ALIMENTOS TRANSGÉNICOS Principios básicos y métodos de

ALIMENTOS TRANSGÉNICOS
Principios básicos y métodos de detección
CONTENIDO:
1.- INTRODUCCIÓN
2.- BASES BIOLÓGICAS
-
2.1.- ¿Qué es la información genética?
-
2.2.- Estructura genética y bioquímica
-
2.3.- Etapas de decodificación del genoma
3.- OBTENCIÓN DE ALIMENTOS TRANSGÉNICOS
-
3.1.- Alimentos transgénicos de origen vegetal
-
3.2.- Alimentos transgénicos de origen animal.
4.- DETECCIÓN
-
4.1.- Métodos analíticos basados en la detección de ADN.
-
4.2.- Métodos analíticos basados en la detección de proteína.
El presente documento se realiza a título meramente divulgativo, con el objetivo de mostrar de forma
general los principios bioquímicos y los métodos de obtención y detección de alimentos transgénicos.
Remitimos al lector a la extensa información publicada al respecto en el caso de que se desee profundizar
en algunos de los aspectos aquí citados.
Página 2 de 24
INTRODUCCIÓN:
Un “Alimento genéticamente modificado” o como se denomina comúnmente
“Alimento transgénico” se diferencia de otro “no modificado” en que al primero se le
han modificado ciertos genes que pueden o no ser propios de dicho alimento mediante
métodos moleculares1, proporcionando una característica diferencial frente al “no
modificado”. Dicha modificación se ha podido realizar gracias a los avances en la
identificación genómica y el desarrollo de técnicas biológicas que han permitido no solo
conocer la estructura del ADN sino su papel en la expresión contenida en su código.
La obtención de estos nuevos alimentos, se realiza generalmente mediante la
inserción de una cantidad proporcionalmente mínima de ADN en comparación con el
genoma total del alimento por lo que los métodos de análisis requieren de técnicas
específicas con una alta capacidad de detección, como se indica posteriormente.
2. BASES BIOLÓGICAS:
Desde las primeras épocas en las que el hombre se convierte en agricultor y
ganadero, la genética le ha permitido la mejora y selección de manera empírica de
aquellas razas y especies por poseían características interesantes para su producción.
Pero es en los últimos años cuando el estudio de la genética a nivel molecular ha
permitido conocer las bases científicas de la variabilidad de los organismos y la
evolución de las especies.
La genética moderna y la comprensión de los mecanismos genéticos permite a
los investigadores la manipulación de las especies mediante estrategias útiles para la
1
En este sentido es necesario citar la existencia de múltiples alimentos obtenidos a través de
microorganismos o enzimas modificados genéticamente a los cuales no se les aplica dicho término de
forma común, a pesar de que también son obtenidos gracias a el empleo de técnicas de ingeniería
genética.
Página 3 de 24
construcción de forma controlada y dirigida de nuevos organismos de uso potencial para
los seres humanos.
2.1. ¿Qué es la información genetica?
Todos los procesos que tienen lugar en la célula involucran evidentemente a las
moléculas. Mucho antes de que se conociese qué moléculas eran importantes para estos
procesos se tenía claro que debía existir una unidad funcional de información genética,
esta unidad se ha llamado gen. El gen es el elemento de la información que codifica la
secuencia de aminoácidos de una proteína. Por lo tanto, los genes constituyen la
información almacenada, mientras que las proteínas son las entidades funcionales de la
célula.
En todas las células los genes están compuestos por una molécula llamada ADN
(ácido desoxirribonucleico).
La historia de su conocimiento comienza en el año 1869 cuando Frederick
Miescher descubrió en el núcleo de las células una sustancia de carácter ácido a la que
llamó ácido nucleico. En los años 20, el químico alemán Robert Feulgen, utilizando una
tinción específica, descubrió que el ADN estaba situado en los cromosomas. A partir de
este descubrimiento todo sucedió muy rápidamente. En 1944 Avery, McClenod y
McCarty comprueban que el ADN es el portador de la información genética (Avery,
McClenod, McCarty, 1944. J. Exp. Med. 79: 137-158). En 1953 Watson y Crick
revelan la estructura del ADN como una doble hélice complementaria que recuerda la
estructura de una escalera de caracol (Watson y Crick, 1953 Nature 171: 737-738).
