CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LA RUTA CATABÓLICA

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
Facultad de Farmacia
Departamento de Microbiología II
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LA RUTA CATABÓLICA
DEL 4-HIDROXIFENILACETATO DE Eseherichia colí W
Memoria que para optar al Grado de Doctor en Farmacia presenta:
M~ AUXILIADORA PRIETO JIMENEZ
Director de la Tesis:
Dr. José Luis García López
Investigador Científico
Consejo Superior de Investigaciones Científicas
Madrid, 1995
A Rafa
A ints padres
Qulero expresar mi agradecimiento a aquellas personas que me han ayudado en la realización
de esta Tesis.
Especialmente, quiero agradecer a mi director, José Luis García López, la formación
cientp9ca que de él he recibido, siendo para mí un punto de referencia no sólo por su alto nivel
cien4fico sino también por la comprensión y el respeto con el que trata a las personas que le
rodean. Realmente, me siento afortunada por haber tenido la oportunidad de trabajar con él
durante estos años.
Por otra parte, quisiera mostrar mi más profundo agradecimiento al Dr. Rubens López
por haberme aceptado en su laboratorio, por sus valiosos consejos y por el inmejorable trato
humano que siempre me ha dispensado. También quiero agradecer a los doctores Pedro
Garcia y Ernesto García la gran ayuda profesional y moral que me han brindado en todo
momento, demostrando que son personas cotilas que siempre se puede contar. Además, quiero
hacer mención a la Dra. Concepción Ronda, que en los d<fíciles momentos iniciales, supo crear
un ambiente de amistad y compañerismo a su alrededor, facilitándome la integración en el
grupo.
De manera especial, agradezco sinceramente a todos mis compañeros de laboratorio
con los que he compartido mis buenosy malos momentos, la amistad, comprensión y a veces
paciencia que siempre han mostrado hacia mi. Igualmente, agradezco la valiosa colaboración
de Isabel Jado y la excelente asistencia técnica de Eloisa Cano, Manuel Carrasco, Paquita
Morante, Aurelio Hurtado y Ricardo Uña que ha facilitado considerablemente la realización
de este trabajo.
También quisiera agradecer al Dr Kenneth Timmis del G.B.F (Braunschweig,
Alemania,) y a todo su grupo, el haberme permitido trabajar durante un tiempo en su
laboratorio, poniendo a mi disposición todo lo necesario para llevar a cabo mi proyecto con
éxito. Quisiera mencionar especialmente al Dr. Eduardo Día porque sin su ayuda moral y
profesional mi estancia en este centro no habría sido tan fructífera.
A los doctores Víctor de Lorenzo, Juan Luis Ramos, Miguel Vicente, Miguel Angel
Peñalva, Alicia Gibe lío y Amando Garrido Pertierra les agradezco su ayuda y colaboración en
diversos aspectos de este trabajo.
Mi agradecimiento al director del departamento de Microbiología de la Facultad de
Farmacia, el Dr. César Nombela, por haber facilitado la lectura de esta Tesis y haber
aceptado ser ponente de la misma.
También quisiera agradecer a mis amigos, en particular a los miembros de la N B.A y
MB.A., el ánimo que en todo momento han sabido transmitirme.
Por último, quisiera agradecer a toda mifamilia el constante apoyo y comprensión que
siempre me han ofrecido y particularmente a Rafa, que ha compartido con respeto y cariño
todas mis alegrías ypenas durante este tiempo, hasta tal punto que en la actualidad es el único
abogado capaz de sorprender a propios y extraños con “amenas” charlas sobre el papel de
Eseherichia coIl en la descontaminación medioambientat
Este trabajo ha sido realizado gracias a la concesión de una Beca de Formación de
Personal Investigador de la Comunidad de Madrid
ABREVIATURAS
e
coeficiente de extinción molar
A
deleción
2-HPA:
ácido 2-hidroxifenilacético
3 -UPA:
ácido 3 -hidroxifenilacético
4-HPA:
ácido 4-hidroxifenilacético
Api:
resistencia a ampicilina
C120:
catecol 1,2-dioxigenasa
C230:
catecol 2,3-dioxigenasa
cAMP:
adenosin-monofosfato cíclico
CAP:
proteína receptora de cAMP
Ci:
Cmt:
curio
resistencia a cloranfenicol
CoA
coenzima A
CHM
5-carboximeti!-2-hidroxi-muconato
CHMS:
5-carboximetil-2-hidroxi-mucónico semialdehido
Da
dalton
dATP:
desoxiadenosin 5’-trifosfato
dCTP:
desoxicitosín 5’-trifosfato
EDIA:
etilendiaminotetraacetato
FAD:
flavin-adenin-dinucleótido
FMN:
flavin-mononucleótido
aceleración de la gravedad
HCA:
ácido fenilpropiónico
HIIDD:
2-hidroxi-hept-2,4-dien- 1 ,7-dioato
1-lEED:
2,4-dihidroxi-hept-2-en- 1 ,7-dioato
HMS:
2-hidroxi-mucónico semialdehido
HIPC:
homoprotocatecuato
HPLC:
cromatografía liquida de alta resolución
IPTG:
¡sopropil-j3-D-tiogalactopiranósido
kb:
1000 pares de bases
Kmt:
LB:
resistencia a kanamicina
MHP:
ácido 3-(3-hidroxifenil)propiónico
MMGs:
microorganismos modificados genéticamente
NADH:
nicotinamida-adenin-dinucleátido
NADPH:
fosfato de nicotinamida-adenín-dinucleátido
Nalt:
resistencia a ácido nalidixico
OHED:
2-oxo-hept-3-en- 1 ,7-dioato
ONPG:
o-nitrofenil-galactósido
OPET:
5-oxo-pent-3-en-1 ,2,5-tnicarboxilato
ORF:
marco de lectura abierta
p/v:
relación peso/volumen
P340
protocatecuato 3,4-dioxigenasa
PA:
ácido fenilacético
PGA:
penicilina G acilasa
Py:
piruvato
RES:
sitio de unión al ribosoma
Rift:
resistencia a rifampicina
SDS:
dodecil sulfato sódico
SS:
succinato semialdehido
Tcr:
resistencia a tetraciclina
Tris:
2-amino-2-hidroximetilpropano- 1 ,3-diol
y/y:
relación volumen/volumen
X-Gal:
5-bromo-4-cloro-3-indolil-fl-D-galactopiranósido
medio de cultivo de Luna y Bertani
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN
13
1. ACUMULACIÓN DE COMPUESTOS AROMATICOS ENLA BIOSFERA.
UN PROBLEMA MEDIOAMBIENTAL
14
2. ADAPTACIÓN INDUCIDA DE LOS MICROORGANISMOS A LOS
COMPUESTOS AROMÁTICOS CONTAMINANTES
15
3. RUTAS CATABÓLICAS
BACTERIAS
17
DE
COMPUESTOS
AROMÁTICOS EN
3.1. Metabolismo anaerobio
3.1.1. Bacterias fotosintéticas
3.1.2. Bacterias desnitriflcantes...
3.1.3. Bacterias sulfato-reductoras
3.1.4. Fermentación
3.2, Metabolismo aerobio
3.2.1. Rutas periféricas
3.2.1.1. Oxigenasas
3.2.1.2. Compuestos aromáticos halogenados.
3.2.1.3. Compuestos nitroaromaticos
3.2.1.4. Compuestos aromáticos azufrados
3.2.2. Ruta del catecol
3.2.2.1. Ruta meta
3.2.2.2. Ruta orto
3.2.3. Ruta del gentisato
3.2.4. Regulación de las rutas catabólicas de compuestos
aromáticos
4. AMPLIACIÓN DIRIGIDA DE LA CAPACIDAD BIODEGRADATIVA
BACTERIANA
17
18
19
21
22
22
26
26
32
35
36
37
37
40
42
42
46
5. LAS ENTEROBACTERIAS Y LA BIODEGRADACIÓN DE COMPUESTOS
AROMÁTICOS
4S
5.1. La capacidad biodegradativa de E. colí
50
5.1.1. Rutas catabólicas de compuestos aromáticos deE.coll
52
5.2. Fuentes naturales de los compuestos aromáticos metabolizables
por E. col!
56
6. OBJETIVOS
.
60
II. MATERIALES Y MÉTODOS
62
1. ESTIRPES BACTERIANAS Y PLÁSMIDOS
63
2. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO
64
3. PROCEDIMIENTOS DE TRANSFERENCIA GENETICA
64
3.1 Transformación
3.2. Conjugación
64
65
4. MANIPULACIÓN DEL DNA CON ENZIMAS DE USO COMÚN EN
BIOLOGíA MOLECULAR
65
5. PREPARACIÓN DE PLÁSMIDOS Y DNA CROMOSÓMICO
65
6. ELECTROFORESIS DEL DNA EN GELES DE AGAROSA
65
7. AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE LOS FRAGMENTOS DE DNA
66
7.1.
7.2.
7.3.
7.4.
Geles de poliacrilamida
Técnica de Geneclean
Geles de agarosa de bajo punto de fusión
Técnica de la fragarasa
66
66
67
67
8. SELECCIÓN DE LOS CLONES PRODUCTORES DE PGA
67
9. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN DE DNA
68
9.1. Técnica de Southern-bkot
9.2. Hibridación de DNA sobre filtros de colonias celulares
10. SECUENCIACIÓN DEL DNA
10.1. Secuenciación manual
10.2. Secuenciación automática
10.3. Análisis de la secuencia de DNA
68
68
69
69
69
69
11. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS DE CULTIVOS CELULARES
70
12. ENSAYOS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
12.1 Penicilina G acilasa
70
12.2. 4-IIPA-liidroxilasa
71
12.2.1. Cuantificación de la oxidación del NADH
71
12.2.2. Reacción acoplada con la catecol 2,3-dioxigenasa 1 (C230 1)
deP. pulida
71
12.3. HPC-dioxigenasa
72
12.4. ~-lactamasa
72
12.5. ¡1-galactosidasa
72
13. IDENTIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE LA REACCIÓN DE
LA 4-HPA-HIDROXILASA
73
14. DETECCIÓN DE PROTEÍNAS
CLONADOS DE DNA
73
CODIFICADAS POR FRAGMENTOS
15. PURIFICACIÓN DE LA 4-IIPA-HIDROXILASA
74
16. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
74
17. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS EN GELES DE POLIACRIAMIDASDS
74
18. DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA N-TERMINAL DE llpaB
75
19. OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-IJpaB
75
20. TÉCNICA DE WESTERN-BLOT
76
21. AISLAMIENTO DE RNA
76
22. DETERMINACIÓN DE LOS SITIOS DE INICIACIÓN DE
TRANSCRIPCIÓN MEDIANTE EL EMPLEO DE LA TÉCNICA
EXTENSIÓN CON UN INICIADOR
22.1. Marcaje del oligonucícótido con (y-32P1 ATP
22.2. Incorporación de [cé2iL’]dCTP
LA
DE
77
77
78
IR RESULTADOS
79
.
1. CLONACIÓN DEL GEN pac DE E. cali ATCC 11105
SO
1.1. Localización del gen responsable del fenotipo negro
1.2. Detección de las proteinas donadas en el plásmido pAJí9
80
83
2. CARACTERIZACIÓN DE LA HIDROXILASA
2.1.
2.2.
2.3.
2.4.
2.5.
2.6.
2.7.
85
Identificación de los productos de la reacción de hidroxilación
85
Estudio de los cofactores requeridos por la bidroxilasa
88
Especificidad de sustrato
88
Secuenciación del operón de la 4-HIPA-hidroxilasa
90
Implicación de la proteína HpaC en la actividad hidroxilasa
93
Purificación de la hidroxilasa llpaB
97
Presencia de genes homólogos a hpaB en otros microorganismos... 100
....
3. CLONACIÓN Y SECUENCIACIÓN DEL OPERÓN meta DE LA RUTA
DEL 4-UPA
102
3.1. Clonación del operón meta y construcción del mapa fisico de la
ruta del 4-HPA
102
3.2. Secuenciación del ciaste>’ de genes que componen la ruta del
4-HPA deE. col! ATCC 11105
104
3.3. Análisis de las regiones flanqueantes a la ruta del 4-HPA y
su localización en el cromosoma dc E. cali
128
3.4. Las regiones intergénicas
133
4. REGULACIÓN DEL OPERON kpaBC
136
4.1.
4.2.
4.3.
4.4.
Localización del promotor PBc
136
Determinación de los inductores del operé» ¡¿paRC
139
Localización de la región reguladora del operón hpaBC
139
Implicación de las proteínas HpaA y HpaX en la regulación del
operónhpaBC
140
4.5. Represión por catabolito de la 4-UPA-hidroxilasa
141
4.6. Determinación de los sitios de iniciación de la transcripción de los
promotores PA y PBC
142
4.7. El promotor Px
143
5. EXPRESIÓN DE LOS GENES DE LA RUTA DEL 4-HPA EN
ORGANISMOS HETERÓLOGOS
153
5.1 Construcción de módulos transponibles con los genes de la ruta del
4-EPA
153
5.2 Integración de la ruta del 4-EPA en el cromosoma de E. cali K12.. 154
5.3 Producción de la 4-HPA-hidroxilasa en P. pulida KT2442
155
IV. DISCUSION
163
1. CARACTERIZACIÓN DE LA 4-HPA-HIDROXILASA DE E cali W..
164
2. COMPARACIÓN DE LA RUTA DEL 4-EPA DE E col! W CON OTRAS
RUTAS CATABÓLICAS
168
2.1. Comparación de los genes ¡¡pu con los genes estructurales de otras
rutas metabólicas de derivados aromáticos
168
2.2. Los genes reguladores de la ruta del 4-EPA
173
2.3. La organización física de los genes
176
3. PERSPECTIVAS DE FUTURO EN LAUTILIZACIÓN DE LOS GENES
DE LA RUTA DEL 4-HPA EN LA DESCONTAMINACIÓN MEDIOAMBIENTAL
179
V. CONCLUSIONES
181
VI. BIBLIOGRAFL4.
184
Prohab¡emeftte no sw en contra de ¡a ciencia
sugenr que en un lugar u otro existe algún
organismo que, bojo Wt condiciones
adecuadas, pueda oxidar cualquier sustancla..
(Galo, 1952)
1. INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
1. ACUMULACIÓN DE COMPUESTOS AROMÁTICOS EN LA BIOSFERA.
UN PROBLEMA MEDIOAMBIENTAL
La gran capacidad biodegradativa de los microorganismos se conoce desde hace
décadas. De hecho, el principio de infalibilidad microbiana enunciado por Gale en
1952, proponía que, en las condiciones adecuadas, todas las sustancias naturales podían
ser degradadas por algún microorganismo (Stanier, 1986). Ciertamente, la mayoría de
los compuestos naturales se degradan con facilidad, aunque existen claras excepciones
como la lignina, presente en la madera de los árboles, que es muy resistente a la
biodegradación (Kuhad y Singh, 1993). Sin embargo, este principio no contemplaba la
masiva introducción de una amplia variedad de compuestos aromáticos en la Biosfera
como consecuencia de la actividad humana y el gran progreso industrial desarrollado
desde mediados del pasado siglo (Smith, 1990). En líneas generales, podemos definir el
término xenobiótico como un compuesto sintético cuya estructura química no ha sido
expuesta a los microorganismos a lo largo de la evolución (Leisinger y Brunner, 1986).
La aparición reciente de estos compuestos plantea el problema de su integración en los
grandes ciclos de recambio de la materia, que conduce a una acumulación, de estas
especies químicas debido a la resistencia que presentan frente al ataque microbiano. El
impacto que la acumulación de este tipo de contaminantes puede provocar en un
ecosistema viene dado por su concentración y su grado de toxicidad, pudiendo crear
graves problemas de contaminación ambiental.
La etapa limitante en la biodegradación o detoxificación de estos compuestos es
la eficiencia de las rutas catabólicas microbianas. Aunque a veces existen las enzimas
adecuadas para llevar a cabo la completa mineralización de ciertos compuestos
xenobióticos, estos procesos no son lo suficientemente rápidos como para mantener un
equilibrio entre la liberación y eliminación de éstos, siendo la causa principal de este
desfase la gran cantidad de vertidos que de forma incontrolada se liberan en la Biosfera
(Smith, 1990). La eficacia y cinética de estos procesos catabólicos puede verse afectada
por diversos factores como por ejemplo la accesibilidad del sustrato, la presencia de
sustancias adsorbentes en el suelo, o factores fisico-quimicos como la temperatura del
14
INTRODUCCIÓN
hábitat, pH, potencial redox, concentración de oxígeno, etc. (Swindol y cols., 1988;
Spain y van VeId, 1983; Bottomley, 1993).
2. ADAPTACIÓN INDUCIDA DE LOS MICROORGANISMOS
A LOS
COMPUESTOS AROMATICOS CONTAMINANTES
La selección natural actúa favorablemente sobre una población cuando las
variaciones introducidas permiten a dicha población obtener un crecimiento más rápido.
La continua y rápida evolución genética característica de las bacterias ha facilitado la
aparición y diseminación de rutas metabólicas para la degradación de una gran variedad
de hidrocarburos aromáticos (Leisinger y Brunner, 1986). Sin embargo, la masiva
liberación de agentes xenobióticos durante un corto espacio de tiempo, desde el punto de
vista evolutivo, no ha permitido a los microorganismos desarrollar nuevas propiedades
catabólicas con la rapidez suficiente para paliar el problema medioambiental originado
por la acumulación de estos compuestos en distintos ecosistemas.
Para acelerar los procesos evolutivos implicados en la adquisición de nuevas rutas
catabólicas se han diseñado en el laboratorio, mediante el uso de quimiostatos, diversos
experimentos consistentes en la aplicación controlada de una presión selectiva sobre una
estirpe, o una comunidad microbiana, que metabolice un compuesto parecido al que se
quiere degradar (Dom y cols., 1974). Estos estudios indican que es posible conseguir
una completa mineralización de ciertos agentes xenobióticos sustituyendo lentamente la
ffiente de carbono metabolizable por el compuesto en estudio. El periodo de exposición
al nuevo sustrato puede consistir en días o meses, denominándose proceso de
adaptación microbiana al cambio que provoca la ampliación de la capacidad
biodegradativa (Spain y van VeId, 1983). Estas estrategias se han utilizado con éxito en
varias ocasiones y tienen la ventaja de ser sencillas y de no ser necesaria la
caracterización a priori de las rutas catabólicas que intervienen en el proceso. La
desventaja principal que presentan es que el resultado final no es totalmente predecible.
Los mecanismos que han desarrollado los microorganismos para llevar a cabo
estos procesos consisten, por una parte, en la inducción de enzimas especificas para la
15
INTRODUCCIÓN
degradación del sustrato, y por otra, en la alteración de la actividad enzimática originada
por procesos de adaptación genética como la recombínación, transposición o mutacion.
También pueden estar implicados procesos de transferencia genética, de forma que, por
transformación, transducción o conjugación, el microorganismo adquiera genes que le
permitan ampliar su capacidad catabólica (Reineke y Knackmuss, 1979; van der Meer y
cols., 1992). Estos procesos se ven facilitados por el hecho de que muchas rutas
catabólicas están localizadas en plásmidos transmisibles o transposones. En la tabla 1 se
muestran algunos ejemplos de plásmidos que contienen genes implicados en rutas
catabólicas de compuestos aromáticos (Frantz y Chakrabarty, 1986).
Otro procedimiento para ampliar la capacidad biodegradativa bacteriana consiste
en la utilización de técnicas de ingenieria genética para la transferencia in vi/ro de genes
donados y/o de sistemas reguladores conocidos (de Lorenzo y Rojo, 1994). Esto da
lugar a microorganismos modificados genéticamente (MMGs) que, por su importancia,
se tratarán en otro apartado. La evolución in vi/ro requiere una caracterización
exhaustiva de las rutas metabólicas que se quieren expandir, lo que justifica el gran
avance que se ha producido en este campo durante las últimas décadas.
Tabla 1. Rutas catabólicas de compuestos aromáticos localizadas en plásmidos
Plásnildo
MIcroorganismo
Ruta degradativa
Referencia
TOL
Pseudomonas putída
Xileno, tolueno
(Dngglebyy cola., 1977)
SAL>
1’. pitido
salicilato
NAH
1±
putida
naflaPeno
(Chakrabatty, 1972)
(Yen y coPs., 1983)
(Yen y coPs., 19813)
NIC
P. Convexa
nicotina, tijeotinato
(Thacker y Gunsalus, 1979)
pRA500
P. puada
35~xiIenol
pEO
E. fluorescens
estireno
(Hopper y Kemp, 1980)
(Sala y cola., 1984)
(Bestetti y cola., 1984)
PC! TI
Eseudornonas sp.
anilina
(AnsonyMackinnon, 1984)
pJP4
Alcaligenes eutrophus
2,4-diclorofenoxiacetato
(DonyPeniberton, 1981)
pWRI
Eseudarnonas sp.
3 .I~pr¿~a~~
(Reineke y Knnckn,us, 1979)
pAC25
E. pulida
3 -clorobenzoato
(Chatierjee y Chakrabarty, 1983)
pVIISO
Eseudo‘nonas CF600
fenol
(Nordlundy coPs., 1990)
16
INTRODUCCIÓN
3.
RUTAS
CATABÓLICAS
DE
COMPUESTOS
AROMÁTICOS
EN
BACTERIAS
Junto con los residuos glucosídicos, el anillo bencénico constituye la unidad de
estructura química más diflindida en la Naturaleza, por lo que no es extraño que los
microorganismos hayan desarrollado rutas metabólicas que les permitan mineralizar este
tipo de compuestos (Smith, 1990). Sin embargo, la introducción artificial de grupos
electronegativos, cloro o nitro, en el anillo aromático disminuye considerablemente su
biodegradabilidad (Leisinger y Brunner, 1986).
El uso moderno del vocablo aromático no tiene ninguna relación con el aroma.
Aunque el término se originó en los albores de la quimica orgánica cuando se descubrió
que muchos compuestos que contenian anillos de benceno se caracterizaban por olores
fuertes, en la actualidad se asocia con compuestos que tienen una estabilidad de indole
aromática (Streiwieser y Heathcock, 1979). Los hidrocarburos aromáticos son muy
estables debido a su configuración electrónica por lo que requieren una activación previa
para ser metabolizados. El mecanismo de activación es diferente dependiendo de si se
lleva a cabo en un microorganismo anaerobio o aerobio. En el primer caso, las reacciones
que conllevan a la desestabilización del anillo aromático consisten, generalmente, en una
tioesterificación del anillo bencénico mediante la incorporación enzimática de coenzima
A (CoA). Sin embargo, los microorganismos aerobios, normalmente, desestabilizan la
estructura resonante mediante una serie de reacciones de oxidación. En ambos casos,
estas reacciones enzimáticas conducen a la formación de metabolitos intermediarios de
rutas centrales como el ciclo de Krebs (Leisinger y Brunner, 1986).
3.1. Metabolismo anaerobio
Los ecosistemas anóxicos se originan cuando el consumo de oxígeno supera al
suministro de éste, como sucede en aguas estancadas, sedimentos de lagos, plantas
industriales que producen metano a partir de desechos orgánicos, plantas de depuración
de aguas residuales, tracto digestivo de los animales, sedimento de los océanos, etc. El
metabolismo anaerobio de los compuestos orgánicos y su mineralización a dióxido de
‘7
INTRODUCCIÓN
carbono y metano depende de la disponibilidad de la luz y de aceptores de electrones
inorgánicos como nitrato, sulfato o dióxido de carbono.
En 1934, Tarvin y Buswell demostraron, mediante evidencias quimicas, que al
incubar un compuesto aromático en condiciones anaerobias, utilizando como medio
fango y aguas residuales, este compuesto era completamente transformado en metano y
dióxido de carbono. Posteriormente, y mediante el uso de benzoato marcado con
Clark y Fina (1952) demostraron que, en condiciones similares, el 50% del carbono
procedente de benzoato era convenido en metano, con lo que definitivamente quedó
demostrado que los microorganismos anaerobios eran capaces de catabolizar este tipo de
compuestos. Actualmente ha surgido un gran interés por el estudio de este tipo de rutas
dado que muchos ecosistemas anóxicos contienen grandes cantidades de residuos
aromáticos procedentes de desechos industriales.
La clasificación de los microorganismos anaerobios capaces de metabolizar
compuestos aromáticos se ha diseñado atendiendo al sistema que la bacteria utiliza para
obtener energía (Evans y Fuchs, 1988) (tabla 2).
3.1.1. Bacterias fotosintéticas
Desde el punto de vista biodegradativo, las bacterias rojas no sulffireas son las
más interesantes dentro del grupo de bacterias fotosintéticas. Son microorganismos
principalmente fotoheterótrofos, es decir, que utilizan la luz como frente de energía y
compuestos orgánicos como frente de carbono. Las bacterias rojas no sulfrreas se
presentan de modo típico en lagos y charcas de agua dulce, donde hay materia orgánica
pero no hay sulfitro, o está en muy baja concentración. Dentro de este grupo de
bacterias, se han descrito algunas especies pertenecientes al género Rhodopseudomonas
como R. palustris que pueden metabolizar benzoato y w-alcanofenilcarboxilatos en
condiciones anaerobias y en presencia de luz (Elder y cols., 1992). El benzoato entra en
la célula mediante un sistema de transporte dependiente de energía y es convertido en
benzoil-CoA por una benzoil-CoA ligasa inducible. Posteriormente, mediante una serie
de reacciones enzimáticas de reducción e hidratación, da lugar a 3-hidroxipimeil-CoA.
18
INTRODUCCIÓN
Este compuesto producirla acetil-CoA mediante una ruta metabólica similar a la f3oxidación de los ácidos grasos (Evans y Fuchs, 1988; Koch y cols., 1993; Gibson y
Gibson, 1992).
Otra especie interesante es 1?. gelatinosa que es capaz de mineralizar
floroglucinol. Se cree que el primer paso consiste en una deshidrogenación ya que el
dihidrofloroglucinol se ha identificado en el medio de cultivo pero el resto de la ruta
metabólica está aún por determinar (Whittle y cols.,1976).
3.1.2. Bacterias desnitrificantes
Muchas bacterias aerobias pueden utilizar nitrato, en lugar de oxigeno, como
aceptor de electrones cuando las condiciones son de anaerobiosis. Siempre que la
materia orgánica se descompone en el suelo o en el agua y se agota el oxígeno como
resultado de la respiración aeróbica microbiana, algunos de estos microorganismos
continuarán utilizando la materia orgánica si hay nitrato presente, es decir, mediante
respiración anaerobia. En este proceso el nitrógeno combinado es eliminado del suelo y
del agua con liberación de N2 a la atmósfera,
En 1970, Taylor y cols. aislaron un microorganismo Gram negativo que fue
clasificado como Psendomonas estirpe PN-1, que era capaz de metabolizar el benzoato
en condiciones aerobias mediante una ruta que conllevaba una hidroxilación que daba
lugar al ácido protocatéquico y posterior ruptura del anillo en posición meta. En
anaerobiosis y en presencia de nitrato este microorganismo también era capaz de utilizar
el benzoato como única fluente de carbono. Se demostró que el primer paso de esta ruta
consiste en la formación de benzoil-CoA. Posteriormente, Blake y Hegeman (1987)
reclasificaron
esta estirpe denominándola A Icailgenes xylosoxidans subespecie
desnitrWcans y demostraron, mediante experimentos genéticos, que la ruta anaeróbica
de degradación de benzoato estaba localizada en el plásmido conjugativo pCB 1. Este
microorganismo también puede mineralizar 2- y 4-fluorobenzoato mediante una reacción
de deshalogenación.
‘9
INTRODUCCIÓN
Tabla 2. Metabolismo anaerobio de compuestos aromáticos
Obtención de energia
Fotosíntesis
flesnitrificación
Microorganismo
benzoato
R. gelatinosa
m,p-hidroxibenzoato (Dution y Evans, 1967)
floroglucinol
(Whittle y cols., 1976)
Alceligenes xylosoxidans
benzoato
hidroxibenzoatos
fluorobonzoato
protocatecuato
vanilato
o, p.cresol
o, in, p-fialato
(Blake y Hegeman, 1987)
(Ziegler y cola., 1987)
(Tschech y Pucha. 1987)
(Bossert y Young, 1986)
(Dangel y cols., 1991)
Desuljbvibrío sp.
2-arninohenzoato
fenol
O, m, pcresol
fenilacetato,
4-hidroxifenflacetato,
fenol
p-cresol
benzoato
Desul/bcoccus
hidroxibenzoatos
(Evaiisy Pucha, 1988)
Desulfonema
fenilacetato
(Evans y Pucha, 1988)
DesuI/bsarcina
fenol
indo!
(Bak y Widdel, 1986a)
(Bak y Widdel, 1986b)
Caprococcus sp.
floroglucinol
(Tial y Sones, 1975)
Streptococcus
resorcinol
(Tschech y Schink, 1985)
Pelobacter acidigallící
galato,
pirogalol
(Schink y Pfennig, 1982)
E,¿bacteriurn oxidoreducens
polifenoles,
quereetina
(Knmn~hoIz y Bryant, 1986)
Asociación microbiana:
bacteria fermentativa +
bacteria acetogénica y n,etanogéniea
lignina
benzoato
tirosina
cinamato
feríilpropionato
feilacetato,
benzoato
fenol,
catecol
hidroquinona
ferulato
vanilato
siringinato
fenilalanina
benceno,
tolueno
tuiptófano,
indol
clorobcnceno
clorofenoles
elorobenzoatos
clorofenoxiacetatos
nítrofeno les
clorogwayacol
(Borufl’y Buswell, 1934)
(Tarvin y Buswell, 1934)
(Mountfort y l3ryant, 1982)
(Balba y Evana, 1980a)
Parococcus sp.
Bacillus sp.
Eseudoinonos
Fermentación
Fermentación n,etanonénica
Referencia
Bhodopseudomonas palustris
Paracoccus denitr,ficans
Reducción de sulfato
Sustrato
(Proctor y Seher, 1960)
(Willian,s y Evana, 1975)
(Rudolphi y cok., 1991)
(Aflringyeols., 1981)
(EvansyFnchs, 1988)
(Balba y Evana, 198Gb)
(Healy y Yoong, 1978)
(BalbayEvans, 1980e)
(Healy y cola., 1980)
(Kaiser y Haseln,ann, 1982)
(Sleat y Robinson, 1983)
(BalbayEvans, 1980a)
(Grbic.Galic y X’ogel, 1987)
(Beny y cola., 1987)
(Reineke y Ki,ackn,uss, 1984)
(Boydycols., 1983)
(Boyd y Shelton, 1984)
(Suflita y cola., 1982)
(Sufluta y t3ibson, 1985)
(Neilson y cols.,l987)
20
INTRODUCCIÓN
Actualmente se sabe que existen otras estirpes del género Eseudomonas que, en
condiciones desnitrificantes, degradan el benzoato y otros compuestos aromáticos como
el hidroxibenzoato, el 2-aminobenzoato, el fenol, el ácido fenilacético (PA) y el ácido 4hidroxifenilacético (4-HPA) (Altenschmidt y cols., 1991; Biegert y cols., 1993; Dangel y
cols., 1991; Mohamed y cols., 1993; Mohamed y Fuchs, 1993; FUer y Kelly, 1994). En
todos los casos interviene una acil-CoA ligasa que da lugar al tioéster correspondiente.
Mediante la intervención de diversas reacciones enzimáticas de a-oxidación,
reducción o carboxilación estos compuestos darán lugar a benzoil-CoA como metabolito
intermediario central que posteriormente es reducido e hidratado enzimáticamente por
un mecanismo similar al propuesto en R. palustris {Koch y Fuclis, 1992; Koch y cols.,
1993). Las acil-CoA ligasas son de vital importancia en los primeros pasos de las rutas
catabólicas anaeróbicas de derivados aromáticos ya que desestabilizan el anillo aromático
mediante tioesterificación.
3.1.3. Bacterias sulfato-reductoras
El hábitat típico de estos microorganismos anaerobios estrictos desasimiladores
de sulfato son sedimentos anaeróbicos que contienen materia orgánica y sulfato. Las
actividades de estos organismos dan como resultado una generación masiva de ácido
sulfhídrico. Esto conduce con frecuencia al desarrollo de bacterias rojas y verdes
suibreas, que utilizan el ácido sulthidrico como donador fotosintético de electrones,
oxidándolo a sulfato bajo condiciones anaeróbicas en presencia de luz Esta acción
combinada determina un ciclo anaeróbico típico del azufre. Los géneros Desu¿fovibrío,
Desu(fococcus, Desulfonema y Desulfosarcina, aislados de sedimentos marinos y de
agua salada, son capaces de metabolizar algunos derivados aromáticos como el
benzoato, el PA, el 3-fenilpropionato y el 2-, 3-, y 4-hidroxibenzoato, pero hasta ahora
se desconoce el mecanismo por el cual este tipo de bacterias mineralizan estos
compuestos (Evans y Fuchs, 1988).
21
INTRODUCCIÓN
3.1.4. Fermentación
La fermentación puede definirse como un proceso metabólico generador de ATP
en el que los compuestos orgánicos sirven tanto de donadores de electrones
(oxidándose) como de aceptores de electrones (reduciéndose).
En 1982, Schink y Pfennig aislaron de fango marino un microorganismo
perteneciente a la familia Bacteroidaceae al que llamaron Pelobacter acidigallící. Este
microorganismo es capaz de convertir ácido gálico, floroglucinol, pirogalol y 2,4,6trihidroxíbenzoato en acetato y CO2 Durante las fermentaciones no se reducía nitrato ni
sulfato. La asociación de este microorganismo con Acetobacteriurn woodii durante el
proceso fermentativo permitía la utilización de un nuevo sustrato ya que esta comunidad
bacteriana convertía e> ácido siringico en acetato. El acoplamiento de diferentes rutas
metabólicas permite a las comunidades microbianas utilizar ciertos compuestos
aromáticos que no serian degradables por un único microorganismo. Este tipo de
asociaciones co-metabólicas existen de forma natural en la Biosfera aumentando la
capacidad biodegradativa de los microorganismos.
3.2. Metabolismo aerobio
Como se mencionó anteriormente, el mecanismo general de desestabilización del
anillo aromático desarrollado por los microorganismos aerobios implica una oxidación
progresiva de la estructura resonante. Actualmente se tiene un gran conocimiento, a nivel
molecular, de algunas rutas catabólicas microbianas de compuestos aromáticos,
especialmente de las pertenecientes al género Pseudomonas (van der Meer y cols.,
1992). Una comparación detallada de estas rutas metabólicas indica que el primer paso
consiste en ¡a incorporación de dos grupos hidroxilo en el anillo bencénico para lo cual
los microorganismos han desarrollado una serie de rutas perféricas de oxidación,
deshalogenación, desnitración o desulfitración, que dan lugar a un intermediario
dihidroxilado susceptible a la acción de dioxigenasas especificas que provocarán la
apertura del anillo. Estos derivados dihidroxilados serán canalizados por dos rutas
generales: por la ruta del catecol, en la que los intermediarios catecólicos pueden ser
22
INTRODUCCIÓN
metabolizados a su vez mediante la ruta nieta o la ruta orto dependiendo de la posición
en la que se efectúe la apertura del anillo, o por la rulo del gen/isa/o. Los metabolitos
finales de ambas rutas entran directamente en el metabolismo intermediario de la célula
(figura 1).
