colapsan. Pudrición de raíces. Ennegrecimiento de tallos y raíces. (WARREN, 1980) 17 Pudriciones de tallo y raíz (Pythium sp.) Las plantas se marchitan y colapsan. Pudrición de raíces. Ennegrecimiento de tallos y raíces. 2.1.2.9 Kales 2.1.2.9.1 Enfermedades Mildeo velloso Los esporangióforos emergen en grupos a través de los estomas de los tejidos de la planta. Mas tarde, adquieren una tonalidad grisácea o café clara y forman una matriz visible constituida por las hifas del hongo en la superficie inferior de las hojas. (AGUDELO et al 1993) 2.1.2.10 Molucella Se le conoce comúnmente como campana de Irlanda. Anualmente produce tallos con flores a intervalos a lo largo de su longitud. La parte atractiva floral es el cáliz abierto, grande, en forma de campana aplanada, ya que las flores en si mismas son insignificantes. Los vástagos pueden venderse verdes o desecados hasta un color marrón – paja. (AGUDELO et al 1993) 2.1.2.10.1 Enfermedades Cercospora Las manchas provocadas por Cercospora al principio aparecen a lo largo de los márgenes de las hojas, causando a menudo que las hojas se ricen. Sin embargo, los síntomas son normalmente más severos y obvios a lo largo de todos los márgenes de las hojas. (AGUDELO et al 1993) 18 El hongo prefiere atacar a las hojas y plantas jóvenes más que a las adultas. En campos con infecciones graves sin embargo, tanto las hojas jóvenes como más adultas pueden ser atacadas. (AGUDELO et al 1993) 2.1.2.11 Rosa El rosal es una planta arbustiva, de porte abierto, con ramos leñosos y normalmente espinosos. A excepción de la especie H, persica, la cual no presenta hojas subdivididas, todas las demás poseen foliolos dispuestos en forma de plumas, desde 5 hasta 19 foliolos, las hojas son pinnadas, con estipulas y caducas. 2.1.2.11.1 Enfermedades Mildeo Polvoso (Sphaerotheca pannosa) No produce la muerte pero transfigura a las partes atacadas dándoles un efecto de invasión por un polvo finísimo blanco que muchos denominan “ceniza” y otros “blanco del rosal”. Ataca las espinas en su base, a los tallos en las partes mas tiernas, a las hojas jóvenes en toda su área, todo el pedúnculo y se adueña del botón antes de abrir los pétalos. (FERRER et al 1995). Mildeo Velloso (Peronospora sparsa) Esta enfermedad provoca severas defoliaciones y ocasiona graves debilitamientos en las plantas. Afecta a hojas, tallos y pedúnculos florales. Los síntomas que se observan en el haz de las hojas son manchas amarillentas en un principio, que posteriormente se secan. En el envés aparecen zonas pulverulentas de color gris, que son las resultantes de la esporulación del hongo. Las hojas dañadas, se curvan, marchitan y caen. En brotes y tallos florales también es posible observar la esporulación del hongo en un estado avanzado de la enfermedad, observándose lesiones de color negro y de longitud mayor a dos centímetros. El desarrollo del patógeno esta fuertemente influenciado por la humedad relativa elevada (90%) y la temperatura (15-18ºC). (BAM S.A. 2000) 19 Podredumbre gris (Botrytis cinerea) Aparece en forma de tizones de inflorescencias y pudriciones del fruto, pero también como chancros o pudriciones del tallo ahogamiento de plántulas, manchas foliares y como pudriciones del tubérculo, como, un bulbo o raíces. Bajo condiciones húmedas el hongo produce una capa fructífera de moho gris sobre los tejidos afectados. (FERRER et al 1995). Roya (Phragmidium sp.) Con frecuencia, el primer síntoma que se observa es un aspecto general de mala salud en la planta. Después pueden observarse áreas irregulares de color rojo y/o amarillo en la cara superior de las hojas. Las esporas fúngicas se vuelven de color pardo rojizo a naranjo brillante. Estas esporas se encuentran principalmente en la cara inferior de las hojas, pero también se pueden observar en la cara superior cuando se trata de una infestación fuerte. (BAÑON et al 1993) Verticilosis (Verticillium sp) Los síntomas aparecen unilateralmente en la planta, produciendo necrosis del tejido vascular, y muerte generalizada del follaje. Aparición de micelio algodonoso blanco. 2.1.2.12 Solidago El solidago es una planta plurianual originaria del hemisferio norte (norte América, Asia) y que pertenece a la familia de las compuestas, subfamilia asteracea y que de forma natural florece al final del verano. La planta es capaz de soportar temperaturas moderadamente altas y pasar el invierno acumulando reservas. La floración es abundante y se compone de un gran número de pequeñas flores compuestas de intenso color amarillo, de unos milímetros de diámetro. Las hojas son simples y se insertan directamente en el tallo. (PLANTFLOR, 2000) Los tallos solo se ramifican cuando desarrollan la inflorescencia, así la planta para seguir desarrollándose emite nuevos brotes vegetativos desde el suelo y todos ellos al final desarrollan inflorescencia. (PLANTFLOR, 2000) 20 2.1.2.12.1 Enfermedades Mildeo Polvoso (Erisiphe cichoracearum) Los síntomas aparecen en forma de manchas blancas en las hojas más viejas. Verticillium sp. Algunos tallos de la planta se ponen mustios y se secan rápidamente y se observan manchas de color marrón oscuro en los vasos conductores (PLANTFLOR. 2000). Pudriciones de tallo y raíz (Sclerotinia sp.) En las plantas se observa, que en la base del tallo o cuello de la raíz hay una lesión seca de color café, acompañada generalmente de un micelio algodonoso blanco con formación de esclerosis de forma redondeada, inicialmente blancos y posteriormente cafés (ARISMENDY et al 1990). 2.1.2.13 Statice Planta de porte erguido y de lento desarrollo, oriunda de la región mediterránea . Se caracteriza por sus flores perfectas, actinomorfas, hipóginas, protegidas por brácteas, dispuestas dicasios o cincinos, espigas, panojas o capítulos, pueden ser azuladas o amarillentas y sus escapos alados, sus hojas son simples, enteras, lobuladas o pinnatífidas, alternas o arrosetadas, envainadoras o amplexicaules de color verde oscuro. (UNNE 2000) 2.1.2.13.1 Enfermedades Podredumbre gris (Botrytis sp.) Botrytis sp. causa una variedad de síntomas que incluyen manchas y marchitamiento en los tejidos de la hoja y los pétalos, podredumbre de la corona. Los tejidos en depósito como raíces, cormos o rizomas son también susceptibles. Las lesiones causadas son identificadas por esporulación característica gris vellosa, sin embargo las esporas solo se desarrollan en 21 condiciones húmedas. Los pétalos de la flor pueden tener pequeñas manchas o se marchitan completamente. Pudriciones de tallo y raíz (Fusarium sp.) Causa podredumbres de la raíz, corona y tallo y es capaz de provocar marchitamiento vascular sistémico. Manchas en las hojas (Alternaria sp.) Formación de pequeñas manchas acuosas y con forma de ampollas parecen en el envés de las hojas inferiores. Cuando las manchas maduran los centros aparecen hundidos de color marrón y pueden mostrar halos difusos amarillos. Finalmente las manchas aparecen en el haz de las hojas. 2.1.2.14 Stock Presenta un alto porcentaje de flores dobles. Con un desarrollo especial para la flor de corte, las hojas son en su mayoría pequeñas y verticales, lo que se traduce en más plantas por m2 que otras series. Los tallos y hojas son brillantes y de color verde oscuro, lo que contrasta con los colores claros de las flores. 2.1.2.14.1 Enfermedades Pudriciones de tallo y raíz (Sclerotinia sp.) Produce marchitamiento causado por las germinación de los esclerocios; y la pudrición foliar, de tallos, de flores es el resultado de la infección de las ascosporas. Pudriciones de tallo y raíz (Rhizoctonia solani) Pudrición café a nivel del cuello de raíz. Plántulas se marchitan y colapsan. 22 2.2 HONGOS FITOPATOGENOS Los patógenos infecciosos son de naturaleza variada e incluyen virus y tiroides, bacterias, hongos, algas, plantas superiores y nematodos capaces de penetrar y establecer una directa y compleja relación parasitaria con el agente hospedero, al mismo tiempo, son agentes transmisibles desde una planta enferma a una sana, por lo cual se les denomina agentes infectivos. Dentro de los agentes causales de tipo infectivo que provocan enfermedad en plantas, se destacan los hongos quienes constituyen el grupo más importante y pertenecen a diversas categorías taxonómicas. Los hongos se definen como miembros del reino fungi, y consisten en un talo carente de clorofila, microorganismos eucariontes, usualmente filamentosos, ramificados, formadores de espora, unicelulares o multicelulares; no utilizan la luz solar como fuente de energía, la pared de células esta formada por quitina, celulosa o ambas. Algunos hongos pueden crecer y multiplicarse solo por la asociación con su planta hospedera, durante toda su vida; estos, se conocen como parásitos obligados o biotrófos. Otros, requieren la planta como hospedero para realizar parte de sus ciclos de vida, quienes lo pueden completar en materia orgánica en descomposición, así como también crecer y multiplicarse allí, denominados parásitos no obligados ( DE LA ISLA 1994). Para que suceda una enfermedad, es necesaria la completa interacción de tres componentes: patógeno, huésped y condiciones ambientales favorables (AGRIOS 1995). 2.2.1 Hongos patógenos vasculares Los hongos que causan la enfermedad denominada como “marchitez vascular” tapan los conductos internos de conducción de agua de las plantas y como consecuencia se observan síntomas de marchitez. Puede presentarse muerte del follaje, hojas o de la planta en general. Para detectar si hay marchitez vascular, se efectúan cortes diagonales en una rama afectada y se observa si hay una decoloración verde oscura a marrón en la parte interna del tallo, lo cual es un síntoma diagnóstico de la presencia de estos patógenos vasculares. Las ramas afectadas por estos hongos generalmente mueren. Algunas plantas mueren rápidamente mientras que en otras se observa la muerte de algunas ramas y posteriormente la de la planta (ARBELAEZ 1987). 23 2.2.2 Hongos causantes de la pudrición de la base del tallo y raíces Son enfermedades causadas por hongos habitantes del suelo, y que pueden causar pudrición temprana o “damping off” de semillas, plántulas o plugs así como de las raíces y la parte baja de los tallos en plantas maduras. Los síntomas que comúnmente aparecen cuando el sistema radicular se encuentra enfermo, son marchitez, enanismo o deficiencias nutricionales en la parte aérea de la planta (GALINDO, et al. 1995). 2.2.3 Hongos causantes de enfermedades foliares Las enfermedades foliares limitan el rendimiento del cultivo, porque se desarrollan a expensas de la planta, consumiendo energía. De manera general, éstas afectan el cultivo, provocando un mal funcionamiento y destrucción de los tejidos fotosintéticos, ya que los patógenos ejercen su parasitismo aprovechándose de la energía producida por el cultivo. De esta manera colonizan, crecen y se reproducen exclusivamente a expensas de la planta, generándoles pérdidas de carbohidratos y nutrientes producidos o de reserva (ARBELAEZ 1996). La mayoría de las enfermedades foliares producen clorosis, necrosis, afectando la fotosíntesis, disminuyendo la intercepción de radiación y aumentando la reflectancia. Así también la mayoría de ellas generan senescencia y algunas más graves, una intensa desfoliación afectando la intercepción lumínica. Esta senescencia anticipada de las hojas puede inducir también una removilización de las reservas del tallo, lo cual aumenta la predisposición a las pudriciones de raíz y tallo con el consiguiente riesgo de vuelco de las plantas y /o quebrado durante la cosecha (VALCARCEL 1995). 2.2.4 Hongos causantes de enfermedades en flores El patógeno más común atacando diversos tipos de flores en producción, almacenamiento y transporte es Botrytis cinerea Esta es una de las enfermedades mas frecuentes y limitantes en rosa, crisantemo y estatice. Con una menor incidencia, la enfermedad se presenta en clavel, gypsophila y alstroemeria. En los últimos años la enfermedad ha aumentado notablemente su incidencia, con un incremento importante en pérdidas y en los costos de producción. (GARCÉS DE GRANADA 1992) 24 En clavel, el hongo Cladosporium echinulatum ataca severamente el cáliz y los tallos de variedades muy susceptibles, ocasionando pérdidas severas, ya que las flores afectadas no se pueden exportar. (GARCÉS DE GRANADA 1992) 2.2.5 Fitopatógenos asociados a flor de corte 2.2.5.1 Alternaria sp. Alternaria engloba unas 50 especies de distribución cosmopolita, fitoparásitas o saprofitas sobre vegetación, capaces de colonizar y degradar numerosos sustratos como papel, cuero, tapicerías, pinturas, o alimentos que se puedan contaminar con micotoxinas. Figura 1. Alternaria sp. Fuente: SUTTON 2004 2.2.5.1.1 Taxonomía Reino: Mycetae División: Amastigomycota Sub. División: Deuteromycotina Forma- Clase: Deuteromycetes Forma Sub. Clase: Hyphomycetidae Orden: Moniliales Familia: Dematiaceas Genero: Alternaria 25 2.2.5.1.2 Características macroscópicas y microscópicas En cultivo presenta colonias de colores oscuros, grises, oliváceos, marrones o negros. Sus conidióforos son macronematosos, mononematosos, simples o ramificados, de color marrón claro a oscuro. (ALEXOPOULOS. 1996) La célula conidiogena es integrada, terminal o intercalar, generalmente simpodial. Los conidios, son muy característicos por su tabicación longitudinal, transversal u oblicua, son del tipo dictiospóreo y presentan forma ovoide u obclavada, con superficie lisa o rugosa y de coloración marrón claro a oscuro, generalmente se forma en cadenas acrópetas. Los conidios pueden aparecer solitarios o encadenados y son fácilmente reconocibles debido a su tamaño (30-50 x 10 -14 micras) color y forma característicos anteriormente nombrados (ALEXOPOULOS. 1996). 2.2.5.1.3 Síntomas El hongo ataca los tallos, hojas y frutas. En las hojas se presentan pequeñas manchas circulares de color café frecuentemente rodeadas de un halo amarillo. Las manchas tienen la característica de tener anillos concéntricos de color oscuro. Usualmente las manchas aparecen en las hojas mas viejas y de estas suben al resto de la planta. A medida que la enfermedad progresa, el hongo puede atacar tallos. En los anillos concéntricos se producen esporas polvorientas y oscuras. Las esporas se pueden observar si la lesión se le acerca un objeto de coloración clara (DIMATE. 2000). 2.2.5.2 Botrytis sp Botrytis sp. se presenta principalmente en flores de exportación como la rosa, clavel, crisantemo, statice entre otras. Su ataque es especialmente grave durante el almacenamiento y transporte de la flor en la cadena de frío, debido a que se dan las condiciones optimas para el desarrollo del hongo, que ataca los pétalos en muchas las variedades, y afecta el pedúnculo floral en otras (GARCES 1992). 