Todas las proteínas que forman un individuo o que el individuo desarrolla están
codificadas en el ADN, por lo tanto, se puede considerar al ADN como el “cerebro”
celular que regula el número y naturaleza de cada tipo de estructura y composición
Página 4 de 24
celular, transmitiendo la información hereditaria y determinando la estructura de las
proteínas, que a través de enzimas actúan sobre el resto de funciones celulares. Esta
molécula tiene una importancia crucial en el conocimiento de los seres vivos así como
en su manipulación puesto que si se modifica el ADN de los individuos, estos pueden
desarrollar características que antes no poseían.
Existe una segunda clase de ácido nucleico, denominado ácido ribonucléico
(ARN) cuya función más importante consiste en la conversión de la información
contenida en el ADN de animales, plantas, hongos y bacterias en proteínas específicas,
es decir actúa como intermediario de la información (mensajero) si bien en algunos
casos (por ejemplo en los virus) su función es contener y transmitir información.
Por lo tanto, ya que los tres tipos de moléculas, ADN, ARN y proteínas
contienen información biológica en sus secuencias, a menudo se les llama
macromoléculas de información.
La información genética pasa de generación en generación gracias a la
replicación de la molécula de ADN. Gracias al avance de las técnicas genéticas los
científicos son capaces de dirigir esta herencia consiguiendo mutar la información de los
individuos otorgándoles propiedades diferenciales a las que antes carecían. Con estas
técnicas se consigue obtener nuevas variedades en un breve espacio de tiempo frente a
los varios años empleados en conseguir una especie mejorada por métodos naturales de
cruzamiento.
2.2. Estructura genética y bioquímica
Las moléculas de ADN y ARN están constituidas por unidades elementales
denominadas “nucleótidos”, los cuales están formados por un reducido número de
componentes estructurales ( Chargaff E. 1951. Fed.Proc. 10:654-659.)
Página 5 de 24
1. Molécula de azúcar
-
Ribosa, en el caso del ARN.
-
Desoxirribosa, en el caso del ADN
2. Base orgánica nitrogenada
-
Adenina, guanina (bases púricas), citosina y timina (bases pirimidínicas)
en el caso del ADN.
-
Adenina, guanina (bases púricas), citosina y uracilo (bases pirimidínicas)
en el caso del ARN.
3. Grupos fosfato (PO43 -).
Fig.1. Adenosina trifosfato, compuesta por una base nitrogenada,
ribosa y fosfato
Los nucleótidos se unen formando cadenas cuyo esqueleto está formado por la
unión entre un azúcar de un nucleótido y el fosfato del siguiente, quedando las bases
nitrogenadas en la parte central, unidas cada una al C1 del azúcar. Estas bases son las
que rinden la especificidad al ácido nucleico.
Página 6 de 24
La estructura del ADN es una doble hélice antiparalela, esto quiere decir que
las dos cadenas están de forma “cabeza-pie”, cuyo esqueleto fundamental está formado
por las cadenas de azucar-fosfato, quedando en la parte central las bases, enfrentadas las
de una cadena con las de la otra complementária y formando entre sí puentes de
hidrógeno, factor que da estabilidad a la doble hélice (Watson J.D. and Crick F.H.C.
1953. Nature 171:964-967). El enfrentamiento de bases es constante, la adenina
siempre se enfrenta con la timina y entre sí se forman dos puentes de hidrógeno, y la
guanina con la citosina, formándose entre ambas tres puentes de hidrógeno. Esta
característica provoca que las dos cadenas sean complementárias. Sin embargo, las dos
hebras no están una al lado de otra, sino que se abrazan mutuamente dando lugar a la
doble hélice.
Fig. 2. Estructura del
ADN
Página 7 de 24
2.3. Etapas en la decodificación del genoma (Metabolismo/Expresión)
Cuando una célula se divide para formar dos, se sintetizan todo tipo de
macromoléculas portadoras de información. Los procesos moleculares que subyacen
bajo este flujo genético de información pueden dividirse en tres etapas que se describen
sucintamente a continuación:
1. Replicación: la molécula de ADN,
que
REPLICACIÓN
ADN
5’…. TTT GTT AAT CAG CAT CTT ….3’
3’…. AAA CAA TTA GTC GTA GAA ….5’
TRANSCRIPCIÓN
como
hemos
comentado
anteriormente sirve como material
genético celular es una doble
hélice de dos cadenas largas.