OH
A
OH
O?
(9
<N.
c120
¡
050
‘N-- ~cetaldehido
Catecol
4cetil-Cot\
Ruta
COOH
¾
Orto
Píruvoto
Ruta Meto
Succinoto
~Sern~aIdeh~do
CO? \ 0005
y
OH
O
~
COOH
OH % OHC ~ÑOH
COOH
0005
P$50
COOH
Protocatecuato
OH
OH
0005
C—COOH
O?
O
OH
E
Fumoroto
.4cetoocetnto
Gentisato
Figura 1. Rutas catabólicas centrales dc compuestos aromáticos de
microorganismos aerobios. Los hidrocarburos aromáticos siguen dos rutas generales:
A, la ruta del catecol y 8, la ruta del gentisato. En el primer caso, la ruptura del anillo
aromático puede ser en posición 1,2 (nilo), o en 2,3 (meto), según la enzima utilizada.
Abreviaturas: C>20, catecol 1 ,2-dioxigenasa; C2,30, catecol 2,3-dioxigenasa; P3,40,
protocatecuato 3 ,4-dioxigenasa; P4,50, protocatecuato 4,5-dioxigenasa; G1.20, gentisato
1,2-dioxigenasa. (de Lorenzo y Rojo, 1994).
23
INTRODUOCÉÓN
En general, los genes que codifican para las enzimas responsables de la
degradación de compuestos aromáticos están estructurados en operones organizados en
agrupaciones o clusters de genes que, en muchas ocasiones, están localizados en
plásmidos transmisibles o en transposones (tabla 1), lo que permite su propagación. En la
figura 2 se muestra la organización de algunas de estas rutas catabólicas.
1
ÚOMI’lJESTO
kb
2Okb
[c<CAr
RtCtILON
(A
Cte robenzoalo
ZACTON
MICRoOBGANISMO
8)
<ch
pPO 1
Pxeudrj,rr<tin.<
pAC2~
1’. parado
PSI
DORFB AP
Clúrecatecol
‘Ir
D,clenofenoa,acoaalo
</4
Ierarrop<rras
cotDFECBM
Benzoato
‘y,
4. caa’ccoccÑCr,í
_
4kvmnr
LNIJHTGQ
u
no),
086//Y
5
¡Ej
X
O
__________
1’
GB
pM<WO
1> pulida
mt-2
NAH7
P~ pando
PpCl
cVOmoSOtfla
1. putido
FI
cIomosecna
A pseudoo<cdhgencs
oromoso’na
1<. rnendocinaKRl
FVIISO
Pseradornnrrasrp
A
1
red
A,AgAsA.BC
CloroLíIen,lo
IVBAMG
__________
&XFCW,84
Tolueno
JMPLI4
bénDCB A
S/9ZKOJFGETLZYX
(MX)
NaFaten&Sal¡eilato
cofA
co,~bcn
8
XiI,noflolue.,n
AC<67
O
bph
KY7O~
A BCDEF
ToJugno
‘nro
PKLM ‘JOPOS O OEFrI/1Z
Fenol
dnrp
Figura 2. Organización física de algunas rutas catabólicas de compuestos
aromáticos. E genes que forman parte de las rutas periféricas; U, genes reguladores; LI,
genes implicados en transporte; N, ruta meta; E ruta orto; ~ ruta orto modificada. Las
flechas indican la dirección de transcripción de los genes. Los genes cuya secuencia de
nucleótidos no se conoce en su totalidad están indicados entre paréntesis.
24
CF600
INTRODUCCIÓN
La ruta catabólica mejor caracterizada es la ruta TOL o ruta de degradación de
xileno y tolueno de Pseudomonas putic~a (Marqués y Ramos, 1993) Esta ruta está
localizada en los plásmidos TOL, de los cuales, el prototipo es el plásmido pWWO que
fue descrito por primera vez en el año 1974 por Williams y Murray aunque sus
propiedades catabólicas ya habían sido observadas en 1973 por Nakazawa y Yokota.
Este plásmido pertenece al grupo de incompatibilidad P-9 y tiene un tamaño de 117 kb
de las que, aproximadamente 40 kb están implicadas en la ruta catabólica (Downing y
Broda, 1979). El plásmído pWWO es autotransmisible y su rango de huésped se
restringe al género Pse udomonas y algunas Enrerobacteriaceae (Nakazawa, 1978;
Ramos-González y cols., 1991). Los genes implicados en esta ruta catabólica del xileno,
o genes xyl, están localizados en el transposón Tn465J de 56 kb que a su vez está
incluido en el transposón Tn46S3 de 70 kb, ambos pertenecientes a la familia de
transposones Tn3 (Tsuda y cols., 1989). El plásmido TOL es termosensible ya que en P.
acruginosa no puede mantenerse a 420C. Hasta ahora no han sido localizados con
exactitud los genes responsables de la replicación y transferencia conjugativa pero se
sabe que la expresión y formación del pilus dependiente de pWWO es constitutiva, lo
que justifica el alto grado de transferencia de este plásmido a las estirpes receptoras
(Ramos-González y cola, 1991).
Los genes catabólicos de la ruta TOL están organizados en dos operones
llamados operón “upper” (xylCMABN) y operón “meta” (xyIXYZLTEGFJQKJH). Los
genes xyITEGFJQKIH codifican para proteinas que forman parte de la ruta nieta para la
degradación del catecol. El resto de los genes
a1
constituyen una ruta periférica
mediante la cual el grupo metilo del tolueno es secuencialmente oxidado hasta benzoato,
o metilbenzoato si el producto inicial es xileno, por los productos de los genes del
operón upper; posteriormente estos compuestos son oxidados y descarboxilados para
producir
catecol
mediante
la
toluato
1 ,2-dioxigenasa
(xyIXYZ)
y
la
dihidroxiciclohexadieno descarboxilasa deshidrogenasa (xylL), respectivamente.
25
INTRODUCCIÓN
3.2.1. Rutas periféricas
A lo largo de la evolución, los microorganismos han ampliado su capacidad
biodegradativa mediante variaciones en las rutas periféricas como la adquisición de
nuevas enzimas y la aparición espontánea de mutaciones que provocan un cambio en la
especificidad de sustrato de las enzimas existentes. Normalmente la formación del
intermediario dihidroxilado en las diferentes rutas periféricas está mediada por
oxigenasas que, en muchos casos, presentan una gran similitud en su estructura primaria,
lo cual indica que podrían derivar de un gen ancestral común (van der Meer y cols.,
1992).
En este apartado se expondrán, de forma general, los tipos de enzimas implicadas
en las rutas periféricas.
3.2.1.1. Oxigenasas
Las oxigenasas son enzimas que catalizan la inserción de oxígeno molecular en
sustratos orgánicos. Estas enzimas se clasifican en monooxigenasas y dioxigenasas,
dependiendo del número de átomos de oxígeno que incorporan en la molécula de
sustrato. Las monooxigenasas incorporan sólo un átomo de oxígeno en el sustrato,
reduciendo el otro hasta agua mediante una reacción de oxidación. Debido al
acoplamiento entre las reacciones de oxigenación y oxidación estas enzimas también se
denominan oxidasas de júnción mixta. Las dioxigenasas introducen dos átomos de
oxigeno en el sustrato y se subdividen en dioxigenasas hidroxilantes, que incorporan dos
residuos hidroxilo en el anillo aromático, y dioxigenasas implicadas en la ruptura del
anillo que, a su vez, se subdividen en extradiol dioxigenasas o intradiol dioxigenasas
dependiendo de si la apertura del anillo aromático dihidroxilado se lleva a cabo mediante
un proceso de nieta-escisión (entre los carbonos 2 y 3 en el caso del catecol) u ortoescisión (entre los carbonos 1 y 2 en el caso del catecol) respectivamente (Harayama y
cols., 1992) (figura 1). Las dioxigenasas implicadas en la ruptura del anillo aromático se
tratarán en el apanado 3.2.2. ya que normalmente no forman parte de las rutas
periféricas.
26
INTRODUCCION
Tabla 3. Oxigenasas implicadas en la hidroxilación de compuestos aromáticos
MONOOXIGENASAS
Enzima
Microorganismo
Referencia
4.hidroxibenzoato 3-hidroxilasa
P.fluorescens
(Berkel y cola.,1992)
salicilato hidroxilasa
P. puada
(Youycols.. 1991)
2,4-diclorofenol 6-monoexigetiasa
Alcatigenes entrophus
(Perkins y cola., 1990)
fenol 2.hidroxilasa
Pseudomonas ESTIQOI
(Nurkycols., 1991)
2-nitrofenol hidroxilasa
1’. putida B2
(Zeyer y Kocher, 1988)
3-hidroxibenzoato 6-hidroxilasa
R cepacia
Micrococcus sp.
fenol 2-hidroxilasa
Psen do,nonas CF600
(Nordlund y cola., 1990)
Tolueno 4-monooxigenaaa
P. mendocina
(Yenycols., 1991)
4.liidroxifenilacefato 3-hidroxilasa
P. pulida
xileno rnonoOxigeflasa
1’. pulida
(Suzuki y cola., 1991)
Clase
Enditan
Microorganismo
Referencia
lA
Fíalato dioxigenasa
P. cepacia
(Batie y cola., 1987)
4-clorofenilacetato 3,4-dioxigenasa
Pseudo,,ionas sp. CB53
(Markus y cola., 1986)
4-sulfobenzoato 3,4-dioxigenasa
Coinamonas testosteroni
(Locher y cola., 1991)
benzoato dioxigenasa
(Yamaguchi y Fujisawa, 1982)
1’. arvilla
.4 cinetobaoter calcoaceuicus
(Neidle y cola.. 1991)
4-metoxibenzoato 0-desnietilasa
JA pulida
ItA
Pirazón dioxigenasa
Pseudo,nonas sp.
(Sauber y cola., 1977)
‘la
Benceno 1,2-dioxigenasa
E. peída
(lrieycols., 1987)
Tolueno dioxigeussa
JA puada
(Gibson y cola., 1982>
Naftaleno dioxigenasa
P.cciida
(Ensley y Gibson, 1983)
Familia
MONOCOMPONENTES
4-hidroxibenzoato 3-hidroxilasa
Fenol 2-hidroxilasa
Flavoproteinas no clasificadas
(Wangycols., 1987)
(Rajasekharan y cola., 1990)
MULTICOMPONENTES
Fenol 2-hidroxilaaa
No clasificadas
(Ararnachalam y cola., 1992)
Aluuil hidroxilasas
DIOXICENASAS
[FI
III
(Bernhardt y cola., 1975)
27
INTRODUCCIÓN
Las monooxigenasas y dioxigenasas hidroxilantes requieren donadores de
electrones externos como el NADH o NADPH y un centro redox, como mínimo, que
permita la activación de la molécula de oxigeno. Estos cofactores suelen ser metales de
transición como hierro, manganeso, cobre y cobalto, o una molécula de flavína o
pteridina. La clasificación actual de las hidroxilasas de derivados aromáticos se ha
establecido en función del peso molecular de las subunidades y de la similitud que
presentan estos enzimas en su estructura primaria (tabla 3). A diferencia de las
dioxigenasas, la mayoría de las monooxigenasas son flavoproteinas monocomponentes,
aunque se han descrito algunos sistemas multicomponentes como la fenol 2-hidroxilasa
de Pseudomonas CF600 que cataliza la conversión de fenol en catecol y está codificada
por los genes dmpKLMYOP (Nordlund y cols., 1990), y la tolueno 4-monooxigenasa de
P. mendocina KR1 codificada por los genes ImoABCDEF Los componentes de estas
dos monooxigenasas están relacionados entre sí y con otros sistemas enzimáticos con
cadena de transpone electrónico como la metano monooxigenasa y algunas dioxigenasas
hidroxilantes de compuestos aromáticos (Yen y cols., 1991).
Una monooxigenasa de interés para la discusión posterior de este trabajo es la 4HPA-hidroxilasa de P. putida (Arunachalam y cols., 1992). Es un sistema enzimático
que consta de dos componentes proteicos; una flavoproteina dimérica con dos
subunidades idénticas de 30,7 kDa y una proteína cooperadora de 38,5 kDa Los genes
que codifican para este sistema todavía no han sido donados, pero la purificación de los
dos componentes enzimáticos ha permitido estudiar parcialmente su mecanismo de
reacción (Arunachalam y cols., 1994; Arunachalam y Massey, 1994). La tiavoproteina
puede, por sí sola, catalizar la oxidación de NADH en presencia de 4-HPA
independientemente de la incorporación del grupo hidroxilo en la molécula de sustrato,
siendo necesaria la presencia de la proteina cooperadora para acoplar las reacciones de
oxidación e hidroxilación (figura 3). La oxidación de NADH mediada por la
flavoproteina también se produce en presencia de otros compuestos estructuralmente
relacionados con el 4-HPA, como son el p-clorofenilacetato y el p-fluorofenilacetato,
aunque sólo el 4-HIPA y en menor medida el p-hidroxifenilpropionato, son susceptibles a
la hidroxilación mediada por la proteína cooperadora. La proteína cooperadora no
presenta ningún centro redox, lo que descarta la posibilidad de que actúe como un
28
INTRODUCCION
receptor de electrones equivalente al componente oxigenasa terminal de la cadena de
transporte electrónico característico de los sistemas multicomponentes.
HDROXILACION
OXIDACION
+
NADHM-H
(Ef ector 1 Sustrato)
j-Oa
FLAVOPROTEINA
+
PROTEíNA COOPERADORA
FLAVOPROTEINA
GH2000H
+
CH2COOH
-a--
1%~3
OH
4-NaD~+H2O
+NADt +H202
OH
OH
Figura 3. Reacción catalizada por el componente flavoproteico de la 4-tIPAhidroxilasa de P. puti<la en presencia y ausencia de la proteína cooperadora.
29
INTRODUCCION
Las dioxigenasas hidroxilantes son sistemas enzimáticos multicomponentes. Los
componentes proteicos de este tipo de dioxigenasas se dividen, desde el punto de vista
funcional,
en dos clases:
oxígenasa terminal (o
hidroxilasa) y
componentes
transportadores de electrones. Generalmente, los genes que codifican para las
dioxigenasas hidroxilantes están agrupados con un gen que codifica para una dihidrodiol
deshidrogenasa que pertenece a la familia de las alcohol deshidrogenasas (Manson y
Camniack, 1992).
Las oxigenasas terminales son proteínas oligoméricas formadas por una o dos
subunidades diferentes que presentan una configuración ctn ó (a13)n. Contienen al menos
un núcleo redox de tipo “Rieske” y un átomo de hierro no hematinico responsable de la
activación de oxígeno. El núcleo redox de tipo “Rieske” está formado por dos átomos de
azufre y dos de hierro en el que, a diferencia de los centros redox de las ferredoxinas de
las plantas donde el hierro y el azufre están coordinados a cuatro cisteinas, un átomo de
hierro está coordinado a dos císteinas y el otro a dos histidinas. Estos aminoácidos están
conservados en el N-terminal de la subunidad cx lo que ha permitido idear la siguiente
secuencia consenso donde X indica cualquier aminoácido (Manson y Cammack, 1992):
C-X-H- 15 a 17 aminoácidos-C-X-X-H
En el sitio de unión del átomo de hierro no hematínico están implicadas dos
histidinas y dos tirosinas conservadas en la parte central de la subunidad ci. Otras
oxigenasas dependientes de hierro como las monooxigenasas de alcanos y xileno (Suzuki
y cois., 1991) contienen regiones ricas en histidina y tirosina que están implicadas en la
unión del átomo de hierro, pero su disposición es diferente a la de las oxigenasas
terminales.
Además de la oxigenasa terminal, en la cadena de transporte electrónico
intervienen una reductasa flavínica que reduce el NADH y otros componentes con
núcleos redox de tipo ferredoxina o “Rieske”. Atendiendo al número de componentes
que formen el sistema y al grupo prostético que utilicen, las dioxigenasas se clasifican en
(tabla 3):
30
INTRODUCCIÓN
-Clase 1: Dioxigenasas de dos componentes en los que el núcleo redox azufrehierro y el llavín nucícótido están combinados en una sola proteína. Dependiendo de si
el cofactor requerido es EMIN ó FA.D, se subdividen en Clase lA y liB respectivamente.
-Clase II: Dioxigenasas de tres componentes en las que en el transporte
electrónico están implicados una flavoproteina y una proteína con un núcleo redox de
tipo ferredoxina ( Clase hA) o de tipo “Rieske” (Clase liB).
-Clase III: Dioxigenasas de tres componentes que constan de una flavoproteina
con un núcleo redox azufre-hierro y una ferredoxina.
A pesar de la gran diversidad que caracteriza a este tipo de enzimas, se piensa
que algunas provienen de un mismo gen ancestral debido a la relación estructural y
funcional que presentan. Como ejemplo podemos citar la benzoato 1,2-dioxigenasa de A.
calcoacezicus (Neidle y cols., 1991) y la toluato 1,2-dioxigenasa deP. putida. Estas dos
enzimas pertenecen a la Clase IB de las dioxigenasas hidroxilantes. La benzoato 1,2dioxigenasa está codificada por los genes benABC, que pertenecen a la ruta orto de
degradación de benzoato de A. calcoaceticus. Esta enzima está codificada en el
cromosoma al igual que la benzoato 1,2-dioxigenasa de P. arvilla C-1, que es una
enzíma equivalente perteneciente a la ruta orto del benzoato en este microorganismo
(Yamaguchi y cols., 1982). La toluato 1,2-dioxigenasa, codificada por los genes xylXYZ
de la ruta TOL, es decir de la ruta me/a de degradación de benzoato, está localizada en el
plásmido pWWO a diferencia de las dos anteriores. La comparación de la secuencia de
aminoácidos entre estas enzimas demuestra que existen grandes zonas de homología en
todos sus componentes enzimáticos, fUndamentalmente en los sitios de unión de los
centros redox. Estas enzimas presentan la misma ftrnción pero difieren en la especificidad
de sustrato ya que, aunque las tres son capaces de oxidar el benzoato, la toluato 1,2dioxigenasa además de toluato, hidroxila otros alquilbenzoatos
sustituidos en las
posiciones 3 y 4 del anillo aromático. Este es un claro ejemplo de cómo los
microorganismos amplían su capacidad metabólica mediante variaciones en sus rutas
periféricas.
31
INTRODUCCIÓN
3.2.1.2. Compuestos aromáticos halogenados
Los hidrocarburos aromáticos halogenados constituyen uno de los grupos más
amplios de compuestos xenobióticos. El uso de herbicidas, insecticidas, fungicidas y
material dieléctrico en diversas industrias, que contienen mezclas de hasta io~ isómeros
diferentes de compuestos polihalogenados como en el caso de los policlorobifenilos
(PCBs) (Furukawa, 1994), contribuye a incrementar la resistencia a la biodegradación
que normalmente presentan los compuestos aromáticos.
Los microorganismos capaces de metabolizar compuestos halogenados requieren
la
intervención
de
enzimas,
denominadas
comúnmente
deshalogenasas,
que
específicamente catabolizan la escisión del enlace carbono-halógeno. Las reacciones de
deshalogenación pueden formar parte de las rutas periféricas cuando se producen en un
paso previo a la ruptura del anillo aromático, mientras que si se producen en un paso
posterior a la apertura del anillo dan lugar a las rutas catabólicas modificadas.
Se han descrito siete mecanismos de deshalogenación que permiten clasificar las
deshalogenasas en siete grupos (tabla 4):
a) Deshalogenasas reductasas. La deshalogenación reductiva está catalizada por
reductasas dependientes de NADH que catalizan la sustitución del halógeno por un
átomo de hidrógeno mediante una reacción de oxidoreducción. Generalmente, este
tipo de deshalogenación se lleva a cabo en un paso posterior a la orto-fisión del
anillo aromático. Las enzimas mejor caracterizadas de este grupo son las
cloromaleilacetato reductasas de las rutas de degradación de derivados aromáticos
dorados de A. eutrophus JMP134 (Ohosal y You, 1988) y Pseudo¡nonas PSi (van
der Meer y cols., 1991b) codificadas por los genes (fdF y tcbF respectivamente.
Ambos genes están localizados en plásmidos.
b) Deshalogenasas oxigenasas. La deshalogenación oxigenolítica está mediada por
monooxigenasas como la pentaclorofenol monooxigenasa de Flavobacterium
32
INTRODUCCIÓN
ATCC 33790, o por dioxigenasas como la 4-clorofenilacetato dioxigenasa de
Pseudomonas sp. CBS3. A diferencia de las reductasas, las oxigenasas intervienen
antes de ¡a ruptura del anillo aromático dando lugar a un derivado dihidroxilado
que seguirá metabolizándose por la ruta del catecol.
e) Halurohidrolasas. La deshalogenación hidrolítica conlíeva la incorporación de
un grupo hidroxilo procedente del agua mediante una sustitución nucleofihica
catalizada por las halurohidrolasas. Estas enzimas utilizan el agua como único
cosustrato. Las halurohidrolasas se han clasificado en fUnción de la especificidad de
sustrato y de su estructura primaria (Janssen y cols., 1994).
d)
Glutation-S-transferasas.
La deshalogenación tiolitica consiste
en el
desplazamiento nucleofilico de un átomo de halógeno por una molécula de
glutation, que posteriormente será a su vez desplazada por una reacción mediada
por el mismo sistema enzimático. En algunas rutas de degradación de compuestos
haloaromáticos
intervienen
conjuntamente
dos
sistemas
enzimáticos
de
deshalogenación como en el caso de la ruta de degradación de pentaclorofenol de
Flavobacternun ATCC 33790 (Orser y cols. 1993a y 1993b). En primer lugar, el
pentaclorofenol sufre una deshalogenación oxigenolítica catalizada por una
monooxigenasa codificada por el gen pcpB. Durante este proceso se elimina un
átomo de cloro. Posteriormente, el derivado dihidroxilado es deshalogenado
mediante una glutation-S-transferasa codificada por el gen pcpC. Las glutation-Stransferasas están implicadas no sólo en las rutas degradativas microbianas sino
que también intervienen en mecanismos de detoxificación de compuestos
aromáticos de organismos superiores.
e) Deshalogenasas isomerasas. Uno de los mecanismos desarrollados por los
microorganismos para degradar compuestos haloaromáticos es la deshalogenación
por sustitución intramolecular. El clorocatecol se produce como metabolito
intermediario de muchas rutas degradativas de compuestos cloroaromáticos. Este
intermediario se metaboliza en ?seudomonas B13 y en A. eutrophus JMPI34 por
una ruta de tipo orto denominada ruta orto modificada (ver apartado 3.2.2.2.). El
33
INTRODUCCIÓN
3-clorocatecol se transforma en el ácido 3-cloromucónico que, mediante la 3cloromuconato cicloisomerasa, da lugar a un intermediario inestable que se
descompone espontáneamente provocando la liberación del cloruro y la formación
del ácido oxomucónico. Este compuesto se metaboliza directamente por la ruta
orto de degradación de benzoato.
O Deshidrodeshalogenasas.
doble enlace y
La deshidrohalogenación conlíeva la formación de un
la liberación de una molécula de haluro de hidrógeno. La y-
pentaclorociclohexano deshidrohalogenasa de 1’, paucimobilis U126, codificada
por el gen linA, transforma este producto en tetraclorociclohexadieno que a su vez
puede ser transformado en triclorobenceno. Este último paso no es muy frecuente
iii
vivo ya que el intermediario tetraclorado es metabolizado por un mecanismo
hidrolitico.
g) Deshalogenasas hidratasas. Dentro de este grupo, la enzima mejor
caracterizada es la 4-clorobenzoato deshalogenasa de Psezdomonas CBS3
(Babbitt y cols., 1992). Este microorganismo está especialmente capacitado para la
mineralización de compuestos haloaromáticos ya que produce dos 4-clorobenzoato
halurohidrolasas, una 4-clorofenilacetato oxigenasa, y una 4-clorobenzoato
hidratasa que cataliza la conversión de 4-clorobenzoato en 4-hidroxibenzoato. La
4-clorobenzoato hidratasa es un sistema enzimático que consta de tres
componentes proteicos: una CoA-ligasa que activa el anillo aromático mediante la
incorporación de una molécula de CoA, una hidratasa que lleva a cabo la
deshalogenación del anillo aromático activado incorporando un grupo hidroxilo, y
una tioesterasa que moviliza el CoA dando lugar a 4-hidroxíbenzoato. Este
mecanismo de deshalogenación se ha detectado en otros microorganismos como
Arthrobacter sp. US (Crooks y Copley, 1993).
34
INTRODUCCIÓN
Tabla 4. Deshalogenasas
Enzimas
Ruta
Microorganismo
Gen
Referencia
2,4-diclorofenoxiacetato
1,2,4.trielorobenceno
A.eutrophus JMP134 (pJP4)
Pseudontonas PSI (pPSl)
OcdE
tcbF
(Ohosal y You, 1988)
(y. d. Meer y cols., t991b)
pentaclorofenol
Flavobecletiun, ATCC 33790
pcpfl
(Orserycols., 1993b)
4-clorobenzoato
4-clorobenzoato
Eseudomonas CBS3
Eseudomonas CBS3
deliCi
deliCi
(Schneidery cols., 1991)
penlaclorofenol
Flavobacterium ATCC 39723
pcpC
(Orser y coís., 1993.)
3-clorobenzoato
2A-diclorofenoxiacetato
1,2,4-triclorobenceno
E. putida AC867 (pAC27)
Aea/ropkus JMPI34 (pIPA)
Eseudonzonas PSI (pI’S 1)
clcB
(Gliosal y You, 1988)
0CdD
icOD
<?erkinsycols., 1990)
(y. d, Meer y cols. 199 Ib)
y-hexaclorociclohexano
E. paucimobilis UT26
linA
(Irnai y cols., 1991)
4-clorobenzoato
4-clorobenzoato
Fseudo,nonas CB53
Arthrobacter SU
ORE1
ORFI
(Babbittycols., 1992>
(Crooks y Copley, 1993>
Cloromaleilacetatoreductasas
Monooxh~enasas
Hidrolasas
Glutation-S-transferasas
Cloroniuconatocicloisornerasa
Desl,idrodesl,alogeu,asas
Hidralasas
3.2.1.3. Compuestos nitroaromáticos
Los compuestos nitroaromáticos se producen a gran escala en los procesos de
fabricación de colorantes, plásticos y explosivos. Son compuestos altamente tóxicos y su
liberación provoca grandes daños no sólo al medio ambiente, sino que también puede
afectar directamente al hombre ya que, incluso a muy bajas dosis, producen cianosis,
hepatotoxicidad, anemia e ictericia.
Se han descrito algunos microorganismos capaces de mineralizar nitrobenceno,
nitrofenoles, cloronitrofenoles, nitroanilinas, nitrobenzoatos, dinitrobenzoatos e incluso
2,4,6-trinitrotolueno (TNT) (Higson, 1992). El TNT es un compuesto derivado de la
fabricación de explosivos que se caracteriza por su notable estabilidad química que le
confiere una gran resistencia al ataque microbiano. Los microorganismos han
35
INTRODUCCIÓN
desarrollado dos mecanismos generales para mineralizar este tipo de compuestos. Por
una parte, una reducción progresiva del grupo nitro generalmente llevada a cabo por
nitroreductasas pertenecientes a rutas centrales, que conduce a la formación de aminas y
amoniaco. La otra alternativa conlíeva la liberación de nitrito mediante una reacción de
oxidación. Estos dos mecanismos coexisten en una estirpe de 1’. pu/ida aislada por Zeyer
y Kearney (1984) ya que es capaz de mineralizar 2-nitrofenol, mediante la formación de
nitrito y catecol, y por otra parte es capaz de metabolizar 3-nitrofenol liberándose
amonio en el proceso.
Actualmente el conocimiento a nivel molecular de este tipo de rutas catabólicas
es muy escaso, aunque el aislamiento de microorganismos degradadores de compuestos
nitroaromáticos permitirá el desarrollo de este tipo de estudios.
3.2.1.4. Compuestos aromáticos azufrados
El azufre está presente en combustibles fósiles en forma de azufre pirítico. tioles,
sulfUros, tiofenos, dibenzotiofenos y ácidos sulfónicos. La combustión de carbón y
petróleo da lugar, además de dióxido de carbono y agua, a óxidos de azufre y nitrógeno
que son muy perjudiciales ya que generan lluvias ácidas que ocasionan grandes daños
en los ecosistemas vegetales. La reducción del contenido en azufre y nitrógeno en este
tipo de combustibles por métodos químicos y biológicos contribuiría a paliar este
problema. Existen varios procedimientos quimicos y microbiológicos para eliminar el
azufre inorgánico del carbón
y petróleo (Monticello y Finnerty, 1985),
pero el
verdadero problema lo plantea el azufre que forma parte de los hidrocarburos aromáticos
que componen estos combustibles. Se han descrito microorganismos y comunidades
microbianas capaces de oxidar selectivamente el enlace C-S facilitando la liberación del
azufre en forma de sulfato, pero hasta ahora, las rutas catabólicas implicadas sólo se han
estudiado con compuestos modelo como el díbenzotiofeno y el ácido nafialen-sulfónico
(de Lorenzo y Rojo, 1994).
36
INTRODUCCIÓN
3.2.2. Ruta del catecol
Mediante las rutas periféricas muchos derivados aromáticos se transforman en
catecol como metabolito intermediario, lo que justifica que comúnmente se le denomine
“embudo catabólico” o “cuello de botella” de las rutas catabólicas de compuestos
aromáticos. Como ya se ha mencionado, dependiendo de la posición en la que se efectúe
la ruptura del anillo, el catecol será mineralizado por la ruta ¡neta o la ruta orto (figura
1).
3.2.2.1. Ruta ¡neta
Un compuesto aromático sigue una ruta de degradación de tipo me/a cuando la
ruptura del anillo se lleva a cabo por una extradiol dioxigenasa (tabla 5). En la figura 2
están indicadas algunas rutas catabólicas de tipo me/a.
Tabla 5. Dioxigenasas implicadas en la ruptura del anillo aromático
Familia
Enzima
Microorganismo
Referencia
Catecol 2,3-dioxigenasa 1
E. putida (TOL)
(Nakai y cols., 1983)
2,3-Dihidroxibifenil dioxigenasa
E. paucimobilis
(Taira y cols., 1988)
1 .2-Dihidroxinaflaleno dio~cigenasa
JA putida
(Harayama y Rekik, 1989)
Protocatecuato 4,5-dioxigenasa
E. paucimobilis
(Nebert y González, 1987)
Catecol 2,3-dioxigenasa fl
.4. eutrophus
(Kabisch y Fortnagel, 1990)
Homoprotocatecuato dioxigenasa
Esclierichia cali C
(Roper y Cooper, 1 990a)
Catecol 1 .2-dioxigenasa 1
E. aeruginosa
(Kukor y cola., 1988)
Catecol 1 ,2-dioxigenasa 11
Eseudomonas sp. PS 1
(van da Meer y cola., 199 Ib)
(Clorocatecol 1 ,2-dioxigenasa)
Protocatecuato 3,4-d¡oxigenasa
.4. calcoaceticus
EXTRADIOL DIOXIGENASAS
Catecol 2.3.dioxigenasa 1
Protocatecuato 4.5-dioxisenasa
Homoorotocatecuato dioxipenasa
INTRADIOL DIOXIGENASAS
Catecol 1.2-dioxicenasa 1
(Hartnett y cols. 1990)
GENTISATO 1.2-DIOXIGENASA
Gentisato 1,2 dioxigenasa
E. testosteroní
E. acidovoran,
(Harpel y Lipseomb, t990a y b)
37
INTRODUCCIÓN
La extradiol dioxigenasa mejor caracterizada es la catecol 2,3-dioxigenasa 1
(C230 1) que está codificada por el gen xylE y forma parte de la ruta TOL de P. putid.a.
La C230 1 está formada por cuatro subunidades idénticas de 32 kDa y contiene un
catión ferroso en cada subunidad. El producto de la reacción es el 2-hidroximucónico
semialdehido o su alquilderivado, dependiendo de si el sustrato inicial es catecol o
alquilcatecol, que es fácilmente detectable por ser de color amarillo. El rango de sustrato
de esta enzima es bastante amplio, oxida 3-metil-, 3-etil-, 4-metil- y 4-cloro-catecol. La
comparación de la secuencia de aminoácidos de la C230 1 de P. putida con la catecol
2,3-dioxigenasa Ii de A. eutrophus sugiere que estas enzimas no derivan del mismo
origen por lo que ambas proteínas deben pertenecer a dos superfamilias diferentes.
Los pasos siguientes a la nieta-escisión en la ruta TOL pueden seguir dos ramas
diferentes que convergen en el intermediario 2-oxopent-4-enoato (figura 4). La via
utilizada dependerá de si el semialdehido, producto de la dioxigenasa, proviene del nitoluato o si proviene del benzoato o del p-metilbenzoato. En el primer caso, el
semialdehido correspondiente es metabolizado mediante una hidrolasa codificada por
xy/F mientras que, en el segundo caso, la ruta sigue la rama del oxalocrotonato en la que
intervienen tres enzimas: la hidroximucónico semialdehido deshidrogenasa (XylG), la 4oxalocrotonato tautomerasa (XyIH) y la 4-oxalocrotonato descarboxilasa (XylI). El 2oxopent-4-enoato es posteriormente hidratado por XyIJ y mediante la acción de una
aldolasa (XyIK) da lugar a acetaldehido y piruvato que entran directamente en el
metabolismo intermediario de la célula (Marqués y Ramos, 1993).
Otras rutas catabólicas de tipo nieta como, por ejemplo, la ruta de degradación
de fenol de Pseudomonas sp CF600 (Powlowski y Shingler, 1994) y la ruta de
degradación de naftaleno de P. puada (Assinder y Williams, 1988), siguen un esquema
similar al de la ruta TOL y se ha demostrado, mediante técnicas de hibridación de DNA
y comparación de secuencias de aminoácidos, que algunas de las enzimas con función
equivalente pertenecientes a diferentes rutas proceden de un gen ancestral común
(Williams y Sayers, 1994).
38
INTRODUCCION
CH2OH
CH3
Rí
CHO
o
xy/MA
CCC H
o
xy/B
xy/G
xy/XYZ
HOOC OH
o
OH
COOH
—
‘N~~
¡
COOH
COOH
xy/H
xyIL
COa~7~ xyl/
a
CH300COOH
+
.tCYIG\
OH
COOH
~
OH
COOH
COOH
0
—.4—.
R2CH2CHO
xy/K
HO
xyIt/
N
Ra
R
xyIE
R1 COOH
Figura 4. Pasos enzimáticos de la ruta TOL. Los sustituyentes del anillo aromático
pueden ser: R1 R2 = -H; R1 -CH3, R2 -H; R1 = H, R2= -CH3; R1 -C2H5, R2
=
-1-1. Los genes xy¡
del operón upper (xylCMABAI) y del operón me/a
(xyIXYZLEGFJKJh’) codifican para las siguientes enzimas: XyIMA, xileno oxidasa;
XyIB, bencil alcohol deshidrogenasa; XyIC, benzaldehido deshidrogenasa; XyIXYZ,
toluato 1 ,2-dioxigenasa; XyIL, dihidroxiciclohexadieno descarboxilasa deshidrogenasa;
XyIE, catecol 2,3-dioxigenasa; XyIF, hidroximuconíco semialdehido hidrolasa; XyIG,
hidroximucónico semialdehido deshidrogenasa; XyIH, 4-oxalocrotonato tautomerasa;
XylI, 4-oxalocrotonato descarboxilasa; XyIJ, 2-oxopent-4-3-encato hidratasa; XyIK, 2oxo-4-hidropentonato aldolasa (Marqués y Ramos, 1993).