26 Figura 2. Botrytis cinerea Fuente: SUTTON 2004 2.2.5.2.1 Taxonomía Súper reino: Eucaryonta Reino: Mycetae División: Amastigomycota Sud División: Deuteromycotina Clase: Deuteromycetes Sub. Clase: Hyphomycetidae Orden: Moniliales Familia: Moniliaceae Genero: Botrytis 2.2.5.2.2 Características macroscópicas y microscópicas Las colonias de Botrytis son de crecimiento moderado, blancas o grises, dependiendo del medio de cultivo donde se encuentre puede ser de tipo micelial, esclerocial o esporulante. La de tipo micelial es de crecimiento mas rápido, abundante, algodonosa y de color pardo. La de tipo esclerocial, es una colonia de crecimiento lento, micelio escaso de color blanco inicialmente y luego de cloro gris a pardo con abundantes esclerocios de color negro, distribuidos irregularmente en el medio. (BAYONA 1996) Los esclerocios son de color negro, generalmente son redondos o de forma irregular. Tiene de 1 a 5 mm de longitud. Se forman sobre tejidos blancuzcos y húmedos de plantas atacadas por el hongo. (BAYONA 1996) 27 Cuando los esclerocios germinan, pueden producir esporas (conidias) o forman un cuerpo fructificante, que se asemeja a una capa o platillo, conocido como apotecio. Cada asco produce 8 ascosporas o esporas sexuales. Los conidióforos presentan ramificaciones alternas y rectas. Las hifas suelen encontrarse septadas, hialinas y dematiáceas con ramificaciones en forma dicótoma (LATORRE et al 1998). El micelio es hialino cuando joven y con la edad va tomando color oscuro, es septado y presenta una perforación en el centro (BAYONA 1996). 2.2.5.2.3 Epidemiología y síntomas Este hongo permanece todo el año en los invernaderos principalmente en forma de conidias y micelio, pero también puede vivir en forma de esclerocios, en plantas que están muy infectadas. (ASOCOLFLORES, 1995) Las esporas de este hongo pueden sobrevivir en el suelo de los invernaderos por períodos más largos, a la intemperie, sobre material en descomposición. (DOSS, 1995) Para que el hongo se desarrolle, no es suficiente que una espora se deposite sobre la superficie de la planta, también es necesario que se presenten condiciones ambientales favorables como alta humedad relativa, pH adecuado, temperatura optima, etc. (VOLPIN 1991) y que en el tejido de la planta donde se deposite la espora, se encuentre en la etapa susceptible, ya que el hongo ataca tejidos blandos o tejidos en proceso de envejecimiento y muerte, por ser estos fuente nutritiva disponible para que las esporas del hongo germinen y causen la infección. (GAMBOA 1998) El fitopatógeno se manifiesta mediante la aparición de puntos y manchas, destruyendo los pétalos, lo que causa grandes pérdidas en las flores. Sin embargo, también causa ulceraciones en el tallo y produce lesiones en las hojas y brotes vegetativos. En plantas con alto nivel de infección se presentan esclerocios, los cuales pueden sobrevivir por largos periodos de tiempo a la intemperie sobre el material en descomposición. (GARCÉS 1992) 28 2.2.5.3 Cercospora Figura 3. Conidios de Cercospora Fuente: NAVA et al 1989 2.2.5.3.1 Taxonomía Reino: Fungi División: Deuteromycota Clase: Mitosporico Orden: Moniliales Familia: Dematiaceae Género: Cercospora. 2.2.5.3.2 Características macroscópicas y microscópicas Macroscópicamente presenta colonias de color gris oscuro por su cara superior, negras por su cara inferior, de borde a veces irregular, aterciopeladas, elevadas. Al microscopio, se observan conidios alargados septados, filiformes algo sinuoso, hialino, de base ensanchada, con cicatriz conidial marcada, conidióforos fasciculados, muy largos, oscuros y tabicados, de crecimiento definido, y el número de septos es de 9 por brazo; son de una coloración pardo-grisácea (CABRERA et al 2003). Micelio de desarrollo lento, castaño grisáceo (ALVAREZ et al 2003) (CABRERA et al 2006). 29 2.2.5.3.3 Patogénesis y Síntomas Al principio de la enfermedad las hojas manifiestan pequeñas manchas necróticas de color marrón oscuro de aproximadamente 1 mm de diámetro con borde indefinido y halo clorótico, pudiéndose encontrar solitarias o coalesciendo y distribuidas por toda la hoja. Las manchas en estado avanzado de desarrollo llegan a medir hasta 10 mm, se necrosan y el centro se torna de color gris claro volviéndose quebradizo el tejido. La enfermedad provoca la abscisión de las hojas por lo que es común observar muchas con síntomas característicos en el suelo al pie de la planta afectada (PALENCIA et al 2003). Las manchas provocadas por Cercospora al principio aparecen a lo largo de los márgenes de las hojas, causando a menudo que las hojas se ricen. Sin embargo, los síntomas son normalmente más severos y obvios a lo largo de todos los márgenes de las hojas. El hongo prefiere atacar a las hojas y plantas jóvenes más que a las adultas. En campos con infecciones graves sin embargo, tanto las hojas jóvenes como más adultas pueden ser atacadas. El patógeno también produce lesiones en los peciolos y tallos, caracterizadas por filos marrón oscuro y centros que van desde el tono bronceado hasta el gris. Las lesiones pueden juntarse y presionar los tallos, haciendo que las hojas mueran (PLANT PRO 2007). 2.2.5.4 Fusarium sp Figura 4. Macroconidias de Fusarium oxysporum Fuente: SHERWOOD, 2007 Hongo Deuteromicete (imperfecto), patógeno, causante del marchitamiento vascular principalmente en vegetales y flores; además recientemente se ha visto que es responsable 30 de micosis en animales y humanos. (AGRIOS 1998). Presenta especies fitopatógenas como, fusarium solani, fusarium moniliforme, fusarium roseum, fusarium lateritium y fusarium oxysporum La mayoría de los casos del marchitamiento vascular debidos a este género, son producidos por especies de fusarium oxysporum; diferentes huéspedes son atacados por diferentes formas especiales y/o especies de este hongo (AGRIOS 1998). Fusarium oxysporum f. sp. dianthi es el agente etiológico que produce la enfermedad conocida como marchitamiento del clavel. 2.2.5.4.1 Taxonomía Súper reino: Eucaryonta Reino: Mycetae División: Eumycota Sub División: Deuteromycotina Clase forma: Hyphomycetes Orden familia: Moniliales Familia forma: Tuberculariceae Genero: Fusarium 2.2.5.4.2 Características macroscópicas y microscópicas Macroscópicamente Fusarium sp, se caracteriza por producir colonias de crecimiento rápido. Su micelio es generalmente aéreo, abundante, algodonoso y con coloración variable de blanco a rosado durazno. Algunos especies presentan usualmente un tinte de color intenso al dorso de la colonia (RATTINK, et al.2000). Microscópicamente Fusarium puede presentar tres clases de esporas: Microconidias: Esporas unilaterales, sin septos, hialinas, elipsoidales a cilíndricas, rectas o curvas, se forman sobre fialides laterales, cortas, simples o sobre conidióforos poco ramificados tienen 5 -12 µ m de largo por 2.5 – 3.5 µ m de ancho. Macroconidias: Esporas de pared delgada, fusiformes, largas, moderadamente curvas en forma de hoz, con varias células de tres a cinco septas transversales, tienen de 27 -46 µ m de largo por 3.0 -4.5 µ m de ancho. 31 Clamidioesporas: Esporas formadas a partir de la condensación de los contenidos de las hifas y macroconidias, de paredes gruesas, mediante las cuales el hongo sobrevive en condiciones ambientales desfavorables y en ausencia de plantas hospederas. Estas esporas se forman simples o en pares, terminales o intercaladas; tienen un tamaño de 5 a 15 µ m de diámetro (GARCES DE GRANADA, et al 1999). 2.2.5.4.3 Patogénesis y síntomas Fusarium sp. penetra la epidermis de las raíces, la corteza y endodermos, finalmente entra a los vasos del xilema, colonizando el sistema vascular, en el cual el fitopatógeno produce compuestos complejos que interfieren con la capacidad de la planta al traslocar la toma de agua y nutrientes; ocasionando la degradación de tejidos y la muerte (OCHOA. 1996). Las hifas del hongo penetran directamente o a través de heridas hechas en forma mecánica o por nematodos, insectos o miriápodos, la epidermis de las raíces, pasa a la corteza y a los endodermos y entran a los vasos del xilema invadiéndolos cuando están maduros. El patógeno coloniza el xilema de las plantas por crecimiento del micelio o por medio del transporte pasivo de las microconidias lo cual contribuye a la colonización no uniforme, generalmente un lado de la planta; el hongo deteriora los tejidos por medio de enzimas que degradan la pared celular como xilanasas entre otras y se comienzan a formar cavidades en las hojas y paredes lignificadas del tallo (OCHOA. 1996). Los síntomas de la enfermedad aparecen de forma unilateral; se acompaña de un amarillamiento parcial de las hojas, a veces se observa una mitad clorótica y la otra verde normal y el doblamiento de los brotes hacia el lado de la planta enferma; a su vez se observa enanismo de éstos y disminución en el crecimiento de la planta, los síntomas avanzan lentamente por la planta hacia arriba hasta causar un marchitamiento generalizado y la muerte (ARBELAEZ 2000). 32 2.2.5.5 Heterosporium sp. Figura 5. Heterosporium sp Fuente: HANSEN, 2000 2.2.5.5.1 Taxonomía División: Mycota Clase: Deuteromycetes Orden: Moniliales Familia: Dematiaceae Género: Heterosporium 2.2.5.5.2 Características macroscópicas y microscópicas Presenta micelio septado, nudoso, oscuro y ancho en estado adulto. En estadios juveniles el micelio no posee septas. El micelio puede ramificarse dicotómica o tricotómicamente terminando en extremos romos. Tiene conidióforos septados, oscuros, fasciculares, agrupados o simples; conidias equinuladas o espinosas, grandes y de forma elíptica, septadas hasta cuatro veces en su madurez. El tamaño de las esporas varia entre 9.8 y 50.6 micras de largo y 6.6 y 13.2 micras de ancho; y los promedios de longitud y anchura son 33.7 y 9.98 micras respectivamente. Las colonias son circulares con constricciones radiales y micelio pardo con bordes blanquecinos (BRICEÑO, G 1990). 33 2.2.5.5.3 Patogénesis y síntomas Se ha reportado como un patógeno que ataca las hojas, tallos y flores del clavel. Los síntomas iniciales se manifiestan por manchas blanquecinas que van evolucionando hasta convertirse en círculos manchados de color pardo grisáceo con un anillo exterior pardo oscuro, cuya apariencia le ha dado a la enfermedad el nombre típico de “mancha anillada”. En estadios avanzados de la enfermedad, las partes centrales de las manchas se oscurecen por la presencia de fructificaciones tomando una tonalidad verde negruzca y una textura pulverulenta que llega a manifestarse en anillos concéntricos. Cuando las manchas se presentan al borde de las hojas pueden adoptar formas circulares. En el cáliz el aspecto de las lesiones es semejante al que se puede observar en las hojas, pero el diámetro de la mancha es menor y causa deformaciones en las flores que se abren de manera imperfecta o no llegan a hacerlo. No se han reportado daños a nivel vascular o radicular. Se ha establecido que el hongo penetra por las partes aéreas produciendo daños a nivel del parénquima (BRICEÑO, G 1990). 2.2.5.6 Itersonilia sp Figura 6. Esporas de Itersonilia sp. Fuente: MCGOVERN, 2006 34 2.2.5.6.1 Taxonomía Clase: Blastomyces Orden: Sporobolomycetales Familia: Sporobolomycetaceae Género: Itersonilia 2.2.5.6.2 Características macroscópicas y microscópicas Macroscópicamente presenta colonias delgadas y algodonosas con pigmentación color crema. Al microscopio se observan esporas de color naranja brillante, y basidiosporas cortas hialinas. 2.2.5.6.3 Patogénesis y síntomas Es conocido como saprofito de la superficie foliar. Causando marchites de pétalos, especialmente en el aire libre y en condiciones húmedas. Las lesiones se inician como manchas pequeñas como cabezas de alfiler, pardas en las flores externas del capitulo que posteriormente se extienden y aparecen cubierta por una eflorescencia blanca opaca (SMITH 1992). 2.2.5.7 Peronospora sp Figura 7. Esporangios y esporas de Peronospora sp. Fuente: CUEVAS et al 2001 35 2.2.5.7.1 Taxonomía Reino: fungi División: Eumycota Sub. División: Mastigomycotina Clase: Oomycetes Orden: Peronosporales Familia: Peronosporaceae Genero: Peronospora 2.2.5.7.2 Características macroscópicas y microscópicas Posee micelio interno no tabicado, alargado, que al momento de reproducirse forma esporangióforos largos, hialinos, agrupados y ramificados dicotómicamente, muy numerosos, con abundantes esporangios globosos, hialinos (CABRERA et al 2000). Produce zoosporas en zoosporangios. Las oosporas se forman por la fusión de gametos morfológicamente distintos. Apariencia vellosa de los esporangióforos y esporangios producidos en el tejido de plantas infectadas. Produce en hojas felpa blanco grisácea (AGRIOS 1995). 2.2.5.7.3 Patogénesis y Síntomas Produce esporangióforos con esporangio terminal en lesiones de las hojas. En la reproducción asexual, los esporangios contienen zoosporas con dos flagelos, aquellos escapan y nadan en las hojas sobre la película de agua formada por precipitaciones. Las zoosporas son atraídas por los estomas y después de un corto período de descanso se enquista. Posteriormente forman un tubo germinativo que penetra a través del estoma en el envés de la hoja, y produce un micelio formado por filamentos tubulares, sin tabiques, pero ramificados y provistos de órganos de succión repartidos irregularmente (DIAZ 1993). Esta enfermedad provoca severas defoliaciones y ocasiona graves debilitamientos en las plantas. Afecta a hojas, tallos y pedúnculos florales. Los síntomas que se observan en el haz de las hojas son manchas amarillentas en un principio, que posteriormente se secan. En el envés aparecen zonas pulverulentas de color gris, que son las resultantes de la esporulación del hongo. Las hojas dañadas, se curvan, marchitan y caen. En brotes y tallos florales 36 también es posible observar la esporulación del hongo en un estado avanzado de la enfermedad, observándose lesiones de color negro y de longitud mayor a dos centímetros. El desarrollo del patógeno esta fuertemente influenciado por la humedad relativa elevada (90 %) y la temperatura (15 – 18 ºC) (BAM S.A. 2000). 2.2.5.8 Phragmidium sp. Figura 8. Esporas de Phragmidium sp Fuente: RUBIO, 2007 2.2.5.8.1 Taxonomía Reino: Fungi División: Basidiomycota Clase: Teliomycetes Orden: Uredinales Familia: Pucciniaceae Género: Phragmidium Especie: Phragmidium Nombres comunes: Roya del rosal. 2.2.5.8.2 Características microscópicas Es un parásito obligado. Uredosporas individuales, casi siempre equinuladas. Teliosporas robustas, desde bi hasta multicelulares por septos horizontales originadas individualmente sobre pedicelos que por lo general son higroscópicos con 2-3 poros germinativos por cada célula. El ciclo de vida completo de los hongos causantes de royas tiene 5 diferentes formas de esporas, Espermogoonio, Aeciosporas, Uredosporas, Teliosporas, Basidiosporas. 37 2.2.5.8.3 Patogénesis y síntomas La roya del rosal se manifiesta con áreas cloróticas, numerosas, en el haz de las hojas, las cuales están en correspondencia con los uredosoros del patógeno en el envés. Las pústulas son de color amarillo intenso y en muchas ocasiones se pueden observar también, las grandes y características teliosporas multitabicadas, de color oscuro. (CABRERA et al 2006) Los espermogonios se desarrollan bajo la cutícula de las hojas, son amarillentos y aplanados. En estos se encuentran los espermacios, órganos reproductores masculinos, y las hifas receptoras, que recogen los anteriores, originando los ecios cuando entran en contacto. Los ecios se forman en el envés de las hojas, en el peciólo y también sobre los frutos, a modo de heridas. Son de color anaranjado. En ellos se forman cadenas de esporas, aciosporas. 