ARN
5’
UUU GUU AAU CAG CAU CUU
3’
Durante la replicación, el ADN se
duplica y el producto son dos
TRADUCCIÓN
dobles hélices, por ello las dos
H2N-
PROTEÍNA
-COOH
cadenas se convierten en cuatro.
Fig.3. Síntesis de los tres tipos de moléculas
portadoras de información
2. Transcripción: El ADN no funciona directamente en la síntesis de proteínas
sino a través de un intermediario de ARN. La transferencia de información
hasta ARN se denomina transcripción y la molécula que lleva tal información
se llama ARN mensajero (ARNm).
3. Traducción: La secuencia específica de aminoácidos en cada proteína es
dirigida por una secuencia de bases en el ARNm (que fue transcrito desde el
ADN). Esta información en los ácidos nucleicos está presente en forma de
código genético. Cada tres bases codifican un aminoácido y cada triplete de
bases se llama codón. Hay una corespondecia inicial entre la secuencia de
bases de un gen y la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. El código
Página 8 de 24
genético es traducido en proteína por medio del sistema sintetizador de
proteínas.
3. OBTENCIÓN DE ALIMENTOS TRANSGÉNICOS:
Conociendo pues donde esta la información necesaria que determina las
características de un individuo, se han desarrollado tecnologías de ingeniería genética,
basadas en el conocimiento de los genes y la biología de los seres vivos, mediante las
cuales es posible manipularlos de tal manera que se pueden introducir nuevos genes que
sean funcionalmente iguales a los que poseía previamente el individuo al manipulado
pero que le confieran una característica especial que antes no poseía dicho individuo.
Algunas de las áreas de interés para el desarrollo comercial de este tipo de
tecnologías son las siguientes:
1. Fermentaciones microbianas: Un gran número de productos se fabrican
industrialmente utilizando microorganismos que interviene de forma directa
en los procesos de producción (lácteos fermentados, bebidas alcohólicas,
productos de panadería, antibióticos…). Pueden utilizarse procedimientos de
ingeniería genética para manipular el organismo responsable de la
fermentación, con el fin de obtener entre otros factores, mayores
rendimientos o para producir antibióticos modificados.
2. Vacunas de virus: Una vacuna es un material que puede inducir inmunidad
frente un agente
infeccioso. Frecuentemente se usan como vacunas
preparaciones de virus muertos y siempre existe un peligro potencial para el
paciente si el virus no ha sido completamente inactivado. Dado que el
componente antigénico de un virus es la cubierta proteica, es conveniente
producir la cubierta de proteína por separado del resto de la partícula.
Página 9 de 24
Por ingeniería genética se pueden insertar genes de la cubierta de proteína y
expresarlos en bacterias o virus no patógenos, haciendo posible el desarrollo
de vacunas seguras y efectivas.
3. Vegetales y animales transgénicos: Además de la obtención de productos
valiosos por medio de microorganismos, la ingeniería genética permite la
obtención de plantas y animales alterados genéticamente. A estos
organismos, a los que se hace referencia con el nombre de transgénicos.
Introduciendo ADN en huevos fecundados o bien directamente en células
vegetales en cultivo, ya es posible criar organismos superiores (animales)
alterados genéticamente.
3.1. Alimentos transgénicos de origen vegetal:
La clásica mejora de plantas ha sido una tarea lenta y difícil, pero la tecnología
de la ingeniería genética promete cambios revolucionarios que están dirigidos a
conseguir los siguientes objetivos:
-
Mejoras agronómicas de la planta: resistencia a plagas y patógenos,
crecimiento acelerado, menores requerimientos ambientales, tolerancia a
herbicidas, etc
-
Mejora de calidad de producto: incremento del valor nutritivo, mejora de
caracteres organolépticos, fibras más resistentes o de mejor calidad, etc.
-
Producción de nuevos compuestos: plásticos, nuevos productos del
metabolismo secundario, péptidos con actividad terapéutica, hormonas,
antígenos para vacunas, anticuerpos, etc.