39
OH
H
INTRODUCCIÓN
3.2.2.2. Ruta orto
Un compuesto aromático sigue una ruta de degradación de tipo orto o ruta del
f3-cetoadipato cuando la ruptura del anillo es llevada a cabo por una intradiol
dioxigenasa. En la figura 2 están indicadas algunas rutas catabólicas de tipo orto.
La familia de las intradiol dioxigenasas incluye tres tipos diferentes de enzimas
(tabla 5): catecol 1,2-dioxigenasa 1 (C120 1), protocatecuato 3,4-dioxigenasa (P340) y
catecol 1,2-dioxigenasa II (C120 11). Las dos primeras se han identificado en muchos
microorganismos que contienen la ruta or/o propiamente dicha como P. putí¿kz, P.
aeruginosa, P. cepacia y A. calcoaceticus (Aldrich y cols., 1987; Doten y cols., 1987;
Hartnett y cols., 1990; Neidle y cols., 1988). Estas enzimas están codificadas en el
cromosoma a diferencia de la C120 II perteneciente a la ruta orto modificada que está
codificada en un plásmido.
Las intradiol dioxigenasas utilizan Fe(III) como cofactor y se ha demostrado,
mediante la determinación de la estructura tridimensional de la P340 de 1-’. putida, que el
Fe(III) se une a la proteina por dos residuos de tirosina y dos residuos de histidina
conservados en todas las intradiol dioxigenasas. Los genes que codifican para la C120 1
(ca/A) y las dos subunidades diferentes de la P340 (pcaH y pcaG) se transcriben
separadamente del resto de los genes de la ruta orto. En la figura 5 se muestran los pasos
enzimáticos que conducen a la formación de acetil-CoA y succinil-CoA.
El aislamiento y caracterización de algunas bacterias capaces de mineralizar
compuestos aromáticos dorados derivados de benceno, benzoato y
el ácido 2,4-
diclorofenoxiacético demostró la existencia de un grupo nuevo de enzimas responsables
de la metabolización de estos compuestos mediante una vía orto que se denomina ruta
orto mod¿ficada (Ohosal y You 1988; Don y Pemberton, 1981). La mayoría de ellas
convierten los derivados aromáticos dorados en clorocatecoles que son susceptibles a la
acción de las dioxigenasas pertenecientes al grupo de la de la C120 II. Las enzimas
implicadas en la mineralización de clorocatecoles presentan una especificidad de sustrato
más amplia que las enzimas equivalentes pertenecientes a la ruta orto no modificada y
40
NTROOUCCION
están codificadas en plásmidos (van der Meer y cols., 1992). Algunas rutas han sido
estudiadas en profundidad como la ruta de degradación de 3-clorobenzoato de
Pseudon,cn tas sp. 813 (Dom
y cois. 1974) y la ruta de degradación del ácido
diclorofenoxiacético codificada por los genes <IdCDEJY en el plásmido pJP4 de A.
eu/¡-ophns JMPI34 (Kaphammer y Olsen, 1990) (figura 2).
NOUOTORES GENES
REGULACORES
4-
GENES NOUCYORES
Htdrozbonzooro
V1?fIDORES
Bon,ooto
cao—
000~~
OH
I
000~
poM
aLt
4
006
000- ~
OH
JOtA
~.
—9
Hidr&xibcn=ootó
pco6/Y
OH
Ch.’
—¾
~—
cao—
COY
cao—
Croas
C0CY
coiS
000
o
CotR
COY
C~5,C’S-
—.
Mv ~eonoTo
COY
->
Oto
Y
pccC
8-celoodipoto
OH
co/A
000~
000~~
beOiOoI(,
000
Prolocotecuoto
000
tanA SC
coi~C
PeoR
~pcaD
000~~
0
COY
L
COY
pocid
i~—ceroodipoto
o
Coo¡A- ceteodipoto
[
pocE
o
fo
II
000~
4
Succ~n,I-Coh
tcetd -CoA
Figura 5. Ruta del »-cetoadipato de A. calcoacelicus y P pulido.. Esquema de la ruta
propuesto por Parales y I-Iarwood (1993).
41
INTRODUCCIÓN
3.2.3. Ruta dcl gentisato
El gentisato es un metabolito dihidroxilado intermediario de algunas rutas de
degradación microbiana de compuestos aromáticos como el antranilato (Ladd , 1962),
g-
naftol (Walker y Lippert, 1965)> 3- y 4-hidroxibenzoato (Crawford, 1975), salicilato
(Crawford y cols., 1975), flavonas (Tomasek y Crawford, 1986), nafialenodisulfonato
(Whittich y cols., 1988), m-cresol, 2,5- y 3,5-xilenol (Hopper y Chapman, 1970). En el
primer paso de esta ruta catabólica (figura 1) interviene la gentisato 1,2-dioxigenasa que
provoca la apertura del anillo aromático dando lugar a maleilpiruvato que
puede
degradarse directamente por el metabolismo intermediario microbiano o transformarse
previamente en flimarilpiruvato mediante una reacción de isomerización. La gentisato
1,2-dioxigenasa se ha purificado de P. acidovorans y 1>. testosteroni (Harpel y
Lipscomb, 1990a) y se ha demostrado que contiene cuatro subunidades idénticas y utiliza
Fe <II) como cofactor igual que las extradiol dioxigenasas, aunque el mecanismo de
acción de ambos grupos de enzimas es diferente (Harpel y Lípscomb, 1990b).
3.2.4. Regulación de las rutas catabólicas de compuestos aromáticos
La expresión de los genes que componen las rutas catabólicas está controlada por
proteínas reguladoras especificas. De esta forma, los microorganismos producen enzimas
para utilizar diferentes Ihentes de carbono, nitrógeno y fósforo degradándolas,
solamente, cuando no existe en el medio otro compuesto más fácilmente metabolizable.
Este mecanismo supone un ahorro de energía en el metabolismo microbiano.
La mayoría de las rutas catabólicas de compuestos aromáticos están reguladas
positivamente. Generalmente las proteínas reguladoras se unen a un efector o coinductor
e interaccionan con la región promotora de los operones catabólicos a los que regulan
favoreciendo su transcripción. Actualmente se ha caracterizado un gran número de
proteínas reguladoras de este tipo de rutas. El sistema más estudiado es el formado por
las proteinas XyIS/XylR que regulan coordinadamente la expresión de los operones
upper y nieta de la ruta TOL de P. putida (Marqués y Ramos, 1993). La figura 6
muestra el modelo de la regulación de esta ruta. Los dos genes reguladores están
42
INTRODUCCIÓN
situados en una posición adyacente uno del otro en el extremo 3~ del operón me/a y se
transcriben divergentemente mediante los promotores Pr en el caso de xy/R y LS en el
caso de xy/S. XylR es una proteína de 566 aa (67 kDa) que pertenece a la familia de
reguladores NtrC (Inouye y cols., 1988). El gen xylR se expresa constitutivamente y
responde a la presencia de xileno activando la transcripción del operón upper y xylS, en
presencia del factor &~ (RpoN) de la RNA polimerasa y, para el caso del operón upper,
la proteina reguladora ll-IF (Kóhler y cols., 1989, HolteL y cols., 1990, de Lorenzo y
cols., 1991).
toluoto
_______
Pu xyl CMABN
st
y
Pm xyl XYZLTEGFXJQKIH
+
RpoN
~sPrzyIR
t
—
e
£
a¿aa
u
RpoN
u
x ¡ lera
Figura 6. Regulación de la ruta TOL de P putida. Símbolos: O, forma inactiva de
XyIR incapaz de estimular eficientemente la transcripción a partir de Pu y Ps; U, forma
activa de XyIR que i) autorreprime su propia síntesis, u) en presencia del factor de
transcripción a 54ó proteína RpoN (@) estimula la transcripción del gen xyIS, y iii) en
presencia de RpoN y de la proteína II-IP (•) estimula la transcripción del operón
upper; A, forma inactiva de XyIS que a baja concentración no es capaz de activar al
promotor Pm; A, forma activa de XyIS que estimula la transcripción a partir de Pm +
estimulación de la transcripción; , inhibición de la transcripción (Marqués y Ramos,
1993).
-
43
NTRODUCCIÓN
La familia de reguladores NtrC se caracteriza por estar estructurada en cuatro
dominios (A, B, C y D), tres de los cuales están altamente conservados entre los
miembros de esta familia. El dominio D está situado en el extremo C-terminal de estas
proteínas y
presenta un motivo de hélice-giro-hélice responsable de la unión de la
proteína reguladora al DNA. El dominio C es la región más conservada y se cree que es
la responsable de la interacción de estas proteínas con la RNA polimerasa permitiendo la
formación de un complejo abierto de transcripción (Kustu y cols., 1991). El dominio 13
comprende una región hidrofilica muy corta que actuaría como sistema de unión entre
los dominios C y A. Por último, el dominio A parece estar implicado en la recepción de
la señal activadora, bien sea una señal mediada por una proteina como en el sistema
NtrC/NtrB (Ninfa y cols., 1988) o bien una señal mediada por un compuesto quimico
como en el caso de XyIR. El dominio A constituye el N-terniinal de estas proteínas y es
el menos conservado en esta familia.
Además de XyliR, existen otros miembros de esta familia implicados en la
regulación de las rutas catabólicas de derivados aromáticos como, por ejemplo, las
proteínas DmpR y PhhR pertenecientes a la rutas de degradación de fenol de
Pseudomonas CF600 (Shingler y cols., 1993) y de P. putida P35X, respectivamente
(Ching y cols., 1995). El porcentaje de identidad que presentan estas tres proteínas es
superior al 60% (Ching y cols., 1995).
La activación de la transcripción del operón meta está mediada por la proteína
XyIS que se hiperproduce como consecuencia de la activación provocada por XyIR o se
activa independientemente de XyIR en presencia de benzoato o determinados
alquilbenzoatos que actúan como efectores (Inouye y cols., 1987; Mermod y cols.,
1987; Ramos y cols., 1986). XyIS es una proteína de 321 aa (36 kDa) que pertenece a la
familia de reguladores AraC (Gallegos y cols., 1993). Algunos de estos reguladores
(RhaR, RhaS, MeIR, MaC y XyIS) están implicados en el catabolismo de ciertas fUentes
de carbono como la ramnosa, la melobiosa, la arabinosa y los alquilbenzoatos (Tobin y
Schleit 1987 y 1990; Webster y cols., 1989; Miyada y cols., 1990; Stoner y Schleit
1982; Lei y cols., 1985). Otros regulan la expresión de factores de virulencia en E. coli
(Rns) (Caron y cols., 1989) y Yersinia eníerocolitica (VirF) (Comelis y cols., 1989). La
44
INTRODUCCIóN
mayoria de ellos son reguladores positivos excepto CeID que actúa como represor del
operón ceIABCF de E. cdi (Parker y Hall, 1990). Estas proteinas reguladoras están
estructuradas en dos dominios el C-terminal y el N-terminal. En el C- terminal existe un
motivo característico de hélice-giro-hélice responsable de la unión de la proteína al DNA.
Este dominio está muy conservado en toda la familia lo que ha permitido diseñar una
secuencia consenso que caracteriza a la familia (Gallegos y cols., 1993). El dominio Nterminal no está conservado y se cree que, en el caso de los reguladores implicados en el
metabolismo de fluentes de carbono, es el responsable de la unión al efector (Ramos y
cols., 1990).
Otra familia de reguladores muy frecuentes en este tipo de rutas catabólicas son
los pertenecientes a la familia de reguladores LysR (Henikoff y cols., 1988; Schell,
1993). Normalmente codifican para proteínas activadoras de la transcripción excepto
catM (Neidle y cols., 1989) que actúa como represor. La mayoría de estos genes tienen
un tamaño aproximado de 1 kb y se transcriben en sentido contrario al gen u operón al
que regulan (Schell, 1993). En la región N-terminal de los miembros de esta familia
existe un motivo de hélice-giro-hélice, característico de proteínas que se unen a DNA,
que está conservado en la mayoría de los miembros de esta familia. Estas proteínas
necesitan un coinductor para activar la transcripción pero se unen al DNA diana
independientemente de la presencia del coinductor. La tabla 6 muestra algunos ejemplos
de proteínas reguladoras implicadas en el catabolismo de derivados aromáticos
pertenecientes a esta familia.
Tabla 6. Familia de reguladores LysR.
Froleinas
Origen
Ruta catsbólles
Colnduetor
Refeniwia
NahR
plásn,ido NAH7 deP. putida
nattaleno/salieilato
salicilato
(Schell, 1985)
CatR
P. putida
benzoato
cis-cis-nxuccuato
(Rothmel y cols., 1990)
CatM
.4. calcoacé ricos
benzoato
cis-cis-muconato
(Neidie y cols., 1989)
Tfds
plásmido pJP4 deA. eurrophus
cloromaleilacetato
(Kaphanuner y Olsea, t990)
TcbR
Pseudo,nonas sp. estirpe PSI
diclorofetioxiacetato
clorodienlactona
clorobenzoato
3-elorobonzoato
(van der Meer y cois., 199 ta)
CIcR
plásmido pAC2S deP. vuuda
clorocatecol
clorocatecol
(Coco y cols., 1993)
45
INTRODUCCIÓN
4. AMPLIACIÓN DIRIGIDA DE LA CAPACIDAD BIODEGRADATIVA
BACTERIANA
Como se comentó en el apanado 2., la caracterización exhaustiva de las rutas
metabólicas microbianas para la mineralización de compuestos aromáticos, permite la
utilización de técnicas de ingeniería genética para la ampliación de la capacidad
biodegradativa de los microorganismos. Esta aproximación experimental puede
abordarse por distintas vías; por una parte, desde el punto de vista cuantitativo, puede
mejorarse la actividad catalitica de cienos sistemas enzimáticos incrementando la
transcripción a partir de los promotores nativos mediante el uso de proteínas reguladoras
mutadas, aumentando el nivel de traducción o actuando globalmente sobre los circuitos
reguladores de la ruta (Ramos y cols., 1988; Timmis y cols., 1994). Desde el punto de
vista cualitativo, las rutas metabólicas pueden mejorarse mediante la variación controlada
de la estabilidad y la actividad catalítica de las enzimas que componen la ruta, la
construcción de enzimas hibridas con amplio rango de sustrato o el aislamiento de
mutantes con enzimas reguladoras modificadas que permitan aumentar el rango de
efectores que activen la ruta (Timmis y cols., 1994).
Otra forma de ampliar la capacidad metabólica de una bacteria es la construcción
de nuevas rutas mediante el ensamblaje de genes provenientes de diversas rutas
catabólicas de otras bacterias de forma que, en conjunto, se componen como una ruta
coordinada (de Lorenzo y Rojo, 1994). Generalmente, las rutas metabólicas de
hidrocarburos aromáticos convergen, mediante rutas periféricas,
en un intermediario
metabólico como el catecol o el gentisato (ver apanado 3.2.). Esta estructura modular
permite la combinación de diferentes módulos bioquimicamente compatibles que
posibiliten la canalización de nuevos
sustratos hacia rutas metabólicas centrales.
Dependiendo de si los nuevos compuestos metabolizables son o no análogos
estructurales del sustrato que originalmente el microorganismo podía metabolizar, la
expansión de la capacidad biodegradativa de una ruta metabólica puede ser lateral o
vertical (Timmis y cols., 1994). Un ejemplo clásico de este tipo de estrategias es la
expansión de la ruta de degradación de 3-clorobenzoato de Pseudomonas sp. B13. Este
microorganismo contiene una ruta de tipo orto para la degradación de benzoato y una
46
INTRODUCCIÓN
ruta orto modificada para la degradación de 3-clorobenzoato, pero no es capaz de
mineralizar 4-clorobenzoato o mezclas de alquil- y halobenzoatos (Dom y cols., 1974).
Sin embargo, Pseudomonas sp. FRI (pFRC2OP), una cepa derivada de Pseudomonas
sp.B13
que fUe
construida mediante el ensamblaje de genes
de
diferentes
microorganismos, es capaz de mineralizar estos compuestos (Rojo y cols., 1987).
La liberación al medio ambiente de microorganismos modificados genéticamente
(MlvIGs) para su utilización en la descontaminación de suelo, aguas subterráneas, o en
plantas de tratamiento de aguas residuales, plantea el problema de la predictibilidad del
impacto ecológico que tendrán las bacterias recombinantes en el medio en que se
introducen así como los posibles riesgos para la salud humana y animal (de Lorenzo y
Rojo, 1994). La evaluación de riesgos requiere el estudio de sistemas modelo o
microcosmos, que simulen el nicho ecológico en el que las cepas recombinantes están
destinadas a actuar. El microcosmos debe ser diseñado de forma que se puedan controlar
diferentes parámetros como la capacidad de los MMGs para sobrevivir y multiplicarse, la
estabilidad del material genético introducido, la capacidad de los MMGs para llevar a
cabo la fUnción para la cual habían sido construidos o la transferencia genética del
material introducido en los MMGs a otros microorganismos que comparten el
microcosmos (Ramos y cols., 1994). Por tanto, los MMGs destinados a aplicaciones
medioambientales deben presentar ciertas propiedades que complican significativamente
su manipulación genética en comparación con los MN’IGs de uso exclusivo de
laboratorio, La mayoría de las bacterias recombinantes contienen marcadores de
resistencia a antibióticos, por lo que la liberación de este tipo de bacterias está prohibida
por la mayoría de las normativas vigentes en los países de nuestro entorno (de Lorenzo y
Rojo, 1994). Por ello se han desarrollado nuevos sistemas de selección inocuos desde el
punto de vista medioambiental como, por ejemplo, resistencias a herbicidas y metales
pesados (Herrero y cols., 1990; de Lorenzo y cols., 1990). Estos marcadores están
incluidos en vectores-transposones, siendo los más utilizados los mini-transposones
derivados de TnS (Herrero y cols., 1990). Otra alternativa consiste en utilizar
anticuerpos monoclonales como marcadores de selección que reconozcan epitopos de la
superficie celular de la bacteria recombinante en estudio, Este sistema es muy sensible y
permite la identificación de los MMGs in si/u (Ramos y cols., 1994).
47
INTRODUCCIÓN
Por último, es importante resaltar los trabajos que actualmente se están
desarrollando en sistemas de contención biológica, consistentes en el diseño de circuitos
genéticos que permiten la expresión de un gen tóxico cuando el MMG no se encuentra
bajo las condiciones de crecimiento preestablecidas (Molin y cols., 1987; Knudsen y
Karlstróm, 1991; Ramos y cols., 1994). Con estos sistemas se pretende evitar la
proliferación incontrolada de los MMGs fUera del nicho ecológico para los que fUeron
diseñados o cuando el compuesto tóxico ya ha sido eliminado. Asimismo, también han
sido diseñados recientemente sistemas de contención genética que reducen la posible
transferencia genética horizontal del material recombinante a la población nativa de
microorganismos (Diaz y cols., 1994).
5. LAS ENTEROBACTERIAS Y LA BLODEGRADACIÓN DE COMPUESTOS
AROMÁTICOS
Las Enterobacterias constituyen uno de los grupos mayores y mejor definidos
entre las Eubacterias Gram-negativas no fotosintéticas. Son bacterias de forma bacilar
recta o curva cuyas dimensiones oscilan entre 0,3-1,0 x 1,0-6,0 ¡-im (Brenner, 1984). Las
especies pertenecientes a ciertos géneros son inmóviles mientras que otras se mueven
mediante flagelos perítricos. Se distinguen del resto de las Bubacterias Gram-negativas
de estructura similar por ser anaerobios facultativos. En condiciones anaeróbicas
obtienen energía por fermentación de carbohidratos mientras que, en condiciones
aeróbicas, pueden utilizar una amplia gama de compuestos orgánicos como, por ejemplo,
ácidos orgánicos, aminoácidos y carbohidratos (Stanier y cols., 1986). La consideración
de la inserción flagelar como un carácter taxonómico ha impedido la inclusión en el
grupo entérico de algunas bacterias acuáticas muy relacionadas con las enterobacterias,
como las pertenecientes a los géneros Vibrio, Aeromonas, Beneckea y Photobacterium.
Estas bacterias presentan flagelos polares o inserción flagelar mixta y son oxidasapositivos a diferencia de los miembros del grupo entérico (Stanier y cols, 1986). En la
figura 7 se muestra un esquema simplificado del porcentaje de similitud entre el DNA de
los géneros de la familia Enrerobacter¡aceae (Brenner, 1984).
48
INTRODUCCIÓN
~5oijj
70-100
J~efIa
40-50
[jjrotocíer
30 60 ]Zie(1a~~~3O~4O
LEEd
Li]
15
Figura
1540113
40 50
IEitc
¡¡a
114111
0
Edila
[jotacter
20
20
10 15
111
7. Porcentaje de similitud a nivel de nucleátidos entre los miembros de la
familia Enterobacteriaceae.
Eseherichia coil
es el representante clásico de las enterobacterias (Brenner,
1984). Este microorganismo forma parte de la flora intestinal habitual de los mamíferos,
aunque algunas estirpes patógenas causan infecciones intestinales y del tracto urinario.
Además, esta bacteria está presente en el suelo y en ciertos ambientes acuáticos como
consecuencia del tratamiento del suelo con estiércol y del vertido de aguas residuales
urbanas (Cies!ak y cols., 1993; Tsai y Olson, 1992; Manja y cols., 1992). Los géneros
Sah-nonella y Shigella están constituidos por bacterias patógenas responsables de
infecciones intestinales como la disentería bacilar, la fiebre tifoidea y la intoxicación
alimentaria bacteriana (Schaechter y Neidhardt, 1987). Dada la importancia clinica de
estos géneros se han hecho subdivisiones intraespecificas muy minuciosas en base al
49
INTRODUCCIÓN
estudio inmunológico de las superficies celulares (Brenner, 1984). Los géneros
Enterobacter, Serratia, Erwinia, y Proteus están muy relacionados con los anteriores
pero su hábitat es diferente, ya que principalmente están presentes en el suelo y en
algunos ambientes acuáticos. Las especies pertenecientes al género Erwinia son
patógenos de plantas. Algunas bacterias
patógenas de animales clasificadas
antiguamente dentro del género Pasteurella se incluyen actualmente dentro del género
Yersinia. Entre las especies que componen este género la más conocida es Y pestis el
agente causal de la peste bubónica que se caracteriza por ser una infección muy diferente
a las infecciones entéricas desde el punto de vista de la sintomatología que provoca y del
mecanismo de transmisión (Stanier y cols., 1986).
No cabe duda de que E. coli es un microorganismo paradigmático que ha servido
como herramienta para el estudio y desarrollo de la Biología Molecular. Ya desde
principios de siglo fUe elegido por los fisiólogos para sus investigaciones, debido a su
capacidad de crecer rápidamente en medios simples. A finales de 1930,
las
investigaciones realizadas por Wollmans y Bronfenbrenner sobre los bacteriófagos de E.
coli, determinaron el establecimiento definitivo de esta bacteria como modelo de estudio.
Actualmente el conocimiento de esta bacteria a nivel molecular es mayor que el de
cualquier otro organismo unicelular. De hecho, en el año 1987 aproximadamente un
tercio de los productos génicos de esta bacteria habían sido estudiados en detalle desde
el punto de vista bioquímico y sus genes habian sido identificados (Schaechter y
Neidhardt, 1987; Bachmann, 1990).
5.1. La capacidad biodeeradativa de E. coil
E. coli presenta un alto grado de adaptabilidad al medio ambiente, propio de las
bacterias que compiten por los nutrientes con otros microorganismos en un mismo nicho
ecológico. Por ejemplo, ante ciertos estímulos como e! aumento en la concentración de
nutrientes en el medio de cultivo, este microorganismo puede variar en segundos la fase
de crecimiento desde fase estacionaria hasta fase exponencial (Schaechter y Neidhardt,
1987). Por otra parte, E. cok puede degradar una amplia gama de compuestos orgánicos
como diferentes azúcares, polioles y ácidos orgánicos utilizándolos como frente de
50
INTRODUCCIÓN
carbono, lo que favorece la adaptación de este microorganismo a nichos ecológicos con
diferente composición química (Lin, 1987). Sin embargo, resulta sorprendente que
siendo E. coli la bacteria mejor estudiada bioquimica y genéticamente no se haya
analizado,
hasta hace relativamente poco tiempo, su capacidad para degradar
compuestos aromáticos. Aunque el número de trabajos en este sentido es aún escaso, se
sabe que algunas cepas de E. coli poseen rutas tan complejas como las descritas en otros
microorganismos para mineralizar distintos derivados bencénicos
como los ácidos
fenilacético (PA), 3- y 4-hidroxifenilacético (3- y 4-HIPA), homoprotocatéquico (HPC),
3-fenilpropiónico (HCA), 3-(3-hidroxifenil)propiónico (MHP), 3-hidroxicinámico y 2feniletilamina (Cooper y Skinner, 1980; Burlingame y Chapman, 1983; Cooper y cois.,
1985). Otras enterobacterias que poseen rutas catabólicas de este tipo son K.
pneumomae, que puede mineralizar 3- y 4-hidroxibenzoato así como 3-y 4-UPA (Suárez
y cols., 1991; Martin y cols., 1991), y algunas especies del género Serrada que pueden
utilizar como única fUente de carbono benzoato, benzilformato, 3- y 4-hidroxibenzoato y
PA (Brenner, 1984).
No todas las estirpes de E cok pueden catabolizar los mismos sustratos (tabla 7).
Por ejemplo, la estirpe K-12 puede metabolizar el PA pero no el 3- y 4-HIPA, a diferencia
de la estirpes B y C que sólo pueden mineralizar los hidroxiderivados del PA. La estirpe
W puede degradar tanto el PA como el 3- y 4-1-IFA así como todos los derivados
aromáticos que han sido estudiados hasta ahora, por lo que parece estar especialmente
capacitada para la mineralización de este tipo de compuestos (Burlingame y Chapman
1983). Esta estirpe posee una enzima denominada penicilina G acilasa (PGA) capaz de
hidrolizar el resto PA de la molécula de penicilina O, liberando ácido 6-amino
penicilánico que es la base de las penicilinas senaisintéticas (Cole, 1964). La PGA ha sido
muy estudiada en la industria para la producción de antibióticos ¡3-lactámicos siendo una
de las pocas enzimas que actualmente se emplean en procesos industriales de
biotransformación (Valle y cols., 1991). Además de la penicilina O esta enzima puede
hidrolizar otras amidas y ésteres del PA, 4-HiPA y de otros compuestos aromáticos
(Margolin y cols., 1980; Roa y cols., 1994; Duggleby y cols., 1995) por lo que se ha
especulado que su fUnción debe estar relacionada con la posibilidad de hidrolizar
compuestos que puedan ser posteriormente utilizados como fUente de carbono (Valle y
5’
INTRODUCCIÓN
cols. 1991). El mecanismo de regulación de la acilasa apoya esta hipótesis ya que su
producción está sujeta a represión catabólica y se induce por PA y otros derivados
aromáticos relacionados con éste (Merino y cols., 1992; Vandame, 1985). Existen otras
enterobacterias que poseen PGA como Kluyvera citrophila ATCC 21285 y Proteus
reageri ATCC 31052 (Barbero y cols., 1986; Daumy y cols., 1985)
pero, sin duda
alguna, la acilasa mejor caracterizada es la de la estirpe W de E. coli ATCC 11105.
Tabla 7. Estirpes de E. coil que metabolizan compuestos aromáticos
Estirpe
B
C
Ml
Número examinado
2
Fenilacetato
+
3-Hidroxifenilacetato
K-12
NTCTCS928
A¡slados clínicos
9~28
1
2~
27
+
+
+
+
4-Hidroxifenilacetato
3-Fenilpropionato
+
3-(3-Hidroxifeniflpropionato
+
*
3-Hidroxifenilcinamato
+
+
+
+
+
4
*
+
*
+
+
5.1.1. Rutas catabólicas de compuestos aromáticos de E .coIi
Los primeros trabajos sobre rutas catabólicas de aromáticos de E. coli frieron
realizados en 1980 por Cooper y Skinner. Mediante la identificación de intermediarios
catabólicos en extractos crudos de células de la estirpe C de E. cok incubadas en
presencia de los ácidos 3- y/ó 4-HPA y la caracterización bioquímica de las enzimas
implicadas, propusieron una ruta metabólica de ruptura meta para la degradación de 3- y
4-NIPA. El primer paso de la ruta consistiría en una hídroxilación del sustrato para dar
52
+
INTRODUCCIÓN
lugar en, ambos casos, al HPC, por lo que demostraron que ambas rutas están
conectadas en
esta estirpe. Durante los últimos quince años se ha caracterizado
bioquimicamente y donado ~osgenes (Jipe) de la ruta de degradación nieta del HPC de
E. cok C, aunque el mapa de restricción así como el orden de transcripción de los genes
de la ruta no han sido determinados hasta 1993 por Roper y cois., (figura 8) (Cooper y
Skinner, 1980; Garrido-Pertierra y Cooper, 1981; Skinner y Cooper 1982; Jenkins y
Cooper 1988; Ferrer y Cooper, 1988; Fawcett y cols., 1989; Roper y Cooper, 1990a, b;
Roper y Cooper, 1993; Roper y cols., 1995)
hpcR
hpcE
hpcC
Represor
OPET
descarboxilasa
deshidrogenasa
CEnAS
hpcB
hpeG
hpcH
OREO
Fil-LEO
hidratasa
aldolasa
ApeO
HPC
dioxigenasa
CI-IM-isomerasa
w
1 kb
Figura 8. Orden de transcripción de los genes de la ruta catabólica del
honioprotocatecuato dc E. cotí C. Esta ruta está compuesta por el gen regulador Jipe]?
y el operón me/a (hpcECBDGA9. Las flechas indican la dirección de transcripción de los
genes. Los genes hpc codifican para las enzimas que aparecen en la parte inferior de la
figura. Abreviaturas: HPC, homoprotocatecuato; CI-IMS, 5-carboximetif-2-hidroximucónico semialdehido; CHM, 5-carboximetil-2-hidroxi-muconato; OPET, 5-oxo-pent3-en- 1 ,2,5-tricarboxilato; OHED, 2-oxo-hept-3-en-1 ,7-dioato; HHED, 2,4-dihidrox,hept-2-en-l,7-dioato (Ropery col., 1993).
53
INTRODUCCIÓN
La ruta catabólica del PA no ha sido prácticamente estudiada. En 1985> Cooper y
cols. aislaron una serie de mutantes de E. col) K-12 incapaces de metabolizar e] PA y
localizaron los genes implicados en esta ruta metabólica en el minuto 30,4 del
cromosoma de E. col) K-12. Se ha demostrado bioquimicanaente que la ruta de
degradación de 2-feniletilamina está relacionada con la ruta del PA, ya que esta amina se
transforma en fenilacetaldehido mediante una amina oxidasa dependiente de cobre y
posteriormente en PA mediante una deshidrogenasa, por lo que aparentemente las rutas
de degradación de la 2-feniletilamina y del PA podrian estar relacionadas (Parrot y cols.,
1987; Cooper y cols., 1992). Por otra parte, se ha demostrado la existencia de una
fenilacetil-CoA ligasa en E. col) W inducible por PA que podria estar involucrada en la
ruta catabólica de
este compuesto,
activando el
anillo aromático
mediante
tioesteriflcación, de igual forma que otras acetil-CoA ligasas implicadas en las rutas
catabólicas de derivados aromáticos de microorganismos, generalmente, anaerobios
(Vitovski, 1993).
La ruta catabólica del UCA fije caracterizada bioquimicamente en 1983 por
Burlingame y Chapman. Posteriormente, mediante el aislamiento de mutantes incapaces
de metabolizar el HCA, estos autores determinaron los pasos enzimáticos de la ruta de
degradación del HCA y del MHIP de E. coli K-12 (figura 9) (Burlingame y cols., 1986).
Esta ruta sigue un mecanismo similar al de las rutas de ruptura me/a descritas en otros
microorganismos para la degradación de otros hidrocarburos aromáticos (ver apartado
3.2.2.1.). Actualmente se han localizado en el minuto 8 del cromosoma de E. coiz K-12
los genes que codifican para las tres primeras enzimas de la ruta de degradación del
MIHIP, la MHP-hidroxilasa (mhpA), la 3-(2,3-dihidroxifenil)propionato 1,2-dioxigenasa
(mhpB) y la 2-hidroxi 6-cetononadienedionato hidrolasa (mhpC) (figura 9) y se han
donado e hiperexpresado los genes mhpB y mhpC (Bugg, 1993). La comparación de la
secuencia del extremo N-terminal de la 1 >2-dioxigenasa MhpB indica que esta enzima
puede estar relacionada con la catecol 2,3-dioxigenasa II de A. eutrophus (Kabisch y
Fortnagel, 1990).
54
INTRODUCCIÓN
LeCH
000 H
OH
-41
HcoA
~
~
OH
H CA
H
HcaB
000 H
COOH
00019
MhpA
OH
OH
MhpR
OH
‘~‘-
O
00019
OH
—>
2,3-DHP
MHP
lv
III
Mh~C¡~
00019
2
00019
VII
0195
O
00019
19
CH~
Ix
x
~
CO OH
MhpE
HO
MhpD
00019
OH
O
VIII
VI
Figura 9. Ruta de degradación del ácido 3-fenlipropiónico y del ácido 3-(3hidroxifenil)propiónico dc E. coIi K12. Los metabolitos son los siguientes: ácido 3fenlípropiónico (HCA) (1), cis-3-(3-carboxietil)-3,5-ciclohexadieno-l,2-diol (II), ácido 3(3 -hidroxifenil)propiónico (MA-IP) (III), ácido 3-(2,3-dihidroxifenil)propiónico (2,3DHP) (IV), ácido 2-hidroxi-6-cetononadienodióico (y), ácido 2-ceto-4-pentenoico
(enol) (VI), ácido succinico (VII), ácido 4-hidroxi-2-cetovalérico (VIII), acetaldehido
(IX), ácido pirtivico (X). Denominación de las enzimas implicadas en la ruta: dioxigenasa
HcaA, deshidrogenasa HcaB, hidroxilasa MhpA, dioxigenasa MhpB, hidrolasa MhpC,
hidratasa MhpD aldolasa MhpFi (Bugg, 1993).
,
55
INTRODUCCION
5.2. Fuentes naturales de los comnuestos aromáticos metabolizables por E. cotí
Para poder establecer una hipótesis sobre el posible papel fisiológico de estas
rutas en un organismo como E. cok, es necesario conocer las &entes naturales de las que
provienen tos compuestos aromáticos que este microorganismo puede nietabolizar.