2.2.5.9 Pythium sp. Pythium sp. se encuentra distribuido en los suelos y en aguas en todo el mundo. Es un organismo saprófito y vive sobre los restos de animales y plantas muertas, o bien se pueden desarrollar como parásito atacando las raíces fibrosas de las plántulas jóvenes de una gran variedad de espermatofitas susceptibles. Cuando un suelo húmedo se encuentra densamente infestado por Pythium este hongo ataca todo tipo de semillas o plántulas que emerjan de aquellas (CARONE 1986). Figura 9. Pythium oligandrum Fuente: DIAZ 2002 38 2.2.5.9.1 Taxonomia Reino: Stramenopila phylum: Oomycota Clase: Oomycetes Orden: Pythiales Familia: Pythiaceae Genero: Pythium 2.2.5.9.2 Características macroscópicas y microscópicas Se caracteriza por poseer hifas incoloras dispuestas en forma de racimo. Las estructuras de la reproducción sexual son oogonios equinulados generalmente pleróticos, fertilizados por anteridios en forma de clava, de pared reticulada que se producen en grupos sobre una misma hifa; las estructuras de la reproducción asexual están representadas por zoosporas que se producen en zoosporangios intercalares morfológicamente poco diferenciados, las cuales se liberan desde vesículas bien diferenciadas (CORREA DE RESTREPO et al 1990). Microscópicamente se observan hifas blanquecinas y delgadas, con un crecimiento hacia arriba, en forma arborescente, que parte del estrato basal o vegetativo, tendiendo a ser de forma tridimensional, semejante a una esfera; en conjunto presenta un aspecto algodonoso formando los típicos pilares que caracterizan su apariencia macroscópica (CORREA DE RESTREPO et al 1990). 2.2.5.9.3 Patogénesis y síntomas El tubo germinal de las esporas o el micelio saprofítico de Pythium entra en contacto con los tejidos de las plantas hospedantes ya sea al azar, o debido a que los exudados de éstas le sirvan al hongo como nutrientes y estimulantes para sus zoosporas y micelio, los cuales se mueven o crecen en dirección de las plantas. La infección inicial se produce a nivel de la superficie del suelo o por debajo de ella dependiendo del grado de humedad y la profundidad del cultivo; el micelio del hongo entra directamente en las células epidérmicas y corticales del tallo, nutriéndose así de la mayoría de los contenidos celulares, por lo tanto degradan las paredes celulares, desintegrando células y tejidos. 39 Lo anterior ocurre por la secreción de enzimas pectinolíticas por parte del hongo, las cuales degradan la lámina media que mantiene unida a las células dando como resultado la maceración de los tejidos. En el momento en que las lesiones llegan al tejido vascular se observa decoloración, indicando la cercana muerte de la planta; mientras que cuando la invasión del hongo se da en la corteza del tallo subterráneo de la planta, esta puede durar y crecer durante un breve periodo de tiempo hasta que la lesión se extiende por arriba de la superficie del suelo; en tal caso, los tejidos invadidos y colapsados no tienen la capacidad de sostener la planta, por lo tanto, cae en el terreno y muere (AGRIOS 1997). 2.2.5.10 Rhizoctonia solani Figura 10. Micelio de Rhizoctonia solani Fuente: CASTRO et al 2005 2.2.5.10.1 Taxonomía Reino: Fungi División: Eumycota Sub. División: Deuteromycota Sub. Clase: Hyphomycetidae Clase: Hyphomycete Orden: Moliniales Familia: Agronomycetaceae Genero: Rhizoctonia 40 2.2.5.10.2 Características macroscópicas y microscópicas Las hifas cuando jóvenes son hialinas de 6 a 12 micras de diámetro, vacuolazas, con tabiques gruesos, al envejecer adquieren color castaño a castaño rojizo, presenta características de ramificarse en ángulo recto. Produce esclerocios en forma de masa miceliales, color blanco, que luego se oscurecen hasta llegar a distintos tonos de castaño, irregulares, grandes de 1 a 8 mm visibles a simple vista, variando las condiciones en que se produce, de consistencia dura en cortes microscópicos muestran una constitución de hifas entrelazadas, de diámetro variable, cortas, elípticas, semejantes a diminutos barriles dispuestos en cadena (SARASOLA et al 1975). Macroscópicamente las colonias típicas de este microorganismo se caracterizan por ser blancas, algodonosas, planas, sin embargo, dependiendo de la especie, puede presentarse tonalidades cremas amarillentas (BARNETT et al 1982). 2.2.5.10.3 Patogénesis y Síntomas Ataca principalmente en los primeros días de la plantación, se agrava si los esquejes se siembran muy enterrados. El hongo se favorece con altas temperaturas y vive a nivel del suelo. También ataca a plantaciones adultas con problemas de mal drenaje y altas temperaturas. La planta se pone de color verde grisáceo y toma un aspecto de flacidez hasta que se marchitan completamente. Generalmente al arrancar la planta se separa fácilmente el sistema radicular del cuello, donde se nota una pudrición. 41 2.2.5.11 Sclerotinia sp Figura 11. Sclerotinia sp. Fuente: RUBIO, E. 2007 2.2.5.11.1 Taxonomía Clase Deuteromicetes Orden: Discomicetes Familia: Sclerodermataceae Genero: Sclerotinia 2.2.5.11.2 Características macroscópicas y microscópicas Ascomycete que forma fructificaciones vernales acopados y provistos de un pedículo de sostén desarrollado que sale de un esclerocio tuberiforme, generalmente enterrado, exteriormente negruzco e interiormente blanco. Parece que se asocia con las raicillas de muy diversas plantas vasculares (RUBIO, E.2007). La principal estructura de supervivencia de Sclerotinia sp. son los esclerocios, estructura de resistencia que consiste en su interior de una porción llamada médula y una cubierta protectora en el exterior, llamada corteza. 2.2.5.11.3 Patogénesis y síntomas La especie causa lesiones café claras sobre el tallo, el cual puede ser cubierto por un crecimiento micelial esponjoso de color blanco y numerosos esclerocios. (SANDOVAL et al 2000). 42 Sclerotinia sp. produce cuerpos esclerociales negros en las plantas enfermas. Estos cuerpos, son las estructuras de resistencia que sobreviven en el suelo. Dependiendo del hospedero y el ambiente, los esclerocios germinan, produciendo micelio que infecta las raíces y las bases de los tallos, causando marchitamiento y decaimiento foliar. También puede producir ascosporas que puede infectar los tejidos aéreos de las plantas; la infección ocurre a través de los estomas abiertos; el hongo penetra el tejido foliar y forma apresorios; una vez la infección ocurre, el micelio se ramifica rápidamente. La dispersión de planta a planta se efectúa a través del crecimiento micelial. En las primeras etapas de desarrollo del ataque en los tallos, el follaje muestra muy pocos signos de ataque del hongo, de ahí que las plantas infectadas pasen inadvertidas fácilmente. Los esclerocios negros del hongo pueden formasen internamente en el tallo o pueden formase fuera del tallo donde son bastante conspicuos. Para la mayoría de los huéspedes, las raíces, tallos y follaje infectado desarrolla primero lesiones acuosas. Posteriormente las lesiones se expanden y toman una coloración café. 2.2.5.12 Sphaerotheca sp. Figura 12. Conidios Sphaerotheca pannosa Fuente: MAGNUS GAMMELGAARD, 2008 2.2.5.12.1 Taxonomía Reino: Fungi División: Ascomycota Orden: Erysiphales Familia: Ericiphaceae Género: Sphaerotheca 43 2.2.5.12.2 Características macroscópicas y microscópicas El cuerpo fructífero de este hongo es un ascocarpo que, por ser esférico, se denomina cleistotecio, en cuyo interior se producen las ascas, de forma oblongo-globosa con 8 ascosporas. La formación de cleistotecios puede proporcionar a la especie mayores posibilidades de sobrevivir a las condiciones invernales y ampliar la variabilidad del miceto (SINOBAS 1997). Las conidias van dispuestas en cadenas, por esto se disemina por el viento. Estas conidias puede generar muchos ciclos, pero en condiciones adecuadas generaran el cleistotecio. Se caracteriza por formar un micelio de color blanco-grisáceo sobre la planta infectada. 2.2.5.12.3 Patogénesis y síntomas Manchas blancas con aspecto harinoso aparecen en forma aislada sobre las hojas más jóvenes, son el primer síntoma. Según las variedades, poco a poco todo el follaje puede ser infestado, igualmente los pedúnculos y las flores, afectando el aspecto decorativo del producto. El desarrollo del patógeno esta relacionado con tres factores básicos: la temperatura, una baja humedad relativa y la insolación. El hongo se caracteriza por un micelio superficial de color blanco. Dicho micelio, compuesto de órganos chupadores, penetra la cutícula y se introduce en las células de la epidermis vegetal. Con temperaturas adecuadas aparecen las conidias (forma sexual de reproducción de los hongos) que dan a las manchas el aspecto polvoriento, que caracteriza esta enfermedad fungosa. Posteriormente sobre el micelio nacen los conidioforos que llevan las conidias (EXPOFLORES 1995). 44 2.2.5.13 Verticillium Figura 13. Conidióforos y conidios de Verticillium Fuente: CEDEÑO. 1997 2.2.5.13.1 Taxonomía Reino: Fungi Clase: Deuteromycetes Orden: Moniliales Familia: Moniliaceae Genero: Verticillium 2.2.5.13.2 Características macroscópicas y microscópicas Las colonias son delgadas, algodonosas y con variedad de pigmentos; blancos, verdes, rojos o rosados. Microscópicamente, tiene conidióforo recto, tabicado y ramificado cuya terminación es en fiálides, con ápices puntiagudos. Los ameroconidios se producen en bolsas (gloisporas) presentando características hialinas y agrupándose en el extremo de la fiálide. No presentan clamidosporas (AGRIOS 1995). 2.2.5.13.3 Patogénesis y síntomas Produce clorosis, bronceamiento o enrojecimiento parcial de la lámina foliar y escaldadura marginal de las hojas. Los síntomas aparecen unilateralmente en la planta. Se evidencia una necrosis del tejido vascular, y provoca la muerte generalizada del follaje. Las plantas 45 enfermas tienden a rebrotar desde la base. La incidencia y severidad se relaciona con el potencial de inoculo del suelo con el manejo y edad de la planta (LATORRE 1999). 2.3 MICROSCOPÍA DE LUZ COMO TÉCNICA PARA LA OBSERVACIÓN DE HONGOS FITOPATOGENOS 2.3.1 LUZ La luz, definida como una forma de energía conocida como radiación electromagnética, está contenida en unidades o quantos llamados fotones que tienen las propiedades de partículas y ondas (Figura 14). Esta puede representarse de varias maneras dependiendo de las características en las cuales se desee enfatizar (MURPHY, D 2001): - Como quantos (fotones) de radiación electromagnética, donde los fotones son detectados como quantos individuales de energía (como fotoelectrones) sobre las superficies de instrumentos de mediación cuantitativos. - Como ondas, donde la propagación de un fotón es representada gráficamente como un par de campos eléctricos y magnéticos que oscilen en fase y en dos planos mutuamente perpendiculares. Figura 14. Representación de la luz como Quantos, Ondas, Vectores, Rayos. Fuente: MURPHY, D. 2001 46 - Como vectores, donde la longitud del vector representa la amplitud, y el ángulo del vector representa el avance o el retraso de la onda concerniente a una referencia imaginaria. - Como rayo, donde la trayectoria linear de un rayo en un medio homogéneo se muestra como una línea recta. 2.3.1.1 Propiedades de la luz La luz interactúa con la materia en una amplia variedad de formas, presentando una serie de propiedades características que al incidir sobre un cuerpo varían su comportamiento según la superficie y constitución de éste y la inclinación de los rayos incidentes, dando lugar a diversos fenómenos físicos (MURPHY, D. 2001). Un rayo de luz puede ser desviado mientras pasa a través de un objeto transparente el cual presenta un índice de refracción diferente, fenómeno conocido como Refracción, o puede curvarse uniformemente rodeando los bordes de un objeto opaco, fenómeno conocido como difracción, o incluso dispersarse por pequeñas partículas y estructuras que tienen dimensiones similares a la longitud de onda de la luz (También conocido como difracción). Fenómenos que aplicados a un espécimen presentan una gran influencia en el proceso de formación de la imagen en microscopía de luz (MURPHY, D. 2001). 2.3.1.2 Tipos de luz De acuerdo al grado de uniformidad de los rayos, la luz puede clasificarse en varias clases. Encontrando dentro de los tipos más frecuentes referidos a microscopía de luz (MURPHY, D. 2001): - Monocromática: Ondas que tienen la misma longitud de onda o frecuencia vibracional. - Polarizada: Ondas cuyos vectores oscilan en planos que son paralelos uno del otro. - Coherente: Ondas de una longitud de onda dada que mantienen la misma relación de fase mientras que viajan a través del espacio y el tiempo. 47 - Focalizada: Ondas que presentan una trayectoria coaxial de propagación a través del espacio, sin convergencia o divergencia, pero no necesariamente tiene la misma longitud de onda, fase, o estado de la polarización. 2.3.2 FORMACIÓN DE IMÁGENES La formación de imágenes, se basa en el uso de lentes los cuales consisten en un plano principal y un plano focal, definidos como aquellos planos, dentro del lente y en la imagen enfocada, respectivamente, donde los rayos o las extensiones de rayos se interceptan y se unen físicamente. Lo que implica parámetros geométricos específicos de los lentes los cuales incluyen (MURPHY, D. 2001): - Plano focal: Plano en el cual los rayos se interceptan para formar una imagen. - Plano principal: Plano en el lente en el cual las extensiones de los rayos incidentes y emergentes se interceptan. - Longitud focal: Definida como la distancia comprendida entre el plano principal y el plano focal - Eje óptico: Definido como la línea imaginaria que recorre los centros de un sistema óptico y forma ángulo recto con el plano de la imagen. En el microscopio óptico, la luz que pasa alrededor y a través del espécimen sin ser alterada en su trayectoria (luz directa), es proyectada por el objetivo y se extiende uniformemente a través del plano de imagen entrando en el diafragma del ocular. La luz difractada por el espécimen es conducida al foco en varios puntos situados sobre el mismo plano de la imagen, donde causa interferencia destructiva y reduce la intensidad resultando en más o menos áreas oscuras. Estos patrones de luz y oscuridad son los reconocidos como imagen del espécimen. Debido a que los ojos son sensibles a las variaciones en brillo, la imagen se convierte en una reconstitución más o menos fiel del espécimen original, donde los lentes del ocular magnifican la imagen que finalmente se proyecta sobre la retina o el plano de la película de una cámara fotográfica (ABRAMOWITZ, M. 1987). El principio fundamental para la mayoría de métodos de contraste, en microscopía óptica se basa en la combinación de luz directa y difractada como factor crítico en la formación de la imagen, siendo los lugares claves para tal fin, el plano focal anterior del objetivo y el plano focal frontal del condensador (DAVIDSON, et al 2001). 