96 Micropropagación

MICROPROPAGACIÓN
MEDIOS DE CULTIVO
Como se indica en la Guía 80: Micropropagación en el laboratorio de enseñanza,
los medios de cultivo incluyen agua, una fuente de carbono, compuestos
inorgánicos (sales minerales), vitaminas, hormonas y factores reguladores del
crecimiento (Tabla 1). Generalmente, el pH del medio es mantenido entre 5,0 y
6,5.
Tabla 1. Los componentes del medio de cultivo para células vegetales.
COMPONENTES
CARACTERÍSTICAS Y EJEMPLOS
Agua destilada
Representa el 95% del medio nutritivo.
Fuente de carbono
Generalmente se utiliza sacarosa. La fuente de carbono es necesaria porque los
explantes no son totalmente autotróficos y la fotosíntesis in vitro no aporta las
necesidades de las células.
Compuestos inorgánicos
Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) y microelementos (Fe, Co, Zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu,
I), en una proporción que depende de la planta elegida.
Vitaminas
Mioinositol, vitamina B1 (tiamina), ácido nicotínico (niacina), vitamina B6 (piridoxina),
pantotenato de calcio, ácido fólico, vitamina B2 (riboflavina), vitamina C (ácido
ascórbico), vitamina H (biotina), ácido para-aminobenzoico y vitamina E (tocoferol).
Hormonas y reguladores de
crecimiento
Auxinas. Estas promueven el elongación celular, la formación de callos y de raíces
adventicias; inhiben la formación de brotes axilares adventicios y, a veces, la
embriogénesis en suspensiones celulares. Ejemplos: IAA (ácido indol acético), NAA
(ácido naftalenoacético), IBA (ácidoindolbutírico),
2,4 D(2,4- diclorofenoxiacético).
Citocininas. Estas promueven la división celular, regulan el crecimiento y el desarrollo de
los tejidos vegetales. Ejemplos: cinetina, 2iP (2- isopentiladenina), BAP
(benzilaminopurina), ceatina.
Otros compuestos. Ejemplos: giberelinas, ácido abcísico, etileno.
Mezclas de compuestos
poco definidos
Ejemplos: extracto de levadura, extractos vegetales, hidrolizados de caseína, peptona y
triptona. La tendencia actual en investigación es la de sustituirlos por medios de
composición definida.
Materiales inertes
Utilizados como soporte. Ejemplos: agar, agarosa, otros polisacáridos (Gelrite, Phytagel),
lana de vidrio, papel de filtro, arena, esponjas de poliestireno.
Guía 96
María Antonia Malajovich / Guías de actividades
Biotecnología: enseñanza y divulgación
http://www.bteduc.bio.br
MICROPROPAGACIÓN / MEDIOS DE CULTIVO
Existen diferentes formulaciones, desde las más sofisticadas a las más simples,
siendo la más antigua la solución de Knop, que incluso hoy en día es utilizada como
base para los estudios sobre los macronutrientes necesarios para las plantas.
Actualmente, se admite que la composición de un medio debe estar ajustada a las
necesidades de cada especie.
Uno de los medios más utilizados es el de Murashige & Skoog (M&S), una mezcla
compleja de sales complementada con vitaminas, a la cual se agrega sacarosa y
agar. Por ser bastante concentrado, a veces se usa en una dilución del 50%. Su
preparación figura e la Guía 111: Micropropagación- medios clásicos.
El crecimiento y la diferenciación celular son controlados in vitro mediante
modificaciones de las proporciones de hormonas y reguladores de crecimiento. De
un modo general, si la proporción entre citocininas y auxinas es mayor que 1, se
desarrollan brotes, si es menor, raíces, y si son iguales, callos.
Sin embargo, la necesidad de utilizar medios bien definidos se aplica
fundamentalmente a la investigación científica. Para el horticultor o para el docente
dicha necesidad es menor, y en muchos casos, los medios alternativos son
suficientes para obtener buenos resultados.
Algunos autores (Taji, Bridgen) diseñaron medios alternativos de composición
simple: fertilizante NPK 10:10:10 y vitaminas. En el laboratorio de enseñanza,
tuvimos buenos resultados con el medio de Taji. La información sobre su
preparación se encuentra en la Guía 112: Micropropagación- medios alternativos.
La sacarosa puede ser reemplazada por azúcar cristal, en una concentración de 2
a 3%. El medio solidifica con agar bacteriológico en una concentración de 0,6 a
0,8%. También se puede experimentar con otros materiales (almidón, bolitas de
vidrio, compost, papel de filtro, arena, etc.).
Con excepción de la hormona de enraizamiento que es barata y fácil de encontrar
en los viveros, el precio de la mayoría de los factores de crecimiento es muy alto
para un laboratorio de enseñanza e inclusive para algunos laboratorios
comerciales. Una posibilidad es la adición de agua de coco a los medios, porque
contiene reguladores del crecimiento análogos a la cinetina, que estimulan la
división celular.
Además del agua de coco, otras sustancias de origen vegetal interesantes son la
pulpa de banana y los jugos de tomate, naranja, uva y piña. Poco empleadas en
la investigación científica, estas sustancias alternativas de composición mal
definida sustituyen, en el laboratorio de enseñanza, algunos reactivos caros o de
difícil obtención.
Guía 96
María Antonia Malajovich / Guías de actividades
Biotecnología: enseñanza y divulgación
http://www.bteduc.bio.br
MICROPROPAGACIÓN / MEDIOS DE CULTIVO
En Brasil, el agua de coco es un producto barato y fácil de encontrar, de modo que
puede ser incluido habitualmente en el medio para estimular el crecimiento de los
explantes. Para inducir la embriogénesis o la organogénesis del explante, se
reemplaza el agua de coco por un volumen equivalente de agua destilada.
Una vez dominada la técnica para el establecimiento de un cultivo aséptico, se
puede comparar el crecimiento en medios de diferente composición, utilizando una
adaptación de Piérik (Tabla 2).
Tabla 2. Combinaciones posibles para la formulación de un medio de cultivo.
Compuesto
Concentración
Azúcar (sacarosa)
1-2-4%
Sales minerales (M&S o
Taji)
1:4; 1:2; 1:1
Agua de coco
25%, 50%, 75%
Pueden obtenerse así hasta 33= 27 combinaciones de las cuales será elegida
aquella que muestre mejores resultados.
Guía 96
María Antonia Malajovich / Guías de actividades
Biotecnología: enseñanza y divulgación
http://www.bteduc.bio.br