Como se mencionó anteriormente, E. cok forma parte de la flora intestinal del hombre y
otros mamíferos y, por tanto, no sería extraño que estos compuestos estuvieran
presentes en el hábitat intestino/fecal. Se ha planteado la hipótesis de que E. col) utiliza
estos compuestos cuando están presentes en el medio y no hay un sustrato más
fácilmente metabolizable, lo que justifica que las rutas sean inducibles y que algunas de
ellas estén sujetas a represión catabólica (Valle y cols., 1991).
Los derivados aromáticos metabolizables por E. col) no pueden ser considerados
como agentes xenobióticos, ya que están presentes en la Biosfera como compuestos
naturales y de hecho existen otros microorganismos que contienen rutas metabólicas para
su completa mineralización (tabla 8). E! ácido cinámico e hidroxícinámico son
metabolitos centrales implicados en la síntesis de compuestos fenólicos en plantas, y se
encuentran en la mayoria de los vegetales como ácidos conjugados en forma de ésteres o
como ácidos libres, La reducción del doble enlace del sustituyente alifático del ácido
cinámico da lugar al HCA,
por lo que este compuesto también puede aislarse en
extractos vegetales (Martinez y cols., 1992; Elder y Kelly 1994). Por tanto, este tipo de
compuestos aparece de forma natural en los alimentos de origen vegetal como, por
ejemplo, frutas y hortalizas (Li y cols., 1993). También se ha detectado la presencia de
PA y MHP en champiñones, ciruelas, calabacines, pimientos verdes, tomates y
berenjenas (Chen y Wu, 1984, Heimhuber y Herrmann, 1990). En muchas ocasiones,
este tipo de compuestos son los responsables del sabor y el aroma de ciertos alimentos
como por ejemplo el de la miel. De hecho, la presencia o ausencia del PA y del HCA en
este alimento se ha utilizado como parámetro para la identificación de diferentes tipos de
miel (Steeg y Montag, 1988).
56
INTRODUCCIÓN
Tabla 8. Bacterias que metabolizan 4-HPA
Bacteria
Referencia
Acinetobacter sp.
(Spamins y cols., 1974)
Bacillus brevis
(Que y cols., 1981)
B. stearotherrnoplzllus
(Janialuddin, 1977)
E. coli (30 aislados clínicos)
(Burlingame y Chapinan,1983)
E. coli B
(Cooper y Skinner, 1950)
cali
(Cooper y Skinner, 1980>
E.
C
E. cali W (ATCC 9637, ATCC 11105)
(Cooper y Skinner >1980>
Fla,’obacteriurn sp.
(van den Twecl y cols., 1988)
K. pneumoniae M5a1
(Grant, 1967)
P. acidovorans
(Harelaud y coN., 1975)
E. ola lis
(Adachl y coN., 1964)
P.
(Raju y cols., 1988)
pulida
E. purida T
(Spamins y coN., 1974)
R puada U (NC~ 10015)
(Spamins y cols., 1974)
Pseudornonas sp.
(Blakley y cols., 1967)
Bacteria de suelo
(Blakley 1972)
Se ha demostrado que el PA, HCA, MI-IP, HPC, 3- y 4-NIPA y algunos derivados
de éstos, son productos intermediarios del metabolismo de aminoácidos aromáticos en
organismos superiores y en bacterias (Samid y cols., 1994; Spoelstra, 1978; Sparnins y
Chapman, 1976>. Por otra parte, el 4-HPA y HPC se producen como consecuencia del
metabolismo bacteriano de aminas simpaticomiméticas como la sinefrina que está
presente en ciertas plantas en grandes cantidades (Devi y cols., 1975). El hecho de que
estos productos se acumulen durante procesos metabólicos microbianos, justifica su
presencia en alimentos cuya elaboración conlíeva procesos fermentativos. Por ejemplo,
se ha detectado la acumulación de PA durante la maduración de licores y vinos, siendo
uno de los componentes responsables del sabor y aroma de estas bebidas (Kepner y cols.,
57
INTRODUCCIÓN
1968; Gianotti y Stefano, 1991; Yayas y Rapp, 1992). También se ha identificado el PA
entre los componentes volátiles responsables del sabor del vinagre (Kubota y cols., 1989)
y como producto de la descomposición de la fenilalanina en la elaboración del queso
(Lee y Richard, 1984).
La presencia de este tipo de compuestos en el hábitat intestino/fecal no procede
sólo del apode alimenticio, sino también del metabolismo de la flora intestinal. En este
sentido, se ha demostrado la presencia de PA, HCA, MI-IP y 4-NIPA en estiércol
procedente de granjas dedicadas a la cría del ganado porcino. Estos compuestos se
producen como metabolitos del catabolismo de la tirosina de microorganismos que
forman parte de la flora intestinal (Spoelstra, 1978).
El PA y sus derivados hidroxilados están presentes habitualmente en cerebro,
tejidos periféricos y fluidos corporales de mamiferos como consecuencia del
metabolismo de las aminas simpaticomiméticas tiramina y 2-feniletilamina, las cuales se
originan a partir de la L-fenilalanina y la L-tirosina (Saavedra, 1989). La toxicidad del
PA y sus derivados en humanos es dosis-dependiente. En condiciones normales, la
concentración de estos compuestos en tejidos humanos es muy baja, sin embargo, en
procesos patológicos como la fenilcetonuria provocada por una deficiencia en la enzima
L-fenilalanina hidroxilasa, los niveles de estos compuestos se elevan considerablemente
provocando daños en el sistema nervioso central y retraso mental en niños (Thibault,
1994). No obstante, desde el punto de vista farmacológico, a la dosis adecuada el PA,
HCA y algunos derivados de éstos se comportan como agentes anticancerígenos y
analgésicos (Samid y cols., 1994; Adanas, 1992).
Ya se ha mencionado que, desde el punto de vista medioambiental, los sustratos
aromáticos metabolizables por E col) no pueden ser considerados como compuestos
xenobióticos. Sin embargo, su acumulación puede ser la causa del mal olor del estiércol
que se genera en explotaciones de ganado porcino ya que, como se ha demostrado, el 4NIPA y otros derivados de éste se transforman mediante reacciones metabólicas de las
bacterias presentes en las heces, en los compuestos fenólicos responsables de dicho mal
olor (Spoelstra, 1978).
58
INTRODUCCIÓN
Durante el proceso de molturación de la aceituna para la extracción del aceite de
oliva se originan una serie de subproductos entre los cuales cabe destacar el alpechin o
agua residual originada durante dicho proceso (Martínez y cols., 1992). Este residuo es
muy recalcitrante debido a su elevado contenido en compuestos fenólicos de alto poder
contaminante. Entre los componentes principales de carácter aromático de los alpechines
se encuentra el ácido hidroxicinámico y algunos derivados del HCA y del PA como el 4NIPA, que junto con el ácido siríngico puede constituir hasta el 50% del total de los
compuestos fenólicos en ciertos alpechines (Balice y Cera, 1984; Martínez y cols.,, 1992).
Tan solo en la cuenca del río Guadalquivir se puede estimar una producción media de
1.800.000 m3 de alpechin al año, de los cuales el 25% se vierte de una forma
incontrolada, lo que implica un importante deterioro de las aguas. El 75% restante, en la
actualidad, se trata en balsas de evaporación que tan solo palían parcialmente el
problema medioambiental (Martínez y cols., 1992). Actualmente se han puesto en
práctica diversos procesos que van desde la simple evaporación, hasta procesos fisicoquímicos como la ósmosis inversa y la ultrafiltración. Pero estos procesos requieren altas
inversiones de dificil amortización dado el carácter temporal de la industria almazarera.
Distintos organismos de la Administración y empresas privadas están desarrollando
planes de actuación con el fin de paliar el problema causado por el vertido de estos
residuos aprovechando, además, su alto contenido en materia orgánica e inorgánica
mediante procesos de reciclado que permitan su uso en la producción de combustibles
sólidos, compost y biogas (de Andrés y García, 1982). Uno de los proyectos más
interesantes es el diseño de biorreactores para la depuración biológica de los alpechines,
que permita la biotransformación de los compuestos aromáticos con el fin de disminuir el
carácter tóxico de estos residuos (Janer, 1980, Fiestas y cols., 1982; Martinez y cols,
1986; Martínez, y cols. 1992). Dado que los principales componentes del alpechin son
metabolizables por algunas estirpes de E. cok, este microorganismo podria ser
considerado como un candidato en el diseño de biorreactores para la depuración
biológica del alpechin, a lo que también contribuiría su gran capacidad de adaptación a
distintos ecosistemas. El estudio y caracterización a nivel molecular de las rutas
catabólicas de este tipo de compuestos, nos aportarla nueva información que seria de
gran utilidad a la hora de diseñar proyectos biotecnológicos como los descritos
anteriormente.
59
INTRODUCCIÓN
6. OBJETIVOS
Durante el periodo de tiempo en el que el Dr. José Luis García formaba parte del
equipo de investigación de Antibióticos S.A., desarrolló un procedimiento para donar
genes ¡mc, que codifican para la penicilina G acilasa (PGA), de diferentes
microorganismos. Este método está basado en la complementación auxotrófica de E. col)
1-IB 101 (leuB) incubando las células en medio mínimo en presencia de fenilacetil-Lleucina como única fUente de L-leucina (García y Buesa, 1986). En el proceso de
aislamiento del gen pac de E. col) ATCC 11105, se detectó un clon productor de PGA
que al incubarlo en medio Luna Bertani (LB) presentaba un extraño fenotipo negro. Este
clon contenía el plásmido pAEC19, el cual es un derivado de pBR322 que contiene un
fragmento H¡ndIII de aproximadamente 8,5 kb del DNA cromosómico de E. col! ATCC
11105. El hecho de que los derivados catecólicos se oxiden espontáneamente dando
lugar a productos de coloración marrón o negra y la posible implicación de la PGA en el
metabolismo de derivados del PA nos indujo a pensar que, además del gen ¡mc, el
plásmido pAEC 19 podía contener un gen que codificara para una hidroxilasa de
compuestos aromáticos.
Ya se ha comentado que E. col), un microorganismo que se caracteriza por
crecer rápidamente en medios simples, es la bacteria más estudiada a nivel molecular. Por
tanto, la caracterización y el estudio de la expresión de una ruta de derivados aromáticos
de E. col) resulta interesante desde el punto de vista biotecnológico, ya que facilitaría el
uso de esta ruta con fines medioambientales. Además, aportaría nuevos datos sobre la
posibilidad de utilizar este microorganismo como vehículo de expresión de rutas
catabólicas de compuestos recalcitrantes.
Por todo ello, los objetivos de esta Tesis son los siguientes:
1. Caracterización de la hidroxilasa de compuestos aromáticos de E. cotí ATCC
11105
i) Localización del gen que codifica para la hidroxilasa.
u)
Construcción de un sistema que posibilite la alta producción de la enzima.
60
INTRODUCCIÓN
iii) Purificación de la enzima.
iv) Estudio de los requerimientos bioquímicos de la hidroxilasa.
y)
Determinación de la especificidad de sustrato de la enzima.
vi) Secuenciación del gen que codifca para la 4-HiPA-hidroxilasa.
vii) Comparación de la secuencia de aminoácidos de la 4-HPA-hidroxilasa con otras
oxigenasas ya secuenciadas.
viii) Clasificación de la hidroxilasa en función de la similitud que presente con otras
oxigenasas.
II. Caracterización molecular del resto de la ruta metabólica del 4-HPA de E. cotí
ATCC 11105
i) donación de todos los genes implicados en la mineralización del 4-NIPA.
u) Construcción del mapa fisico de la ruta del 4-NIPA de E. col) W.
u) Secuenciación de la ruta completa del 4-NIPA
III. Estudio del mecanismo de regulación de la 4-HPA bidroxilasa
i) Búsqueda de regiones promotoras.
u) Construcción de fusiones de las regiones promotoras a genes trazadores.
iii) Identificación de las proteínas implicadas en la regulación de la expresión de la 4NIPA-hidroxilasa.
IV. Expresión de los genes de la ruta del 4-HPA en organismos heterólogos
i) Obtención mediante Ingeniería Genética de módulos transponibles que permitan
transferir los genes de la ruta del 4-NIPA a otros microorganismos.
u) Expresión de los genes de la ruta catabólica del 4-NIPA en organismos heterólogos
con el fin de ampliar su capacidad biodegradativa.
6]
II. MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES Y MÉTODOS
1. ESTIRPES BACTERIANAS Y PLASMIDOS
Para el desarrollo de este trabajo se utilizaron las estirpes de E. col) que se
detallan a continuación: E. col) ATCC 11105 (derivada de E. col) W
ATCC 9637
auxótrofa para vitamina B12, productora de PGA); B/rK (E .coli B resistente a Uy,
cedida por el Dr. M. Vicente); C (estirpe salvaje cedida por el Dr. M. Vicente); W
(estirpe salvaje cedida por el Dr. A. Garrido-Pertierra); MCi 116 (A(ara-leu)); HB1O1
<proA 2, leuB, /hi, red); TG1 (supE, hsdDs, th), A~ac-proAB), F’ (traD3ó, proABj
laciA’, lacZDMJS)); MC4100 (araD 139, A(JacIPOZYA); SBS688 (MC4100, Acrp39),
W3110 (CECT 416, ATCC 27325), DH1 (supE44, hsdRI7, recAí, endAl, gyrA9ó,
diii, relAi)(Sambrook y cols., 1989), SF5000 (MC4100, recAS6) (Silhavy y cols.,
1984) ET8000
(Nair,
rbs lacZ::ISJ, gyrA, hutC) (MacNeil, 1981); CC118-Xpir (ALcira-
leu], araD, /xlacX74, galE, galK, phoA2O, 1h14, rpsE, rpoB, argE (Am), recAí, Xpir);
t, Smr, recA, th), pro, hsdlt, Kl RP4:2-Tc:Mu:Km Tn7, Xp)r) <Herrero y
S17-V)r (Tp
cols., 1990).
Otras especies utilizadas: K. c)trophila ATCC 21285 (productora de PGA)
(García y Buesa, 1986) and K. pneumon)ae M5aí (cedida por el Dr. A. GarridoPertierra) (Martin y cols., 1991), P. put)da KT2442 (hsdR, Rif’) (Herrero y cols., 1990).
Los plásmidos utilizados son los siguientes: pBR322 (Apr, Tet); pBR325 (Apr,
Cmr,
Tc» (Bolívar, 1978); pACYC184 (Cmt, Tcr) (Rose, 1988); pUC18 (Ap’) (Yanisch-
Perron y cols., 1985); pRS551 (Apt, Kmr; plásmido para la búsqueda de promotores)
(Simons y cols., 1987); pUTmini-Tn5Km2 (Apr, Kmr) (de Lorenzo y coís., 1990);
pUCl8Not (Ap’) (Herrero y cols., 1990); pCNB5 (Apt, Km’) (de Lorenzo y cols., 1993);
pAW3 1 (Ap’) (derivado de pEMBL9 con un fragmento Sail de 1,7 kb que contiene el
gen xylE) (cedido por el Dr. V. de Lorenzo); pAG464 (Ap’) (derivado de pUC 18 que
contiene el gen de la HPC-dioxigenasa de K. pneumoniae M5al) (cedido por el Dr. A.
Garrido-Pertierra).
63
MATERIALES Y MÉTODOS
2. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO
Las cepas bacteríanas se conservaron congeladas a -700C en medio de cultivo al
que se añadió glicerol al 10% (y/y). En el momento de inocularías se descongelaron,
incubándose en los medios correspondientes a 37’C, a menos que se indique lo contrario,
con agitación. Los principales medios de cultivo utilizados han sido: LB, MQ y M63
suplementados adecuadamente en cada ensayo y añadiendo agar al 1% (p/v) para los
cultivos en medio sólido (Miller, 1972; Sambrook y cols., 1989). Cuando se requiere una
fuente de carbono especifica se preparan soluciones estériles de éstas para suplementar el
medio mínimo hasta una concentración final de 5 mM, en el caso de los derivados
aromáticos, 20 mM si se trata de glicerol y 10 mM si la fuente de carbono utilizada es
glucosa.
La concentración de antibiótico añadido al medio de cultivo de cepas resistentes
flie de 100 ng/ml para la ampicilina, 10 vg/ml para la tetraciclina, 50 ~tg/ml para la
kanamicina, 30-60 ~tg/mlpara el cloranfenicol, 50 ~tg/mlpara la rifampicina y 25 ¡igmí
para el ácido nalidixico.
El crecimiento de las cepas se siguió por turbidimetría a 600 nm con un
espectrofotómetro Shimadzu UV-260.
3. PROCEDIMIENTOS DE TRANSFERENCIA GENÉTICA
La transferencia de DNA entre las diferentes estirpes se ha llevado a cabo por
transformación y conjugacion.
3.1. Transformación
Las cepas de E. col) se transformaron con el método del RbCI (Kushner, 1978) y
por electroporación (Wirth y cols, 1989) utilizando un equipo Gene Pulser de Bio-Rad.
64
MATERIALES Y MÉTODOS
3.2. Coniu2ac¡ón
Los plásmidos que contienen transposones derivados de mini-TnS se transfieren
por conjugación según el método descrito por de Lorenzo y Timmis (1994). Para ello se
utilizaron E colí S 17-1 Apir como cepa donadora y E col) ET8000 y P. pulida KT2442
como bacterias receptoras
4. MANIPULACIÓN DEL DNA CON ENZIMAS DE USO COMÚN EN
BIOLOGíA MOLECULAR
Las endonucleasas de restricción se obtuvieron de Boehringer Mannheim,
Amersham, Pharmacia o New England Biolabs. La fosfatasa alcalina de intestino de
ternera se obtuvo de Boehringer Mannheim. Amersham suministró la DNA ligasa, el
fragmento Klenow de la DNA polimerasa 1 de E. col) y la polinucleótido quinasa del
fago T4. Todas las enzimas y sus tampones correspondientes se utilizaron siguiendo las
indicaciones recomendadas por las casas suministradoras.
5. PREPARACIÓN DE PLÁSMmOS Y DNA CROMOSÓMICO
La preparación de plásmidos a partir de cepas de E. col) se realizó utilizando el
método rápido de lisis alcalina y el método de purificación de DNA por centrifugación en
gradiente de CsCl (Sambrook y cols., 1989). La extracción del DNA cromosómico a
partir de las bacterias utilizadas en este trabajo se realizó según el método descrito para
E. col) por Sambrookycols., (1989).
6. ELECTROFORESIS DEL DNA EN GELES DE AGAROSA
Se utilizaron geles de agarosa al 0,7 ó 1% en tampón TAE (Tris-NICI 40 mM,
ácido acético 20 mM, EDTA 2 mM, pH 8,1), utilizando el mismo tampón como
electrolito. A las muestras se les añadió 1/5-1/10 de su volumen de una solución
compuesta por Fico!! 400 al 30% (p/v), azul de bromofenol al 0,2% (p/v), xilencianol al
0,2% y EDTA 40 mM pH 8,0. La electroforesis se realizó a 100-150 V durante 60-90
65
MATERIALES Y MÉTODOS
minutos. Una vez finalizada la electroforesis, los geles se tiñeron con bromuro de etidio
(5 jg/ml) para su visualización con radiación ultravioleta. Como marcador de tamaño se
utilizó el DNA del fago X digerido con la enzima de restricción BsIEII (Amersham).
7. AISLAMIENTO Y PURIflCACION DE LOS FRAGMENTOS DE DNA
Los fragmentos resultantes de la digestión del DNA con las enzimas de
restricción se aislaron y purificaron por cuatro procedimientos distintos.
7.1. Geles de noliacrilamida
Se utilizaron geles de poliacrilamida no desnaturalizantes preparados en TBE
(Tris-borato 89 mlvi, ácido bórico 89 mM y EDTA 2 mM, pH 8,0) a una concentración
variable dependiendo del tamaño de fragmento a aislar. Se empleó como electrolito para
la electroforesis el tampón TRE. A las muestras se les añadió 1/10 de su volumen de una
solución compuesta por Ficolí 400 al 30% (p/v), azul de bromofenol al 0,2% (p/v),
xilencianol al 0,2% y EDIA 40 mlvi pH 8,0. Una vez terminada la electroforesis, los
geles se tiñeron con azul de metileno y se recortó la banda de DNA deseada en cada
caso. El DNA se eluyó de la banda de acrilamida tal como describen Sambrook y cols.,
(1989).
7.2. Técnica de Geneclean
Los fragmentos que se desean aislar se separan mediante electroforesis en geles
de agarosa. Posteriormente, se recodan las bandas de interés y el DNA se purifica de la
agarosa mediante su adsorción a panículas de vidrio siguiendo la técnica del Geneclean,
tal como recomiendan los fabricantes (Bio 101 Inc., La Jolla, CA, USA).
66
MATERIALES Y MÉTODOS
7.3. Geles de agarosa de bajo punto de fusión
Para algunos aislamientos de fragmentos de DNA se utilizaron geles de agarosa
de bajo punto de fusión (Bio-Rad) al 1-1,4% en tampón TAE. Una vez realizada la
electroforesis, se recortó del gel la banda deseada en cada caso y se resuspendió en
tampón TE (Tris-HCI 10 mM, pH 8,0; EDTA lmM) con Nací 0,25 M. La agarosa se
fundió manteniéndola a 65 oc durante 5 minutos. A continuación, la muestra se trató con
fenol y posteriormente con éter (y/y), incubándola después a 650C durante 10-15
minutos con el fin de eliminar los posibles restos de fenol. El DNA se precipitó con dos
volúmenes y medio de etanol absoluto durante 45 minutos a -700C. Tras
una
centrifugación a 10.000 x g durante 10 minutos, el precipitado se lavó con etanol 70% y
finalmente se disolvió en un volumen adecuado de tampón TE.
7.4. Técnica de la B-a2arasa
El empleo de esta técnica también requiere la separación previa de los fragmentos
mediante electroforesis en geles de agarosa de bajo punto de fusión y posterior
tratamiento de la banda extraída con la 13-agarasa. Esta enzima hidroliza la agarosa
liberando el DNA. Para ello es necesario fundir previamente la banda de agarosa
recortada en el tampón de la enzima (10 mM Bis Tris-RU pH 6,5; 10 mM EDTA) y
posterior tratamiento con la ~3-agarasadurante una hora a 40-420c. Después de tratar
con fenol y precipitar el DNA se resuspendió en el volumen de TE adecuado. Tanto la
enzima como el tampón se obtuvieron de la casa comercial Biolabs.
8. SELECCIÓN DE LOS CLONES PRODUCTORES DE PGA
La selección de los clones con actividad PGA se realizó según el método descrito
por Garcia y Buesa (1986). La fenilacetil-L-leucina fUe cedida por Antibióticos SA.
(León). Las células de E. colí NIB 101 transformadas con una genoteca H¡ndl[I de E. col)
ATCC 11105 construida en pBR322 se sembraron en medio mínimo M9 suplementado
con glucosa 10 n,M, lmg/l de tiamina-Hcl, 10 mg/l de L-prolina, 100 mg/l de fenilacetilL-leucina y ampicilina a 75 vg/ml. Después de 72 horas de incubación a 30 0C, las
67
MATERIALES Y MÉTODOS
colonias que crecieron fueron aisladas y su fenotipo se estudió resembrándolas en M9
con y sin fenilacetil-L-leucina. Se consideró que un clon era positivo cuando la colonia
crecía exclusivamente en presencia de L-leucina o su fenilacetil derivado.
9. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN DE DNA
Los fragmentos de DNA marcados radiactivamente (sondas) se obtuvieron
mediante la técnica del random-primer utilizando [a-32P] dcTP (400 Cilmmol, 10
pCi/yd) (Aniersham), el fragmento Klenow, la solución de iniciadores (Pharmacia) y los
dNTPs, según se indica en Sambrook y cols., (1989). Todas las hibridaciones y lavados
se hicieron a 65 0C.
9.1. Técnica de Soutbern-blot
La hibridación del DNA mediante la técnica descrita por Southem (1975), se
realizó siguiendo el protocolo de Sambrook y cols., (1989). Las membranas de nylon
para la transferencia del DNA se obtuvieron de Schleicher and Shuell. Las bandas
radiactivas se detectaron a -700C utilizando peliculas Hyperfilm~«-1vW (Aimersham) y
pantallas amplificadoras Cronex Lightning Plus (Dupont).
9.2. Hibridación del DNA sobre filtros de colonias celulares
Las colonias de E. col) se transfirieron a los filtros de nitrocelulosa (Millipore
HATF, tamaño de poro 0,45 gm) como se indica en Sambrook y cols., (1989). Las
células se Usaron sobre el filtro mediante tratamientos sucesivos, de 5 minutos de
duración cada uno, con las soluciones que se indican: i) NaCí 1,5 M y NaOH 0,5 M (2
veces); u) Tris-HCI 1 M, pH 7,0; iii) Tris-HCI 0,5 M, pH 7,0 y NaCí 1,5 M; iv) 2 x
(NaCí 0,3 M, citrato sódico 0,003 M). La fijación del DNA al filtro se realizó mediante
incubación a 80 oc durante 2 horas. Para eliminar los restos celulares, los filtros se
hirvieron en agua destilada durante 10 minutos. La hibridación con la sonda radiactiva se
realizó como se describe en Sambrook y cols., (1989).
68
MATERIALES Y MÉTODOS
10. SECUENCIACIÓN DEL DNA
La secuenciación del DNA se realizó según el método de Sanger y cols., (1977)
por dos procedimientos:
10.1. Secuenciación manual
Para la reacción de secuenciación se utilizó el T7 DNA polymerase Kit
(Pharmacia) y como desoxinucleósido trifosfato marcado radiactivamente, [a-35S] dATP
(Amersham), siguiendo las recomendaciones de los fabricantes.
10.2. Secuenciación automática
Parte de la secuenciación del DNA se llevó a cabo en el Centro Nacional de
Biotecnología
(G.B.F.)
(Braunschweig,
Alemania)
utilizando
un
secuenciador
automático modelo 373A (Applied Biosystems). Para la reacción de secuenciación se
utilizó el Prisrn ready react)on dye deoxyterminator cycle sequenc)ng 1</e de Applied
Biosystems que conlíeva el uso de didesoxinucleótidos coloreados y la DNA polimerasa
AmpliTaq siguiendo las recomendaciones de los fabricantes. Las reacciones de
polimerización se llevaron cabo mediante la técnica de PCR (reacción en cadena de la
polimerasa) para lo que se utilizó un termociclador Perkin-Elmer Cetus 480.
10.3. Análisis de la secuencia de DNA
Para el análisis de la secuencia de DNA se utilizó el grupo de programas para
Biología Molecular de la Universidad de Wisconsin (WINP) presente en el VAX del
Centro Nacional de Biotecnología de Madrid. La secuencia de aminoácidos deducida a
partir de la secuencia de nucleótidos se comparó con las proteínas de las siguientes bases
de datos: GenBank/EMBL y Swissprot.
69
MATERIALES Y MÉTODOS
11. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS DE CULTIVOS CELULARES
Para obtener extractos de las cepas de E. col) se cultivaron éstas en 100 ml del
medio indicado en cada caso a 37 oc durante 16 horas (fase estacionaria de crecimiento).
A continuación, los cultivos se enfriaron a 4 0C y se centrifugaron a 6.000 x g durante
10 minutos, resuspendiéndose las células en 10 ml de tampón fosfasto sódico 20 mM ó
100 mM pH 8, dependiendo del ensayo que se fuera a realizar. Una vez homogeneizada
la suspensión, las células se rompieron en un sonicador MSE modelo MK2 mediante
cuatro pulsos de 15 segundos cada uno, manteniendo siempre la muestra a 4 oc.
Finalmente la suspensión sonicada se centrifugó a 4 0C y 30.000 x g durante 20 minutos
para eliminar los restos celulares. El sobrenadante de esta centrifugación (extracto
crudo) se conservó a -200C. Cuando se cultivaron volúmenes mayores, las células se
rompieron usando una French-Press (American Instruments Company) operando a una
presión de 7,6 atmósferas.
12. ENSAYOS DE ACTIVIDAD ENZIMATICA
En todos los casos las medidas de absorbancia se realizaron en un
espectrofotómetro Shimadzu UV-160.
12.1. Penicilina G acilasa
La amplia especificidad que presenta la PGA para el resto ácido o amino de los
enlaces que hidroliza, permite el empleo de sustratos derivados del PA cuya hidrólisis
supone la aparición de cromóforos. Durante este trabajo, la actividad penicilina G acilasa
se determinó de acuerdo al método colorimétrico descrito por Szewczuk y cols., (1979).
Los cultivos se incubaron a 30 oc con agitación en presencia de fenilacético al 0,1 5%
durante toda la noche. La mezcla de reacción contenia 0,2 ml de una solución de 5 mlvi
fenilacetil-p-aminobenzoico y una alicuota de 0,05 ml de medio de cultivo con células en
estado estacionario. Esta mezcla se incuba 20 minutos a 37 0C deteniéndose al añadir
0,250 ml de una solución que contiene 10 mM de nitrito sódico en ácido acético 0,25 M.
Posteriormente se añadieron 0,750 ml de la solución reactiva (ácido 1-amino 8-
70
MATERIALES Y MÉTODOS
hidroxinafialeno 3,6-disulfónico al 0,01% (pfv) en carbonato sódico 0,66 M). Por
centrifugación en microfuga se eliminan los restos celulares y se mide la reacción en el
espectrofotómetro a 535 nm utilizando un coeficiente de extinción molar (E) de 36.000
M-’ cm~.
12.2. 4-HPA-bidroxilasa
Para determinar la actividad de la 4-NIPA hidroxilasa sobre diferentes sustratos
se utilizaron dos métodos que se detallan a continuación.
12.2.1. Cuantificación de la oxidación del NADH
La actividad hidroxilasa se midió añadiendo 0,01 ml de sustrato 0,1 M a 0,5 ml
de una solución que contiene, NADH 0,2 mlvi y 0,06 ml de extracto preparado en
tampón fosfato sódico 100 mM pH 8. La oxidación del NADH se determina a 30 0C
midiendo la disminución de absorbancia a 340 nm usando un s=6.220 M’ cm~’ para el
NADH. Los valores se corrigieron por la oxidación del NADH en ausencia de sustrato.
Una unidad de actividad hidroxilasa se define como la cantidad de enzima necesaria para
la oxidación de 1 ytmol de NADH por minuto.
12.2.2. Reacción acoplada con la catecol 2,3-dioxigenasa 1 (C230 1) de P pulida
Este ensayo se llevó a cabo utilizando fenol como sustrato de la 4-HPA
hidroxilasa. En presencia de concentraciones saturantes de C230 1 el catecol se
transforma instantáneamente en 2-hidroximucónico semialdehído (HMS) que presenta
un máximo de absorción a 375 nm lo que permite su cuantificación (s=46.000 Nt1 cm1
a pH 8). La reacción se inicia añadiendo 0,050 ml de extracto de E. col) JM1OI
(pAW3 1) en el instante en que todo el NADH se ha oxidado. Una unidad de actividad se
define como la cantidad de enzima necesaria para la transformación de 1 ¡tmol de HiMS
por minuto.
71
MATERIALES Y MÉTODOS
12.3. IIPC-dioxi2enasa
El ensayo de actividad de la HiPC-dioxigenasa se llevó a cabo de acuerdo al
procedimiento espectofotométrico descrito por Cooper y Skinner (1980). La mezcla de
reacción contenía 0,005 ml de HPC 20 mM, 0,05 ml de extracto crudo y 0,445 ml de
tampón fosfato 50 mM PH 8. La formación de 5-carboximetil-2-hidroximucónico
semialdehido (CHMS) se detectó a 380 nm utilizando un s= 35.000 M4 cnt.
12.4. 8-lactaniasa
La actividad B-lactamasa se determinó mediante el método espectrofotométrico
de Ross y O’Callaghan (1975). Se utilizaron 0,05 ml de extracto enzimático en 0,5 ml de
tampón fosfato 100 mlvi pH 7 iniciándose la reacción por la adición de cefaloridina 0,1
mM. La reacción se desarrolló a 25 oc. La hidrólisis del anillo j3-lactámico se siguió a
una longitud de onda de 255 nm, registrando la disminución de absorbancia durante 5
mm. Se calcularon los imoles de cefaloridina hidrolizados empleando un e= 14000 M’
cm
—I
12.5. B-2alactosidasa
Los niveles de 13-galactosidasa se determinaron de acuerdo al protocolo de Miller
(1972). Las células se cultivaron a 30 0C y los efectores ensayados se añadieron al medio
de cultivo a una concentración de 1 mM. Se analizaron diferentes alícuotas de medio de
cultivo en función de los niveles de 13-galactosidasa producidos por cada clon, entre 0,02
y 0,1 mi, completando a un volumen final de 0,5 ml con tampón Z, (fosfato disódico 0,06
M, fosfato monosódico 0,04 M, KCl 0,01 M, SO
4Mg 0,00 1 M y 13-mercaptoetanol 0,05
M). Las células se permeabilizaron añadiendo dos gotas de cloroformo (Merck) y una
gota de dodecilsulfato sódico (SDS) al 0,01
%.
La reacción se inicia añadiendo 0,1 ml
del sustrato, 2-nitrofenil-13-D-galactopiranósido (ONPG) (4 mg/mí). Tras un periodo
variable de 5 a 15 minutos a 28 oc se para la reacción con 0,25 ml de carbonato sódico 1
M. Los restos celulares se eliminaron centrifugando las muestras a 12.000 x g durante 10
minutos y posteriormente se midió la reacción en un espectrofotómetro Shimadzu UV-
72
MATERIALES Y MÉTODOS
160 a 420 nm. La medida es estable durante 20 mm a 4 0C. Las unidades de 13galactosidasa se calcularon en base a la siguiente ecuación:
Unidades 13-gal
[DO 420 / t (mm) x vol (ni]) x DO 600 del medio de cultivo] x 1000
13. IDENTIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE LA REACCIÓN DE LA 4HPA-IIIIPROXILASA
Los productos obtenidos por incubación de las células en medio M9
suplementado con glucosa 10 mM y el sustrato a analizar a una concentración final de 1
mM, se analizaron por cromatografia líquida de alta resolución (HPLC). Después de
centrifugar los cultivos se analizaron los sobrenadantes en un equipo Gilson utilizando
una columna Nucleosil 300-508 (250 x 4 mm) precedida de una precolumna Nucleosil
300-SC 18 (11 x 4 mm). Para detectar la formación de catecol se utilizó una solución
(1:1) de fosfato potásico 50 mM y metanol pH 5 como fase móvil. Para detectar LDopa, se utilizó como fase móvil una solución de fosfato potásico 50 mM, EDTA 0,1
niIvI, trifluoroacético 100 mM y acetonitrilo 8 %
mí/mm
y/y
a PH 4,8. El flujo se mantuvo a 0,5
y la detección se llevó a cabo espectrofotométricamente a 280 nm. Los
metabolitos se identificaron por comparación con los tiempos de retención de las
sustancias puras.
14. DETECCIÓN
DE PROTEÍNAS CODIFICADAS POR FRAGMENTOS
CLONADOS DE DNA
Las proteínas codificadas por los genes hpaB, hpaC y la ORF 14, presentes en
diferentes plásmidos, donados en E. coil SESOOO se detectaron mediante la técnica de
maxicélulas descrita por Silhavy y cok., (1984) utilizando [a-35S]metionina (1.500
CiImoI) (Amershan). La electroforesis en gel de poliacrilamida se llevó a cabo según se
describe en el apartado 18.