48 2.3.3 PLANOS DE IMAGEN Y APERTURA EN EL MICROSCOPIO La configuración del microscopio se basa en una serie de planos focales conjugados, los cuales se presentan simultáneamente en un sistema dado (Figura 15) Dichos planos se componen de dos sistemas: un conjunto de cuatro planos de campo y un conjunto de cuatro planos de difracción, que determinan posiciones definidas con respecto al objeto, elementos ópticos, fuente de luz y el ojo o cámara (DAVIDSON, et al 2001). El conocimiento de los planos focal anterior y frontal de un lente, es esencial para el ajuste y comprensión de los principios implicados en la formación de la imagen, los cuales en orden de secuencia iniciando con la fuente de luz, se establecen de la siguiente manera (MURPHY, D. 2001): Planos de Campo Planos de Apertura - Diafragma de campo - Filamento de la lámpara - Plano de campo o objeto - Diafragma del condensador - Plano de imagen real intermedio - Apertura anterior del objetivo - Retina o cámara - Salida de la pupila del ocular 49 Planos de campo Planos de apertura Conjugados conjugados Figura 15. Configuración de los planos focales conjugados en el microscopio de luz. Fuente: MURPHY, D. 2001 2.3.4 ILUMINACIÓN KOEHLER En microscopía de luz, la técnica de iluminación Koehler es empleada como método estándar ya que proporciona un control total del funcionamiento óptico para la obtención de imágenes de calidad, generando la iluminación uniforme del espécimen (DAVIDSON, et al 2001). El principio de la iluminación del microscopio, por el método de Koehler, se basa en el uso de un juego de lentes involucrados con el fin de controlar los factores fundamentales en iluminación, en el cual un lente (lente de la lámpara) es situado frente a la lámpara. El plano focal anterior de este lente es usado como fuente de luz para iluminar el espécimen, lo que garantiza iluminación uniforme desde cualquier punto donde la lámpara esté, por lo que su luz será distribuida incluso en el plano focal anterior. En este plano se encuentra el iris de 50 campo, el cual controla el tamaño de la fuente eficaz, y por lo tanto el tamaño del área iluminada sobre el espécimen (COX, G. 2002). El iris de campo y por tanto el plano focal anterior del lente de la lámpara es enfocado sobre el espécimen por el condensador. En el plano focal anterior del condensador se encuentra otro iris el cual controlará el ángulo de luz que alcanza el espécimen y debe por tanto ajustarse para diferentes aperturas numéricas en los objetivos (COX, J. 2002). 2.3.5 COMPONENTES OPTICOS DEL MICROSCOPIO DE LUZ En el uso del microscopio se encuentran dos principios involucrados: la magnificación (capacidad de aumentar el tamaño de una imagen) y la resolución (capacidad de producir una imagen nítida, o la capacidad del instrumento para dar imágenes bien definidas de puntos situados muy cerca uno del otro). El microscopio de luz compuesto, se basa en el uso de luz visible para producir una imagen magnificada de un objeto (o espécimen) que se proyecta sobre la retina del ojo o sobre un dispositivo de proyección de imagen. Éste es el resultado de dos sistemas de lentes los cuales trabajan juntos para producir la magnificación final de la imagen (MURPHY, D. 2001): (1) El lente del objetivo, el cual colecta la luz difractada por el espécimen y forma una imagen real magnificada en el plano de imagen intermedio cerca al ocular. Los objetivos del microscopio, están diseñados para proyectar una imagen en un plano fijo (plano de imagen intermedio) el cual está establecido por la longitud del tubo del microscopio y situado a una distancia especifica del plano focal anterior con respecto a la distancia del objetivo. Los especímenes son reflejados en una distancia muy corta más allá del plano focal frontal del objetivo con un medio de índice de refracción definido, generalmente aire, agua, glicerina, o aceites de inmersión especializados (MURPHY, D. 2001). En la obtención de imágenes de calidad, los objetivos presentan una serie de especificaciones que aportan valor (Figura 16): - Correcciones ópticas: Se encuentran usualmente abreviadas como Achro (acromático), Apo (apocromático), y Fl, Fluar, Fluor, Neofluar, o Fluotar (fluorina) lo 51 que indica corrección para aberraciones esféricas y cromáticas. Y como Plan, Pl, EF, Acroplan, Plan Apo o Plano para correcciones de curvatura de campo. - Apertura numérica: Es un valor crítico que indica el ángulo de aceptación de luz el cual alternadamente determina la energía de luz acumulada, energía de resolución, y profundidad de campo del objetivo. - Longitud mecánica del tubo: Es la longitud del tubo del cuerpo del microscopio entre la pieza, donde es incorporado el objetivo, y el borde superior de los tubos de observación donde se insertan los oculares. La longitud del tubo usualmente está escrita sobre el objetivo como el tamaño en milímetros (160, 170, 210, etc.) para las longitudes fijas, o el símbolo infinito () para el longitudes de tubo corregidas a infinito. - Grosor del cubreobjeto: La mayoría de luz transmitida de los objetivos se designa a la imagen de los especímenes que son cubiertos por un cubreobjeto. El grosor de estas placas está actualmente estandarizado a 0.17 mm para la mayoría de aplicaciones, aunque hay algunas variaciones en el grosor de ciertos portaobjetos. Por esta razón algunos de los objetivos de apertura numérica alta tienen un ajuste de corrección de los elementos internos del lente para compensar esta variación. - Medio de inmersión: La mayoría de los objetivos se designan a la imagen del espécimen con aire como el medio entre el objetivo y el cubreobjeto. Para lograr aperturas numéricas de un funcionamiento más alto, muchos objetivos se designan a la imagen del espécimen con otro medio que reduzca diferencias del índice de refracción entre el cristal y el medio de proyección de imagen. - Códigos de color: Permiten una identificación rápida de la magnificación. Algunos objetivos especializados tienen un código de color adicional que indica el tipo de medio de inmersión necesario para alcanzar la apertura numérica óptima. - Propiedades ópticas especializadas: Los objetivos del microscopio usualmente tienen designados parámetros que optimizan el funcionamiento sobre condiciones específicas. Como los designados para luz polarizada, contraste diferencial de interferencia y fluorescencia entre otros (INOUÉ, et al 1995). 52 Figura 16. Especificaciones del objetivo Fuente: MURPHY, D. 2001 (2) El lente del condensador, el cual concentra la luz del iluminador sobre una pequeña área del espécimen. La subetapa del condensador recoge luz de la fuente de luz del microscopio y la concentra en un cono de de luz que ilumina el espécimen con rayos paralelos de intensidad uniforme de todos los ángulos sobre el campo de vista (ABRAMOWITZ, D. 1987). El ajuste de apertura y enfoque adecuado del condensador son de importancia crítica para aprovechar el potencial completo del objetivo. El uso apropiado de la apertura ajustable del iris del diafragma permite asegurar la correcta iluminación, contraste y profundidad de campo. El cierre y apertura de este iris controla el ángulo de los rayos luminosos los cuales pasan a través del condensador, a través del espécimen y luego al objetivo (DAVIDSON, et al 2001). 2.3.6 TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA DE LUZ El desarrollo de técnicas de contraste en microscopía, permite mejorar la visibilidad del espécimen proporcionando una imagen más definida. La habilidad de un detalle para 53 resaltar contra el fondo u otro detalle adyacente es una medida del contraste del espécimen (DAVIDSON, et al 2001). En microscopía óptica es posible distinguir variantes que ofrecen diferentes imágenes de un mismo objeto de estudio, según sea la naturaleza del material, sus características y el objetivo para el que se examina, lo que permite la elección de una u otra técnica específica. 2.3.6.1 Microscopía de campo claro La técnica de campo claro efectúa la iluminación del espécimen con un cono sólido de rayos. En esta, la absorción en gran parte y la difracción en un menor grado de importancia, dan lugar a la formación de la imagen (MURPHY, D. 2001). La iluminación del espécimen se basa en la conducción de luz proveniente de la lámpara hacia el lente situado bajo el condensador, el cual proyecta un cono de luz sobre este. Luego de atravesarlo, el haz luminoso, en forma de cono, penetra en el objetivo; el objetivo proyecta una imagen aumentada en el plano focal del ocular, que nuevamente la amplia. Por lo que la imagen provista por el ocular puede ser percibida por la retina del ojo (Figura 17) (BARRERA, et al 1997). Figura 17. Mecanismo óptico del microscopio de campo brillante. Fuente: LASSLET, 2006 54 Los objetos son observados en la trayectoria de luz, porque la pigmentación natural o las tinciones absorben luz diferencialmente, o porque son lo suficientemente gruesas para una cantidad significativa de luz a pesar de ser incoloras (BARRERA, et al 1997). 2.3.6.2 Microscopía de contraste de fases La técnica de contraste de fases se basa en el retraso en la longitud de onda que pueden producir diversas estructuras con índices de refracción distintos. Mediante un sistema óptico, las diferencias de fase, en las cuales se altera levemente la fase de la luz difractada por el espécimen, se traducen en diferencias de amplitud las cuales generan cambios en la amplitud de la imagen que son detectados por el ojo humano como diferencias en la intensidad luminosa (MURPHY, D. 2001). En la microscopía de contraste de fases, se distinguen dos tipos de contraste, lo cual depende de la aceleración o retraso en la luz directa (Figura 18): Contraste de fase positivo u oscuro: basado en la aceleración de la luz directa ¼ de longitud de onda, por lo que la diferencia en la longitud de onda entre la luz directa y difractada para un espécimen de fase es de ½ de longitud de onda, causando interferencia destructiva entre la luz directa y difractada la cual llega al nivel de imagen del ocular lo que resulta en la aparición de detalles oscuros contra un fondo más claro (ABRAMOWITZ, M. 1987). Contraste de fase negativo o brillante: basado en el retraso de la luz directa ¼ de longitud de onda, por lo que la luz directa y difractada alcanzan el ocular y pueden interferir constructivamente, lo que resulta en una imagen brillante de los detalles del espécimen sobre un fondo oscuro (PLUTA, 1989). 55 Figura 18. Esquema descriptivo de contraste de fase Positivo (a) y Negativo (b) Fuente: (ABRAMOWITZ, M. 1987). El método involucra la separación de la luz directa de orden cero, de la luz difractada en el plano focal anterior del objetivo, ubicando para esto, un aro anular en posición directa bajo el lente inferior del condensador (plano focal frontal). Debido a que el cono hueco de luz de dicho anular pasa a través del espécimen sin desviarse, éste alcanza el plano focal anterior del objetivo en forma de aro de luz. La luz más tenue difractada por el espécimen, es entonces dispersada por todo el plano focal anterior del objetivo (ABRAMOWITZ, M. 1987). Para acelerar la luz directa de orden cero, el microscopio para contraste de fases presenta una placa de fase con un aro formado “desfasador” sobre ésta, en el plano focal anterior del objetivo. El área estrecha del aro de la placa de fase es más delgada que el resto de la placa (Figura 19); generando como resultado, que la luz no desviada que pasa a través del aro de fase, viaje una distancia mas corta en atravesar el objetivo con respecto a la luz difractada (DAVIDSON, et al 2001). 56 Placa de Fase Anular Figura 19. Configuración esquemática para microscopía de contraste de fases. Fuente: DAVIDSON, et al 2001. El diseño óptico para la implementación de la técnica, se basa entonces en dos aspectos esenciales: 1) el aislamiento de los rayos circundantes y difractados emergiendo del espécimen para que estos ocupen diferentes posiciones en el plano de difracción en la apertura anterior del lente del objetivo, y 2) el avance en fase y la reducción en la amplitud de la luz circundante, con el fin de maximizar diferencias en amplitud entre el objeto y el fondo en el plano de imagen; lo que requiere por tanto el empleo de dos piezas fundamentales para el equipamiento del microscopio: un condensador anular y un lente del objetivo sosteniendo una placa de fase (MURPHY, D. 2001). 2.3.6.3 Microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) La microscopía de contraste de interferencia diferencial, se basa en la interferencia de cada rayo de luz, con otro que pasa a través del espécimen una distancia muy corta lejos de él. Si el índice de refracción del espécimen cambia en este punto, se efectuará una diferencia en 57 la trayectoria entre los dos rayos, mientras si es uniforme no se presentará, por lo que el contraste observado al final de la imagen dependerá del cambio en el índice de refracción. El principio de la técnica consiste en el manejo de óptica de interferencia de rayo-dual basada en luz polarizada y dos dispositivos los cuales actúan separando o recombinando los rayos denominados prismas Wollaston (COX, G. 2002). Esta involucra el paso de la luz proveniente de la lámpara, a través de un polarizador localizado bajo el condensador (Figura 20). RAYOS DE LUZ CON RAYOS DE LUZ TRANSMITIDA POR ORIENTACIÓN AL AZAR DEL EL POLARIZADOR LOS CUALES TIENEN PLANO DE VIBRACIÓN EL MISMO PLANO DE VIBRACIÓN Figura 20. Incidencia al azar de los rayos de luz en un polarizador Fuente: (ABRAMOWITZ, M. 1987). Consecuentemente en la trayectoria de la luz de este plano de luz polarizada, se encuentra un prisma Wollaston modificado, situado bajo el lente inferior del condensador, el cual separa el rayo entrante de luz polarizada en dos rayos viajando en direcciones levemente diferentes. Los rayos de luz emergentes vibran a 90 grados en relación uno del otro con una leve diferencia en la trayectoria (Figura 21) (ABRAMOWITZ, 1987). Y se interceptan 58 Figura 21. Representación esquemática del Prisma Wollaston Modificado Fuente: ABRAMOWITZ, M. 1987. posteriormente en el plano focal frontal del condensador, donde viajan paralelos y extremadamente cerca con una leve diferencia en la trayectoria pero vibrando aún perpendicularmente uno del otro, por lo que son incapaces de interferir (Figura 22) (BRADBURY, et al 1996). Figura 22. Ilustración esquemática de la configuración del microscopio para contraste diferencial de interferencia. Fuente: DAVIDSON, et al 2001 59 Los rayos separados entran y pasan a través del espécimen, donde sus trayectorias son alteradas según las variaciones en el grosor, inclinación e índices de refracción del mismo. Estas variaciones causan alteraciones en la trayectoria de la onda de ambos rayos pasando a través de áreas de detalles del espécimen (Figura 23). Los rayos paralelos están aún avanzando a través del microscopio dentro del objetivo donde son enfocados en el plano focal anterior del objetivo, e ingresan posteriormente a un segundo prisma que combina los dos rayos. Esto remueve la cizalla y la diferencia en la trayectoria original entre los pares de rayos (ABRAMOWITZ, 1987). Figura 23. Trayectorias de onda alterando el espécimen de áreas adyacentes de acuerdo con el grosor e índice de refracción Fuente: ABRAMOWITZ.1987. Para que los rayos interfieran, las vibraciones de los rayos de diferente longitud de trayectoria deben ser conducidas en el mismo plano y eje. Esto es llevado a cabo ubicando un segundo polarizador (analizador) sobre el prisma superior que combina los rayos. La luz procede entonces a través del ocular, donde puede observarse como diferencias en intensidad y color (ABRAMOWITZ, 1987). La imagen producida finalmente, presenta una apariencia atrayente “bajorrelieve” con una parte de cada objeto apareciendo brillante (o posiblemente en color) y la otra sombreada (o de otro color). Los efectos de color y/o intensidad de luz observados en la imagen están relacionados al cambio en el índice de refracción, el grosor o ambos en detalles a áreas adyacentes del espécimen (COX, 2002). 