Página 10 de 24
-
Plantas con nuevas aplicaciones: fitoremediación.
3.1.1.- Métodos de obtención
La tecnología del ADN interviene en este proceso ya que existen métodos para
la inserción en plantas de nuevos genes y por tanto modificación de estas:
-
Método físico: Se trata de un método balístico (bombardeo con partículas)
mediante el cual se realiza un disparo de una secuencia de ADN que se desee
insertar a un tejido concreto de la planta como semillas vegetales. Un
pequeño cilindro de acero que contiene una carga de pólvora se usa para
disparar sobre las células diana partículas revestidas con ácido nucleico. Las
partículas bombardean las células traspasando las paredes celulares y las
membranas sin provocar realmente la muerte de las células.
Aperturas
Percutor
Células o
tejidos
Carga
Macroproyectil de nylon
Placa de detención del
proyectil de nylon
Fig.4. Pistola de ADN
-
Agrobacterium tumefaciens: Esta bacteria tiene la capacidad de
atacar ciertas plantas e insertar trazas de su propio ADN que se
comporta como parte del ADN de la planta. Por este mecanismo de
acción, la planta posee un nuevo genotipo (puesto que tiene unos
genes de más que antes no poseía).
Página 11 de 24
Los científicos han utilizado esta bacteria para transferir genes exógenos en plantas de
forma dirigida. Se puede exponer las células de una planta al efecto de una bacteria
Agrobacterium que haya sido modificada previamente y por tanto se le haya insertado
una secuencia de ADN conocida y de interés. Cuando las células de la planta se dividan
el ADN exógeno se copiará igual que si fuera propio y de esta manera será pasado a
todas las nuevas células. Este proceso puede utilizarse para crear nuevos fenotipos en
plantas.
Bacillus turingiensis
(produce Bt toxina)
Agrobacterium
tumefaciens
Tecnología del ADN
Agrobacterium tumefaciens con capacidad
de invadir plantas y expresando la Bttoxina
Ataque de
insectos
Resiste
Muere
Fig.5. Producción de plantas transgénicas y resistencia a insectos
Página 12 de 24
En ambos casos, muchos genes que se ha intentado insertar no se expresan
correctamente en plantas, esto es debido a que necesitan de una pequeña secuencia
inicial llamada promotor y que permite que la información que hay en el gen sea
procesable, ya que el sistema de procesamiento de la planta va a reconocer esta pequeña
secuencia como propia pudiendo expresar todo aquello que lleve detrás de ella. Existen
distintos promotores, actualmente se utiliza en plantas el promotor p35S que proviene
del “virus del mosaico de la coliflor”. Es un promotor constitutivo, esto es, que puede
expresar todo lo que lleve detrás de él en cualquier tejido de la planta. Del mismo modo
debe llevar la secuencia un fragmento pequeño de terminación de lectura.
Fig.6. Localización y estructura de un gen exógeno
Promotor
ADN
Gen de interés
Terminador
….ATC TGC C………CTG CTA GTA CAT GAC….…TAG
ARNm
TRANSCRIPCIÓN
…CUG CUA GUA CAU GAC….
EXPRESIÓN
Proteína de
interés
Página 13 de 24
3.2.-
Alimentos transgénicos de origen animal
Con el uso de la tecnología del ADN y las técnicas de microinyección para
introducir genes exógenos en huevos fecundados se han podido expresar varios genes,
tanto en animales de laboratorio, como en especies animales importantes a nivel
industrial. Tales animales se denominan transgénicos y se ha ido haciendo cada vez más
importante en la investigación biomédica básica para estudiar la regulación de genes y
la biología del desarrollo.
Uno de los fines que se pretende es mejorar la productividad o la resistencia a
una enfermedad propia del animal, como en el caso de las plantas agrícolas. Sin
embargo, los animales transgénicos también se están utilizando para producir proteínas
de valor farmacológico. Así mismo, estos animales pueden ser útiles para obtener
proteínas humanas que no pueden obtenerse a través de microorganismos ya que estas
proteínas deben sufrir unas modificaciones a través de un mecanismo que no poseen los
microorganismos. Es por ello que en el caso de que estos genes sean introducidos en
ellos no se traducirían y no serían funcionales (como ocurre con ciertas enzimas
responsables de la coagulación de la sangre).