73
MATERIALES Y MÉTODOS
15. PURIFICACIÓN DE LA 4-HPA-HIDROXILASA
Las células de E.coli DHI (pAJ221) fueron incubadas a 37 0C en 50 ml de medio
LB conteniendo 34 gg/ml de cloranfenicol. Después de centritbgar, el sedimento se
resuspendió en 5 ml de tampón fosfato 20 mM, pH 8. Las células se rompieron mediante
sonicación y el extracto resultante se centrifugó a 30.000 x g durante 20 minutos. Los 5
ml de extracto se cargaron en una columna (3 x 1,5 cm) de Cibacrón Blue 3GA Agarosa-
3000-cL (Sigma) equilibrada en tampón
fosfato 20 mlvi, pH 8. La columna se lavó con
el mismo tampón y la enzima se eluyó con tampón fosfato 20 mM conteniendo 30 mlvi
NADH. Las fracciones que presentaban actividad hidroxilasa se mezclaron y
concentraron con polietilenglicol 20.000. Para la croniatografia de filtración se utilizó
una columna Superosa 12 HR 10/30 (Pharmacia) equilibrada en tampón fosfato 50 mlvi,
pH 8 utilizando un equipo de HPLC Gilson. Los patrones utilizados para las
determinaciones del masa molecular fueron: ovoalbúmina (45.000 Da), seroalbúmina
bovina (67.000 Da) y aldolasa (160.000 Da).
16. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
La concentración de la proteína existente en preparaciones puras de HpaB y en
extractos crudos celulares ha sido determinada mediante el método descrito por
Bradford (1976).
17. ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DE POLIACRIAMIDA-
SDS
Las electroforesis analíticas de proteínas se realizaron en todos los casos en
condiciones desnaturalizantes en presencia de SDS. La técnica empleada fue descrita por
Laemmli (1970) utilizando geles de poliacrilamida en placa (160 x 100 x 2 mm)
preparados a concentraciones que, según los casos, oscilaron entre el 8 y el 15 %. Las
muestras se hirvieron durante 5 minutos en presencia del tampón de ruptura (Tris-UCI
62,5 mM, pH 6,8; SDS al 2%, ¡3-mercaptoetanol al 5%, glicerol al 10% y azul de
bromofenol al 0,005%). Las electroforesis se realizaron a temperatura ambiente y
74
MATERIALES Y MÉTODOS
corriente constante (50 mA), utilizando un electrolito que contenia Tris-I{CI 0,025 M,
glicina 0,192 M y SDS al 0,1%. Las proteínas de los geles se visualizaron con azul
brillante de Coomassie R-250, según se describe en Swank y Munkress (1971). Las
proteínas empleadas como marcadores de tamaño molecular se adquirieron de Bio-Rad.
18. DETERMINACION DE LA SECIIJENCIA N-TERMINAL DE HpaB
La secuencia de aminoácidos N-terminal de la proteína HpaB se determinó
mediante el método de degradación de Edman utilizando un secuenciador de fase
gaseosa conectado a un equipo de HIPLC (Applied Biosystems).
19. OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI4IpaB
Para la obtención de anticuerpos policlonales anti-HpalB se inmunizaron conejos
con la enzima HpaB purificada. Se utilizaron dos dosis de 100 ~.tg
de proteína en solución
salina; la primera en adjuvante completo de Freund (1:1
incompleto de Freund (1:1
y/y)
y/y)
y la segunda en adjuvante
dejando transcurrir un mes entre ambas. La
administración del antígeno se realizó por vía subcutánea. Una semana después de la
administración de la segunda dosis se extrajo la sangre a los conejos para la obtención
del antisuero. La sangre se incubó a 37 0C durante 5 horas y después se mantuvo a 4 0C
12 horas para permitir la formación del coágulo. El sobrenadante se centrifugó a 10.000
x g a 4 0C durante 5 minutos para eliminar los restos celulares y, por último, se
inactivaron las proteínas del complemento durante 15 minutos a 56 0C. Se ensayó la
especificidad del antisuero obtenido, así como la posible reacción inespecífica del suero
pre-inmune, mediante análisis por Western blot utilizando diferentes diluciones del
mismo. Para evitar la detección de bandas inespecíficas en el Western blot formadas por
la posible reacción cruzada del antisuero con otras proteínas celulares diferentes a HpaB
se preincubó el antisuero a 37 0C con un extracto celular de la cepa que posteriormente
se iba a emplear para producir la proteína HpaB.
75
MATERIALES Y MÉTODOS
20. TÉCNICA DE WESTERN BLOT
Una vez separadas las proteínas mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida-SDS, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Schleicher and
Shuell) según describen Sambrook y cols., (1989). La membrana se saturó con leche en
polvo desnatada al 5% (p/v) en tampón PBS (fosfato sódico 10 mlvi, pH 7,4; NaCí 140
mM) mediante incubación a 40C durante 12 horas. Posteriormente, se incubó a
temperatura ambiente con agitación suave durante 4 horas en presencia del suero antiHpaB. Después de tres lavados con PBS que contenía Tween-20 al 0,1%
(y/y),
de 10
minutos de duración cada uno, la membrana se hizo reaccionar durante 1 hora a
temperatura ambiente y agitación suave con anticuerpos de cabra anti-IgGs de conejo
conjugados con peroxidasa (Jackson Immunoresearch). Finalmente se lavó con tampón
PBS y las bandas de reacción con los anticuerpos se visualizaron con peróxido de
hidrógeno y 4-cloro-1-naftol (Sigma).
21. AISLAMIENTO DE RNA
Para obtener el RNA total de un cultivo de E. col), las células se cultivaron en 20
ml de medio de cultivo hasta una DO
600 de 0,5 (fase exponencial de crecimiento). El
sedimento celular se resuspendió en 1 mide TE 10:10 (Tri-HCI 10 mM, pH 8; EDTA 10
mlvi) lavándolo a continuación con el mismo tampón. Posteriormente se resuspendió en
0,4 ml de tampón de lisis (TE 10:10 con 2 mg/ml de lisozima (Sigma)) y se provocó la
lisis celular con tres ciclos sucesivos de congelación-descongelación utilizando nitrógeno
líquido. Se añadió a la mezcla SDS al 0,8%, acetato sódico 166 mM, pH 4 y 0,5 ml de
0C. Se calentaron a 60 oc durante 5 minutos y se
fenol equilibrado con agua a 60
centrifugaron a 30.000 x g 10 minutos a 4 0C. El sobrenadante recibió un nuevo
tratamiento con fenol ácido caliente. El RNA total se precipitó con etanol absoluto
disolviéndose finalmente en un volumen adecuado de TE 10:10. La concentración de
RNA se estimó a partir de la DO de la preparación a 260 nm. Una unidad de DO a 260
nm equivale a una concentración de 40 ¡.tg/ml. La cantidad de RNA obtenida a partir de
los 20 ml de cultivo de E. col) osciló entre 0,3 y 0,8 mg. Para comprobar la calidad del
RNA, las muestras se visualizaron en un gel de agarosa del 1 %, tras eliminar las
76
.
MATERIALES Y MÉTODOS
RNAsas de la cubeta y tampones. Una extracción correcta permite observar bandas de
1,1, 0,8 y 0,2 kb. Los RNAs se conservaron a -70 0C. Se eliminaron los posibles restos
de DNA de la muestra, que pudieran interferir en el análisis posterior del RNA, mediante
un tratamiento con DNAsa libre de RNAsa (DNAsa 1 de Pharmacia) en presencia de
RNAsina (inhibidor de RNAsa) (Boebringer) durante 1 hora a 37 0C. Posteriormente se
repitió el proceso de fenolización ácida y precipitación con etanol del RNA en
condiciones similares a las descritas anteriormente.
22.
DETERMINACIÓN
TRANSCRIPCIÓN
DE
LOS
MEDIANTE
EL
SITIOS
DE
EMPLEO
INICIACIÓN
DE
LA
DE
LA
TÉCNICA
DE
EXTENSIÓN CON UN INICIADOR.
Para localizar e] sitio de ¡niciacion de la transcripción de los genes hpaA
y hpaB de E. col) ATCC 11105 se han seguido dos procedimientos diferentes,
ambos basados en la técnica de extensión del cDNA a partir de un iniciador o
primer extension.
Los
oligonucleótidos
utilizados para determinar los sitios de
iniciación de la transcripción de los genes hpaA y hpaB son 038A (figura 23)
y
OLACZSO 5’-GCGGAACTGGCGGCTGTGGG-3’, respectivamente.
22.1. Marcaje del oli2onucleótido con Fy-32P1 ATP
Este método se llevó a cabo según el protocolo descrito por Sambrook y cols.,
(1989). Para el marcaje de oligonucleótidos se empleó la T4 polinucleótido quinasa
utilizando como isótopo [y-32P]dATP (SOOOCiImml, 10 ~Ci/pd).Para ello se utilizaron 7
pmoles del oligonucleótido y 50 gCi de [y-32P] dAfl. Posteriormente se mezclaron 1
pmol de oligonucleótido y 15 ¡.tg RNA precipitando la mezcla según el procedimiento
descrito por Sambrook y cok., (1989). El precipitado se resuspendió en 30 pU de tampón
de hibridación (40 mM PII>ES pH 6.4, 1 mM EDTA pH 8, 0,4 M NaCí y formamida al
50 %), desnaturalizando a 85 0C durante 10 minutos e incubando la mezcla 12 horas a 30
0C para permitir la hibridación. El híbrido RNA-oligonucleótido se precipitó con 2,5
volúmenes de etanol absoluto resuspendiéndolo posteriormente en la mezcla de reacción
de la transcriptasa reversa (lx tampón AIvW (Promega), 0,9 mlvi dNTPs, pH 7, 0,4 U de
77
.
MATERIALES Y MÉTODOS
RNAsina, y 3 U de transcriptasa reversa AMV (avian myeloblastosis virus) de Promega.
La reacción de extensión transcurrió durante una hora a 42 oc y se detuvo con NaOH a
una concentración final de 0,4 M, manteniéndose 12 horas a temperatura ambiente para
desnaturalizar los ácidos nucleicos. El siguiente paso consistió en la neutralización de la
mezcla con ácido acético 0,4 M y posterior precipitación con etanol, resuspendiendo el
precipitado en una solución 1:1
(y/y)
de agua y solución colorante (azul de broniofenol al
0,3 %, xilencianol al 0,3 %, 10 mM EDTA~ pH 7,5 y formamida desionizada al 97,5 %).
Para analizar la longitud de los productos de la extensión, y por tanto el punto de
iniciación de la transcripción, se realizó una electroforesís cargando las muestras en un
gel de poliacrilamida al 6 %-urea 8 M, detectándose el resultado por autorradiografia. La
secuenciación de los plásmidos que contenían las zonas promotoras subclonadas, con el
mismo oligonucleótido, sirvió para localizarar el punto de iniciación de la transcripción
en e] genonia.
22.2. Incorporación de lct-32PldCTP
Este método se realizó según el ensayo descrito por Chandry y cols., (1994). Para
ello, se calentaron a 90 0C durante un minuto 3 ~lde la mezcla que contenía 40 pmoles
de oligonucleótido y 15 pg de RNA y posteriormente se mantuvo la mezcla a 42 0C
durante 5 minutos para realizar el anillamiento RNA-oligonucleótido. El cDNA es
sintetizado en un volumen de reacción de 10 pU que contiene 24 U de la enzima
transcriptasa reversa (AMV), 15 ~Ci de [ct-32P]dCTP, dCTP 10 ItM, dATP 100 gM,
dGTP 100 vM, dTTP 100 ~.tM,Tris-HCI 50 mM pH 8,5, KCI 50 mM, MgCI
2 20 mM y
0C durante 30 minutos y se detiene con 5
ditiotreitol 10 mM. La reacción se incuba a 42
ud de formamida al 0,5 %, EDTA 20 mM, azul de bromofenol 0,05 % y xilencianol 0,05
%.
El resultado se visualiza y analiza como en el método anterior.
Este procedimiento es mucho más rápido que el anterior y tiene la ventaja de
conseguir una mejor desnaturalización cuando se trabaja con material genético de
elevado contenido en estructura secundaria.
78
III. RESULTADOS
RESULTADOS
1. CLONACIÓN DEL GIENpae DE E. cdi ATCC 11105
Como se ha comentado en la Introducción (apartado 6.) el clon HElOI
(pAEC 19), productor de PGA, presentaba un fenotipo negro al incubarlo en medio LB
que había sido relacionado con la presencia de una hidroxilasa de compuestos aromáticos
en esta cepa. Además, la producción del pigmento negro también se observaba al incubar
las células en medio mínimo suplementado con diferentes compuestos aromáticos como
L-tirosina, N-acetil-L-tirosina, L-tirosina-metil éster, 4-HIPA, 3 -HIPA y fenol, lo cual
apoyaba la hipótesis de la existencia de una hidroxilasa de aromáticos en este clon (figura
10). Sin embargo, cuando las células se incubaron en presencia de PA, L-fenilalanina o 2HPA no se detectó la producción de ningún pigmento. Dado que por una parte, el clon
1-118101 (pAECl9) era propiedad de Antibióticos S.A y que, además, era necesario
comprobar que este fenotipo era realmente consecuencia de la expresión de un gen de E.
col) ATCC 11105, se construyó nuevamente la genoteca HindIII de esta estirpe en
pBR322 y, utilizando el método desarrollado por García y Buesa (1986) para seleccionar
clones productores de PGA, se seleccionó el clon HB1OI (pAJl9) que presentaba un
fenotipo idéntico al de las células transformadas con el plásmido pAEC19. Para
confirmar que el plásmido pAJl9 contenía el gen responsable del fenotipo negro se
transformaron diferentes estirpes de E. col) (DH1, JIMiO], TG1 y SESOOO) obteniéndose
siempre el mismo resultado.
1.1. Localización del
2Cfl
resuonsable del fenotino negro
El plásmido pAJl9 contiene un fragmento HindIII de 8,5 kb del DNA
cromosómico de E. col) ATCC 11105. El gen pac fue localizado en uno de los extremos
de este fragmento mediante secuenciación, utilizando oligonucleótidos sintéticos
diseñados a partir de la secuencia de nucleótidos del vector pBR322. Para localizar el
gen responsable del fenotipo negro, al que se denominó hpaB, se hicieron distintas
construcciones algunas de las cuales se muestran en la figura 11. Un paso decisivo en la
localización del gen hpaB consistió en la construcción del plásmido pAJ2l mediante una
deleción Safl del plásmido pAJ2O. Las células transformadas con el plásmido pAJ2 1 no
producían el pigmento negro al incubarías en LB, lo que indicaba que el gen hpaB estaba
80
RESULTADOS
EH
E
H Fo
Ho
H
pU~I9
2.Zkb
H
Figura II. Subclonac¡ón del gen hpaB. Símbolos: ~, gen pat., U gen /rpaB; E, gen
que codifica para la proteína C; E, gen que codifica para la proteina D. Las flechas
indican la dirección de transcripción de los genes. Abreviaturas: Apr, resistencia a
ampicilina; Cmt, resistencia a cloranfenícol; Tcr, resistencia a tetraciclina; B, Ba,nHI; lE.
EcoPJ; Ec, EcoRV; Hc, HindII; H, K/ndIII; P, Psfl; Pv, PvulL; 5, Sa/l; Ss, SspI.
82
RESULTADOS
1.2. Detección de las Droteinas donadas en el plásmido pAJl9
Una vez localizado el gen hpaB en el plásmido pAJ27 se analizaron los productos
de los genes donados en el plásmido pAJI9 mediante la técnica de maxicélulas (figura
12). En el carril correspondiente al clon SESOOO (pAJI9), además de la fB-lactamasa
(30.000 Da), se observan tres bandas 59.000, 40.000 y 19.000 Da que se indican como
proteínas 18, 13 y C, respectivamente. No se detectaron las bandas correspondientes a las
dos subunidades de la PGA de 60.000 y 26.000 Da, ya que la producción de esta enzima
sólo tiene lugar a 30 0C y en presencia de PA. Los plásmidos pAJ19, pAJ22 y pAJ27
contenían el gen hpczB a diferencia del plásmido pAJ2S, dado que en las células
transformadas con este último no se observó el fenotipo negro. Teniendo en cuenta que
en las células que contenian el plásmido pAJ22 se producía la cloranfenicol acetil
transferasa (27.000 Da) y las proteínas 18 y C, y en el clon SE5000 (pAJ27) sólo se
observaban la ¡3-lactamasa y la proteína B, se dedujo que el producto del gen hpaB
podria ser la proteína 18 que se denominó HpaB.
83
RESULTADOS
2. CARACTERIZACIÓN DE LA HIDROXILASA
2.1. Identificación de los productos de la reacción de bidroxilación
Como se ha mencionado, los clones que expresan la hidroxilasa producen
pigmentos de coloración marrón o negra al incubarlos en medio mínimo en presencia de
compuestos aromáticos monohidroxilados como L-tirosina, fenol, y 3- ó 4-HIPA. Para
comprobar que los productos coloreados procedían de la oxidación espontánea de
derivados dihidroxilados obtenidos mediante la acción de una hidroxilasa, se identificaron
los metabolitos de la reacción mediante cromatografia líquida de alta resolución (HPLC).
Para ello, la cepa E. col) DH1 (pA.122) se incubó durante toda la noche a 37 0c en medio
M9 con glucosa suplementado con L-tirosina o fenol 1 mM. Para comprobar que los
sustratos no se transformaban por otro sistema diferente a la reacción mediada por la
hidroxilasa, se incubaron en las mismas condiciones células de E. col) DH1 (pBR32S).
Posteriormente los cultivos se centrifugaron a 6.000 x g durante 10 minutos y el
sobrenadante se utilizó para el análisis en HPLC empleando como patrones sustancias
puras para determinar el tiempo de retención de cada compuesto. Los resultados de este
experimento indicaron que la cepa E col) DH1 (pAJ22) producía L-dopa y catecol a
partir de L-tirosina y fenol respectivamente, demostrándose que la enzima codificada en
el plásmido pAJ22 transformaba estos sustratos aromáticos monohidroxilados en los
correspondientes dioles mediante una reacción de hidroxilación (figura 13). Este sistema
se utilizó para comprobar la transformación de otros posibles sustratos como N-acetil-Ltirosina y L-tirosina-metil éster, detectándose en ambos casos la aparición de un
metabolito más polar que no pudo ser identificado por carecer de las sustancias puras
correspondientes. Mediante este método también fue analizada la transformación del PA
y de sus derivados hidroxilados, observándose que los picos correspondientes al PA y al
2-HIPA permanecían invariables en el cromatograma del sobrenadante del medio de
cultivo de E. col, DH1 (pM22). Sin embargo, el 3-tIPA y el 4-HPA se transformaban
en un metabolito que, dada su inestabilidad, no era identificable mediante este método.
85
RESULTADOS
HRC
L±wur~
0
C
B
A
(1~i
F~
1
llfflmi
5
lo
0
5
lO
O
1
t
t (mm)
Figura 13. Identificación por HPLC del producto de la oxidación de fenol mediada
por la 4-HPA-bidroxilasa. Panel A, solución estándar de hidroquinona (H), resorcinol
(R), catecol (C) y fenol (P). Panel B, sobrenadante del cultivo de E. col) DHI (pBR325)
cultivada en medio M9 suplementado con fenol lmM. Panel C, sobrenadante del cultivo
de E. col) DHI (pA.J22) cultivada en las mismas condiciones.
86
-<
RESULTADOS
La transformación de 3- y 4-tIPA en HPC por la acción de la hidroxilasa fue
comprobada por otro procedimiento consistente en el acoplamiento in vivo de la
reacción de hidroxilación y la reacción de oxigenación mediada por la HPC-dioxigenasa
de K. pneunzoniae M5al (Gibello y cols., 1994). Esta dioxigenasa lleva a cabo la ruptura
en posición nieta del anillo aromático del HPC dando lugar al 5-carboximetil-2hidroximucónico semialdehido (CHMS), que es de color amarillo y presenta un máximo
de absorbancia a 380 nm. Para expresar los genes de la hidroxilasa y de la dioxigenasa en
una misma cepa se construyó el plásmido pAJ221
(figura 11), compatible con el
plásmido pAG464, el cual es un derivado de pUCiS que contiene el gen de la HPCdioxigenasa (Gibello y cols., 1994). El vector pACYC184 se digirió con las nucleasas
HindIII y BamHI ligándose posteriormente al fragmento de 2,7 kb HindIII-Bamm de
pAJ22, que previamente habia sido purificado mediante la técnica de la ¡3-agarasa. La
mezcla de ligación se utilizó para transformar las células competentes de E. cotí DH1 y
los clones recombinantes frieron seleccionados en base a su resistencia a cloranfenicol y
al fenotipo negro que, en este caso, era más evidente que en cualquier otra construcción
analizada anteriormente ya que, como se observó posteriormente, la cepa E. cok DH1
(pAJ221) hiperproduce la hidroxilasa. Una vez obtenido el plásmido pAJ221 se
transformaron las células competentes de E. col) DH1 (pAG464).
Al incubar la células de E. cok DH1 (pAJ22I, pAG4Ó4) en medio M9
suplementado con glucosa y con 4-HIPA ó 3-tIPA, se producía un compuesto de color
amarillo cuyo espectro de absorción coincidía con el del CHlvIS lo que confirmaba la
presencia de este compuesto en el medio de cultivo. Al suplementar el medio con 2-HIPA
como sustrato aromático de la hidroxilasa no se detectaba CHMS en el medio de cultivo,
ya que el 2-tIPA no era un sustrato de la hidroxilasa.
Un experimento similar al anterior pero utilizando la catecol 2,3-dioxigenasa de
P. puada codificada en el plásmido pAW3 1, confirmó la transformación de fenol en
catecol por acción de la hidroxilasa. La cepa E. cotí JM 101 (pAW31, pAJ22 1), incubada
en condiciones similares a las anteriormente descritas pero suplementando el medio
mínimo con fenol, producía 2-hidroximucónico semialdehido (Ii-IMS) que también es
amarillo y presenta un máximo de absorbancia a 375 nm (datos no mostrados).
87
RESULTADOS
2.2. Estudio de los cofactores requeridos noria J¡idroxiiasa
Las oxigenasas hidroxilantes requieren donadores de electrones externos como el
NADH ó NADPH y un centro redox, como mínimo, normalmente compuesto por
metales de transición o una molécula de fiavina (apartado 3.2.1.1. de la Introducción).
Para llevar a cabo el estudio de los cofactores requeridos por la hidroxilasa se utilizó el
fenol como sustrato ya que, a concentraciones saturantes de la catecol 2,3-dioxigenasa
de P. putida (C230), todo el catecol se convierte instantáneamente en WvIS que puede
ser detectado a simple vista en un análisis cualitativo. El análisis coloriniétrico permite
cuantificar la cantidad de sustrato transformado. El acoplamiento de estas dos reacciones
in viti-o no sólo permitió determinar los requerimientos bioquímicos de la hidroxilasa sino
que también facilitó la detección de la enzima durante el proceso de purificación que se
detalla en el apartado 2.6.
La formación de I-IIMS en el extracto crudo de la cepa E. cok JM 101 (pAW3 1,
pAJ221) se midió espectrofotométricamente llevándose a cabo la reacción en presencia
de FAD o FMN 1pM añadiendo en ambos casos NADH ó NADPH 0,2 mM como
cosustrato. Mediante estos experimentos se llegó a la conclusión de que la hidroxilasa
era una enzima dependiente de NADH. Aunque los niveles de HMS no aumentaban en
presencia de FAD o FMiN, esto no indicaba que no fueran requeridos en la reacción de
hidroxilación ya que estos cofactores estaban presentes en el extracto crudo,
probablemente, en concentraciones saturantes.
2.3. Especificidad de sustrato
La especificidad de sustrato de la hidroxilasa se determinó utilizando el extracto
crudo de la cepa DH1 (pA.1221) preparado en tampón fosfato sódico 100 mM, PH 8,
midiendo espectrofotométricamente la oxidación de NADH (tabla 9). Los resultados de
este experimento permitieron clasificar la enzima como una 4-HPA-hidroxilasa, a pesar
de que presentaba un rango de sustrato muy amplio actuando sobre una gran variedad de
derivados aromáticos como la L-tirosina, el HPC, el p-cresol, el fenol y algunos
derivados dorados de éste. La oxidación de NADH no aumentaba en presencia de PA ni
88
RESULTADOS
de 2-NIPA, lo que confirmaba los resultados obtenidos en la identificación mediante
HPLC de los productos de la reacción de hidroxilación.
Tabla 9. Sustratos de la bidroxilasa
Compuesto
Actividad (%)
4-Hidroxifenilacetato
100’
3 -Hidroxifenilacetato
82
2-Hidroxifenilacetato
Homoprotocatecuato
65
2,5-Difidroxifenilacetato
155
3-CI-4-Hidroxifenilacetato
16
Fenilacetato
N.D.
4-Clorofenilacetato
5
o-Creso!
N.D.
m-Cresol
N.D.
p-Cresol
51
Fenol
28
2-Clorofenol
N.D.
3-Clorofenol
5
4-Clorofenol
41
Catecol
2
Resorcinol
28
Hidroquinona
32
L-Tirosina
5
L-Fenilalanina
N.D.
L-Dopa
7
D-4-Hidroxifenilglicina
N.D.
‘100 % de actividad equivale a 0.2 U/mg de proteína.
bND No detectado
89
RESULTADOS
2.4. Secuenciación del oDerón de la 4-HPA-bidroxilasa
El análisis de la expresión de los genes contenidos en el plásmido pAJ22 mediante
la técnica de maxicélulas indicó que el fragmento HindIII-PvuII de 2,5 kb contenía el gen
que codifica para la 4-NIPA-hidroxilasa. Este plásmido fue utilizado como punto de
partida para la construcción de una serie de subclones (plásmidos pM24-28) (tabla 10 y
figura 22). Los fragmentos donados en estos plásmidos fueron secuenciados por ambas
cadenas revelando la existencia de dos marcos de lectura abiertos (ORFs) que parecían
estar formando parte de la misma unidad de transcripción. La región de DNA analizada
es la comprendida entre los nucleótidos 9.185 y 11.695 de la figura 23, donde se indican
los oligonucleótidos sintéticos utilizados en la secuenciación. En la figura 23 se puede
observar que la primera ORF comienza en el nucleótido 9.258 y su codon de iniciación
está precedido por la secuencia AGAGG correspondiente a un posible sitio de unión al
ribosoma (RBS). La masa molecular deducida de esta ORE era de 58.781 Da que se
correspondía con el valor de la masa molecular de la proteína HpaB determinada
mediante la técnica de maxicélulas (figura 12). El codon de iniciación de la segunda ORE
está localizado en la posición 10.838 de la figura 23 y, como en el caso anterior, está
precedido por un posible RBS que se corresponde con la secuencia AGGAGG. Esta
ORE codificaba para un polipéptido cuya masa molecular (18.679 Da) se correspondia
con la observada para la proteína C (figura 12) a la que se denominó HpaC por estar
codificada en el mismo operón que HpaB. En la región inmediatamente posterior al
extremo 3’ del gen hpaC, entre los nucleótidos 11.357-11383, se encontró un posible
terminador de la transcripción Rho-independiente con un energía libre de -22.6 kcallmol,
lo que parecía indicar que hpaC era el último gen del operón.
Para determinar la presencia de otros genes que formaran parte del operón de la
hidroxilasa en la región anterior al extremo 5’ del gen hpaB, se construyó una genoteca
EcoRV con el DNA deE. coli ATCC 11105 en pUCiS. Asi se aisló el plásmido pAJ33
(figura 14) que contenía un fragmento EcoRV de 2,6 kb situado entre los nucleótidos
8147-10.788 de la figura 23. El análisis de la secuencia de este fragmento reveló la
existencia de otro gen al que se denominó hpaA, que terminaba en el nucleótido 9.005 de
la figura 23. Aunque el gen hpaA no estaba aún completo en su extremo 5’ terminal,
90
RESULTADOS
Tabla 10. Plásmidos construidos para la secuenciación de la ruta del 4-HPA
Plásmido (kh)
Vector
Diana
Inserto
del Vector
Diana
pAlI 9
13
(pb)
Procedencia
pBR322
HindllI
HindJiIl
8.593
Genoteca Hindm de E. col! ATCC 11105
pAJ2O
9,2
pBR322
Hin dIll-EcoRI
HindIll-EcoRl
4.890
Deleción EcoPJ de pAJI 9
pAJ2I
8,5
pBR322
Sal!-EcoPJ
SalI-EcoRI
4.822
Deleción Sal! de pAJ2O
pAJ22
7,8
pBR325
H¡ndlll~EcoRV* Hindffi~Pvull*
2.506
FragmentoHindffl-Pvull de pAJ2O
pAJ23
7,8
pACYCI84 EcaPJ
3.510
FragmentoEcoPJ de pAd 19
pAJ24
3
pUC 19
pAJ25
3,5
pUC19
EcoRI-Hindffl
PstI-Ba,niI1
PsII-Pvufl’
163
Fragmento PstI-BamHl de pAJ22
±
PstI
PstI
800
FragmentoPM! de pAJ22
_
Pstl
PMI
1.341
FragmentoPsi! de pAJ22
1.717
Fragmento Ilindffi-SspI de pAJ22
739
FragmentoPsti-EcoRv de pAJ22
pAi26
4
pUC 19
pALJ27
4,4
pUC 19
Hindlfl-Hind.ll H¡ndffi.SspP
pAJ28
3,4
p1IJC 18
Pstl-HindJr
PstI-EcoRv
pAJ32
4
pUC 18
Srnal
PvuhI*
1.319
FragmentoEvul! de PAJ2O
pAJ33
5,3
pUC 18 —
Srnai*
EcaRV
2.641
Genoteca EcoRV de E. cali ATCC 11105
pAJ34
4,5
pUC 18
Ban,l{1-Sn¡aP
Ban:HI-EcoRv
1.868
Deleción BarnHl de pAi33
pAJ35
3,4
pUC 18
-
Dan, Hl
EcoRvtBarnill
pAJ36
3,7
pUC 18
+
pAJ37
3,7
pAJ3S
_
733
Fragmento BamI{l de pAJ33
ffindtfl
HindIfl~EcoRv* 1.038
Fragmento HindllI de pA.J33
pUC 18
Hitidr-EcoPJ
PvulltEcaRI
1.065
Fragmento Pvull-EcoRl de pAJ2O
5,2
pUC ¡8
Ban¡HI
DaniEl!
2.521
Genoteca BornE?! de E. cali ATCC 11105
pECE 1
8,7
pUCi8
BamHl
Ban,HI
6.017
Genoteca BornE??! de E. col! ATCC 11105
pECE2
5,3
pUC 18
Ban,W-EcoRl
BamHl-EcoRI
2.631
Deleción EcoR! de pHCB 1
pHCI33
13,7
pUC ¡8
EcoRI
EcoRI
pHCE4
7,2
pUC 18
BamHI~SmaI*
Ban¡HI~EcoRV* 4.566
Deleción Ecaav-SrnaI de pivlCB 1
pECES
2,9
pUC 18
Sn¡alY
EcoRV*
Fragmento EcoRv de pHCB 1
pHCE6
3,8
pUC 18
S,naI*~BarnHt
EcoR’P-BamHI 1.163
pHCRi
8,5
pUC 18
EcoRI
EcoRI
5.900’
Genoteca EcoRI de E. cali ATCC 11105
pACYCI84 EcoRI
EcoPJ
5.900’
Fragmento EcoRI de piziCRí
pUC 18
Hindfll-EcoRI
Hin dIU-EcaRI
s.ooo’
Deleción Hindffi de pHCR.1
pUC 18
HindIl-EcoRI HindiI-EcoPI-EcoRi 16.000’
pHCR2
pECR3
pAJ4O
10
7,6
19
-
—
-
11.061
288
Genoteca BeoRí de E. cali ATCC 11105
Fragmento EcoRV-Bamnidll de pECE 1
Digestión Eco]?) pI-ICR3 ligado
a fragmento
EcoR! de pHCB3
*
Diana de restricción perdida durante el proceso de donación.
a Tamaño aproximado.
+: Promotor E,,. orientado en el sentido de la transcripción de los operones catabólicos.
-
Promotor Eiac orientado en el sentido contrario al de la transcripción de los operones catabólicos.
91
RESULTADOS
parecía no formar parte del mismo operón que los genes hpaB y hpaC ya que en la
región dc 254 pb comprendida entre los genes hpaA y hpaB existía una secuencia de
nucícótidos capaz de originar una posible estructura de bucle con una energia libre de 19.8 kcalimol, que podría actuar como un terminador de la transcripción (nucleátidos
9.044-9.084 de la figura 23). Por otra parte, el promotor del operón de la 4-NIPAhidroxilasa fue localizado en la región situada entre el gen hpaA y el operón hpaBC,
como se demuestrará en el apartado 4,1.
La proteína truncada HpaA se parecía (21,4% de identidad) a la proteína MeIR
de E. coli (figura 31),
un miembro de la familia de reguladores de transcripción
XyIS/AraC (Gallegos y cols., 1993), lo que indicaba que HpaA podria ser una. proteína
reguladora. La secuencia de HpaiB no mostró una similitud significativa con ninguna
proteína secuenciada hasta el momento, a diferencia de la proteína HpaC que se parecía
(24,7% de identidad) a la ORF6 del cluster de genes de la síntesis de actinorrodina de
Streptomyces coelicolor (Fernández-Moreno y cols., 1992) (figura 15).
>4e/Ec
HelEe
Ss
OsP
pAd2S
EcSs/HcB Ss
pAJ2T
H
Ss/Nc
HSP
E
PAJ271
PE
1B~P
Ss
S~ >4
Y
PEcO,
Pv/Oc
Pj
?(~
7
7
Ss
Ss
H
pAJ22
dSP
E
pAJ22I
Sm/Oc SsE3 HSP
pAJ33
1
MW
—~
Vr’
~ 1
SS
SsH
Y
P Oc/Sm
SsN,~$m/Fc
Oc SsBHSP
¡pcA
Pv’Oc
POcOs P SS
PEcO,
PPv
1
—
~cB
—
hgcc
1W
Figura 14. Mapa de restricción de los plásmidos pAJ28, pAJ27, pAJ271, pAJ22,
pAJ22I y pAJ33. Símbolos: U, pUCI8 y pUCI9; ~9 pBR32S; ~, pACYC1S4; U
región donada. Las flechas indican la dirección de transcripción de los genes.
Abreviaturas: B, BamNIl; Ec, EcoRV; Hc, HindII; H, HindIII; P, PstI; Pv, PvuII; S, Saft;
Sm, SrnaI; Ss, SspI.