60 3. JUSTIFICACIÓN A través de los años, Colombia ha logrado alcanzar un importante posicionamiento en el mercado internacional de las flores, el cual se encuentra altamente diversificado convirtiéndose en el principal proveedor de productos tradicionales como la rosa, el clavel y el pompón. Sin embargo, las empresas floricultoras se enfrentan a problemas fitosanitarios que reducen la calidad de los cultivos, generando pérdidas económicas, tiempo y esfuerzos. Alrededor de un 80 % de las enfermedades en plantas son causadas por hongos, siendo los cultivos de flores altamente susceptibles debido a muchos factores y condiciones que pueden favorecer la proliferación de microorganismos patógenos. Así mismo, se encuentran fallas en cuanto a los planes de manejo adecuados los cuales involucran un seguimiento y control de enfermedades lo que requiere del conocimiento y análisis de los agentes causales; consecuencia indirecta de la falta de herramientas necesarias que conducen a garantizar la identificación de patógenos tomando por ende las medidas pertinentes para su control. Actualmente, el país presenta una gran falencia en cuanto al acceso a equipos que proporcionen tecnologías avanzadas en la identificación morfológica de microorganismos de interés en varios niveles. Además, no se cuenta con información apreciable disponible, ya que aunque en ocasiones se desarrollan estudios referentes al tema, las investigaciones se han centrado en la solución de problemas existentes, sin generar documentos que permitan su consulta posterior. Esta escasez de información es atribuida principalmente a la falta de equipos, tecnología y herramientas eficaces para el logro de dicho objetivo. Por otra parte, ya que los controles de sanidad vegetal son fundamentales como criterio de aceptación de producto, y eje central en las regulaciones para la prevención de enfermedades, contar con material gráfico que proporcione imágenes útiles en la detección de microorganismos patógenos, es indispensable como instrumento de referencia para la identificación confiable de éstos y el logro de un enfoque preventivo correcto, lo que contribuye al beneficio del sector. 61 Por lo anterior, y debido al escaso material disponible hasta el momento, el presente trabajo propone desde la microbiología y mediante la aplicación de microscopía de luz, la elaboración de un atlas para la descripción de hongos fitopatógenos que afectan flores de corte, el cual aporte información valiosa que pueda ser empleada y comprendida desde diversos campos, permitiendo de este modo, una aproximación a un mejor conocimiento de los microorganismos implicados, no solo para la prevención y solución de problemas, sino también como instrumento de referencia. 62 4. OBJETIVOS 4.1 OBJETIVO GENERAL Elaborar un atlas descriptivo de los principales hongos fitopatógenos que afectan flores de corte de especies cultivadas en la Sabana de Bogotá. 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Aislar e identificar hongos fitopatógenos de mayor incidencia en especies de flores de corte a partir de material vegetal infectado con sintomatología presuntiva de enfermedad fúngica. Caracterizar morfológicamente los principales hongos causantes de enfermedad en flores de corte cultivadas en la Sabana de Bogotá. Obtener, mediante microscopia de luz y fotografía digital, imágenes representativas para la descripción microscópica y macroscópica de hongos y la manifestación de enfermedades en los distintos órganos de las plantas, las cuales permiten una aproximación en la identificación del agente causal. 63 5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN El estudio realizado, se basó en un componente experimental el cual incluyó el aislamiento y obtención de microorganismos a partir de material vegetal infectado, con el fin de aportar material gráfico útil en la evaluación y reconocimiento de hongos fitopatógenos de importancia en cultivos de flores de corte, mediante un enfoque descriptivo soportado en argumentación bibliográfica y la aplicación de técnicas de microscopía de luz. 5.1.1 Población de estudio y muestra La población de estudio comprendió muestras de cepas de hongos y plantas presentando los signos y sintomatología característicos de enfermedad. La colección de microorganismos fue realizada con base en las muestras enviadas para análisis en el lugar de estudio, y las colectadas en el transcurso de la investigación. El tamaño de muestra estuvo sujeto al número de aislamientos y la capacidad de preparaciones realizadas durante el trabajo en el cultivo. 5.2 MÉTODOS 5.2.1 Localización del área de muestreo Las muestras fueron obtenidas de los invernaderos del cultivo Americaflor Ltda., distribuidos en varias locaciones de la Sabana de Bogotá, para su posterior procesamiento, el cual fue llevado a cabo en el laboratorio de Sanidad Vegetal de éste, ubicado en el municipio de Cajicá, Cundinamarca. El análisis, caracterización y toma de imágenes de microorganismos fue efectuado en la Corporación MICROS, situada en el municipio de Chía, Cundinamarca. 5.2.2 Método de muestreo Se colectaron muestras basadas en material vegetal con síntomas típicos de enfermedad fúngica, procedentes de tres partes puntuales: flor, hoja y tallo, las cuales fueron transportadas en bolsas y procesadas para el aislamiento de microorganismos. 64 La preparación de material para la observación microscópica, se realizó mediante montaje de el láminas en fresco por muestreo directo, y/o impronta. Cada preparación contenía las estructuras diagnósticas características de cada género o especie, para su posterior toma de imágenes. La preparación de material para descripción macroscópica se efectuó mediante la adquisición de hongos crecidos en cajas de petri y la observación de plantas con previa confirmación de la presencia del microorganismo, paso que igualmente incluyó la toma de fotografías representativas. 5.3 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS 5.3.1 Aislamiento de microorganismos El aislamiento y recuperación de microorganismos se realizó mediante cortes de tejido 2 vegetal de 1 cm tomados de la zona de transición entre el tejido sano y el enfermo en los diferentes órganos de la planta y la consecuente desinfección del mismo por inmersión en solución de hipoclorito de sodio al 1%, efectuando luego enjuagues con agua clorada estéril para retirar el exceso de germicidas (García, et al. 2003). La siembra se efectuó mediante la transferencia a partir del material infectado con aguja de disección de una porción de micelio o mediante el pase de tres o cuatro secciones del tejido de cada órgano a cajas de petri conteniendo medio de cultivo: Agar Papa Dextrosa (PDA), Agar (V8), Agar Corn meal (CMA), Agar Ácido gálico (GAA) y Agar (P5). Los medios fueron incubados por 5 -7 días a 22 – 25 °C (Sylvia, 1998). La purificación de microorganismos se realizó a través del pase de éstos en los medios iniciales y la idoneidad de las cepas fue efectuada a partir del reconocimiento de características macroscópicas mediante evaluación de criterios como: color, topografía, textura, tasa de crecimiento y producción de pigmentos, y verificación microscópica mediante análisis morfológico basado en la observación e identificación de estructuras típicas. La recuperación de microorganismos no cultivables, se desarrolló mediante la técnica de cámara húmeda colocando partes del material vegetal en recipientes estériles y toallas humedecidas, incubadas a temperatura ambiente, realizando observaciones frecuentes hasta obtener masa fúngica sobre el material que posibilitara la observación al microscopio. 65 5.4 MICROSCOPÍA La evaluación de estructuras para descripción morfológica fue realizada a través de microscopio óptico (BX51, Olympus) efectuando observaciones con magnificaciones 20x (A.N. 0.50), 40x (A.N. 0.65), 60x (A.N. 0.75, Inmersión en aceite) y 100x (A.N. 1.30, Inmersión en aceite) y mediante el examen del material con tinción azul de lactofenol y montajes en agua, aplicando técnicas de microscopía de luz las cuales incluyeron: Microscopía de campo brillante Microscopía de contraste de fases Microscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC) 5.4.1 Obtención de imágenes La obtención de imágenes micromorfológicas fue llevada a cabo mediante cámara digital (Olympus DP50) incorporada al microscopio óptico en uso (BX51, Olympus), y analizada empleando un software de adquisición de imágenes, como base fundamental para el análisis descriptivo relativo a características microscópicas, seleccionando finalmente la fotomicrografía mas representativa como resultado de la técnica de microscopía elegida para tal fin con cada microorganismo evaluado. Así mismo, se obtuvieron fotografías mediante cámara digital referentes a características macroscópicas de los microorganismos implicados, y la manifestación de la enfermedad (Evidenciada por los signos y sintomatología característicos) en plantas. 5.5 RECOLECCION DE INFORMACION Y ANALISIS DESCRIPTIVO El análisis descriptivo basado en la caracterización de microorganismos incluyó además de la descripción pertinente a especies de hongos, plantas y características específicas acerca de la manifestación de enfermedades en las mismas. Dicho análisis fue soportado con material bibliográfico con el fin obtener y proporcionar finalmente información completa sobre los aspectos fundamentales implicados en el presente estudio. 66 5.6 DISEÑO Y ELABORACIÓN DEL ATLAS El compendio de información fue finalmente representado mediante en el atlas de fitopatología el cual colecta la totalidad del trabajo desarrollado en el transcurso del estudio mediante las herramientas y material proporcionado por el cultivo (Americaflor Ltda.) y el apoyo de la corporación MICROS. 67 6. RESULTADOS 6.1 Identificación y descripción de enfermedades fúngicas en flores de corte 6.1.1 ALSTROEMERIA Figura 24. Alstroemeria 6.1.1.1 Hongos fitopatógenos en Alstroemeria MANCHAS EN LAS HOJAS Agente causal: Alternaria sp. El hongo ataca principalmente las hojas, presentando pequeñas manchas aceitosas circulares de color café frecuentemente rodeadas de un halo amarillo. Las manchas tienen la característica de tener anillos concéntricos oscuros, sobre los cuales se producen esporas polvorientas (Figura 25). 68 Figura 25. Síntomas iniciales de enfermedad por Alternaria sp. en hojas de Alstroemeria Usualmente, las hojas senescentes de la parte inferior de la planta, son atacadas en primer término, pero la enfermedad asciende hacia la parte superior de ésta y hace que las hojas afectadas se tornen amarillas y endebles (Figura 26), por lo que se desecan y debilitan hasta desprenderse finalmente. Figura 26. Formación de manchas aceitosas por infección con Alternaria sp 69 PODREDUMBRE GRIS Agente causal: Botrytis sp. Síntomas El fitopatógeno coloniza tejidos vegetales que entran en etapa de senescencia o que están sometidos a estrés. Se manifiesta mediante la aparición de puntos y manchas, destruyendo los pétalos. Sin embargo también causa ulceraciones en el tallo y produce lesiones en brotes jóvenes, manifestándose por el deterioro de los tejidos, los cuales toman una coloración café, presentando también sequedad. Figura 27. Deterioro de tejidos y formación de micelio de Botritys sp. en tallo En las hojas básales y tallo, es posible evidenciar la presencia de una capa densa color grisáceo, como resultado del desarrollo del hongo, el cual con el tiempo y conforme avanza la enfermedad cubre por completo el tejido afectado con un micelio gris del cual se liberan esporas negras (Figura 27). 70 6.1.2 ANIGOZANTHUS Figura 28. Anigozanthus 6.1.2.1 Hongos fitopatógenos en Anigozanthus PODREDUMBRE GRIS Agente causal: Botrytis sp. Síntomas El hongo ataca principalmente las hojas, presentando en los síntomas iniciales decoloración ascendente, a causa del desecamiento y quemazón de los tejidos, por lo que se tornan de color café pálido bordeadas por una zona negra intensa al final de lesión (Figura 29). Figura 29. Manchas causadas por Botritys sp. en hojas de Anigozanthus 71 Cuando la enfermedad avanza, y como consecuencia del desarrollo del patógeno, se presenta la formación de masas de esporas de color grisáceo-pardo de paredes delgadas, lo cual se favorece bajo condiciones de clima nublado, húmedo y fresco. 6.1.3 ANTIRRHINUM MAJUS (SNAPDRAGON) Figura 30. Snapdragon 6.1.3.1 Hongos fitopatógenos en antirrhinum majus (snapdragon) PODREDUMBRE GRIS Agente causal: Botrytis sp. Síntomas El fitopatógeno produce el marchitamiento de hojas, sobre las cuales se evidencia el crecimiento de un moho gris apareciendo en las zonas más afectadas. Éste puede presentarse en forma de esclerocios o de micelio, desarrollándose sobre restos de plantas en proceso de descomposición. 72 Figura 31. Pudrición de tejidos con presencia de micelio del patógeno. Las hojas se tornan café, y presentan pudrición hasta obtener finalmente la muerte del órgano implicado (Figura 31). Agente Causal: Sclerotinia sp. Síntomas Figura 32. Lesión inicial de tejidos de Snapdragon por Sclerotinia sp. La infección inicia en la base del tallo, a partir de la cual asciende hasta afectar las hojas, provocando un decaimiento general de la planta (Figura 32). A medida que la enfermedad 73 avanza, el hongo induce una pudrición blanda acompañada de micelio algodonoso blanco (Figura 33). Figura 33. Decaimiento generalizado de la planta con aparición de micelio de Sclerotinia sp. en tallos Al interior del tallo, es posible encontrar cuerpos fructificantes conocidos como esclerocios. El desarrollo del patógeno se ve favorecido bajo condiciones de temperatura media y húmeda relativa alta, cuando ataca principalmente las partes más susceptibles de la planta. 6.1.4 CLAVEL Figura 34. Clavel 74 6.1.4.1 Hongos fitopatógenos en Clavel PODREDUMBRE GRIS Agente causal: Botrytis sp. Síntomas El hongo se establece en los pétalos de la flor, los cuales son particularmente susceptibles a envejecer, produciendo un micelio abundante. Genera también lesiones en el tallo, las cuales pueden ser hendidas, alargadas y de color oscuro de contorno bien definido o pueden extenderse sobre éste y hacer que se debilite y se quiebre a nivel de la zona de infección (Figura 35). (CHÁVEZ et al 1982) Figura 35. Plantas de clavel afectadas por Botritys sp. Decaimiento de ramas y presencia de micelio en flor. Cuando el clima es húmedo y frío el micelio del hongo produce numerosos conidios que causa varias infecciones, pero el micelio también se desarrolla, penetra e invade el resto de la inflorescencia la cual se llena de un moho de color grisáceo a café claro. (AGRIOS 1991) 75 ENFERMEDAD DE LA RAMA Agente causal: Fusarium roseum Síntomas El hongo se caracteriza por la invasión de los tallos a nivel de la base de la planta. Por lo general, se observa un decaimiento de la misma y una pudrición de tejidos de tallos infectados que progresa de adentro hacia fuera. Los órganos afectados se tornan de color amarillo y las ramas presentan resequedad como consecuencia del taponamiento vascular generado por el hongo (Figura 36). Figura 36. Infección avanzada de Fusarium roseum presentando muerte de tejidos La enfermedad es bastante común en lugares de mucha humedad y puede matar completamente la planta. En una planta adulta que aparenta estar sana en el tallo a nivel del nudo, aparece una mancha rosácea con el centro blanco y un poco amarillento. 