4. MÉTODOS DE ANÁLISIS:
Ante esta situación y frente a la reciente “alarma social” despertada, la Comisión
Europea ha establecido una serie de normas de comercialización y etiquetado de Nuevos
productos en general (Reglamento CE 258/97) , así como otras disposiciones
específicas (Reglamento CE 1139/98) en materia de información al consumidor final
de determinados alimentos e ingredientes alimentarios fabricados a partir de soja
(Glycine max L.) modificada genéticamente contemplada en la decisión 96/281/CE de
la Comisión y de maíz (Zea mays L.) modificado genéticamente contemplado en la
Decisión 97/98/CE de la Comisión. Recientemente ha aparecido unos reglamentos
Página 14 de 24
(Rtos. CE 49/2000 y CE 50/2000) de modificación del reglamento anterior relativos a
la indicación obligatoria en el etiquetado de determinados productos alimenticios
fabricados a partir de organismos modificados genéticamente en uno de los cuales se
especifica un umbral mínimo de presencia accidental en los ingredientes alimentarios de
material procedente de soja y del maíz modificados genéticamente, antes citados. Este
umbral máximo es del 1%.
Debido a esta necesidad por parte de las empresas que comienzan a
comercializar este tipo de productos así como aquellas que los utilizan como
ingredientes en el producto final, se han desarrollado nuevos métodos analíticos
basadas básicamente en la detección de ADN transgénico y/o proteína transgénica en
alimentos primarios fundamentalmente y recientemente en alimentos procesados que ya
se encuentran incluidas en los códigos Alemán y Suizo como métodos oficiales de
análisis, además de existir proyectos en ejecución con el objeto de desarrollar métodos
oficiales de análisis.
Cada uno de estos métodos se basa en dos técnicas específicas, y a su vez
existen distintas formas de abordar una técnica. En líneas generales, para la detección de
proteínas transgénicas se utiliza la técnica ELISA (Enzyme Linked Immunosorbant
Assay) y el LFA (Lateral Flow Strip), mientras que para la detección de ADN
transgénico se utiliza la PCR (Polymerase Chain Reaction) y el Southern Blot.
4.1. Métodos analíticos basados en la detección de ADN
Página 15 de 24
Corrientemente, cuando el alimento ha sido procesado o bien tratado
tecnológicamente (calor, presión, etc…) es conveniente realizar el análisis de ADN y no
de proteína ya que ésta puede haberse desnaturalizado o degradado en el proceso, y los
métodos analíticos de proteína requieren que esta se mantenga funcional. El ADN en
cambio puede haberse fragmentado durante el procesado en trozos pequeños pero ello
no implica necesariamente que no puedan ser detectados.
4.1.1. Southern Blot
Esta técnica consiste en usar sondas de ADN marcadas radioactivamente que
hibridan con una secuencia que sólo tienen los alimentos transgénicos Esta técnica se
utiliza a nivel experimental y de investigación pero no resulta viable para análisis
rutinarios, por ello se cita a título meramente informativo.
4.1.2. PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa)
Fundamento: La técnica de PCR es un método enzimático que permite copiar
de forma experimental una zona concreta de un genoma pudiéndose obtener hasta cien
mil copias de ella en un tubo de ensayo
La PCR hace uso de la enzima DNA polimerasa que es capaz de copiar
moléculas de ADN. La técnica requiere que se conozca la secuencia de nucleótidos de
una región del gen deseado, puesto que para que funcione la PCR es preciso disponer de
cortos oligonucleótidos iniciadores (trozos muy pequeños de ADN), complementarios
de secuencias presentes en el gen o genes de interés a partir de los cuales la DNA
polimerasa irá incorporando nucleótidos complementarios a la cadena que copia. Del
mismo modo es necesario que en el tubo de ensayo haya nucleótidos en cantidad
equimolar.
Página 16 de 24
Este proceso de copia es posible gracias a la utilización de equipos denominados
termocicladores, que permite la programación de ciclos sucesivos con gradientes de
tiempo/temperatura controlados.