92
RESULTADOS
HpaC
NQLDEQRLRFRDAMASISAAVNTITTESDADNA-GLRQRPSCSVTDTPPSLMVCINANSA
:1
:1::::
II: :11
59
:11::
ORES
MAADQSML--RDAMARVPAGVATNTAHDRGGVPHGF’TASS FVSVSMEPPLALVCLARTAN
58
HpaC
MNPVFQGNGKLCVNViNHEQEVMARHFASMTSMP~4EERFSLSCWQKGPLAQPVLKSSLA5
119
ORES
SFPVFDSCGEFAVSVLREDHTDLAMRFA----BKSADKFAGSEFVRTARGATVLDGAVAV
114
HpaC
LESEIROVQAIGTHLVYLVEIKNITLSAEGHGLTYFKRRFHPVI4LEMEAAI
170
:1::::
:1:1::
1::::
:1 :jIl
:1
OREE
VECTVHERI PACDHI ILLGEVQSVHVEERGVPAVYVDRRFAAICSAAGACPSATGRGVPH
175
OREE
AS
177
Figura 15. Alineamiento de la proteína HpaC y la ORF6 del cluster de genes de la
síntesis de actinorrodina de S. coelicolor. y : indican, respectivamente, aminoácidos
idénticos y conservados.
2.5. Implicación de la proteína HpaC en la actividad hidroxilasa
Como se comentó en el apartado 3.2.1.1. de la Introducción, la 4-HPAhidroxilasa de P. putida es un sistema enzimático formado por dos componentes
proteicos; una flavoproteina homodimérica, que cataliza la oxidación de NADH
dependiente de 4-1-IPA, y una proteína cooperadora, que acopla la reacción de oxidación
de NADH a la incorporación del grupo hidroxilo en el anillo aromático (Arunachalam y
cols., 1992). En este sistema, la transformación de 4-HPA en HIPC depende de la
presencia de ambos componentes.
93
RESULTADOS
Durante la subclonación del gen hpaB se había observado que, en las mismas
condiciones de incubación, E. cok DH1 (pAJ27) presentaba un fenotipo negro menos
acusado que las cepas que producían conjuntamente las proteínas HpaB y HpaC. Este
hecho podría ser atribuido a una diferencia cuantitativa en la expresión del gen hpaB en
estos clones pero, teniendo en cuenta el mecanismo de reacción descrito para la 4-NIPAhidroxilasa de P. pulida, y que los genes hpaB y hpaC forman parte del mismo operón,
cabía la posibilidad de que la proteína HpaC actuara como proteína cooperadora
incrementando la actividad hidroxilasa de HpaB.
El plásmido pAJ271 se construyó ligando el fragmento HindIII-BamHI de 1,7 kb
al vector pACYC 184 digerido con las mismas enzimas de restricción (figura 14). La
mezcla de ligación se utilizó para transformar células competentes de E. colí DHI y los
clones recombinantes se seleccionaron en base a su resistencia a cloranfenicol y a la
producción del fenotipo negro al incubarlos en medio LB. Como en el caso del clon Dii
(pAJ27), el fenotipo negro que presentaba la cepa DH1 (pAJ271) no era tan acusado
como el de Dii (pAJ221) a pesar de que, la proteína HpaB se producia en la cepa DRí
(pAJ27l) a unos niveles similares a los de el clon DH1 (pM221) (datos no mostrados).
El plásmido pAJ27l se utilizó para transformar las células competentes de E. cok DH1
(pAJ28). En la figura 16 se puede observar el fenotipo negro que presenta la cepa Dii
(pAJ271, pAJ28) al incubaría en medio LB comparado con las cepas DH1 (pM271) y
Dl-II (pAJ28) incubadas en las mismas condiciones. El plásmido pAJ28 sólo contiene el
gen hpaC por lo que el incremento de la producción del pigmento negro, y por tanto, el
incremento de la actividad hidroxilasa observado en la cepa DH1 (pAJ271, pAJ28)
respecto a la cepa DH1 (pAJ27 1), sólo puede atribuirse a la presencia de la proteína
HpaC. Los resultados que se muestran en la tabla 11 indican que las células portadoras
del plásmido pAJ271 presentan una actividad hidroxilasa muy baja que aumenta
considerablemente al añadir el extracto crudo de la cepa DH1 (pAJ2S) a la mezcla de
reacción. Cuando los genes hpaB y hpaC se expresan en la misma célula en cis (DH1
(pAJ221) ó en tratis (DH1 (pAJ271, pAJ28)), los extractos son capaces de transformar
eficientemente el fenol en catecol. Por otro lado, se observó que la oxidación de NADH
dependiente de fenol aumenta considerablemente cuando ambas proteínas están presentes
en la mezcla de reacción (tabla 11). Estos experimentos permitieron demostrar que la
94
RESULTADOS
Tabla II. Actividad h¡drox¡lasa dc los extractos de E. ccli
Actividad (mU>’
Cepa
Oxidación
de NADH
Formación
de RMS
-FAD ±FAD
-FAD d-FAD
DHI(pAJ22I)
34
47
46
58
DHI(pAJ27I>
1
2
1
4
DIII (pAJ2S)
NDS
ND
ND
ND
DHI(pAJ27I,pAJ2S)
18
50
23
63
DHI(pAJ27I) + DHl(pM28)
10
42
10
51
a
Actividad (mU): La actividad hidroxilasa se ensayó utilizando fenol 2 mM como
sustrato. El FAD se añadió a la mezcla de reacción a una concentración final de 0,6 uM.
no detectado
4
Co
sc
300
-
~0
-J
>0~
o’.
—r
‘cl
4z
orD
o¡
50
1
-
o
o
cl
—ox
1~-
ci
cl
o
0
2
3
4
íog [r~o] (nM)
Figura 17. Dependencia de la actividad 4-HPA-hidroxilasa por el FAD. Los niveles
de oxidación de NADH dependiente de 4-HPA se determinaron utilizando una mezcla
1:1 de los extractos celulares de E. cok DHI (pAJ27I) y E. cali DIII (pM2S).
96
RESULTADOS
2.6. Purificación de la bidroxilasa HoaR
Las enzimas dependientes de coenzimas derivados de la adenina interaccionan
específicamente con la molécula de Cibacrón blue que presenta analogía estructural con
esta base púrica (Stellwagen y Baker, 1976). Dado que la 4-ILPA-hidroxilasa es una
enzima dependiente de NADH y FAD cabía la posibilidad de que el Cibacrón blue
pudiera actuar como ligando de adsorción de esta proteína. De este modo se podría
conseguir la purificación de la enzima en un número reducido de pasos mediante
cromatografia de afinidad. Para purificar la hidroxilasa HpaB se utilizó el extracto crudo
de la cepa E. cok DHI (pAJ221) ya que esta cepa hiperproducía la 4-}WA-hidroxilasa
(figura ISA). El proceso de purificación de la enzima se llevó a cabo mediante una
cromatografia de afinidad en una columna de Cibacrón blue 3GA-agarosa 3000-CL
equilibrada en tampón fosfato sódico 20 mM, pH 8 y eluida con el mismo tampón
conteniendo NADH 30 mM. Las fracciones que presentaban actividad hidroxilasa se
concentraron con polietilenglicol 20.000 y se cargaron en una columna de filtración en
gel de Superosa 12 HIR. Durante todo el proceso de purificación la medida de la
actividad hidroxilasa se llevó a cabo por el método acoplado con la C230 de P. pulido
dada la alta sensibilidad y reproducibilidad de este sistema.
En el análisis en geles de poliacrilamida-SDS que se muestra en la figura 1SB
puede observarse que la proteína HpaB queda retenida en la resma y eluye
específicamente al afiadir NADH al tampón de lavado. Lo mismo sucede con la
cloranfenicol acetil transferasa (CAT) codificada en el plásmido pAJ22 1, ya que la CAT
es una enzima dependiente de acetil-CoA y por tanto, susceptible de ser purificada por
este tipo de resinas (Stellwagen y Baker, 1976). La proteína HpaC eluye de la columna
durante el proceso de ¡avado lo que indica que la interacción entre los dos componentes
de la 4-UPA-hidroxilasa es muy débil.
El extracto crudo presentaba una actividad específica de la hidroxilasa de 50 mU
sobre el fenol. Al contrario de lo que cabria esperar, esta actividad disminuyó a lo largo
del proceso de purificación obteniéndose al final un valor de actividad específica para la
proteína HpaB purificada de tan soloiS mU en presencia de FAD 0.6 lilVí, pero que
97
RESULTADOS
En la figura 19 se muestra e! cromatograma correspondiente a la elución de la
enzima HpaB purificada de la columna de Superosa 12 1-IR con un tiempo de retención
equivalente a una proteina de 120.000 Da, lo que sugiere que la proteina HpaB nativa es
una enzima homodimérica.
La purificación de la hidroxilasa HpaB permitió determinar la secuencia de
aminoácidos MK.PEDFRASTQRPFTGEEYL,
correspondiente a los primeros 19
residuos del extremo N-terminal. Esta secuencia coincide exactamente con la del Nterminal de la proteína HpaiB deducida a partir de la secuencia de nucleótidos.
A
B
1
2
3
L
1
1
0
20
40
t
(m¡n)
1~
1
1
60
80
0
20
.Th~ffi
40
_
60
ffi
80
t ( ini n
Figura 19. Determinación de la masa molecular de la proteína HpaB mediante
filtración en LIPLC. Panel A: 1, aldolasa (160 kDa); 2, seroalbúmina (67 kDa); 3,
ovoalbúmina (45 k.Da). Panel B: proteína HpaB (120 kDa).
99
RESULTADOS
2.7. Presencia de 2enes homólo2os a hpaB en otros microor2anismos
Teniendo en cuenta que el 4-HPA y 3-NIPA eran buenos sustratos de la
hidroxilasa (tabla 9) y que había sido descrita la presencia de una hidroxilasa de 3-NIPA y
4-NIPA en E. cok C (Cooper y Skinner, 1980), cabía pensar que el operón hpaBC
formara parte de la ruta de degradación de estos compuestos en E. cok ATCC 11105 y,
por tanto, otras estirpes capaces de mineralizar estos compuestos podrían tener genes
homólogos a hpaB. Utilizando como sonda el fragmento HindIII-EcoRV de 1,6 kb del
plásmido pAJ27 se investigó mediante análisis por Southem blot la presencia del gen
hpaB en otras estirpes (figura 20). Estos análisis indicaron que las estirpes B, C y W de
E. co/¿ así como otros microorganismos capaces de degradar el 4-NIPA como K
pneumon¡ae y K dftrophila, contienen genes similares a hpaB. Los genomas de dos
estirpes diferentes de E. cotí K12, DHI y W3 110, no contienen ningún fragmento de
DNA homólogo. Esta sonda flie utilizada para donar la 4-NIPA-hidroxilasa de E. cok C
mediante la construcción de una genoteca Hindilí en pBR322. De esta forma se aisló el
clon DH1 (pHd) que contenía un fragmento Hindilí de 6 kb y presentaba un fenotipo
negro similar al de los clones que expresan la 4-NIPA-hidroxilasa de E. cok W (ATCC
11105). La secuenciación de los extremos de este fragmento nos permitió deducir la
secuencia de los primeros 45 aminoácidos de la hidroxilasa de la estirpe C, que era
idéntica a la secuencia N-terminal de la 4-HIPA-hidroxilasa de la estirpe W, E. coil
ATCC 11105.
100
RESULTADOS
3. CLONACIÓN Y SECUENCIACIÓN DEL OPERÓN meta DE LA RUTA DEL
4-HPA
3.1. Clonación del operón meta
y
construcción del mapa fisico de la ruta del 4-RFA
K pneumoniae M5al es un microorganismo capaz de utilizar 3-y 4-HPA como
única fUente de carbono. En el apartado 2.7, se comprobó que existen secuencias
homólogas al gen hpaB en el DNA de esta bacteria y por otra parte, se habia descrito
que otros genes de la ruta de degradación del 4-HPA de K pneumoniae son homólogos
a los genes equivalentes en E. cali W (Fawcett y cols., 1989). Por todo ello, se analizó
mediante Southern blot la posibilidad de utilizar como sonda el gen de La HPCdioxigenasa de K. pnewnoniae MSal para donar el operón meta de la ruta de
degradación del 4-HPA de E. cali ATCC 11105. En la figura 21 se muestra la presencia
de genes similares al de la HIPC-dioxigenasa de K. pneu¡noniae en las bacterias capaces
de mineralizar el 4-HIPA como K. citrophila y las estirpes B, C y W de E. cok.
Posteriormente se construyeron diferentes genotecas de E. cali ATCC 11105 en pUC18
utilizando la misma sonda para la selección de células recombinantes portadoras de genes
homólogos a la HIPC-dioxigenasa. Mediante este procedimiento se aislaron dos
plásmidos solapantes, pHCB1 y pHCB3, que contenían un fragmento BamHI de 6 kb y
un fragmento EcaPJ de 11 kb, respectivamente (figura 22). Al incubar las células que
contenían el plásmido pHCB3 en medio LB se observó que producían un pigmento
negro similar al observado en las cepas que contenían el plásmido pA.J 19, lo que indicaba
que el fragmento EcaRI donado en el plásmido pHCB3 podía contener el operón
hpal3C. Esto se confírmó posteriormente mediante Southern blot y análisis bioquímico.
El fragmento BarnHI-EcaRI de 2.7 kb del plásmido pHCB1 se utilizó como sonda para
seleccionar el plásmido pHCRI a partir de una genoteca EcoPJ (tabla 10, figura 22). El
análisis de restricción de estos plásmidos permitió determinar el mapa fisico de la ruta
completa del 4-HIPA (figura 22).
102
RESULTADOS
3.2. Secuenciación del cluster de senes que componen la ruta del 4-HPA de E. colí
ATCC 11105
La secuenciación del grupo de genes que componen la ruta de degradación del 4HIPA y de parte de las regiones flanqueantes, Ibe llevada a cabo mediante secuenciación
manual y automática. Para ello se construyeron los plásmidos detallados en la figura 22 y
en la tabla 10, y se utilizaron los oligonucleátidos sintéticos marcados en la figura 23. El
análisis de los marcos de lectura abiertos (figuras 22 y 23) y de la comparación de
secuencias (figuras 15, 25-35), sugirió que esta ruta estaba compuesta por once genes,
ocho de los cuales estaban organizados en dos operones; el operón de la 4-NIPAhidroxilasa u operón hpaBC, y el operón hpaGEDFHJ u operón me/cc Además existen
dos genes reguladores hpaR y hpaA, y el gen hpc¿X~ de fUnción desconocida, que parece
formar parte de la misma unidad de transcripción que hpaA. Paralelamente al desarrollo
de esta tesis, el grupo del Dr. Cooper ha secuenciado y caracterizado bioquimicamente
las enzimas pertenecientes al operón hpcECBDGH u operón me/a de la estirpe C de E.
coli (apanado 5.1.1 de la Introducción). Dada la homología entre las proteínas que
componen los operones me/a de ambas estirpes, la fUnción de las enzimas codificadas
por el operón hpaGEDFHI fUe atribuida de acuerdo a lo establecido por estos autores
para la estirpe C de E. cali. En la figura 24 se detallan los pasos enzimáticos propuestos
para la conversión de 4-NIPA en piruvato y succinato semialdehído.
El primer gen del operón me/a es el gen hpaG (nucleótidos 85 1-2.138 de la
figura 23) que codifica para una proteína de 46.927 Da y es homólogo al gen hpcE de E.
cali C (Roper y Cooper, 1993) que codifica para una enzima bitbncional que cataliza la
descarboxilación
del
ácido
5-oxo-pent-3-en-1,2,5-tricarboxílico
(OPET)
y
la
isomerización del producto de la reacción de descarboxilación, el ácido 2-hidroxi-hept2,4-dien-1,7-dioico (HHDD) (figura 24). La diferencia más notable entre la proteína
HpaG y la proteína equivalente HpcE es que la primera tiene 24 aminoácidos más en su
extremo C-terminal debido a una terminación prematura de la transcripción del gen
hpcE, provocada por una deleción de 7 pb en su extremo 3’. Se ha propuesto que HpcE
podría proceder de una duplicación génica ya que el N-terminal de esta proteína es muy
similar a su C-terminal (Roper y Cooper, 1993). En este sentido, el alineamiento entre el
104
RESULTADOS
N- y C-terminal de HpaG es más preciso debido a la contribución de los 24 aminoácidos
adicionales (figura 25).
También se había
descrito que HpcE se parecía a la 4-
oxalocrotonato descarboxilasa codificada por el gen dmpH de la ruta de degradación de
fenol de Pseudomonas CF600 (Shingler y cols., 1992) y a una proteína de fUnción
desconocida que parecía formar parte de la ruta de degradación de catecol de
Alcaligenes eutrophus (Kabisch y Fortnagel, 1990). Por otra parte, el producto del gen
hpaH (nucleótidos 4.957-5.758 de la figura 23) también se parece a la descarboxilasa
DmpH de Pseudomonas CF600 (figura 25.). Este gen codifica para una proteína de
29.714 Da homóloga a la hidratasa del ácido 2-oxo-hept-3-en-1,7-dioico (OHED) o
proteína HpcG (Roper y cols., 1995) (figura 24). En la figura 25 se muestra la
comparación de la secuencia de aminoácidos de las proteínas HpaG y HpaI-1 con otras
descarboxitasas e hidratasas de diferentes microorganismos e incluso de organismos
eucariontes. Por último, hay que destacar que no se ha encontrado ninguna isomerasa
que presente similitud con HpaG.
El gen hpaE (nucleótidos 2.137-3.601) codifica para una proteína de 53.011 Da
perteneciente a la superfamilia de las aldehido desbidrogenasas (Horn y cols., 1991). La
deshidrogenasa HpaE es homóloga a la CHMS-deshidrogenasa codificada por el gen
hpcC de E. coil C (Roper y cols., 1995). En la figura 26 se muestra el alineamiento de
estas proteínas con la deshidrogenasa DmpC de la ruta de degradación de fenol de
Pseudomonas CF600 (Shingler y cols., 1992). Como en el caso del gen hpcE, una
deleción en el extremo 3’de hpcC provoca la terminación prematura de la transcripción
dando lugar a una proteína con 18 aminoácidos menos que la enzima HpaE.
El gen JipaD (nucleótidos 3.605-4.454 de la figura 23) codifica para una proteína
de 32.018 Da homóloga a la HPC 2,3-dioxigenasa de E. cok C codificada por el gen
hpcB (figura 27) (Roper y Cooper, 1990a). La diferencia más importante entre estas dos
proteínas fUe observada en el C-terminal donde una inserción de 2 pb en el gen hpcB
provoca un cambio en la fase de lectura provocando una pérdida de similitud en los
últimos 23 residuos de UpaD. Estas proteínas no presentan ninguna similitud con otras
dioxigenasas secuenciadas lo que sugiere que puedan formar parte de una nueva familia
de dioxigenasas.
105
RESULTADOS
La proteína codificada por el gen hpaF (nucleótidos 4.466-4.844) es idéntica a la
5-carboximetil-2-hidroximuconato-isomerasa (CHM-isomerasa) de E. cali C (figura 28)
(Roper y Cooper, 1990b). Como en el caso de la HPC-dioxigenasa, esta enzima no se
parece a ninguna proteína secuenciada hasta el momento.
Según el trabajo de Roper y cols. (1993), la última enzima del operón me/a es la
2,4-dihidroxi-hept-2-en-l,7-dioato-aldolasa (HHED-aldolasa) codificada por el gen
hpcH (GeniBank/EMBL ac. Z47799). El gen equivalente hpal (nucleótidos 5771-6.557)
codifica para una proteína de 28.072 Da idéntica a HpcH. Además, HpaI es similar a una
ORE incompleta codificada por un gen de fUnción desconocida localizado en la región 5’
de dos ORFs relacionadas con el metabolismo del gluconato en E. cok (Komine e
Inokuchi, 1991). El grado de identidad entre Hpal y esta proteína es del 44% (figura 29).
El gen hpaR (nucleótidos 577-133 de la figura 23) se transcribe en sentido
opuesto a los operones hpaBC y hpaGEDFHJ (figura 24). Codifica para una proteína de
17.235 Da idéntica a la proteína reguladora HpcR (figura 30) que actúa como represor
del operón me/a de E. cali C (Roper y cols., 1993). Estas proteínas no se parecen a
ninguna proteína reguladora descrita hasta el momento, El gen hpaA (nuclcótidos 8.1209.005) codifica para una proteína de 34.129 Da que conserva la secuencia consenso
presente en los miembros de la familia de reguladores XyIS/AraC (Gallegos y cols.,
1993) (figura 31). Este gen parece formar parte de la misma unidad de transcripción que
el gen hpaX(nucleótidos 6.734-8.108) ya que entre el codon de terminación de éste y el
codon de iniciación del gen hpaA sólo hay 9 nucleótidos. La proteína HpaX tiene una
masa molecular de 50.568 Da y presenta similitud con la proteína codificada por el gen
phtJ (34 % de identidad) de la ruta de degradación del fialato en P. pu/ida (INomura y
cols., 1992) (figura 32). La fUnción de la proteína Phd no está aún determinada, pero se
ha sugerido que podría actuar como un regulador positivo de la expresión de los genes
ph/ ó como un transportador de fialato (Nomura y cols., 1992) ya que se parece a la
proteína transportadora de glicerol-3-fosfato (GIpT) de E. cali (Eiglmeier y cols., 1987)
perteneciente al grupo 4 de la superfamilia de transportadores transmembranales (MES)
(Marger y Saier, 1993). La comparación de la secuencia de aminoácidos de HpaX con la
106
RESU LTADOS
de los miembros de este grupo como GIpT (49 % de similitud y 17 % de identidad), la
proteína transportadora de fosfoglicerato de S. typhimurium (52 % de similitud y 21 %
de identidad), la proteína transportadora de hexosa-fosfato UhpT de E. cali (46 % de
similitud y 20 % de identidad) y su proteína reguladora UhpC (50 % de similitud y 22 %
de identidad), sugirió que HpaX podía ser también un miembro de esta superfamilia.
Todos los miembros de la MES tienen aproximadamente 400 aa y presentan un motivo
estructural común de 12 a-hélices transmembranales. El perfil hidrofóbico de la proteína
HpaX (figura 33) es similar al que presentan los miembros de la MES (Marger y Saier,
1993).
107
RESULTADOS
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Figura 22. Organización f¡sica y mapa de restricción del cluster de genes de la ruta
catabólica del 4-UPA y de las regiones flanqueantes. En la parte central de la figura
están indicados los genes localizados en la región secuenciada y los sitios de restricción
más relevantes. En la parte superior e inferior se indican los fragmentos contenidos en los
plásmidos utilizados para la secuenciación de esta región indicando, únicamente, los
sitios de restricción utilizados para la construcción de los mismos (tabla 10). Las flechas
en línea continua indican el sentido de la transcripción de los genes y las flechas en línea
discontinua indican las regiones secuenciadas parcialmente en este trabajo. Abreviaturas:
B, BamHI; E, EcoRI; Ec, EcoRV; H, HindIII; P, PstI; Pv, PvuII; S, Safl,; Ss, SspI.
108
RESULTADOS
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Figura 23. Sentencia de nucleátidos y aminoácidos de los genes y enzimas que componen la
ruta catabólica del 4-RFA. En la figura está indicadala secuencia de nucleótidos de los genes de
la ruta del 4-NiPA así como la secuencia de aminoácidos de sus productos: hpaR (represor
del operon me/a); hpaG
(5-oxo-pent-3-en-1,2,5-tricarboxilato (OPET)/2-hidroxi-hept-2,4-dien1 ,7-dioato (HHIDD) descarboxilasa/isomerasa); hpaE, (5-carboximetil-2-hidroxi-mucónico
semialdehido (CHMS) deshidrogenasa); hpaD (homoprotocatecuato (HPC) dioxigenasa); hpaF (5carboximetil-2-hidroximuconato (CHM) isomerasa); hpaH (2-oxo-hept-3-en- 1 ,7-dioato (OHED)
hidratasa); hpal (2,4-dihidroxí-hept-2-en-1,7-dioato (NIHED) aldolasa); hpaX (codifica para una
proteina perteneciente a la superfamília de transportadores transmembranales); hpaA (regulador del
operón hpaBC); hpaB (componente de la 4-UPA-hidroxilasa); hpaC (proteína cooperadora de la 4HPA-hidroxilasa).También está indicada la secuencia de nucleótidos de los genes situados en las
regiones flanqueantes al ciusler: tsr (codifica para la proteína quimiorreceptora de serma); ORFs 12,
13 y 14 (codifican para proteínas de función desconocida); pac (codifica para la penicilina O acilasa).
En la figura aparece subrayada la secuencia correspondiente a los primers utilizados en la
secuenciación: 3232A, 32RA, 333A, IiIIDROPRO, 038B-S, OBIA-J,OB2A-H, 0B2B3-9, 0B2K3 y
5, 0B41-7, 0B61-5, 0D61-3, ORIA-F, PACEN, PAJ19A-B, PAJ19AC, PAJ2SR,PAJ26D,
PAJ32B,PAJ32T,PM33B, PAJ36R,PM37A-C, PAJ38A. También está subrayada la secuencia
correspondiente a los posibles sitios de unión de la CAP y los posibles terminadores de la
transcripción. Las secuencias REP se indican con una línea discontinua. Los sitios de la iniciación de
la transcripción están señalados (+1), así como las secuencias promotoras -10 y -35. La secuencia
presentada aparece en la base de datos GeneBankIEMlBL con el número de acceso Z37980.
117
RESULTADOS
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502
Figura 24. Pasos enzimáticos propuestos de la ruta catabólica del 4-RFA. Los pasos
enzimáticos Rieron propuestos por Roper y cola, (1993). Las flechas indican la dirección
de transcripción de los genes. Las flechas en linea discontinua indican los genes que han
sido parcialmente secuenciados en este trabajo. Los sitios de restricción son como
siguen: E, BamHI; E, EcoPJ; Ec, EcoRV; H, Hindilí; Los metabolitos intermediarios de
la ruta del 4-NiPA están indicados en la parte superior de la figura. Abreviaturas: HPC,
homoprotocatecuato; CHMS, 5-carboximeíil-2-hidroxi-mucónico semialdehido; CHM,
5-carboximetil-2-hidroxi-muconato;
OPET,
5-oxo-pent-3-en-1 ,2,5-tricarboxilato;
HHDD, 2-hidroxi-hept-2,4-dien-1 ,7-dioato; OHED, 2-oxo-hept-3 -en- 1 ,7-dioato;
1-lEED, 2,4-dihidroxi-hept-2-en-1,7-dioato; Py, piruvato; SS Succinato semialdehido. B,
C, D, E, F, G, H e 1 representan las enzimas codificadas por los respectivos genes.
118
RESULTADOS
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Figura 25. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la hidratasa HpaH y la
descarboxilasalisomerasa HpaG con otras proteínas. BphE hidratasa de Pseudomonas. sp.
KKSLO2 (Kikuchi y col., 1994), TodO hidratasa deP. puada (Zylstra y Gibson, 1989), BphH
hidratasa de Pseudomonas sp. LB400 (Hofer y cols., 1994), XyIJ hidratasa de la ruta TOL
(Hom y cols., 1991), DmpE hidratasa de Pseudomonas sp. CF600 (Shingler y cols., 1992), XylI
descarboxilasa de la ruta TOL (Harayama y Rekik, 1993), DmpH descarboxilasa de
Pseudomonas sp. CF600 (Shingler y cols., 1992), C. e. proteina de Caenorhabdttis elegans
(GeneBank/EMBL ac. 101366, 100450) HpcG y HpcE, hidratasa y descarboxilasa de E. coil C
(Roper y cola, 1995; Roper y Cooper, 1993). Los asteriscos indican los aminoácidos
conservados entre las hidratasas y las descarboxilasas DmpH y XylI. 1 y : indican,
respectivamente, aminoácidos idénticos y conservados.
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RESULTADOS
HpaD
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53
HpcB
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53
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HpcB FDTHWLVNSAYHINCADHFEGVYTSNELFHFIRDMTYNYEGNPELGQLIADFALKLGVPA
113
UpaD KABNTPSLKLEYGTLvPMRYMNEDKHFKVVSISAFCTvHDFADSRKLGFAILKAIEQYDG
173
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EpeE KAHNIPSLKLEYGSVVEt4RYMNEDKRFKVVSTSAFC’rVHDFADSRKLGERTVKAIEQYDG
173
Epan TVAVIASGSLSHRFT DDQRAEEGNNSYTREEDRQNDERvVKLWREGQFKEFCNNLPEYAD
233
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233
Epa» YCYGEGNI4HDTVMLLGMLGWDKYDGKVEFITELFPSSGTGQVNAVFPLPA
283
HpcB YCYGEGNMHDTVMLLGMLGWDKYDGKVWSLSPSYSQASWHRSG
276
Figura 27. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las dioxigenasas ilpaD
y HpcB. HpcB es la HPC-dioxigenasa de E cok C (Roper y Cooper, 1 990a). 1 y
indican, respectivamente, aminoácidos idénticos y conservados.
121
RESULTADOS
flpaF
MPHFIVECSDNIREEADLPGTJFAKVNPTLAATGTEPLAGIRSRvH
III irrírírí II
UpaD
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HpaF WVDTWQMADGQRDYAFVHMTLKIGAGRSLESRQQAGEI4IFELTKTHFAALP4ESRLLALSF
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UpaD WVDTWQNADSQHDYASVHMTLKTGASRSLESRQQAGEMLFELTKTHFAALNESRLLALSF
105
HpaF El EELHETLNFKQNNVHALFK
126
[11111111111111111 III
Upan ETEELHPTLNFKQNNVHALFK
126
Figura 28. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las isomerasas HpaF y
HpcD. HpcD es la CHIvI-isomerasa de E. cali C (Roper y Cooper, 1990b). y: indican,
respectivamente, aminoácidos idénticos y conservados.
122
RESULTADOS
Epal
MENSFKAALKAGRPQIGLWLGLSSSYSAELLAGAGFDWLIJIDGEHAENNVQTV
53
HpaI
LTQLQAIAPYPSQPWRPSWNDPVQIKQLLDvGTQTLLVEt4VQNADEAREAVRATRYPPA
113
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Rnpbl
HpaI
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30
GIRGVGSALAPASRWNRIPDYIQKANDQMCVLVQIETRE.AI4KNLPQILDVESvDGVFIGP
173
11111::
Rnpbl GIRGVSVS—HRANMFGTVADYFAQSNKNITILVQIESQQGVDNVDATAATEGVDGIINGP
89
Epal
AOLSADNGYAGNPQHPEVQAAIEQATVQTRESGKAPGILTANEQLAKRYLELGALFVAVG
233
Rnpbl
SDLAAALGHLGNASHPDVQKáIQHTFNPASAHGKFSGILAPVEADARRYLEWGATFVAVG
149
HpaI
VDTTLLAPAAEALAARFGAQATAVKPGVY
¡ :
:1:: II:
Pnpbl SDLSVFRSATQKLADTFKK
262
168
Figura 29. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la aldolasa ilpal con
una proteína de función desconocida de E. colí. La proteína Rnpbl truncada está
codificada por un gen de función desconocida localizado cerca del gen rnpB (Komine e
Inokuchi, 1991). 1 y: indican, respectivamente, aminoácidos idénticos y conservados.
123
RESULTADOS
EpaR
MINCFYINDFEFFRGKINHDSITIALLQAR
30
III
HpcR
MINCFYINDFEFFRGKIMHDSLTIALLQAR
30
UpaR EAAI4SYFRPTvKRHNITEQQWRIvRILAESPSMDFHDLAYEACILRPSTJTGILTPMERDG
90
Él ¡¡liii LI
EpeR EAAI4SYFRPIVKRHNLTEQQWRIVRTLAESPSMDFHDLAYRACTLRPSLTGILTPMERDG
90
EpaR LVLRLKPINDQRKLYISLTKEGQAIJYNPAQTQIEEAYRQTEAQFTAEKMQQLTHTJLEEFI
150
111111
UpaR LVLRLK?TNDQRKLYISLTKEGQALYNRAQTQIEEAYRQIEAQFTAEKMQQLTHLLEEFI
150
UpaR AIGNSRQEUIPGDNE
165
HpcR ALGNSRQEDTPGDNE
165
Figura 30. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las proteínas ilpaR y
HpcR. HpcR es la proteína represora de la transcripción del operón me/a de la ruta
catabólica del HPC de E. cok C (Roper y cols., 1993). 1 indica aminoácidos idénticos.
124
RESULTADOS
HpaA
MCDRQIANIDIS}~YDESLGTDDVHYQSFARMAPFLASMIPHRHEQYFQM
50
MeiR
frfCSSDEKQTRSPLSLYSEYQRMEIEF----RAPHIMPT--SHWHGQ-VEV
49
HpaA
HFLNSGQIELQI>DDHRYSVEAPIFVITPPSVPHAFI TESDADGHV—- -IT
97
MeiR
NVPEDGOVEYLINNEKVNINQGHITLE’WACTPHQLTDTCTCQSNAIENL?
99
HpaA
-
VREDLIWPLLEVIJYPGTRETEGLPGICLSLADKPDELAALEHYWQLIERE 14?
MeiR
NHLELSWPLDKDLI--NHVT}{CM--VIKSLA--TQQLSpFEVRRWQQEIN 143
HpaA
3--- -VEQLPGREHTLTL- -LAQAVFTLLLRNAflDDHAASGMRGSLKIE 191
:11:
1:11
:7::::
:11:
:1:1:1:
SPNEQIRQLAIDEIGLKRE5ISEPILVNKTSRTH}~SVSRHAQFYV 193
MeiR
Epa
MeiR
QRFNMLIESHFHQHWTVPDYMJELHITESRLTDICRRFANRPPKRLIFDr~ 241
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SQMIGFIAENYDQAITTNDVAEHVflNANYAMGT FQRVMQLTMKQYI TAM 243
Epa
QLREAKRIJLLFSDNAVNNIAWQIGEKDPAYFARFFNRLVCCSPSAYPAKK 286
MeiR
RINHVRALLSDTDKS ILDIAIJTAGFRSS SRFYSTFGKYVGMSPQQYRKLS 290
Epa
vPvT
**
**
**
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T-DIA---GF-S--YF---F----G-TPS--R
CONSENSO
MellE
QQ
Figura 31. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las proteínas HpaA y
MeIR de E coiL MeIR es un miembro de la familia de reguladores XyIS/AracC. La
secuencia consenso del motivo conservado en la región C-terminal de esta familia está
indicada en la parte inferior de la figura. La posible región implicada en la unión al DNA
está subrayada (Gallegos y cols., 1993). y : indican, respectivamente, aminoácidos
idénticos y conservados. Los asteriscos indican los aminoácidos idénticos a la secuencia
consenso.