76 MANCHA ANILLADA DEL CLAVEL Agente causal: Heterosporium sp. Síntomas Figura 37. Síntomas iniciales de enfermedad por Heterosporium sp. en hojas de clavel La enfermedad ataca toda la parte aérea de la planta con especial preferencia por las hojas y las flores. El síntoma característico se produce en hojas y sépalos. En las hojas, comienza a manifestarse como manchas pequeñas de color púrpura que más tarde se ensanchan, mostrando centro cremoso o gris claro y margen púrpura. En el centro de las lesiones aparece un moho oscuro que contiene los conidióforos y conidios del hongo (Figura 37). En los pétalos el hongo induce el desarrollo de manchas color marrón-claro, donde produce una gran cantidad de conidios (Figura 38). Los botones florales con infecciones severas se abren prematuramente y las flores emergentes no alcanzan el tamaño normal. Figura 38. Botón de clavel afectado por Heterosporium sp. 77 MAYA DEL CLAVEL Agente causal: Fusarium oxysporum Síntomas La enfermedad se caracteriza por la apariencia unilateral de los síntomas de marchitamiento, acompañado por el amarillamiento parcial de las hojas y el doblamiento de los brotes hacia un lado de la planta enferma. En estados iniciales en las hojas pueden observarse la mitad clorótica y la otra mitad de un verde normal el marchitamiento es progresivo de la base del tallo hacia arriba, hasta causar un marchitamiento general y la muerte. Al realizar un corte transversal del tallo, es posible evidenciar la presencia del patógeno la cual es identificada por un oscurecimiento sectorial de los vasos conductores en forma de anillo alrededor del cilindro vascular de los tallos infectados (Figura 39). Figura 39. Corte transversal de un tallo de clavel afectado por Fusarium oxysporum El hongo también daña y bloquea los haces vasculares de la raíz del clavel, y se disemina a través del xilema, causando además una pudrición del cuello, y finalmente, la muerte de la planta. 78 Agente Causal: Sclerotinia sp. Síntomas Los síntomas se evidencian por la generación de una pudrición blanda, con lesiones marrones sobre los tallos, sobre los cuales se desarrolla la formación de masas algodonosas de color blanco, correspondientes al micelio del patógeno, sobre los tejidos afectados. El hongo se caracteriza por desarrollar cuerpos fructificantes resistentes de color negro grisáceo y forma circular u ovalada sobre el micelio, conocidos como “esclerocios”, los cuales se encuentran dentro o sobre los tallos. Los tejidos localizados arriba de la lesión se marchitan y mueren con el tiempo (Figura 40). Las esporas germinan sobre tejido sano y sobre órganos enfermos y al hacerlo invade tejidos y completa su desarrollo formando nuevamente esclerocios, forma en la cual el microorganismo inverna en el suelo. Figura 40. Síntomas avanzados de infección por Sclerotinia sp. en rama de clavel 79 6.1.5 DELPHINIUM Figura 41. Delphinium 6.1.5.1 Hongos fitopatógenos en Delphinium PODREDUMBRE GRIS Agente causal: Botrytis sp. Síntomas Bajo condiciones muy húmedas, una capa fina grisácea de micelio puede ser visible. Una estructura llamada "conidióforo" que contiene esporas crece a menudo en el tejido (Figura 42). Cuando se sacuden las plantas infectadas, grandes nubes de polvo que contienen esporas pueden ocurrir. Figura 42. Corona en Delphinium afectada por Botritys sp. 80 El hongo no invade tejido celular verde saludable como hojas y tallos a menos que se encuentre presente un área injuriada o muerta, o que crezca directamente de una base como un pétalo u hoja caída. El hongo ataca primero tejidos afectados presentando pudrición (Figura 43) y posteriormente afecta tejido saludable. Figura 43. Atrofia y pudrición de tejidos con formación de micelio algodonoso de Botritys sp. en Delphinium MILDEO POLVOSO Agente causal: Erysiphe cichoracecearum Síntomas Los síntomas presentan el desarrollo de parches blancos difusos sobre las hojas, en donde crece el hongo, especialmente en el haz. Con el avance de la enfermedad el patógeno genera un recubrimiento, por lo que se evidencia un aspecto polvoso blancuzco (Figura 44). 81 Figura 44. Síntomas de Mildeo Polvoso sobre el haz de una hoja en Delphinium En ataques severos, se presenta clorosis o necrosis en el tejido por debajo de la mancha, en el envés de las hojas y sobre los tallos, e incluso pedúnculos y flores pueden ser afectados (Figura 45). Figura 45. Tallo con necrosis por infección de Mildeo Polvoso 82 MANCHAS EN LAS HOJAS Agente causal: Alternaria sp. Sintomas Los síntomas iniciales de enfermedad, presentan puntos pequeños en la hoja, circulares, y húmedos. Posteriormente, las manchas se agrandan hasta 13 milímetros de diámetro con los anillos concéntricos oscuros dentro de los puntos (Figura 46). Los puntos se unen para afectar áreas grandes de hojas, afectando fuertemente el órgano hasta causar el deshoje. Figura 46. Haz de una hoja con manchas causadas por Alternaria en Delphinium 6.1.6 GERBERA Figura 47. Gerbera 83 6.1.6.1 Hongos fitopatógenos en Gerbera PODREDUMBRE GRIS Agente causal: Botrytis sp. Síntomas La infección se inicia en tejidos senescentes y en descomposición, especialmente en flores que han quedado sin cosechar. Se evidencian manchas pequeñas color café sobre los pétalos, las cuales con el tiempo, se agrandan tomando una forma ovalada (Figura 48). Cuando la enfermedad se encuentra en un estado avanzado, se desarrollan pequeñas esporas grises sobre afección, las cuales son las encargadas de diseminar el hongo e iniciar infecciones en hojas y flores de otras plantas. Figura 48. Mancha en pétalo de Gerbera afectado con Botritys sp. 84 MANCHAS EN LAS HOJAS Agente causal : Alternaria sp. Sintomas El hongo genera la formación de pequeñas manchas acuosas, las cuales presentan aspecto de ampollas sobre el envés de las hojas inferiores. Cuando las manchas maduran, los centros aparecen hundidos de color marrón y pueden mostrar halos difusos amarillos. Finalmente las manchas aparecen en el haz de las hojas. Si las condiciones siguen siendo apropiadas para el desarrollo de la enfermedad, las manchas se agrandan. En ciertos casos, las lesiones muestran anillos concéntricos y las lesiones próximas pueden unirse. En los pétalos, aunque menos incidente, es posible evidenciar la presencia del hongo, sobre los cuales se observan diminutas lesiones pálidas circulares (Figura 49). Figura 49. Manchas acuosas causadas por Alternaria sp. en pétalos 85 Agente causal: Itersonilia perplexans. Sintomas El patógeno se encuentra muy distribuido como saprofito de la superficie foliar. Pero causa también marchites de pétalos, especialmente en el aire libre y en condiciones húmedas. Las lesiones se inician con manchas pequeñas como cabezas de alfiler pardas, en las flores externas del capitulo, las cuales se extienden tomando posteriormente una coloración amarilla de borde oscuro, y aparecen cubiertas desde el centro hacia afuera por una eflorescencia blanca opaca (Figura 50) . Figura 50. Lesiones características de Itersonilia sp en pétalos de Gerbera Las lesiones se presentan mayormente en los pétalos externos, y consecuente afectan la flor hacia el interior hasta causar el decaimiento total de la misma. 86 6.1.7 GIRASOL Figura 51. Girasol 6.1.7.1 Hongos Fitopatógenos en Girasol MILDEO POLVOSO Agente causal Sphaerotheca sp. Síntomas Los síntomas de la enfermedad se manifiestan en las hojas, sobre las cuales se genera una clorosis alrededor de las nervaduras principales, la cual se evidencia principalmente en el haz (Figura 52). Figura 52. Hoja de girasol afectada con Mildeo Polvoso 87 Como resultado del ataque del hongo, se observan parches radiales blanquecinos pertenecientes al micelio y fructificaciones asexuales del hongo. En condiciones en que la humedad atmosférica es alta se forman en el envés de las hojas, en las partes invadidas por el micelio, una capa blanca que esta integrada por zoosporangios del hongo. Agente causal: Sclerotinia sp. Síntomas El primer síntoma aparece durante la mascencia y se manifiesta en que el tallo bajo los cotiledones se vuelve blanco y estos decaen hasta el suelo. La infección se produce por micelios, los cuales han invernado sobre las semillas y también por contacto de la semilla con esclerocios del capítulo. Después en el tallo y en la base del capítulo se van pudriendo superficies blandas, apareciendo en estos lugares micelios blancos que después de poco tiempo empiezan a secarse y se forman esclerocios oscuros. El tallo se vuelve débil, las hojas se secan y se caen (Figura 53). Figura 53. Decaimiento y pudrición de una rama de Girasol afectada con Sclerotinia sp. Por ultimo se presenta la infección del capítulo, cuya parte inferior se vuelve blanda, mas tarde toma un color marrón y aparece un tejido algodonoso blanquecino. 88 6.1.8 GYPSOPHYLA Figura 54. Gypsophila 6.1.8.1 Hongos Fitopatógenos en Gypsophyla Agente causal: Sclerotinia sp. Síntomas La enfermedad afecta principalmente los tallos, los cuales presentan un decaimiento generalizado, que inicia usualmente en la porción terminal y avanza hacia la corona. Conforme avanza la enfermedad los órganos se tornan pálidos y presentan alta resequedad. Figura 55. Síntomas avanzados de enfermedad en tallos de Gypsophila. Atrofia de órganos y presencia interna de esclerocios 89 La porción de la corteza ubicada entre la corona y aproximadamente 10 cm de altura de los tallos, se vuelve blanquecina y en el corte longitudinal es posible encontrar esclerocios ovales de color negruzco, los cuales son los resultantes de las fructificaciones del hongo (Figura 55). PUDRICIONES DE TALLO Y RAÍZ Agente causal: Pythium sp. Síntomas El primer síntoma es el amarillamiento de las hojas inferiores de la planta, indicativo de un problema radicular (Figura 56).Específicamente sobresale la necrosis parcial o total de las raíces cuando el hongo penetra por éstas. Si la infección se da en el tallo, se observan pequeños puntos negros, los cuales evolucionan en poco tiempo. Las zonas invadidas se vuelven acuosas y decoloradas, también la parte basal del tallo, se torna más delgada y débil. Perdiendo su firmeza y soporte hasta que la planta cae sobre el suelo. El hongo sigue invadiendo la planta hasta que esta finalmente muere. Figura 56. Síntomas característicos de enfermedad por Pythium sp. en brotes de gypsophila 90 En plantas adultas, el hongo desarrolla pequeñas lesiones, causando pudrición de raíz y tallo, reduciendo considerablemente su desarrollo y crecimiento (Figura 57). Figura 57. Síntomas avanzados de enfermedad por Phytium sp. Atrofia y necrosis de raíces y tallos 6.1.9 KALES Figura 58. Kales 91 6.1.9.1 Hongos fitopatógenos en Kales MILDEO VELLOSO Agente causal: Peronospora sp. Síntomas Se localizan esporangios en las puntas de las ramas. En un principio los esporangióforos casi siempre son largos y blancos y emergen en grupos a través de los estomas de los tejidos de la planta (Figura 59). Figura 59. Síntomas iniciales de Mildeo velloso en hojas de Kyles Mas tarde, adquieren una tonalidad grisácea o café clara y forman una matriz visible constituida por las hifas del hongo en la superficie inferior de las hojas (o en ambas superficies de ellas) o bien sobre otros tejidos infectados. Cada esporangióforo crece hasta llegar a la madurez y entonces produce varios esporangios casi simultáneamente. 92 6.1.10 MOLUCELLA Figura 60. Molucella 6.1.10.1 Hongos Fitopatógenos en Molucella Agente causal: Cercospora Síntomas Se manifiesta en las hojas con pequeñas manchas necróticas de color marrón oscuro de aproximadamente 5 mm de diámetro con borde indefinido y halo clorótico al inicio de la enfermedad (Figura 61), pudiéndose encontrar solitarias distribuidas por toda la hoja. Figura 61. Mancha causada por Cercospora sp en etapas iniciales de enfermedad 93 En estadíos mas avanzados de la enfermedad, las hojas se rizan, y las manchas se ensanchan tomando forma oval, y adquiriendo una coloración amarilla intensa. El patógeno debilita finalmente los tejidos, causando la ruptura de los mismos (Figura 62). Figura 62. Hojas de Molucella infectadas con Cercospora sp. Debilitamiento y ruptura de tejidos 6.1.11 ROSA Figura 63. Rosa 94 6.1.11.1 Hongos Fitopatógenos del Rosal ROYA Agente Causal: Pragmidium sp. Sintomas Durante el desarrollo de la enfermedad,se producen cuerpos de color naranja redondeados, los cuales se observan como pequeños tumores en el envés de las hojas (Figura 64). Figura 64. Envés de una hoja mostrando pústulas de roya en rosa El haz presenta áreas cloróticas, las cuales están en correspondencia con los uredosoros del patógeno en el envés (Figura 65). Las plantas afectadas se marchitan y mueren. ´ Figura 65. Áreas cloróticas en el haz de hojas de rosa causadas por la esporulación del patógeno en el envés 95 MILDEO POLVOSO Agente causal: Sphaerotheca pannosa. Sintomas El ataque del patógeno inicia la infección sobre las hojas jóvenes de la planta, causando su deformación, con abullonado. En las hojas aparecen manchas pulverulentas de color blanco grisáceo sobre el haz y el envés; los bordes del limbo se crispan, por lo que las hojas se vuelven curvadas y deformes, tomando una forma abarquillada (Figura 66). Figura 66. Esporulación del patógeno sobre hojas de rosa El ataque se manifiesta con el recubrimiento de las estructuras fungosas blancuzcas, que forman una capa semejante a polvo, las cuales corresponden al micelio (con conidióforos) que se forman en el crecimiento ectoparásito del hongo (Figura 67). También es posible el desarrollo de manchas del patógeno en los tallos jóvenes, de forma especial, en la base de las espinas y en las partes más sensibles durante la maduración de los tallos, aunque con menor incidencia. 96 donde persisten Figura 67. Síntomas avanzados de enfermedad afectando follaje en rosas MILDEO VELLOSO Agente causal: Peronospora sparsa. Síntomas Figura 68. Síntomas iniciales de Mildeo velloso en la base de la cabeza floral del rosal. Esta enfermedad provoca severas defoliaciones y ocasiona graves debilitamientos en las plantas. Afecta a hojas, tallos y pedúnculos florales. El patógeno se caracteriza por la 97 generación de lesiones elípticas grandes a lo largo de la hoja. Manchas violáceas sobre hojas y tallo (Figura 68). Figura 69. Curvatura y enrojecimiento de tejidos de rosa afectados por Peronospora sp. Avanzada la infección, se presenta entorchamiento de las hojas y marchitamiento de las mismas. En el envés, se desarrollan áreas grisáceas, pequeñas, de aspecto velloso, que son las resultantes de la esporulación del patógeno (Figura 69).Los foliolos infectados se caen rápidamente y un cultivo infectado con severidad puede aparecer casi completamente defoliado. PODREDUMBRE GRIS Agente causal: Botrytis sp. Síntomas Figura 70. Síntomas característicos de enfermedad generados por Botritys en pétalos de rosa 98 La presencia de esta enfermedad es evidenciada por un crecimiento fúngico gris, con cuerpos oscuros realzados, productores de esporas, sobre cualquier zona de crecimiento. Se producen necrosis extensas en los tallos y brotes, pero lo más conocido es el daño que causa en las flores. En los botones florales, con diferentes grados de apertura, aparecen, primero, pequeñas manchas rojo-púrpura (Figura 70); posteriormente el micelio y las estructuras de propagación del hongo cubren toda la flor observándose en este caso una masa pulverulenta gris (Figura 71). El ambiente húmedo y la falta de viento con temperatura suave, facilita el desarrollo de la enfermedad. Figura 71. Infección severa del patógeno con producción de micelio en flor Las lesiones foliares se inician desde los márgenes hacia el interior del órgano. En éstas la penetración se produce por el estilo, pétalos o pedúnculos. En el tallo de rosa, el patógeno origina una coloración roja cobriza y hace su epidermis quebradiza desprendiéndose fácilmente del resto de la corteza. 