El fundamento de la PCR se puede resumir en las siguientes etapas:
Página 17 de 24
5’
3’
Genes diana
DNA
polimerasa
3’
1) El ADN diana se calienta para
5’
separar las dos hebras y, junto a
Iniciadores
la DNA polimerasa, se añade un
exceso
Calentar
1)
de
iniciadores
complementarios a la cadena
5’
3’
5’
5’
del ADN diana.
2) Una vez unido el iniciador, la
extensión de éste proporciona
3’
5’
Extensión de los
iniciadores
una copia del ADN de doble
cadena original.
3) Un calentamiento, y la posterior
2)
unión y extensión del iniciador,
+
proporciona un segundo ADN
de doble cadena.
Calentar
3)
4) El segundo ADN de doble
cadena sufre un proceso igual al
indicado
en
los
puntos
anteriores.
5) Dos ciclos adicionales de PCR
rinden
8
y
16
copias
respectivamente de la secuencia
Extensión de los
iniciadores
4)
del ADN original. Posteriores
ciclos
incrementan
progresión
en
geométrica
número de copias
5)
Fig. 7 Fundamento de la
PCR
Página 18 de 24 Repetir el ciclo
el
Etapas del análisis
En el punto anterior comentamos la esencia de la PCR, sin embargo, para
realizar completamente un análisis de PCR se requiere de unos pasos previos al
comentado anteriormente y otros posteriores que vienen detallados en el siguiente
esquema y que básicamente constan de:
METODOLOGÍA
EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
•PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
•EXTRACCIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
•PRECIPITACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
-
Extracción del ADN total.
-
Amplificación de una zona
concreta del ADN.
-
Visualización
de
COMPROBACIÓN
DE LA EXTRACCIÓN
DNA diana
los
fragmentos amplificados en
un equipo de electroforesis.
Fig. 8. Etapas de la
PCR
PREPARACIÓN DE LA
“MASTER” DE PCR
•PRIMERS
•TAQ POLIMERASA I
•dNTPs
•TAMPÓN DE
AMPLIFICACIÓN
AMPLIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS
NUCLEICOS EXTRAIDOS POR PCR
•DESNATURALIZACIÓN
•ACOPLAMIENTO
•POLIMERIZACIÓN
DETECCIÓN E INTERPRETACIÓN
•ANALISIS ELECTROFORÉTICO
POR COMPARACIÓN CON PATRONES
MOLECULARES CONOCIDOS
•ANÁLISIS SECUNDARIOSDE RESTRICCIÓN,
HIBRIDACIÓN, ETC.
Aplicación de la PCR a la detección de alimentos transgénicos
La PCR es un método muy sensible para la detección de alimentos transgénicos,
ya que puede localizar específicamente cualquier gen del que se conozca su secuencia.
Página 19 de 24
En los alimentos transgénicos, como ya se comentó anteriormente, hay
secuencias exógenas que corresponden a un promotor, al gen de interés y a un
terminador.
Cuando se está realizando un estudio de un alimento del que se desconoce qué
gen se ha introducido, se debe realizar un estudio de “screening” en el cual se intentará
localizar el promotor frecuentemente utilizado para la inserción del gen (p35S) o el
terminador (NOS). En otros casos deben diseñarse iniciadores para localizar el gen
concreto.
Actualmente los métodos de “screening” se basan en la detección del promotor
p35S como se describe en el protocolo que se describe en el estudio de validación
realizado por el Instituto para la Salud y Protección del Consumidor de la Comisión
Europea (ISPRA, Italia) (Journal of AOAC International Vol. 82 Nº4, 1999 pg 923928).
Además de este método también se dispone de kits desarrollados para el análisis
de cualquier tipo de alimentos en los que puedan estar presentes ingredientes
procedentes de material transgénico.
En todos los casos es necesario disponer de material de referencia con distintas
concentraciones de ADN transgénico como el desarrollado por el Instituto para
Materiales de Referencia y Medidas de la Comisión Europea (Geel, Bélgica).
Los ensayos de cada muestra se analizan por duplicado y los presuntos positivos,
se confirma mediante un “análisis de restricción” consistente en utilizar un enzima que
a una temperatura determinada divide específicamente el fragmento p35S, en dos
fragmentos de una longitud en pares de base determinada y que son detectados también
Página 20 de 24
por análisis electroforético, o bien se complementan con detección colorimétrica a
través de marcadores específicos
Equipo necesario e instalaciones
Si se desea incorporar esta técnica al laboratorio se debe tener en cuenta una
inversión importante en equipos así como en cambios y distribución determinada del
laboratorio.