125
RESULTADOS
HpaX
MSDTSPAIPESIDPANQHKATJTAGQQAVIKKIFRRLIVFIFVTjFIFSFLDRINIG
55
.1:1:
Phtl
I4TTTAATDAVPHLLQRSHERIEKVYRKVTLRU4TFIFVALqVLNYLDRvNTS
51
RpaX FAGLTMGRDLGISATMFGLATTLFYAAWI FGI PSNTNLSIVGARRWTATTNVLWGIAST
115
:1:
:1:
1:111
1:111111:1:
Thtl FAQvYLKHDZJGMSDADLRTRRKLvFHRLHRIGNTQYAYLQKIGARLTITPIHVLWGLISA
111
HpaX ATMFATGPTSLWTJRILVGITEAGFLPGILLYLTFWFPAYFPARANALFMVAMPVTTALG
175
Phtl SMAFMTTPTEFYTAPALLGAAEAGFWPGIILYLTYWYPGARPARITSRFLIJATAAAGIIG
171
EpaX SIVZGYI 1S-LDGVMALKGWQWLFLLEGFPSVLLGV1~5VWFWZDD5PDKAKWLTKEDKKCL
234
Phtl
GPLSGWILTHPVDVMGI4KNWQWMFILEGLPAAVMGVb4AYFYLVDKPEQAKWLDUEEKSIT
231
flpaX QE~4I4DNDRLTLVQEEGAISHHAMQQRSt4WRETFTPVVNP4YTLAYFCTJTNTTJSAISTWTPQ
294
Phtl
LDALAADPAG-KKPVTDKRHAVLAALKDPR-VYVLAACWATVP--ICGT----ILNYWTPT
284
HpaX T LQSFNQGSSNTTIGLLAAVPQTCTILGMVY~SRHSDRRQERRHHTALPYLFAAAGW-LL
353
1:11
II
Phtl IIRN-TGSIQDVLHVGLLSTvPYTVGAIAI4ILIARSSDTRLERRKHFFFSTAFGALGACLL
343
BpaX ASATDHNNIQMLGIIMASTGSFSAMAIFWTTPDQSISIRARAIGIAVTNATGNTGSALSP
413
Phtl PHVVDSATTSITCLAJ4TAVSYFGAAATIWSIPPAYLNDESAAGGISAISSLGQTGAFCAP
403
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458
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451
32. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la proteína HpaX con
la proteína Pthl. Phtl es una proteina de la ruta de degradación del fla]ato deP. pu/ida
perteneciente a la superfamilia de transportadores transmembranales (Nomura y cols.,
1992). y: indican, respectivamente, aminoácidos idénticos y conservados.
Figura
126
RESULTADOS
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458
Figura 33. Perfil hidrofóbico de la proteína llpaX. Se llevó a cabo por el método de
Kyte y Doolittle (1982).
127
RESULTADOS
3.3. Análisis de las re2iones flanqueantes a la ruta del 4-HPA
y
su localización en el
cromosoma de E. cdi
El análisis de las regiones flanqueantes mostró la presencia de cinco OREs
(figuras 23 y 24). La ORFíS estaba incompleta y era similar a la proteína
quimiorreceptora de serma codificada por el gen /sr de E. cok K12 (Ames y Parkinson,
1994). Esta ORF también fije localizada a 119 pb del codon de terminación del gen hpcl-?
de E. cali C (Roper y cola, 1993). La ORFI2 era similar a la proteína CstA de E. cali
MC4 100, la cual se expresa durante la fase estacionaria de crecimiento y en estados
carenciales de fuente de carbono (Schultz y Matín, 1991), y a los primeros 567
aminoácidos de la ORFf721 de E. cok MG1655 (Genflank¡EMBL ac. U14003) (figura
34). La ORE 13 era similar a una proteína de función desconocida (Cst2) que forma parte
del mismo operón que la proteína CstA (Schultz y Matín, 1991) y al C-terminal de la
OREf721 de E. cali MG1655 (GenBank/EMBL ac. U14003) (figura 34). Por tanto, la
0RFf721 de la estirpe M01655 sería equivalente al producto de la fusión de las OREs
12 y 13 de E. cali W. Esta fusión podría estar provocada por una mutación en la
ORFf72 1, que originara un cambio de fase mediante la inserción de un nucleótido en la
posición equivalente al nucleótido 13.421 de la figura 23. En este sentido, Schultz y
Matín (1991) demostraron, mediante la técnica de maxicélulas, la producción de las dos
proteínas del operón de la CstA equivalentes a las ORFs 12 y 13 de E. cali W.
La ORF14 era muy similar al producto del gen yjiA de función desconocida,
localizado en la región 5’ del gen mrr en diferentes estirpes de E. coli K12 (Waite-Rees y
cols., 1991; GenlBankJEMBL ac. U 14003), y a la proteína P47K deP. chlararaphis B23
implicada en el metabolismo del nitrilo (Nishiyama y cols., 1991) (figura 35). Las OREs
12,13 y 14 se transcriben en la misma dirección que los genes que componen los
operones hpaBC y meta. Por el contrario, el gen pac, localizado a 82 pb del codon de
terminación de la ORE 14, se transcribe en el sentido opuesto (figura 22). El gen pac no
fue secuenciado en su totalidad ya que su secuencia había sido determinada
anteriormente por otros autores (Oh y cols., 1987).
128
RESULTADOS
El hecho de que el gen cstA haya sido localizado en el minuto 14 del mapa
genético del cromosoma de E. cali W31 10, mientras que los genes tsr y mrr se mapean
en los minutos 99 y 98,5 respectivamente (Bachmann, 1990), indicaría que la adquisición
de los genes de la ruta del 4-NiPA se había producido simultáneamente a un
reordenamiento de estos genes en el cromosoma de E. cali W, o que el cromosoma de
esta estirpe es muy diferente al de E. cak K12 W3 110. Sin embargo, en la estirpe
MG1655 de E. cali K12, los genes tsr, OREfl2l, yjiA y mrr están situados en una
posición adyacente en el cromosoma entre los minutos 92,8 y 0,1 (GenBank/EMBL ac.
U14003) (figura 36). De acuerdo con este dato, se podria sugerir que el cluster de genes
de la ruta del 4-NiPA se habría insertado en el cromosoma entre el gen tsr y la ORFf721,
en las posiciones correspondientes a los nucleátidos 73 y 11.450 de la figura 23 (figura
36). Estos nucleótidos están localizados en regiones no codificantes, a 57 y 101 pb de los
codones de terminación de los genes JipaR y hpac, respectivamente. Además la
comparación de las secuencias de las estirpes MG1655 y W reveló la existencia de una
inserción entre los nucleótidos 11.602-11.727 de la figura 23, en la región
inmediatamente anterior al codon de iniciación de la ORFf721 (figura 36).
Por otra parte, en el apartado 2.7 se comentó que se había localizado la
hidroxilasa de E. colí C en uno de los extremos del fragmento HindIII del plásmido
pHC 1. La secuenciación del otro extremo reveló la presencia de una ORE similar a la
ORF14. La secuencia de nucleótidos de esta región era prácticamente idéntica a la de E.
cali ATCC 11105 hasta el codon de terminación de la ORE 14. A partir de este punto, se
pierde completamente la similitud entre las secuencias de las estirpes MG1655, W (figura
36) y C (datos no mostrados). Asimismo, se midió la actividad PGA en las estirpes B y C
de E. cali utilizando las mismas condiciones en el ensayo que para la PGA de E. cok
ATCC 11105 y se analizó, mediante Southern blot, la presencia de genes homólogos al
gen pac en estas estirpes (datos no mostrados). Estos experimentos indicaron que el gen
pac no está presente en las estirpes B y C. Estos resultados sugerirían que el gen pac
podría haberse insertado en el cromosoma de E. cali W en la región adyacente al codon
de terminación del gen yjiA.
129
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130
RESULTADOS
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YflA
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II 111111111
ORF14
VDDQLIGDRAT
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147K
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96
YjiA
TQFDRLVIECTGMADPGPTIQT--FFSHEVLCQRYI--LDGVIAI<VDAVH
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111111111 III
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P47K
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QVGYADRILLTKTDVAGEA 128
0RF14
ADEQWJRF-TIAQS
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P47K
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HFIADKQNOISSI----VVELDYPVDISEVSRVMENLLLES--ADKLLRY 286
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P47K
KGYF~~IASRHLEIGLLAQSGKQFQWrYVGRWWNFIEPSQWPRDEYRLQGI 344
EKPHSTMVFI
Yj±A
0BP14
EPNPLLFQGVQRLYS--AflWDRPWGD
318
RIQLPEEEIRA—--AFAG 277
147K
ETPHSTMvFI
RIQLPEDEIRA-—-AFAG 343
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1
:11 1
MARWnSWGDCRQELVFIGQGLDTRvLQRELDHCLLSAQEIAAGPIAWQA 394
YjiA
RK
279
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1K
345
147K
LT
396
35. Alineamiento de la 0RF14 con las proteínas YjiA de E. cdi y P47K de
chlororaphis 1323.
y
indican, respectivamente, aminoácidos idénticos y
Figura
E
conservados.
131
RESULTADOS
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In.
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1
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Figura 36. Comparación de las secuencias flanqueantes al cluster de genes de la
ruta del 4-HPA con la región correspondiente del cromosoma de la estirpe MG1655
de E. coli K12. Las flechas indican la dirección de transcripción de los genes; y
indican, respectivamente, aminoácidos idénticos y conservados; A, significa deleción de
secuencia; = indica regiones muy conservadas; In., indica codon de iniciación; Ter.,
indica condon terminador.
132
RESULTADOS
3.4. Las regiones intergénicas
El análisis de las regiones intergénicas reveló la presencia de cinco secuencias
palindrómicas similares a la secuencia consenso de las REP (secuencia extragénica,
palindrómica y repetida (figuras 37 y 38A). Este tipo de palindromes se ha encontrado a
lo largo del cromosoma de algunas enterobacterias pero su fUnción es aún un tema
controvertido, aunque se ha demostrado que pueden estar implicados en la expresión
génica e influir en la estabilidad del mRNA (Stem y cols., 1984).
En la figura 37 se
puede observar que dos RiEP están localizadas entre los genes hpaF y hpaH, la región
intercistrónica más larga del operón hpaGEDFHJ, mientras que las otras tres están
localizadas en la región 3’ del gen hpal, el último gen del operón me/a. Las REP 1 y
REP 2 están invertidas y, como se muestra en la figura 38B, forman una estructura de
bucle con una energía libre de -65.9 kcallmol. La posibilidad de que este bucle se
comporte como un terminador de la transcripción dividiendo al operón me/a en dos
policistrones aún no ha sido comprobada. En el apanado 2.4 se comentó que habían sido
localizados los posibles terminadores de la transcripción de los operones
hpaBC y
hpaX4, en cambio, entre los genes Jipal y hpax los únicos palindromes localizados son
las REPs 3, 4 y 5 por lo que no se descarta que estas secuencias sean las responsables de
la terminación de la transcripción del operón me/a. Por otra parte, se ha detectado la
presencia de estructuras semejantes a las REP en la ruta arta de degradación de catecol
(ca/) de P. pu/ida, aunque como en el caso de las REP de las enterobacterias, su función
no ha sido determinada (Houghton y cols., 1995).
El sitio de iniciación de la transcripción del operón me/a se localizó comparando
la secuencia de nucleótidos de esta región con la equivalente del operón hpcECBDGH de
E. colí C (Roper y cols., 1993) (figura 37). Esta comparación también permitió localizar
las secuencias promotoras -35 y -10 y un sitio de unión a la CAP (proteína receptora de
cAMP).
133
RESULTADOS
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OTATAATTAGCGAATEGATACTAGCAACGAAOCTE
17779
Figura 37. Regiones intergénicas del cluster de genes de la ruta del 4-HPA. Sólo se
muestran los extremos 5 ‘y 3’ de las regiones codificantes. Las flechas indican la dirección
de transcripción de los genes. Las secuencias REP están subrayadas con doble línea. Los
posibles terminadores de la transcripción y el presunto sitio de unión a la proteína CAP
del operón me/a están subrayados. También está indicado el sitio de iniciación de la
transcripción (±1)del operón me/a y las secuencias promotoras -10 y -35. Los asteriscos
señalan el codon de terminación de las proteínas.
134
RESU LTADOS
A
RE 2
RE 2
1
GCCCGGTGGCGC
TGCGCTTACCGGGCCTAC
2
GCCGGATG-CG--GCT----GCGCCTTATCCGGCCTAC
RE 2
RE 2
RE 2
3
4
5
GCCGGAAG-CGGCGTAA---ACGCCTTATCCGGCCTAC
GCCGGATG—CGC
TGCGCTTATCCGGCCTAC
GGCGGATG-CGGCGTA----ACGCCTTATCCGGTCCGC
CONSENSO
GCCGGATG~CGCCGC
T
A T
GCGCCTTATCCGGCCTAC
A
T
A
B
RE Pl
C
-
O
-4
-
-
-
G
AAAAC CC CA
A
A
GCC SG TG CG CTGCGC TTA CCGG CCTAC
CGG CC AC SC GACGCG AAT GGCC GGATG
-1-
C
5
A
-
CCACATGCC
RE P2
Figura 38. Alineamiento de las secuencias REP. Panel A, alineamiento de las REPs
localizadas en las regiones intercistrónicas del clus/er de genes de la ruta del 4-NiPA con
la secuencia consenso (Stern y cols., 1984). Panel B, estructura de bucle formada por las
REP 1 y 2.
135
RESULTADOS
4. REGULACIÓN DEL OPERÓN hpaBC
4.1. Localización del promotor PRc
Para estudiar la regulación de la transcripción del operón hpaBC era necesario
disponer de un sistema que detectara clara y específicamente la producción de la 4-HPAhidroxilasa tanto en medio sólido como en medio liquido. Inicialmente se pensó en
utilizar el fenotipo negro provocado por la producción de esta enzima, pero éste sólo era
evidente en los clones hiperproductores. Por ello, para determinar la presencia de un
posible promotor en la región de 254 pb comprendida entre el gen hpaA y el operón
hpaBC, se fusionó dicha región al gen trazador lacZ. Este sistema tiene la ventaja de que
la expresión del gen fusionado se puede detectar Pi vivo, con el sustrato cromogénico XGal, o
iii
vi/ra determinando la actividad p-galactosidasa. En la figura 39 se detalla la
construcción de esta fusión en el plásmido pROHí. Este plásmido se utilizó para
transformar células competentes de la cepa E. cali MCi 116 seleccionando los
transformantes a 30 oc en placas de medio LB suplementado con kanamicina y X-Gal. A
las 12 horas de incubación, las colonias presentaban un fenotipo azul a diferencia de la
cepa control MCi 116 (pRS551) cuyas colonias eran blancas. En la figura 40A se
muestra la expresión de la ¡3-galactosidasa en la cepa MCi 116 (pROHí) durante la fase
exponencial de crecimiento, comparada con la cepa control. Una vez comprobado que
en esta región había un promotor, al que se denominó P~0, se determinó la actividad
13-
galactosidasa de las células cultivadas en un medio con 4-NiPA. Estos resultados
demostraron que, en la cepa MCi 116 (pROHí), la expresión de la fusión PBC-lacZ no se
inducía en presencia de 4-NiPA (figura 40A). Para comprobar si este promotor estaba
regulado por una proteína existente en la estirpe salvaje, se transformaron las células
competentes de E. cali ATCC 11105 con el plásmido pROHí. Al cultivar la cepa E. cali
ATCC 11105 (pROHí) en medio M9 con glicerol en presencia o ausencia de 4-NiPA se
comprobó que los niveles de J3-galactosidasa aumentaban 10 veces en presencia de 4NiPA, lo que demostraba que la expresión de la fusión >PBC-lacZ estaba regulada
positivamente en esta estirpe (figura 40B).
136
RESULTADOS
8
Ec/Sm
8
Ec/Sm
1 Salí
2. 8am Hl
3. ,S—Agarasa 1
4. Klenow
1. SmaI
2~ Fosfatase alcalino
Eco Rl
8am Hl
EcoRí
Bern Hl
T4 Lig
E
B
Figura 39. Construcción del plásmido pROHí. Las flechas finas indican la dirección
de la transcripción de los genes y las gruesas el promotor PBC. Abreviaturas: Apr,
resistencia a ampicilina, Kmr, resistencia a kanamicicna; TI4, terminadores de la
transcripción; B, BamNiI; E, EcoPJ; Ec, EcoRV; S, Salí,; Sm, SmaI.
137
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138
.
RESULTADOS
4.2. Determinación de los inductores del operón hpaBC
La purificación de la proteína HpaB permitió obtener un suero anti-HpaB
(apanado 19. de Materiales y Métodos) y por tanto, detectar la producción de esta
enzima mediante la técnica de Western blot. Esta técnica se empleó para determinar qué
compuestos inducian la producción de la 4-HPA-hidroxilasa en la estirpe salvaje. Para
ello, se cultivó E. cali ATCC 11105 a 30 0C en medio M9 conteniendo glicerol y uno
de los siguientes compuestos: 4-NiPA, 3-NiPA, PA, L-tirosina, L-fenilalanina, Lmetionina y L-alanina. Se tomaron alícuotas de los cultivos durante la fase exponencial
de crecimiento y se analizaron por Western blot (figura 41). De esta manera se demostró
que de los compuestos ensayados sólo el 4-NiPA, 3-NiPA y PA inducen la producción de
la hidroxilasa.
Los inductores de la producción de 4-HPA-hidroxilasa también fueron analizados
mediante el estudio de la producción de 13-galactosidasa en la cepa E. cali ATCC 11105
(pROHI), incubada en medio M9 suplementado con glicerol y diferentes compuestos
aromáticos (tabla 12). Los resultados de estos experimentos permiten concluir, en primer
lugar, que los inductores de la hidroxílasa son el 4-HIPA, el 3-NiPA y el PA, y, en
segundo lugar, que algunos sustratos de la enzima como el NiPC, el 2,5dihidroxifenilacetato, el 3-cloro-4-NiPA, el 4-cloro-fenilacetato, el p-cresol, el fenol, el 3cloro-fenol y el 4-cloro-fenol, no se comportan como inductores.
4.3. Localización de la re2ión re2uladora del oDerón hpaBC
Los resultados derivados de la secuenciación de la ruta metabólica del 4-NiPA
revelaron que esta ruta está formada por dos operones catabólicos, los genes reguladores
JipaR y hpaA, y el gen hpaX que parece cotranscribirse con el gen hpaA (figura 22).
Como ya se ha mencionado, el gen JipaR es homólogo al gen hpcR de E. cali C, que
actúa como represor del operón me/a en esta estirpe. Según los trabajos de Roper y cols.
(1993), la transcripción del operón me/a se induce en presencia de NiPC y/o 4-NiPA. Para
comprobar si la transcripción del operón hpaBc estaba regulada también por la proteína
HpaR se construyó el plásmido pHCR2 ligando el fragmento EcaRI de 5,9 kb del
139
RESULTADOS
plásmido pHCR1 al vector pACYC184 digerido con la misma enzima (datos no
mostrados). La mezcla de ligación se utilizó para transformar las células competentes de
MCi 116 (pROHí) con el fin de expresar en la misma célula la fusión PBC-lacZ y el gen
JipaR. Los niveles de 13-galactosidasa en la cepa MCi 116 (pROHí, pHCR2) eran
similares a los de la cepa MCi 116 (pROHí, pACYC1S4) (datos no mostrados) lo que
indicaba que, aparentemente, la proteína HpaR no estaba implicada en la regulación del
operón de la hidroxilasa. Para comprobar la influencia ejercida por las proteínas HpaA y
HpaX en la regulación de la hidroxilasa, se construyó el plásmido pREl según se detalla
en la figura 42 y en el esquema de la figura 43. Con este plásmido se transformó la cepa
MC4100 (pROHí) que presentaba el mismo fenotipo que la cepa MCI 116 (pROHí)
pero crecía más rápidamente en medio mínimo, facilitando los estudios de producción de
f3-galactosidasa en la fase exponencial de crecimiento. La cepa MC4100 (pROH1, pREl)
al ser incubada en medio M63 con glucosa presentaba un nivel basal de j3-galactosidasa
de 40.000 unidades que aumentaba al cultivar las células en presencia de 4-NiPA (figura
44). Para confirmar que el incremento del nivel basal de 13-galactosidasa observado en la
cepa MC4100 (pROHI, pREl) respecto a la cepa MC4100 (pRS551, pREl) no se debía
a un aumento en el número de copias del plásmido pROHí, se midió la actividad
13-
lactamasa de dichas cepas. En ambos casos, la actividad ¡3-lactamasa a las 4 horas de
incubación era de 1-4 x io-~ ,imoles de cefaloridina hidrolizados/minuto, lo que indicaba
que el aumento de la actividad 13-galactosidasa en la cepa MC4100 (pROHí, pREl) no
era debido a un aumento del número de copias del plásmido pROH1 sino a un
incremento en la expresión de la fusión PBC.-JaCZ, aparentemente provocado por las
proteínas HpaA y/o HpaX.
4.4. Implicación de las proteínas llpaA
y
HpaX en la regulación del onerón hnaBC
Para determinar si la transcripción del promotor hpaBc estaba regulada por la
proteína HpaA, la proteína HpaX, o ambas, se construyeron los plásmidos pRAl y pRXl
(figuras 42 y 43). A continuación se transformó la cepa MC4100 (pROHí) con cada uno
de ellos, seleccionando los recombinantes en medio LB con kanamicina y cloranfenicol.
La actividad j3-galactosidasa que presentaban las cepas MC4100 (pROHí, pRAl) y
140
RESULTADOS
MC4IOO (pROHí, pRIXí) demuestra que la proteína HpaA regula positivamente la
expresión de la fUsión PBC-lacZ en presencia de 4-NiPA (tabla 13).
El plásmido pRA2 (figura 43) se construyó ligando el fragmento Salí de 1,4 kb
de pRAl, al vector pRS551 digerido con la enzima de restricción BamNiI, tratando
previamente ambos fragmentos con el fragmento Klenow de la DNA polimerasa. La
mezcla de ligación se utilizó para transformar la cepa MC4 100 seleccionando, en placas
de LB con kanamicina, X-Gal y 4-NiPA, los clones que presentaban el inserto orientado
en la dirección que permitía expresar el gen lacZ mediante el promotor PBC. Las colonias
positivas presentaban un fenotipo azul muy intenso. En la cepa MC4100 (pRA2), el gen
hpaA y la fUsión Psc-lacZ se expresan en cis lo que permitió estudiar la producción de la
4-UPA-hidroxilasa en un sistema semejante, aunque en multicopia, al existente en el
cromosoma de la estirpe salvaje. En la figura 45A se muestra la producción de 13galactosidasa en esta cepa cultivada en presencia de 4-NiPA, 3-NiPA, PA y 2-NiPA,
comparándola con la de E. cok ATCC 11105 (pROHí) (figura 45B) cultivada en las
mismas condiciones. La respuesta de ambas cepas ante la presencia de los inductores es
similar, aunque la actividad j3-galactosidasa en la cepa MC4 100 (pRA2) es
aproximadamente 6 veces mayor debido, probablemente, a que en la estirpe salvaje sólo
hay una copia
del gen hpaA.
Por otra parte, la diferencia observada entre los niveles basales de ¡3-galactosidasa
de las cepas MC4100 (pROHí, pRAl) y MC4lOO (pROHí, pREl) (tabla 13) podría
justificarse si la proteina HpaX activara a la proteína HpaA. Sin embargo, la producción
de j3-galactosidasa en las cepas MC4100 (pRA2, pACYC1S4) y MC4IOO (pRA2, pRXl)
era muy similar (datos no mostrados).
4.5. Represión por catabolito de la 4-HPA-bidroxilasa
Los trabajos de Roper y cols. (1993) demostraron que el operón me/a de la ruta
de degradación del 4-NiPA en la estirpe C de E. cali estaba sujeto a represión catabólica.
Por tanto era lógico pensar que, puesto que la hidroxilación del 4-HPA es un paso previo
a las reacciones mediadas por las enzimas codificadas en el operón me/a, la expresión de
141
RESULTADOS
el operón hpaBC también dependiera de la fuente de carbono utilizada en el medio de
cultivo. Para comprobar esta hipótesis, se cultivaron las células de E colí ATCC 11105
(pROHí) en medio M9, en presencia y ausencia de 4-NiPA, utilizando glucosa ó glicerol
como fuente de carbono (figura 46A). La producción de 13-galactosidasa en esta cepa era
10 veces menor cuando la glucosa estaba presente en el medio de cultivo sugiriendo que,
efectivamente, el operón de la hidroxilasa también estaba sujeto a represión catabólica.
En la figura 46B
se
muestra la producción de 13-galactosidasa en las cepas MC4 100
(pRA2) y SBSÓS8 (pRA2) utilizando las condiciones de cultivo descritas anteriormente.
En este caso, la presencia de glucosa en el medio sólo afectaba a la cepa MC4100
(pRA2), sugiriendo fuertemente que la represión catabólica estaba mediada por la
proteína CAP (crp) ya que la cepa 5BS688 era un mutante Acrp de MC4100.
4.6. Determinación de los sitios de iniciación de la transcripción de los promotores
Ya se ha comentado que los genes hpaA y hpaX estaban prácticamente juntos en
el cromosoma, lo que parecía indicar que ambos genes formaban parte de la misma
unidad de transcripción (figura 23); sin embargo, los resultados obtenidos hasta ese
momento en las células que contenían el plásmido pRAl ó el plásmido pRA2,
demostraban la existencia de un promotor
(PA)
situado en la región de 203 pb anterior al
codon de iniciación del gen hpaA. El sitio de iniciación de la transcripción del promotor
PA
se determinó mediante la técnica de “primer extension” (figura 47A) para lo cual, el
oligonucleótido 038A (figura 23) se hibridó con el RNA total de la cepa MC4100
(pROHí, pREl). Este RNA se utilizó posteriormente para determinar el sitio de
iniciación de la transcripción del promotor PBC (figura 47B) utilizando en este caso el
oligonucleátído OLACZSO, de 20 nucleótidos, situado en la cadena no codificante del
vector pRS5S1, a 50 pb de la diana BamNiI del mismo (apartado 22 de Materiales y
Métodos). Los resultados obtenidos en ambos casos se confirmaron repitiendo el
experimento según el método descrito en el apartado 22.2 y en el caso del promotor PBC,
utilizando el RNA total de la cepa MC4 100 (pRA2) cultivada en presencia de 4-HPA. En
la figura 47C se muestra la secuencia de nucleótidos correspondiente al promotor PBC,
así como dos posibles sitios de iniciación de la transcripción en la región 5’ del gen
142
RESULTADOS
hpaA, estando uno de ellos
(.i)
precedido por un posible sitio de unión a la proteína
CAP. Para comprobar la flincionalidad de ambos sitios de iniciación de la transcripción
seria necesario realizar una serie de experimentos genéticos que hasta el momento no han
sido desarrollados.
4.7. El promotor Pr
Se ha demostrado que la hiperproducción de algunos reguladores pertenecientes
a la familia XyIS/AraC provoca la inducción de la transcripción del gen al que regulan
independientemente de la presencia del efector (Marqués y Ramos, 1993). Por tanto, la
diferencia apreciada entre los niveles basales de 13-galactosidasa de las cepas MC4100
(pROHí, pRAl) y MC4IOO (pROHI, pREl) (tabla 13) podrían indicar que la proteína
HpaA estaba hiperproducida en esta última. La determinación del sitio de iniciación de la
transcripción del promotor PA demostró que la expresión del gen hpaA estaba controlada
por este promotor tanto en la cepa MC4100 (pROHí, pREl) como en la cepa MC4IOO
(pRA2) (apartado 4.6). Estos resultados sugerían que la supuesta hiperproducción de
HpaA en las células que contienen el plásmido pREI, podría deberse a la formación de
otro tránscrito a partir de un promotor más fuerte que PA.
Para comprobarlo se
construyó el plásmido pRX2 (figura 43) ligando un fragmento Eco47III de 288 pb del
plásmido pAJ3S (figura 22) al vector pRS55I digerido con la enzima BamHJ y tratado
con Klenow. Este fragmento (nucleótidos 6.502-6790 de la figura 23) abarca toda la
región intergénica situada entre el operón me/a y el gen hpaX, por lo que se consideró
que debía contener el posible promotor de este último (Px). La cepa MC4100 (pRX2)
producía 13-galactosidasa constitutivamente hasta un nivel de 100.000 unidades, igual
que las cepas MC4IOO (pRX2, pRAL) y MC4IOO (pRX2, pHCR2) (datos no
mostrados) -
143
RESULTADOS
Tabla 12. Inductores del operón hpaBC
SUSTRATO
ACTIVIDAD I3~GALa
4-Hidroxifenilacetato
+++
3-Hidroxifenilacetato
2-Hidroxifenilacetato
fenilacetato
++
N.D Y
3-Cloro-4-hidroxifenilacetato
3-Clorofenilacetato
Homoprotocatecuato
2,5-Dihidroxifenilacetato
p- Creso!
rn-Cresol
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
o-Cresol
Fenol
N.U.
N.D.
4-Clorofenol
3 -Clorofenol
2-Clorofenol
N.D.
N.U.
N.D.
+
Actividad 13-gal: para ensayar la actividad f3-galactosidasa, E. cok ATCC
11105 (pROH1) se cultivó durante 4 horas a 30 0C en medio M9
suplementado con glicerol 20 mM y los compuestos aromáticos mostrados
en la tabla a una concentración final de 1 mM.
“N.U.: no detectado
a
145
RESULTADOS
E-
pACYC1B4
42 kb
5
Pi
PI
-
PI
Ec
Ec
5
PI
5 PI
s
p1
Figura 42. Construcción de los plásniidos pREI, pRXI y pRAl. U, gen hpaA; ~ gen
hpaX; Bfl, gen hpal; 1, resto de los genes contenidos en el plásmido pHCB3. Las flechas
indican la dirección de transcripción de los genes. Abreviaturas: AV. resistencia a
ampicilina; Cmr, resistencia a cloranfenicol; Tct, resistencia a tetraciclina; B, BarnHJ; E,
EcoRí; Ec, EcoRV; P
1, Pv¡¡I; S, Salí.
146
’
RESULTADOS
Ec
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pIRE 1
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pRX1
pRAl
-4
-~
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pRA2
-3
-4
~BC
pRX2
px
.1
1 Kb
Figura 43. Fragmentos donados en los plásmidos pROH1, pREI, pRXl, pRAl,
pRA2 y pRX2. U, gen hpaA; I~ gen hpaA~ I?fl, gen Jipal; ~, operón hpaBC; !!U resto de
los genes del operón me/a, ~, operón lac; Las flechas indican la dirección de
transcripción de los genes. En la figura se indican la localización de los promotores PA,
PBC y P,<, y los sitios de restricción utilizados para la construcción de los plásmidos. Los
asteriscos indican los sitios de restricción que no son únicos en el fragmento mostrado.
Abreviaturas: B, BamHl; Ec, EcoRV; E~, Eco47flI; P1, Pwñ; S, Salt..
147
RESULTADOS
Tabla 13. Estudio de la expresión de la fusión PBc-lacZ en presencia de HpaA y
ILpaX.
Cepa
Unidades 13-gal x io’~ a
+ 4-NiPA
a
- 4-NiPA
MC4100 (pROHI, pACYC1S4)
0,70
0,62
MC4IOO (pROHí, pREl)
63,5
38,7
MC4IOO (pROH1, pRAl)
41,4
0,5
MC4IOO (pROH1, pRXl)
0,95
0,94
Actividad j3-gal: para ensayar la actividad 13-galactosidasa las células se cultivaron
durante 4 horas a 30 oc en medio M63 suplementado con glicerol 20 mM en presencia o
ausencia de 4-NiPA 1 mM.
148
RESULTADOS
loo
o
7.5
-J
cl:
o
50
o
2
D
25
3
2
4
5
t (h)
Figura 44. Producción de 13-galactosidasa por la cepa E. cali MC4100 (pREl,
pROHl). Las células se cultivaron a 30 0C en medio M63 suplementado con glucosa 10
mM (A, A) 6 glicerol 20 mM (O,
en presencia (@, A) ó ausencia (O, A) de 4-HPA 1
mM.
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~
~
~ 3.2
~
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151
RESULTADOS
5. EXPRESIÓN DE LOS GENES DE LA RUTA DEL 4-RFA EN ORGANISMOS
HETERÓLOGOS
El plásmido pAJ4O se construyó con el fin de comprobar que la ruta completa del
4-NIPA estaba formada por los genes lipa y que no era necesario ningún gen adicional
para la mineralización de este compuesto. Para construir el plásmido pAJ4O se ligó el
fragmento EcoRI de 11 kb del plásmido pHCB3 al plásmido PHCR3 digerido con la
enzima de restricción EcaPJ (tablalO, figura 22). La mezcla de ligación se utilizó para
transformar las células competentes de E. coli ETSOOO. La selección de los clones
recombinantes se llevó a cabo a 30 0C, en medio M9 sin glucosa suplementado con
ampicilina y 4-NiPA 5 mM. Sólo los clones que pudieran utilizar el 4-NiPA como única
fuente de carbono serían capaces de crecer en este medio. Después de dos días de
incubación en estas condiciones, se obtuvieron dos colonias que fueron reaisladas en el
mismo medio selectivo en presencia de ácido nalidixico, ya que la cepa ETSOOO es
resistente a este compuesto. De esta forma se aisló la cepa ET8000 (pAJ4O) a partir de
la cual se obtuvo el plásmido pAJ4O, que se utilizó posteriormente para transformar
células competentes de E. cok DH1 y así comprobar que la capacidad de utilizar el 4NIPA y, por tanto, de expresar todos los genes implicados en su ruta de degradación, no
era dependiente de cepa. La cepa E. cali DH1 (pAJ4O) también era capaz de mineralizar
este compuesto tanto en medio sólido como en medio liquido (tabla 14). Mediante estos
experimentos se demostró que los genes necesarios para la degradación del 4-NiPA
estaban contenidos en el fragmento donado en el plásmido pAJ4O.
5.1. Construcción de módulos transponibles con los eenes de la ruta del 4-HPA
Los minitransposones derivados de TnS se han diseñado en un plásmido
(pGP7O4) cuya replicación (oriRK6) depende específicamente de la proteína
it
~pir)
(Herrero y cols., 1990), por lo que sólo puede mantenerse de forma estable en cepas que
produzcan esta proteína, y que además contiene el origen de transferencia conjugativa
(ori7RP4) del plásmido promiscuo RP4. Por tanto, los vectores-transposones mini-mS,
son estables en bacterias lisógenas \pir y pueden ser movilizados por conjugación a una
bacteria receptora mediante las funciones de transferencia del plásmido conjugativo RP4.
153
RESU LTADOS
En el caso de que la cepa receptora no produzca la proteína
it
el plásmido no podrá ser
mantenido y, con una cierta frecuencia, habrá transposición del mini-TnS o sus derivados
a un replicón diferente, normalmente el cromosoma de la célula receptora. El gen que
codifica para la transposasa (/np*) no está incluido dentro de la unidad móvil, por lo
que, si la bacteria receptora no es capaz de mantener el plásmido transferido sólo se
integrará una copia del segmento móvil en su cromosoma. Los transconjugantes así
obtenidos son muy estables desde el punto de vista genético y fáciles de seleccionar en
base al marcador de resistencia incluido en el segmento móvil (de Lorenzo y Timmis,
1994).
Uno de los objetivos de esta tesis era la expresión de la ruta catabólica del 4-NIPA
en otros microorganismos diferentes a E. cok W para conferirles la capacidad de
metabolizar este compuesto y así ampliar su capacidad biodegradativa. Con este fin
fueron construidos los plásmidos pAJ224 y pAJ402 como se muestra en la figura 48. El
primero es un derivado de pCNBS que tiene donado, dentro del segmento móvil, el
operón
hpaBC orientado de forma que
promotor P/rc, así como el represor ~
su expresión
pueda ser controlada por el
y el marcador de resistencia a kanamicina. El
plásmido pAJ4O2 es un derivado de pUTmii-TnS-Km2 y fue construido para poder
insertar la ruta
completa del 4-NIPA en el cromosoma de otros microorganismos
diferentes a E. coli W, seleccionando los transconjugantes en base a su resistencia a
kanamicina.