99 VERTICILOSIS Agente causal: Verticillium sp. Síntomas Figura 72. Clorosis y enrojecimiento parcial del tallo por Verticillium sp. Al inicio de la enfermedad se observa un color amarillo en la base de la planta (Figura 72). El patógeno causa clorosis, bronceamiento o enrojecimiento y marchitez parcial de la lámina foliar. La decoloración vascular causada se distribuye en forma uniforme por todo el tallo. Los síntomas aparecen unilateralmente en la planta, produciendo necrosis del tejido vascular, y muerte generalizada del follaje. Los tallos permanecen secos hasta su muerte, y las hojas se secan y mueren de abajo hacia arriba. Finalmente, se evidencia aparición de micelio algodonoso blanco (Figura 73). Figura 73. Síntomas avanzados de enfermedad presentando necrosis unilateral y formación de micelio en tallos 100 6.1.12 SOLIDAGO Figura 74. Solidago 6.1.12.1 Hongos Fitopatógenos en Solidago MILDEO POLVOSO Agente causal: Sphaerotheca sp. Síntomas El micelio del hongo se desarrolla rápido cubriendo las superficies infectadas, siendo tenue al principio y como eflorescencias densas y de aspecto apelmazado al final de las infecciones (Figura 75).Usualmente los síntomas se presentan en las hojas más viejas, pero la infección es más severa cuando más jóvenes son las plantas al ser afectadas. Figura 75. Manchas foliares de Mildeo polvoso en solidago 101 Toda la parte aérea se puede recubrir de las eflorescencias blancas, se produce defoliación y decaimiento hasta la muerte de las plantas. ROYA Agente causal: Puccinia sp. Síntomas Figura 76. Clorosis y presencia de pústulas de Puccinia sp. en hojas de solidago Los síntomas de esta enfermedad son muy típicos, ya que se evidencian cuerpos naranjas, redondeados y produciendo esporas en el haz y envés de las hojas (Figura 76).El haz presenta además superficies planas, cloróticas en las áreas correspondientes a la presencia de las esporas del patógeno. Agente causal: Sclerotinia sp. Sintomas La enfermedad inicia con el decaimiento generalizado de la planta, presentando sequedad y marchitamiento que inicia de la base hacia arriba. Se produce una pudrición blanda del tallo, y éste es debilitado hasta perder su rigidez (Figura 77). 102 Figura 77. Síntoma de infección por Sclerotinia sp. en ramas de solidago En estados avanzados de enfermedad, es posible evidenciar la presencia del patógeno mediante la aparición de micelio blanco algodonoso, y formación de esclerocios dentro y/o fuera de éste (Figura 78). Figura 78. Síntomas avanzados de enfermedad. Atrofia y amarillamiento de tejidos. Presencia de esclerocios 103 6.1.13 STATICE Figura 79. Statice 6.1.13.1 Hongos Fitopatógenos en Statice PODREDUMBRE GRIS Agente causal: Botrytis sp. Síntomas El patógeno genera pudrición de las hojas, las cuales se marchitan con el tiempo. También afecta la base de las cabezas florares, en donde causa el deterioro de los tejidos perjudicando la apertura y ocasionando sequedad, por lo que se tornan de color café (Figura 80). Figura 80. Atrofia y pudrición de tejidos de Statice por Botritys sp. Cuando la infección es severa, se evidencia la formación de micelio algodonoso gris sobre flores, las cuales terminan por entorcharse y marchitase. 104 Agente causal: Cercospora sp. Síntomas La enfermedad se presenta principalmente en la base de la planta, afectando el follaje, sobre el cual se forman manchas pequeñas, relativamente circulares (3-5 mm), las cuales presentan una coloración crema a gris claro en el centro y borde café rojizo (Figura 81). Figura 81. Haz de hojas de Statice presentando manchas causadas por Cercospora sp. En el transcurso de la enfermedad, las manchas crecen, y estructuras pequeñas polvosas se desarrollan debido a la esporulación del hongo (Figura 82). Inicialmente se observan los síntomas de daño en algunas hojas, sin embargo, la enfermedad puede extenderse a todo el cultivo, propagándose por lluvia, riego por aspersión y viento. Eventualmente el follaje y las ramas muertas se desprenden de planta. Figura 82. Lesiones características de Cercospora sp. con presencia de esporas sobre hojas de statice. 105 6.1.14 STOCK Figura 83. Stock 6.1.14.1 Hongos Fitopatógenos en Stock PODREDUMBRE GRIS Agente Causal: Botritys sp. Síntomas En esta especie el patógeno afecta las hojas, causando pudrición de los tejidos. Las puntas se tornan rugosas y toman una coloración marrón claro o amarillenta. Con el progreso de la enfermedad, la mancha se extiende hacia la base de las hojas y se desarrolla un moho gris de aspecto polvoriento como consecuencia del desarrollo del hongo (Figura 84). Figura 84. Pudrición de tejidos con presencia de micelio del patógeno 106 PUDRICIÓN DEL TALLO Y LA RAÍZ Agente causal: Rhizoctonia sp. Síntomas Los síntomas en la planta presentan inicialmente decaimiento con amarillamiento y deshidratación del follaje. El patógeno genera un aspecto flácido en la planta, acompañado de un bronceado y descomposición de las raíces y de la corona. La parte afectada, se torna arrugada y de color café (Figura 85). Figura 85. Síntomas característicos de infección por Rhizoctonia sp. El óptimo desarrollo de la planta es afectado, hasta que termina muriendo por la pudrición de raíces y base del tallo. Generalmente la pudrición ocurre en el tallo que se encuentra en contacto con la superficie del suelo (Figura 86). Figura 86. Muerte de plántulas por contaminación de Rhizoctonia sp. en suelo 107 Agente causal: Sclerotinia sp. Síntomas Figura 87. Planta afectada por Sclerotinia sp. La infección con Sclerotinia sp, se manifiesta en el cultivo con un notorio decaimiento y marchitez de la planta (Figura 87). Si las condiciones ambientales acompañan el desarrollo del patógeno, se evidencia la aparición de un micelio de color blanco (Figura 88), afectando la planta hasta abarcar todo el tallo y provocar la caída, total o parcial, del mismo. Figura 88. Síntomas avanzados de enfermedad con presencia de micelio. En estados avanzados de la podredumbre se pueden distinguir cuerpos negros, que son los esclerocios del hongo (estructuras de resistencia), los cuales caen al suelo y perduran hasta el cultivo siguiente. 108 6.2 Características macroscópicas y microscópicas de hongos fitopatógenos 6.2.1 Alternaria sp. Macroscopía Figura 89. Crecimiento de Alternaria sp. en medio V8 Alternaria sp. presenta en cultivo colonias de color verde oscuro, tornándose oscuras o casi negras a medida que envejece. Polvosas por el desarrollo de un micelio aéreo, denso bien desarrollado, de borde irregular. El envés de la caja, no presenta diferencias en la pigmentación de la colonia. Microscopía Los conidios pueden aparecer solitarios o encadenados y son fácilmente reconocibles debido a su tamaño (30 – 50 x 10-14 micras) color y forma característicos. Los conidios, son muy característicos por su tabicación longitudinal, transversal u oblicua y presentan forma ovoide u obclavada, con superficie lisa o rugosa y de coloración marrón claro a oscuro, generalmente se forma en cadenas. Presenta hifas septadas coloreadas, café oliváceas o cafés. Figura 90.Conidios de Alternaria sp. empleando DIC. Objetivo: 100 x AN: 1.3 109 6.2.2 Botrytis sp Macroscopía Figura 91. Crecimiento de Botritys sp. en medio PDA Botrytis sp. presenta colonias de crecimiento moderado, cuyo micelio es de apariencia vellosa color blanco a gris. Microscopía Presenta conidias formadas en conidióforos, el cual forma en el ápice una vesícula con varios puntos conidiales. Estos conidios son grandes, y sus conidióforos pueden ser erectos, simples o ramificados. Figura 92. Botrytis sp. Campo claro. Objetivo: 100 x AN: 1.3 Micelio hialino en etapas iniciales de desarrollo, posteriormente, toma un color oscuro, presentando septos y perforaciones centrales. Figura 93. Hifas Botrytis sp. Campo claro Objetivo: 100 X AN: 1.3 110 6.2.3 Cercospora sp. Macroscopía Figura 94. Crecimiento de Cercospora sp. en medio V8 Colonias de color gris oscuro, de borde irregular, aterciopeladas por su cara superior. En el envés, la colonia presenta pigmentación negra. Microscopia Los conidióforos son siempre coloreados, oliváceos a café pálidos o muy oscuros. Conidios alargados septados, filiformes algo sinuosos, hialinos, de base ensanchada Figura 95. Conidios de Cercospora sp. Campo Claro Objetivo: 100 x AN: 1.3 111 6.2.4 Fusarium oxysporum Macroscopía Figura 96. Crecimiento de Fusarium oxysporum en medio PDA El hongo produce colonias de rápido crecimiento, presentando micelio aéreo abundante, algodonoso, con una coloración variable, de blanco a rosado. Con pigmentación violeta o púrpura Usualmente un tinte púrpura o violeta más intenso se presenta al dorso de la colonia. Microscopía Posee microconidias que son esporas unilaterales, sin septos, hialinas, elipsoidales a cilíndricas, rectas o curvas, se forman sobre fialides laterales, cortas, simples o sobre conidióforos poco ramificados Macroconidias, esporas de pared delgada, fusiformes, largas, moderadamente curvas. Presenta clamidioesporas formadas a partir de la condensación de los contenidos de las hifas y macroconidias, de paredes gruesas, mediante las cuales el hongo sobrevive ambientales desfavorables Figura 97. Fusarium oxysporum. empleando campo claro. Objetivo: 100 x AN: 1.3 112 en condiciones 6.3.5 Fusarium roseum Macroscopía Figura 98. Crecimiento de Fusarium roseum en medio PDA Fusarium roseum, produce colonias de rápido crecimiento, algodonosas, de micelio blanco a rosado. Por el envés de la caja se observa un crecimiento con una pigmentación de un rosado mas oscuro. Microscopía Formación de macroconidias las cuales son delgadas, de pared gruesa septadas, hialinas y bien curvadas. A diferencia de Fusarium Oxysporum, no forma microconidias ni clamidosporas. Figura 99. Fusarium roseum, empleando DIC. Objetivo: 100 x AN: 1.3 113 6.3.6 Heterosporium sp Macroscopía Figura 100. Crecimiento de Heterosporium sp. en medio V8. Las colonias presentan coloración verde oscuro en el borde y verde aceituna en el interior. Son de aspecto pulverulento, y ocasionalmente pueden presentar líneas radiales. El reverso de la colonia, no presenta diferencias en la pigmentación Microscopía El hongo presenta micelio septado, nudoso, oscuro y ancho en estado adulto. En estadios juveniles el micelio no posee septas. Posee conidióforos septados, oscuros, fasciculares, agrupados o simples; conidias equinuladas o espinosas, grandes y de forma elíptica, septadas hasta cuatro veces en su madurez. Figura 101. Heterosporium sp. Campo Claro Objetivo: 40 x AN: 0.65 114 6.3.7 Itersonilia Macroscopía Figura 102. Crecimiento de Itersonilia sp. en medio PDA Presenta colonias delgadas, pulverulentas, de crecimiento lento, con pigmentación color crema en el dorso. Microscopía Posee balistosporas, es decir, conidios formados en una estructura llamada esterigma. Estas balistosporas vistas al microscopio son hialinas y muy cortas. Figura 103. Itersonilia sp. empleando DIC Objetivo: 60X AN: 1.3 115 6.3.8 Peronospora sp. Macroscopía Figura 104. Envés de una hoja de rosa contaminada con Peronospora sp. Muestra enfocada en estéreo. Microscopio Olympus BX 51 Microorganismo viable, no cultivable. Microscopía Esporangióforos largos, hialinos, agrupados y ramificados dicotómicamente, muy numerosos, con abundantes esporangios globosos, hialinos Presenta micelio hialino, no septado. Figura 105. Peronospora sp. empleando campo claro Objetivo: 40x AN: 0.65 116 6.3.9 Pragmidium sp. Macroscopía Figura 106. Envés de una hoja de solidago infectada con Pragmidium sp. Imagen enfocada en Estereo Microscopio Olympus BX51 Microorganismo viable, no cultivable. Microscopía Pragmidium sp. presenta diferentes tipos de esporas dentro de las cuales se encuentran: Las ecidiosporas que son redondas o elipsoides, de 19-30 µ de largo y 17-24 µ de ancho, con episporio hialino, provistas de verrugas lenticulares con punta sobrepuestas, muy espaciadas. Las Uredosporas son elipsoides a ovaladas, de 25-32 µ de largo y 21-24 µ de ancho, con episporio hialino, provisto de verrugas espinudas distanciadas, fuertes y cónicas. Las Teleutosporas, de 85-110 µ de largo y 32-35 µ de ancho, compuestas de 3-5 células (generalmente 4), cilíndricas, poco contraídas en los tabiques, con ápice redondeado provisto de una papila amarilla. Membrana celular parda, de 8-10 µ de espesor, provista de numerosas verrugas hialinas; poros germinativos 3-4. Pedicelo incoloro, hinchado en la parte basal, de mayor longitud que la espora 117 Figura 107. Esporas de Pragmidium sp. empleando contraste de fases. Objetivo 60 x. A.N: 0.65 Figura 108. Esporas de Pragmidium sp empleando Campo claro. Objetivo 40x. A.N: 1.3 Figura 109. Esporas de Pragmidium sp. empleando DIC. Objetivo: 100 x AN: 1.3 118 6.3.10 Pythium sp. Macroscopía Figura 110. Crecimiento de Pythium en medio V8 Macroscópicamente presenta hifas blanquecinas y delgadas, con un crecimiento hacia arriba, en forma arborescente, que parte del estrato basal o vegetativo, tendiendo a ser de forma tridimensional, semejante a una esfera: en conjunto presenta un aspecto algodonoso formando los típicos pilares que caracterizan su apariencia macroscópica. El dorso de la colonia, no presenta diferencias en su pigmentación. Microscopía Se caracteriza por poseer hifas incoloras dispuestas en forma de racimo. Las estructuras de la reproducción sexual son oogonios equinulados generalmente pleróticos, fertilizados por anteridios en forma de clava, de pared reticulada que se producen en grupos sobre una misma hifa; las estructuras de la reproducción zoosporas asexual que se están producen representadas en por zoosporangios intercalares morfológicamente poco diferenciados, las cuales se liberan desde vesículas bien diferenciadas (CORREA DE RESTREPO et al 1990) Figura 111. Zoosporas de Pythium sp. empleando Campo Claro. Objetivo: 60x A.N: 0.65 119 6.3.11 Rhizoctonia sp Macroscopía Figura 112. Crecimiento de Rhizoctonia sp. en medio PDA Se caracterizan por presentar colonias blancas, algodonosas, planas, sin embargo, dependiendo de la especie, puede presentarse tonalidades cremas amarillentas. Por el envés de La caja se observa un crecimiento con una pigmentación amarilla más oscura Microscopía Hifas relativamente anchas y tiene un modelo de la bifurcación característico. Se orientan las ramas de hifas perpendicularmente a su punto de origen y se estrechan a su base Muestran una constitución de hifas entrelazadas, de diámetro variable, cortas, elípticas, semejantes a diminutos barriles dispuestos en cadena Figura 113. Hifas de Rhizoctonia sp. empleando contraste de fases. Objetivo 40x A.N: 0.65 120 6.3.12 Sclerotinia sp. Macroscopía Figura 114. Crecimiento de Sclerotinia sp. en medio PDA Se caracteriza por formar micelio algodonoso blanco. Desarrolla cuerpos fructificantes resistentes sobre este micelio conocidos como esclerocios, de color negro grisáceo, en forma circular u ovalada. Por el envés de la caja se observa el micelio blanco y los esclerocios. Figura 115. Esclerocios de Sclerotinia sp. tomados a partir de una planta infectada Microscopía Hifas septadas con característica forma de Y-formando la bifurcación, presenta ramificaciones excesivas Figura 116. Micelio de Sclerotinia sp. empleando campo claro Objetivo: 40x AN: 0.65 121 6.3.13 Sphaerotheca pannosa Macroscopía Figura 117. Envés de una hoja de rosa contaminada con Sphaerotheca sp. Muestra enfocada en estéreo, microscopio Olympus. BX 51 Microorganismo viable, no cultivable Microscopia El cuerpo fructífero de este hongo es un ascocarpo que, por ser esférico, se denomina cleistotecio, en cuyo interior se producen las ascas, de forma oblongo-globosa con 8 ascosporas. Los cleistotecios, con apéndices micelioides tortuosos de color marrón pálido a negros, se forman irregularmente en algunas zonas de la planta, solamente en algunos cultivares pero no en otros. Las conidias van dispuestas en cadenas, por esto se disemina por el viento. Estas conidias puede generar muchos ciclos, pero en condiciones adecuadas generaran el cleistotecio. Figura 118. Conidios Sphaerotheca pannosa empleando Campo Claro Objetivo: 40 x 122 6.3.14 Verticillium sp. Macroscopía Figura 119. Crecimiento de Verticillium sp. en medio PDA Presenta en medio de cultivo, colonias delgadas, algodonosas y con variedad de pigmentos Microscopía Tiene conidióforo recto, tabicado y ramificado. El hongo presenta hifas las cuales pueden variar de hialinas a color gris o pardo. Presenta conidias hialinas de forma cilíndrica – elipsoidal formadas en sucesión en el ápice del fiálide. Figura 120. Conidióforos y conidios de Verticillium sp empleando Campo claro Objetivo: 100 x AN: 1.3 123 7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS El análisis de enfermedades fúngicas en las variedades de flores colectadas, demostró la presencia de diversos microorganismos en los diferentes órganos de las plantas. Los géneros de hongos fitopatógenos encontrados en el estudio, correspondieron con los reportados en la literatura para las diferentes especies. No obstante, se obtuvieron muestras de géneros poco mencionados, como el caso de Itersonilia sp. y Cercospora sp. los cuales fueron solo evidenciados en las variedades gerbera y molucellas respectivamente, encontrando escasos estudios reportando su presencia. Así mismo, otros géneros ampliamente citados por varios autores, por su alta incidencia y/o el efecto causado sobre las plantas, como el caso de roya blanca en (flor) y Phialophora sp en clavel, no fueron evidenciados en ninguna ocasión durante el transcurso de la recolección en campo. Estudios realizados anteriormente por autores como (García, Camargo. 