Los equipos indispensables en la técnica vienen detallados en la siguiente tabla:
PASOS ANALÍTICOS
EQUIPOS
EXTRACCIÓN DEL ADN
Centrífugas, microcentrífugas,
cabina de flujo laminar, micropipetas
AMPLIFICACIÓN DEL ADN
Termociclador
DETECCIÓN
Cubeta y fuente de electroforesis,
transiluminador y cámara o captador y
procesador de imágenes
Del mismo modo, al ser una técnica muy sensible, existe un riesgo alto en la
contaminación. Para evitar esto aparte de utilizar controles en todos los análisis, deben
de existir en el laboratorio zonas aisladas que para la realización de las distintas etapas
Página 21 de 24
del análisis (Extracción del ADN, PCR, detección por electroforesis) así como en la
preparación de los distintos reactivos.
4.2. Métodos de análisis basados en la detección de proteína
Uno de los métodos más utilizados para la detección de proteína transgénica es
el ELISA (Enzyme Linked Immunosorbant Assay). Sin embargo, como alternativa a
este método, ha aparecido recientemente en el mercado un sistema llamado LFA
(Lateral Flow Strip) cuya diferencia fundamental es el formato ya que la base es la
misma: detección de proteínas usando anticuerpos específicos de la proteína de
interés.
El LFA es un método de captura que utiliza una combinación de anticuerpos
inmovilizados en un soporte sólido. Sin embargo es un método de desarrollo reciente y
que requiere de validaciones previas antes de ser utilizado como método de rutina
analítica.
Página 22 de 24
4.2.1. ELISA:
Los análisis ELISA detectan o miden la cantidad de proteína de interés en una
muestra que puede contener numerosas proteínas distintas. Se utiliza un anticuerpo
fijado al pocillo que se une específicamente a la proteína transgénica, un segundo
anticuerpo conjugado a un enzima cuyo producto genera un color que es visible al
añadir un sustrato determinado y fácilmente cuantificable basado en la comparación de
una curva patrón de proteína de interés.
1) Pocillo de placa con
anticuerpo
3) Añadir segundo
anticuerpo marcado con
enzima
Fig.9. Fundamento del ELISA
2) Añadir la muestra. Si
hay proteína transgénica
de unirá al anticuerpo
4) Añadir sustrato del
enzima
5) Detección colorimétrica que
se compara con curva patrón
Del mismo modo que la PCR, la técnica de ELISA requiere de personal
capacitado y equipo especializado. Las características claves de esta técnica son las
siguientes:
-
Menos sensible que la PCR, sin embargo esto puede ser una ventaja
en algunos casos ya que es menos susceptible a “falsos positivos”.
-
Se necesita desarrollar previamente anticuerpos que reconozcan
específicamente la proteína transgénica que se desee. Por lo tanto no
puede utilizarse este método como técnica de “screening”.
Página 23 de 24
-
Por otra parte aunque el desarrollo de anticuerpos es una labor cuanto
menos tediosa, una vez desarrollados, el resto de reactivos resultan
mucho más económicos y rápidos que los utilizados en la PCR.
-
Estos métodos basados en la localización de la proteína son
aplicables siempre y cuando la proteína no haya sufrido ningúna
desnaturalización en el proceso de manipulación del alimento
(calentamiento y enfriamiento, prensado, etc).
ELISA aplicado actualmente a la detección de alimentos transgénicos
El único “límite” técnico para utilizar este método como análisis rutinario es que
se debe de conocer qué proteína concreta se ha debido modificar en cada caso, y se
deben desarrollar anticuerpos frente a esa proteína.
El desarrollo de estos anticuerpos es posterior a las exigencias marcadas por la
ley, que en la actualidad en Europa se aplican a la proteína Bt-176 del maíz y la
CP4EPSPS (Roundup Ready) expresada en soja.
Actualmente se dispone de anticuerpos para la detección de la proteína
modificada en soja (grano, harina, concentrado, aislado) y en breve espacio de tiempo se
espera disponer de los anticuerpos que reconocen la Bt-176 del maíz.
Página 24 de 24