2000) evaluando presencia de enfermedades fúngicas en flores, sugieren la influencia de factores en el área como: humedad relativa alta mayor al 93%, temperatura elevada y presencia de agua libre sobre los tejidos, que favorecen el desarrollo de la infección, así como las condiciones del suelo y agua de riego los cuales pueden ser también medios que facilitan la transmisión de fitopatógenos a las plantas. Así mismo, la obtención de muestras en campo, mostró incluso la susceptibilidad de ciertas variedades de plantas dentro de una misma especie, a microorganismos específicos, siendo Botrytis sp., uno de los hongos de mayor incidencia, evidenciando ataques sobre diversos órganos de todas las especies de plantas colectadas en las diferentes fincas, y su alta prevalencia como contaminante, el cual resultó invadir y colonizar frecuentemente tejidos senescentes o ya afectados por otros microorganismos, como fue el caso de los montajes de Mildeos en cámara húmeda, los cuales fueron rápidamente contaminados con este microorganismo, hecho que se presume puede deberse a las estructuras reproductivas propias del hongo; las esporas grises son las encargadas de diseminar el microorganismo e iniciar infecciones en hojas y flores de otras plantas, además puesto que éste es saprofito, y produce formas resistentes (clamidosporas), puede ser fácilmente diseminado en los residuos de la cosecha, en el suelo o sustrato, mediante el riego, el movimiento del personal, la cosecha y la propagación, lo que requiere por tanto, la adopción de medidas mas estrictas para su control, como las evidenciadas en el cultivo del rosal, en el cual se realizaba el cubrimiento de la flor con bolsas de papel para prevenir su expansión, lo que mostró la capacidad del microorganismo para afectar varias especies de plantas, y desarrollarse ampliamente, atribuyendo este hecho principalmente a los bajos requerimientos nutricionales y ambientales del mismo. Otros microorganismos incidentes en 124 varios cultivos fueron también evidenciados, como Sclerotinia sp., aunque su presencia en este caso, se relacionó principalmente con condiciones del suelo y la formación de estructuras resistentes conocidas como esclerocios, los cuales pueden sobrevivir por largos períodos de tiempo en el suelo (García, Camargo. 2000). Un caso contrario fue experimentado con otros hongos como Heterosporium sp., el cual aunque se colectó con facilidad en los muestreos en campo a partir de clavel, su recuperación in vitro no se efectuó de igual manera. Los aislamientos realizados con este microorganismo mostraron diferencias en cuanto a requerimientos nutricionales con respecto a los demás hongos, teniendo en cuenta que la mayoría mostró un rápido crecimiento en el medio PDA, mientras Heterosporium sp. sólo se desarrolló en el medio V8 el cual es un medio selectivo y para lograr un amplio crecimiento este debía ser ubicado en zonas específicas del laboratorio lo que mostró altas exigencias en cuanto a condiciones de luz y temperatura. Esto concuerda con lo planteado en otros estudios (Cedeño, Carrero. 2003) en los que el patógeno presentó dificultad para desarrollarse bajo condiciones a nivel de laboratorio y su crecimiento fue lento con respecto a otros hongos también relacionados en este estudio. Un hecho similar fue observado en la recuperación de los hongos Rhizoctonia sp. y Phytium sp., microorganismos que presentaron dificultades al realizar su identificación presuntiva en campo, ya que ambos se caracterizan por atacar la misma zona en la planta y su sintomatología es muy similar, además los aislamientos a partir de material infectado en pocas ocasiones lograron la recuperación de éstos, lo que dificultaba verificar la presencia del microorganismo afectante, e igualmente, mostraron un mejor desarrollo en medios diferentes a PDA, permitiendo confirmar también que aunque se encontraron géneros con requerimientos nutricionales mas complejos, el medio de cultivo PDA, es adecuado para la recuperación de los patógenos implicados permitiendo el crecimiento y desarrollo de los mismos, así como la formación de estructuras reproductivas y la esporulación, por lo que se recomienda su uso en este tipo de estudios. La manifestación de enfermedades, mostró una característica en común al analizar la presencia de patógenos en diversas variedades, observando que la sintomatología entre una especie de planta y otra, no presentaba diferencias relevantes al ser afectada por un mismo microorganismo, Por otra parte, el órgano afectado por un patógeno específico, resultó ser mas variable, hecho observado principalmente con Botrytis sp., el cual presentó facilidad para infectar varios órganos y su presencia en éstos estuvo relacionada a la especie de planta en particular. Sin embargo éste no mostró mayor especificidad por algún órgano debido a la facilidad de desarrollo y diseminación anteriormente mencionadas. Autores como (Horst, 2003), atribuyen el grado de susceptibilidad de las plantas, así como 125 de órganos específicos a factores genéticos e incluso la influencia del color de la variedad en el ataque por un microorganismo. Con relación a las características morfológicas de los microorganismos colectados, se evidenciaron diferencias en el aspecto macroscópico, así como las observadas al microscopio, en la formación de estructuras en un mismo microorganismo, las cuales predominaron dependiendo el medio de cultivo empleado, la variedad de planta a partir de la cual fue aislado y el estado de la enfermedad; lo que demuestra la capacidad de los microorganismos para producir diversos pigmentos o formar estructuras somáticas o de reproducción de acuerdo a los componentes del medio, los cuales pueden estimular dichas características, e igualmente debe tenerse en cuenta la edad del cultivo lo que genera también cambios en el tipo y/o color de la estructura evidenciada. Literatura enfocada al estudio de morfología de hongos reporta cambios en el color y grosor de las hifas de varios microorganismos empleados en este estudio, factor que puede encontrarse relacionado al tiempo del cultivo (García, et al., 2000). Aunque contrariamente a lo planteado, las características observadas presentaron usualmente la misma apariencia, para todos los microorganismos. Por otra parte, el análisis comparativo con la implementación de técnicas de microscopía, mostró que contrario a los esperado, la técnica de campo claro resultó ser la mas apropiada para la obtención de la mayoría de micrografías, ya que permitió evidenciar detalles específicos en ciertas estructuras los cuales no eran fácilmente observados en otras técnicas como la tabicación de conidios y septos de hifas, como los evidenciados en Alternaria sp. y Heterosporium sp., además de proporcionar una aproximación mas clara del color de las estructuras. La aplicación de técnicas como DIC y contraste de fases proporcionó mejores micrografías con hongos como Botritys sp., y Fusarium sp, principalmente en la observación de conidios los cuales proporcionaron un aspecto en relieve y las variaciones de contraste resaltaban significativamente la imagen. En base a lo evaluado en los montajes realizados con los diferentes microorganismos, se presume que varios factores influyeron en este hecho; dentro de los cuales se destaca el uso de agua o colorantes empleados como el azul de lactofenol, los cuales intervienen de manera positiva o negativa dependiendo la técnica empleada, así como el uso de cinta a cambio de laminilla, montaje apropiado para evitar daños y desfragmentación de estructuras, pero en algunos casos causó interferencia disminuyendo la nitidez, apresando gran cantidad de burbujas entre la muestra e incluso dificultando la implementación de alguna técnicas. Este fue uno de las principales inconvenientes encontrados en el desarrollo del trabajo, ya que la morfología de varios hongos por su aspecto plano y poco algodonoso, dificulta en gran medida la obtención de una muestra adecuada para observación con laminilla, igualmente, 126 las variaciones en el grosor de la muestra, modificaban la resolución debido a que ésta, se encontraba en varios planos y su enfoque no podía ser optimizado. Por lo que no se recomienda el uso de materiales adhesivos o plásticos para cubrir la muestra en este tipo de estudios. Una de las limitaciones mas reportadas en bibliografía en el empleo de técnicas como DIC y contraste de fases, es su requisito para una muestra transparente de índice de refracción bastante similar a sus alrededores, lo que afecta su implementación con especímenes gruesos o altamente pigmentados, y el uso de materiales como cinta, que interfieren con la trayectoria de la luz. (Lasslet. 2006). Aunque por los resultados obtenidos de imágenes con técnicas diferentes a campo claro con microorganismos como Botritys sp. el cual presentaba una estructura fuertemente coloreada, se asume que diferencias en la composición estructural, o el aspecto morfológico del microorganismo, intervienen en la imagen final obtenida. Las experiencias evidenciadas durante el desarrollo de las técnicas, mostraron que los hongos que presentaban una aspecto mas denso y algodonoso proporcionaban mayor información en una micrografía, lo que generaba posiblemente, cambios mayores en el índice de refracción intensificando el contraste y resultando por ende en una imagen mas significativa. Teniendo en cuenta que el principio de estas técnicas se basa en las diferencias en el índice de refracción dentro el espécimen o entre este y el medio y la distancia a la que viajan las ondas de luz dentro de estas regiones, lo que resulta en efectos de sombras, permitiendo resaltar características especificas en una muestra (Davidson., et al. 2001). Por lo que no es posible afirmar mejores resultados con alguna de las técnicas, ya que esto depende en gran parte, de la naturaleza de la muestra. Sin embargo, y con base a los aspectos anteriormente mencionados, se destaca que la técnica de campo claro fue mas flexible y adaptable a la variación de montajes realizados y no generó interferencias un ningún caso. La identificación de enfermedades y colección de muestras en campo, proporcionó una aproximación a lo frecuentemente encontrado en este tipo de cultivos, susceptibles no solo al ataque de hongos, si no también bacterias y nematodos. Hecho en el que los factores ambientales y la naturaleza del microorganismo desempeñan un papel fundamental como se mencionó anteriormente, encontrando microorganismos de alta incidencia, los cuales se presentan fácilmente y se mantienen en el tiempo, y hongos ocasionales que requieren un control mas estricto, pues su aparición en un cultivo, es una amenaza que genera un gran impacto. Aunque se notó un amplio control de estas enfermedades, lo que impide avances perjudiciales para un cultivo, razón por la cual se resalta la importancia de contar con información adecuada para tal fin y se recomienda además, la colección de preparaciones permanentes de manera que sea posible mantener cepas de referencia que faciliten la 127 identificación de microorganismos a partir de sus características morfológicas, pues su existencia facilitaría también la toma de decisiones respecto a las medidas preventivas y de control para la creación de programas fitosanitarios específicos, soportando igualmente, la experimentación in vitro. 128 8. CONCLUSIONES Se elaboro un atlas descriptivo con los principales hongos encontrados en flores de corte cultivadas en la Sabana de Bogotá, el cual será útil como instrumento de referencia en el estudio de enfermedades fúngicas en cultivos de interés Los hongos identificados en material vegetal contaminado, presentaron la capacidad de atacar diferentes especies de flores, destacándose entre estos a Botrytis sp. Los hongos encontrados en material vegetal contaminado, fueron caracterizados morfológicamente, identificando estructuras propias de cada microorganismo, soportadas con material bibliográfico antes investigado. Las muestras obtenidas a partir de material vegetal infectado, posibilitaron la recuperación de hongos fitopatógenos de interés de las especies de flores colectadas, mostrando que la mayoría de microorganismos crecieron en medio nutritivo no selectivo, lo que permitió el rápido crecimiento de cepas, para su posterior caracterización. Las técnicas de microscopia óptica distintas a campo claro, proporcionaron imágenes de gran contraste, pero presentaron mayores restricciones en su implementación con un espécimen. El uso de elementos y montajes inadecuados durante la implementación de técnicas de microscopía, generó interferentes los cuales afectaron la obtención de imágenes deseadas. 129 9. RECOMENDACIONES Se recomienda realizar estudios complementarios incluyendo otras enfermedades como bacterias, nematodos y virus que atacan a flores de corte en la Sabana de Bogotá, y que permitirían aportar información en este aspecto. Sería pertinente realizar estudios acerca de las enfermedades ocasionadas en flores cultivadas en diferentes regiones del país, las cuales involucren especies distintas a las relacionadas en el presente estudio. Se propone la implementación de otros tipos de técnicas de microscopia, que permitan continuar evaluando la obtención de imágenes de calidad. 130 10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS AGRIOS, G. 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