5.2. Inte2ración de la ruta del 4-tIPA en el cromosoma de E. cdi 1<12
Las células competentes de E. cali S17-lXpir se transformaron con el plásmido
pAJ402 que le conferia resistencia a ampicilina y a kanamicina. Esta estirpe contiene en
su cromosoma los genes que codifican para las funciones de transferencia del plásmido
RP4 y para la proteína
it
(Herrero y cols., 1990), por lo que podía ser empleada como
cepa donadora en los experimentos de transposición. Como organismo receptor se eligió
la cepa ETEOQO de E. cali K12. La conjugación se llevó a cabo según el método descrito
por de Lorenzo y Timmis (1994) utilizando, para la selección de los transconjugantes,
medio M9 sin glucosa suplementado con kanamicina y 4-NIPA como única frente de
154
RESULTADOS
carbono. La cepa donadora era auxotrofa para L-prolina, por lo que no podía crecer en
el medio de selección. Los transconjugantes así obtenidos se volvieron a seleccionar en
base a su sensibilidad a la ampicilina, descartándose así los procesos de cointegración, y a
su capacidad de mineralizar el 4-NIPA en presencia de kanamicina y ácido nalidixico, un
marcador específico de la cepa ETSOOO. Como resultado de estos experimentos se
obtuvo la cepa ET4025 capaz de utilizar 3- y 4-HPA como única fuente de carbono pero
no 2-NIPA (figura 49, tabla 14). Al incubar durante toda la noche a 30 0C la cepa
ET4025 en medio mínimo suplementado con glicerol y fenol, en presencia y ausencia de
4-NIPA, se comprobó que, en esta cepa, la transformación in viva de fenol en catecol
dependía de la presencia del inductor 4-NIPA (tabla 15). Estos resultados demuestran que
el plásmido pAJ4O2 contenía no sólo las enzimas catabólicas de la ruta del 4-NIPA sino
también los genes reguladores.
5.3. Producción de la 4-HPA-bidroxilasa en P. pu/ida KT2442
Como se ha demostrado en los apartados 2.1., 2.2. y 2.3., la 4-HIPA-hidroxilasa
es una enzima que actúa sobre una gran variedad de compuestos aromáticos
monohidroxilados, pero sólo e] 3- y 4-NIPA son metabolizados completamente por la
estirpe salvaje. La producción de esta enzima en otros microorganismos capaces de
mineralizar metabolitos producidos por la 4-NiPA hidroxilasa, permitiría al organismo
receptor utilizar nuevos sustratos aromáticos como fuente de carbono, lo que supondría
una expansión vertical de su capacidad biodegradativa.
El organismo receptor elegido para comprobar esta hipótesis fue P. pu/ida
KT2442 ya que era capaz de metabolizar el benzoato mediante la ruta arta del catecol
(ver apartado 3.2.2.2. de la Introducción) y, por tanto, debería ser capaz de mineralizar
el catecol procedente de la transformación de fenol mediada por la 4-NIPA-hidroxilasa.
Como organismo donador se utilizó la cepa E. cali S17-lXpir transformada con el
plásmido pAJ224 (figura 48), llevándose a cabo la conjugación según el método descrito
por de Lorenzo y Timmis (1994). Para seleccionar los transconjugantes se utilizó medio
LB suplementado con kanamicina
y rifampicina dado que P. pu/ida KT2442 es
resistente a rifampicina a diferencia de la cepa donadora. La nueva cepa de F. pulida, a la
155
RESULTADOS
que se denominó KTH2, presentaba un fenotipo negro similar al de los clones de E. col-]
que expresan el operón de hpaBC (figura 50), lo que demostraba que la enzima se
producía constitutivamente en esta cepa.
A continuación se investigó la capacidad de P. pu/ida KTH2 para mineralizar el
fenol. Para ello, se incubaron las células a 30 oc con agitación durante toda la noche en
medio M9 suplementado con glicerol 20 mM, IPTG 3 mM y fenol 1 mM. Este cultivo se
utilizó para inocular, el medio compuesto por M9, II’TG 3 mM y fenol 3 mM como
frente de carbono, hasta una DO600 de 0,1. Después de nueve horas de incubación, el
cultivo alcanzó la fase estacionaria de crecimiento con una 00600 de 0,55. Una nueva
adición de fenol 3 mM a los cultivos en fase estacionaria provocó que la cepa KTH2
iniciara un nuevo proceso de crecimiento.Sin embargo, si el fenol se añadía inicialmente a
una concentración superior a 3 mM no se detectaba crecimiento, probablemente debido a
la gran toxicidad de este compuesto. Como control, se repitió paralelamente el
experimento con la cepa P. pu/ida KT2442 cuyo cultivo presentaba a las nueve horas
una densidad óptica similar a la inicial (figura 51).
156
RESULTADOS
8
FI
E
E
6
pAJ4O
19 kb
jopeO
FUnd 111
BomHI
FUnd III
BamHI
EooRI
Gene olean
14 Lig
EcoR 1
T
__________________
4Liq
Gene olean
N
FI
6
¡opo
pAJ223
B
5Zkb
jopeO
NB
N
N
1 tRj5rnt~,..142~<Ptt5.Y1 O
Gene olean
1~O
Gene olean
Not 1
Fosfotoso
No? 1
Fosfotoso
alcalino
alcalino
14 Liq
T4Ug
N
/‘W
pAJ224 R6K’\
ILTkb jopeO
Kn#
¡0 41<
N
hpa8
N
Figura 48. Construcción de los plásmidos pAJ4O2 y pAJ224. U, operón hpaBC; E
fragmento de DNA que contiene la ruta completa para la degradación de 4-NIPA.
Abreviaturas: Apr, resistencia a ampicilina; Kmr, resistencia a kanamicina; Cmr,
resistencia a cloranfenicol; B, BamHI; E, EcaRI; H, Hindilí; N, Na/I; P/rc, promotor /rc;
/np* transposasa mS desprovista de la diana Na/I; 1 y O, secuencias terminales (19 pb)
del minitransposon.
157
RESULTADOS
Tabla 14. Capacidad de mineralizar el 4-tIPA
Cepa de E. coIi
D06»
ET8000
0,3
ATCC 11105
0,8
ET8000 (pAJ4O)
0,85
DH1 (pAJ4O)
1,0
ET4025
0,95
DO600 ,,,,,: los cultivos se inocularon a una DO
600
=
0,3 y se incubaron durante toda la
noche en medio M9 suplementado con 4-NiPA 5 mM.
158
RESULTADOS
Tabla 15. Inducción de la 4-HPA-bidroxilasa en diferentes estirpes de E. coli
Cepas
Catecol (nmol/mI)’
-4-1-IPA
+4-HPA
K12ETSOOO
<1
<1
K12ET4025
<1
329
WAICC 11105
<1
695
Catecol (nmol/ml): La inducción de la actividad hidroxilasa fue determinada mediante la
medida iii vivo de la transformación de fenol en catecol. Las células fueron cultivadas
durante toda la noche a 30 0C en medio M9 suplementado con glicerol 20 mM en
presencia o ausencia de 4-HIPA 1 mM.
160
RESULTADOS
I,0
E
c
o
o
<00
0,5
o
á
lO
20
30
40
50
t(h)
Figura 51. Curva de crecimiento de A pu/ida KTLI2 utilizando fenol como fuente
de carbono. Las cepas P. pulida KT2442 (A) y P. pulida KTNI2 (O) fueron cultivadas
en medio M9 suplementado con IPTG 3 mM y fenol, que se añade a una concentración
de 3 mM al iniciarse el cultivo y después de 24 horas de incubación.
162
IV. DISCUSIÓN
DISCUSIÓN
1. CARACTERIZACIÓN DE LA 4-HPA-HIDROXILASA DE E. coli W
La posible implicación del gen pac en el catabolismo de compuestos aromáticos
fue postulada por Valle y cols., (1991) basándose en la capacidad de la PGA para
hidrolizar distintos ésteres y amidas del PA y algunos derivados de éste que,
posteriormente, pueden ser utilizados como sustratos por los microorganismos
productores. En este sentido, se sabe que la cepa de E. cok ATCC 11105, productora de
PGA, es capaz de utilizar como única fuente de carbono algunos productos de la
reacción catalizada por la PGA como el PA y el 4-HPA (Cooper y Skinner, 1980). Sin
embargo, hasta el momento no ha sido presentada ninguna evidencia que confirme esta
suposición, por lo que el papel fisiológico de estas enzimas todavía no ha sido
determinado. Esta hipótesis y la posibilidad de que el clon NiBlOl (pAECl9), que
contiene el gen pac de E. coli, pudiera producir derivados catecólicos a partir de
compuestos aromáticos monohidroxilados, sirvieron de base para el esquema de trabajo
en esta Tesis, consistente en la caracterización del gen responsable de la transformación
de compuestos aromáticos por este clon así como el estudio de su implicación en el
metabolismo de los derivados del PA.
La identificación de los productos de la transformación de fenol, L-tirosina, 4NIPA y 3-NiPA en los clones que contienen el plásmido pAJ19 mediante distintos
procedimientos, ha permitido confirmar que la enzima codificada por el gen hpaB es una
hidroxilasa de compuestos aromáticos dependiente de FAD y NADH. Esta enzima ha
sido clasificada como una 4-NIPA-hidroxilasa ya que presenta la máxima actividad sobre
este compuesto, aunque su rango de especificidad de sustrato es muy amplio, siendo
capaz de hidroxilar otros compuestos aromáticos como el 3-NiPA, el fenol, la L-tirosina
y otros derivados de ésta (tabla 9). El hecho de que esta enzima fUera capaz de producir
HIPC a partir de 3- ó 4-HIPA sugirió que podria ser similar a la hidi-ooxilasa dependiente de
NADH detectada por Cooper y Skinner (1980) en el extracto crudo de E. cali C.
También se ha descrito en otros microorganismos la presencia de otras 4-NIPAhidroxilasas que utilizan FAD y NADH ó NADPH como cosustratos (Adachi y cols.,
1964; Hareland y cols., 1975; van den Tweel y cols., 1988; Martín y cols., 1991;
Arunachalam y cols., 1992). La especificidad de sustrato de cada una de estas enzimas es
164
DISCUSIÓN
diferente; por ejemplo, las 4-HPA-hidroxilasas de P. acidavorans y P. pu/ida no actúan
sobre el 3-HPA (Hareland y cols., 1975; Arunachalam y cols., 1992) mientras que en el
caso de K. pneumoniae se han descrito dos hidroxilasas diferentes específicas para el 3- y
4-NIPA, respectivamente (Martín y cols., 1991). A diferencia de las anteriores, la 4-HPAhidroxilasa de Flavobacterium sp. (van den Tweel y cols., 1988) produce 2,5-DNIPA
(ácido 2,5-dihidroxifenilacético) en lugar de NiPC.
Por otra parte, existen otras monooxigenasas más inespecíficas como la fenolhidroxilasa (finiD) deP. picke//i PKO1 que, además del fenol, utiliza como sustratos el
o-, m- y p-cresol, el catecol, el clorofenol, el bromofenol y el resorcinol (Kukor y Olsen,
1990). El guaiacol y el 3,4-dimetilfenol se comportan como falsos sustratos de esta
enzima, ya que provocan la oxidación del cosustrato (NADPH) independientemente de la
incorporación del grupo hidroxilo en el anillo aromático (Kukor y Olsen, 1990). Este
desacoplamiento entre las reacciones de oxidación e hidroxilación también ha sido
observado en otras oxidasas de función mixta (Beadle y Smith, 1982), por lo que no hay
que descartar la posibilidad de que el 3-Cl-4-HIPA, el 4-CI-PA, el p-.cresol, el 3-o. y 4..
clorofenol, la L-dopa y los derivados dihidroxilados del fenol y del PA (tabla 9), cuyos
productos de reacción no han sido determinados en este trabajo, puedan comportarse
como falsos sustratos de la 4-NIPA-hidroxilasa de E. coli W.
Inicialmente se pensó que la 4-HPA-hidroxilasa estaba compuesta únicamente por
la proteína HpaB, ya que la cepa DHI (pA.J27) presentaba actividad 4-HPA-hidroxilasa.
Además, la mayoría de las monooxigenasas dependientes de FAD y NADH (ó NADPH)
son proteínas monocomponentes con una masa molecular semejante a la calculada para
la proteína HpaB (figura 12) (Kukor y Olsen, 1990; Neujahr y Oaal, 1973; Beadle y
Smith, 1982; Harayama y cols., 1992). Sin embargo, se han obtenido suficientes pruebas
genéticas y bioquímicas que descartan esta suposición. Por una parte, los resultados
derivados de la expresión de los genes hpaB y hpaC en cis, en trans y en células
diferentes (tabla 11), demuestran que la presencia de la proteína HpaC en la mezcla de
reacción origina un incremento en la actividad 4-HIPA-hidroxilasa de la proteína HpaB.
Además, el análisis de la secuencia de nucleótidos de estos genes sugiere que ambos
forman parte de un mismo operón (hpaBC) (figura 23). En consonancia con estos
165
DISCUSIÓN
resultados, se puede afirmar que la 4-HPA-hidroxilasa es un sistema enzimático formado
por dos componentes; la proteína HpaB de 58.781 Da y la proteína HpaC de 18.679 Da.
Las 4-HPA-hidroxilasas de P. avalis y P. pu/ida son los únicos sistemas
enzimáticos de este tipo descritos hasta el momento, aunque todavía no han sido
estudiados a nivel molecular (Adachi y cols., 1964; Arunachalam y cols., 1992). Como se
ha comentado en el apartado 3.2.1.1 de la Introducción, la 4-UPA-hidroxilasa de P.
pu/ida está formada por una flavoproteina dimérica con dos subunidades idénticas de
30,7 lcDa y una proteína cooperadora de 38,5 kDa. En este sistema enzimático, el
acoplamiento entre las reacciones de oxidación e liidroxilación es llevado a cabo por la
proteína cooperadora ya que, en ausencia de ésta, la flavoproteina oxida el NADH en
presencia del sustrato y de otros compuestos que se comportan como falsos sustratos, no
dando lugar en ningún caso al producto dihidroxilado. La aparente ausencia de centros
redox en la proteína cooperadora descarta la posibilidad de que actúe como oxidasa
terminal de este sistema, por lo que hasta el momento se desconoce la función de esta
proteína. Los dos componentes de las 4-HIPA-hidroxilasas de P. pu/ida y P. ovalis no
parecen formar complejos muy estables ya que, en ambos casos, pueden ser separados
por una simple precipitación fraccionada con sulfato amónico (Adachi y cols., 1964;
Arunachalam y cols., 1992).
En el caso de la 4-NIPA-hidroxilasa de E. cali, el componente HpaB es capaz de
producir catecol a partir de fenol independientemente de la presencia de la. proteína
HpaC, aunque este proceso es más eficiente cuando ambas proteínas actúan
conjuntamente. Además, la oxidación del NADH dependiente de sustrato aumenta en
presencia del componente HpaC hasta unos niveles similares a la formación de producto
dihidroxilado (tabla 11), lo que demuestra que la oxidación del cosustrato no es un
proceso llevado a cabo únicamente por la proteína HpaB. Por otra parte, se ha
comprobado durante el proceso de
purificación
del
componente HpaB
que el
Cibacrón blue actúa como ligando de adsorción de esta proteína, sugiriendo su capacidad
para unirse a coenzimas como el FAD y/o el NADH (figura 18B). En cambio, la proteína
HpaC eluye durante el proceso de lavado de la columna lo que indica que, como en el
caso de las hidroxilasas de P. pu/ida y P. ovalis, el complejo formado entre ambos
166
DISCUSIÓN
componentes no es muy estable, y además, que esta proteina no debe poseer ningún sitio
de unión a NADH o FAD.
Todos estos resultados sugieren que la proteína NipaR es el componente
flavoproteico del sistema y que la proteína HpaC actúa como proteína cooperadora del
mismo aunque, aparentemente, la formación del complejo FAD-enzima requiere la
presencia de ambas (figura 17). No obstante, la comparación de la secuencia de
aminoácidos del componente HpaB con la de otras flavoproteinas secuenciadas no reveló
ninguna similitud significativa, incluso en las regiones implicadas en la a FAD y NADH
(Rossman y cols., 1974; Wierenga y cols., 1986; Eggink y cols., 1990; Di Marco y cois.,
1993). En este sentido, Howell y cols.(1972) demostraron que algunas flavoproteinas
hidroxilasas, que requieren donadores de electrones externos como el NADH o NADPH,
presentan un fenómeno común de control según el cual, la reducción de la flavina por
NAD(P)H aumenta considerablemente tras la formación del complejo enzima-sustrato.
Este mecanismo parece estar limitado a aquellas hidroxilasas que utilizan compuestos
aromáticos como sustratos (Ballou, 1982), sugiriendo una correlación entre la presencia
de un sitio atípico de unión de FAD/NAD(P)H y el incremento en la afinidad de la unión
de NAD(P)H provocada por la presencia del sustrato. Por otra parte, Arunacha]am y
cols. (1992), han propuesto que la naturaleza bicomponente de la 4-HPA-hidroxilasa de
P. pu/ida supone un mecanismo de defensa secundario que evita el consumo
improductivo de NADH. Por tanto, y de acuerdo con estas observaciones, es coherente
suponer que esta nueva familia de hidroxilasas bicomponentes puedan tener un sitio
atípico de unión a FAD¡NADH que hasta el momento no ha sido caracterizado.
El mecanismo por el cual la proteína HpaC favorece la hidroxilación del sustrato
mediada por el componente HpaB aún no ha sido esclarecido. Esta proteína se parece a
la ORF6 del clus/er de genes de la síntesis de la actinorrodina de S. caelicalor (figura 15)
(Fernández -Moreno y cols., 1992) y cuya función no se ha determinado exactamente. Se
ha propuesto que esta proteína podría actuar como una dimerasa uniendo dos moléculas
del último precursor de la actinorrodina para producir la estructura final del antibiótico,
aunque no se descarta que pudiera actuar como una proteína reguladora.
167
DISCUSIÓN
2. COMPARACIÓN DE LA RUTA DEL 4-HPA DE E. coil W CON OTRAS
RUTAS CATABÓLICAS
Generalmente, para relacionar dos mtas metabólicas desde el punto de vista
evolutivo se tienen en cuenta dos criterios; por una parte, la similitud en la estructura
primaria de las enzimas equivalentes y por otra, la conservación en la organización fisica
de los genes (Williams y Sayers, 1994). Se puede afirmar que dos enzimas derivan de un
mismo gen ancestral cuando cumplen los siguientes requisitos: i) catalizan la misma
reacción,
u)
las subunidades de éstas tienen una masa molecular similar, iii) sus
secuencias de aminoácidos pueden ser alineadas sin introducir huecos y iv) el porcentaje
de identidad entre ambas proteínas es superior al 30 % (Harayama y Timmis, 1992).
Teniendo en cuenta estos criterios, en este apartado se va estudiar la relación entre la
ruta metabólica del 4-NiPA de E. coli W y otras rutas microbianas de degradación de
compuestos aromáticos.
2.1. Comparación de los senes hna con los genes estructurales dc otras rutas
metabólicas de derivados aromáticos
Los primeros trabajos en el estudio de la capacidad de E. cok para metabolizar
compuestos aromáticos fueron realizados por Cooper y Skinner (1980). Estos autores
establecieron que la estirpe C de E. cok mineraliza el 3- y 4-NiPA por una ruta inducible
de tipo me/a, donde el NIPC actúa como intermediario central dihidroxilado. A pesar de
que el operón me/a de degradación del NIPC (hpcECBDGH) de esta estirpe ha sido
donado y secuenciado (Roper y cols., 1993), el operón de la 4-NiPA-hidroxilasa, así
como
los
genes localizados entre ambos operones (hpaA y JipaN) (figura 24), no habían
sido donados hasta el desarrollo de esta Tesis. Dado que E. cali W también es capaz de
metabolizar el 3- y 4-NiPA, existía la posibilidad de que las rutas catabólicas de estos
compuestos en ambas estirpes pudieran ser homólogas. Los resultados decisivos que
permitieron la verificación de esta hipótesis fueron: i) la confirmación de la existencia de
secuencias homólogas a hpaB en E. cali C (figura 20),
u)
la donación del operón
hpaBC de E. cali C en el plásmido pHC 1 y la secuenciación parcial del mismo, iii) la
demostración de la presencia de genes homólogos a la NIPC-dioxigenasa de K.
168
DISCUSIÓN
pneuman¡ae tanto en la estirpe C como en la estirpe W (figura 21) y iv) la donación y
secuenciación del operón me/a de degradación del HPC de E. cali W (figuras 22-24).
Los resultados obtenidos mediante análisis por Southern blot (figuras 20 y 21) también
sugieren que otros microorganismos capaces de utilizar el 4-NIPA como única fuente de
carbono como E. cali B, K. pneumaniae y K ci/rophila podrian tener una ruta
catabólica similar a la de las estirpes C y W de E. cali.
La ruta catabólica del 4-NIPA de E. cok W está compuesta por once genes; ocho
genes estructurales organizados en dos operones catabólicos, el operón hpaGEDFHJ u
operón nieta y el operón hpaBC, dos genes reguladores JipaR y hpaA, y el gen hpaX de
función desconocida, que está relacionado con la superfamilia de transportadores
transmembranales MFS (figura 24). Ya se ha mencionado que las enzimas del operón
me/a son homólogas a las de la estirpe C de E. cali, sin embargo, la comparación de la
secuencia de aminoácidos de las enzimas que componen tanto el operón me/a como el
operón hpaBC, ha revelado que sólo los genes hpaE, hpaG y hpaH codifican para
proteínas que se parecen a las enzimas equivalentes en otras rutas catabólicas de
compuestos aromáticos (figuras 25 y 26).
La deshidrogenasa HpaE pertenece a la superfamilia de las aldehido
deshidrogenasas (ADH) igual que las deshidrogenasas XylG y XylC de la ruta TOL
(figura 4) y la proteína DmpC de la ruta de degradación de fenol de Pseudomonas
CF600 (Dmp) (figura 26) (Horn y cols., 1991; Nordlund y Shingler, 1990). La
comparación de l-IpaE con otros miembros de las ADH indica que en esta enzima están
conservados todos los motivos característicos de la superfamilia. Por ejemplo, la Cys278 de HpaE parece ser un residuo esencial implicado en la unión del NAD>, además, la
región anterior a esta cisteina, incluyendo ]a Phe-271, está muy conservada en estas
proteínas. Otra secuencia característica, LGGK, está situada a continuación del Glu-244
de HpaE. Este aminoácido parece estar implicado en el relé de carga o bien se trata del
aminoácido que actúa como nucleófilo. Por otra parte, en el motivo localizado entre la
Gly-224 y la Gly-229, la secuencia FTGGTATG se corresponde con la secuencia
consenso (F/Y)TG(S)(T)XXG presente en esta familia, que también parece estar
implicada en la unión del NAD4. Asimismo, el motivo GTGREG localizado en la
169
DISCUSIÓN
posición 454 de HpaE parece ser el responsable del reconocimiento del cosustrato. Por
último, el Glu-470 de HpaE podría participar en el relé de carga aunque este residuo no
está conservado en todos los miembros de las ADH (Horn y cols., 1991).
La proteína HpaE es equivalente a las deshidrogenasas XyIG y DmpC que son las
primeras enzimas de la rama del 4-oxalocrotonato (rama deshidrogenasaldescarboxilasa)
de la ruta TOL y de la ruta Dmp (figuras 2 y 4). Es interesante resaltar que, a diferencia
de estas rutas que pueden degradar los derivados catecólicos por la rama del 4oxalocrotonato o por la rama hidrolitica (Powlowski y Shingler, 1994), la ruta del 4NIPA de E. col] es la única descrita hasta el momento que únicamente consta de la rama
deshidrogenasa/descarboxilasa.
Las descarboxilasas e hidratasas de las rutas de tipo me/a se caracterizan por
poseer un origen común a pesar de tener funciones diferentes (Harayama y cols., 1989;
Shingler y cols., 1992). Estas enzimas están codificadas por genes diferentes cuyos
productos presentan un porcentaje de identidad superior al 30%, por lo que se supone
que provienen de la duplicación génica de un gen ancestral. Los genes xyLJ y dmpE
codifican para Jas 2-oxopent-4-enoato-hidratasas de las rutas TOL y Dmp. En cambio, la
actividad descarboxilasa sólo es evidente en los clones que expresan conjuntamente los
genes xylI y xyLJ de la ruta TOL, y dmpE y dnzpH de la ruta Dmp, no detectándose en
los clones que producen únicamente las descarboxilasas XylI ó DmpH. Además, todos
los intentos de purificación de la 4-oxalocrotonato-descarboxilasa activa han dado como
resultado una copurificación de las enzimas XylI/XyIJ ó DmpE/DmpH (Harayama y
cols., 1989; Shingler y cols., 1992).
La descarboxilasa HpaG y la hidratasa HpaH se parecen a esta familia de
proteínas pero, a diferencia de las descarboxilasas anteriores, la proteína HpaG parece
haber sufrido dos procesos evolutivos; una duplicación génica y una fusión posterior de
ambos genes, ya que sus extremos N- y C- terminal son muy similares (figura 25).
Además, los experimentos realizados por Roper y Cooper (1993) con la proteína
homóloga (HpcE) de E. coli C indican que esta proteína es la única responsable de la
actividad descarboxilasa. Por otra parte, estos autores atribuyen a la proteína HpcE una
170
DISCUSIÓN
doble función OPET-descarboxilasa/HHDD-isomerasa. En este sentido, Harayama y
cols., (1989) demostraron que, en la ruta TOL, la reacción equivalente a la isomerización
llevada a cabo por esta enzima entre los compuestos HIHDD (forma enol) y OHED
(forma ceto) (figura 24), es un paso enzimático dispensable, teniendo en cuenta que,
debido a su gran inestabilidad, la forma enol se transforma espontáneamente en la forma
ceto. Para llevar a cabo estos experimentos, estos autores sintetizaron químicamente el
2-hidroxipent-2,4-dienoato (forma enol) y demostraron que este compuesto es el
sustrato real de la hidratasa XylJ. Sin embargo, Roper y Cooper, (1993) demostraron la
actividad isomerasa de la enzima HpcE utilizando el HIHDD obtenido mediante la
descarboxilación enzimática del OPET en un clon que contenía el gen hpcE en el que no
se detecté actividad HHDD-isomerasa (Jenkins y Cooper, 1988). La consideración de
los procedimientos de obtención de la forma enólica utilizados en ambos casos, hace
necesario confirmar los resultados obtenidos para HpcE mediante un método similar al
utilizado por Harayama y cols. (1989).
El resto de los genes que componen el operón me/a, incluso su gen regulador
JipaR, no se parecen a los genes equivalentes de otras rutas. Hasta el momento se
conoce la secuencia completa de los genes estructurales de las rutas TOL, Dmp, TOD
(ruta de degradación del tolueno de P. pu/ida Fi) y algunas rutas de degradación de
policlorobifenilos de distintas estirpes del género Pseudomonas (Horn y cols., 1991;
Powlowski y Shingler, 1994; Wang y cols., 1995; Furukawa, 1994) (figura 2). La
comparación de las enzimas que componen estas rutas ha demostrado que todos los
genes equivalentes tienen un origen común y que, aparentemente, mutaciones producidas
a lo largo de la evolución han causado cambios en la especificidad enzimática
provocando diferencias en la capacidad biodegradativa de los microorganismos (Williams
y Sayers, 1994; Harayama y Rekik, 1993). El origen de los genes JipaD, Jipo!’ y Jipal
parece no estar relacionado con el de las correspondientes dioxigenasas, isomerasas y
aldolasas de las rutas citadas anteriormente, lo que implica un claro ejemplo de evolución
convergente.
La presencia de permeasas en las rutas de degradación de compuestos aromáticos
no ha sido estudiada hasta hace relativamente poco tiempo. Ultimamente se han
171
DISCUSIÓN
secuenciado algunos genes integrados en operones de rutas catabólicas o situados
inmediatamente al lado de estos, que codifican para proteínas que presentan una similitud
muy alta con proteínas transportadoras. Por ejemplo, el gen ladY forma parte del operón
tod (figura 2) y su producto se parece a la proteína FadL de E. cok implicada en el
transporte a través de la membrana celular de ácidos grasos de cadena larga. La función
de este gen no está todavia muy clara, pero se ha propuesto que puede actuar como
transportador del tolueno o como proteína receptora de tolueno, responsable de la
activación de las proteínas reguladoras (Wang y cols., 1995). Otros ejemplos de este
tipo de proteínas son la proteína PhtI de la ruta de degradación del ifalato de P~ pu/ida y
la proteína PcaK de la ruta or/o de degradación de 4-hidroxibenzoato de P. pu/ida
PRS2000 (Nomura y cols., 1992; Harwood y cols., 1994). Ambas pertenecen a la
superfamilia de transportadores transmembranales (MES) (Marger y Saier, 1993) aunque
todavía no se conoce exactamente su función. En el caso de la proteína Phtl se ha
sugerido que podría actuar como transportador de ftalato o como regulador positivo de
los genes pía’ (Nomura y cols., 1992). En cambio, la enzima PcaK podría actuar, además
de como transportador de 4-hidroxibenzoato, como proteína quimiorreceptora de
sustrato, y por tanto, estar implicada en la respuesta quimiotáctica que P. pu/ida
experimenta en presencia de este compuesto (Harwood y cols., 1994).
La comparación de la secuencia de aminoácidos de la proteína HpaX y el análisis
de su perfil hidrofóbico (figuras 32 y 33) sugieren que esta enzima es un miembro de la
MFS como los casos anteriormente expuestos. La mayoría de los miembros de esta
familia contienen el motivo (R¡K)XXX(R/K) entre las a-hélices 2-3 y 8-9 que da lugar a
una región altamente hidrofilica (Marger y Saier, 1993). Entre las hélices 8-9 de HpaX se
han localizado dos motivos consecutivos similares al consenso entre la Arg-3 18 y la Arg327 (RHSDRRQERR), en cambio, en la región situada entre las hélices 2 y 3, el carácter
hidrofilico es aportado por el motivo VGARR situado entre la Val-96 y la Arg- 100
(figura 32).
Hasta el momento no se ha donado ningún gen que codifique para una 4-NiPApermeasa, aunque se ha detectado la presencia de estas proteínas en algunos
microorganismos que mineralizan el 4-NIPA como K. pneumoniae y E. cok C (Allende y
172
DISCUSIÓN
cols., 1992; Cooper y Skinner, 1980). Los resultados obtenidos del análisis de la
secuencia de HpaX sugieren que esta enzima podría actuar como un transportador de 4NIPA aunque, hasta que se disponga de las pruebas bioquímicas que lo demuestren, no
se descarta que pueda estar implicada en procesos de regulación y/o quimiotaxis como se
ha propuesto para las proteínas TodX, PcaK y Phtl.
2.2. Los senes re2uladores de la ruta del 4-HPA
Generalmente, las rutas bacterianas de derivados aromáticos están reguladas
positivamente por proteinas pertenecientes a las familias LysR, NtrC ó XylS/AraC
(Inouye y cols., 1988; Schell, 1993; Gallegos y cols., 1993). Sin embargo, los trabajos de
Roper y cols. (1993) demuestran que la expresión de los genes del operón hpcECBDGH
de E. cok C está regulada negativamente por la proteína HpcR que, como ya se ha
mencionado, no se parece a ninguna proteína secuenciada hasta el momento. La
represión mediada por esta proteína depende de la presencia de HPC y/ó 4-HiPA que
actúan como inductores. Además, estos autores determinaron que la expresión del
operón me/a está sujeta a represión catabólica, lo que justifica la presencia de un posible
sitio de unión a la proteína CAP localizado en la región promotora del operón (figura
37). Aunque aún no se han realizado los experimentos bioquímicos y genéticos
necesarios para extrapolar estos resultados al operón hpaGEDFIH y su regulador JipaR,
dada la homología que presentan las enzimas, que en el caso de las proteínas HpaR y
HpcR supone un 100% de identidad (figura 30), se asume que el mecanismo de
regulación es similar en ambas estirpes.
La proteína HpaA es un miembro de familia de reguladores XyIS/AraC (Gallegos
y cols., 1993) que regula positivamente la expresión del operón hpaBC utilizando como
efectores 3-NiPA, 4-NiPA y PA. Los miembros de esta familia se caracterizan por estar
estructurados en dos dominios: el C-terminal que presenta un motivo muy conservado
implicado enlauniónaDNA(figura3l) (Gallegosycols., 1993; Michány cols., 1995)y
el N-terminal, menos conservado entre los miembros de esta familia, que podría estar
implicado en la unión enzima-efector aunque todavía no existen las pruebas suficientes
para confirmarlo.
173
DISCUSIÓN
La comparación de la secuencia de aminoácidos de la proteína HpaA reveló que
MeIR es el miembro de esta familia que más se le parece (figura 31). Esta proteína regula
positivamente la transcripción del operón melAB implicado en el catabolismo de la
melobiosa en E. cok (Webster y cols., 1989). Las diferencias más notables en la
transcripción de los genes hpaA y níelR son, por una parte, que meiR se transcribe en
sentido contrario al operón al que regula, como la mayoría de los miembros de esta
familia (Webster y cols., 1988), sin embargo, el gen hpaA se transcribe en el mismo
sentido que el operón hpaBC. Además, los experimentos realizados con la cepa MC4 100
(pROR?, pREl) y MC4IOO (pRA2) (figuras 44 y 45) indican que la transcripción del
gen hpaA puede estar mediada por los promotores
PA
y/ó Px (figura 43). Estos
resultados sugieren que este gen podría formar parte del operón JipaXA aunque esta
hipótesis no podrá confirmarse hasta que se analice el número de unidades de
transcripción generadas en esta región. Por otra parte, la expresión del operón hpaBC
está sujeta a represión por catabolito (figura 46). Dado que se ha localizado un posible
sitio de unión a la CAP en el promotor PA (figura 47C), y que este efecto no se observa
en las cepas MC4100 (pROHí) y MC4100 (pRX2) (datos no mostrados), se podría
asumir que la represión catabólica observada es debida a la intervención de la proteína
CAP en la expresión del gen hpaA mediada por el promotor PA. En este sentido, se sabe
que la expresión de meiR también está regulada por la CAP (Webster y cols., 1988).
Las proteínas HpaA y XylS son los únicos miembros de esta familia implicados
en la regulación de rutas catabólicas de compuestos aromáticos (Gallegos y cois., 1993).
Como se mencionó en el apartado 3.2.4. de la Introducción, XylS regula positivamente
la expresión del operón me/a de la ruta TOL y su producción está controlada por el
regulador XyIR y el factor &‘ de la RNA polimerasa (Marqués y Ramos, 1993). Se ha
propuesto que la forma activa de la proteína es un dímero cuya formación se favorece en
presencia de los efectores y/o cuando XylS está hiperproducida (Marqués y Ramos,
1993). Los ensayos realizados con la cepa MC4100 (pRX2) demuestran que Px es un
promotor muy fuerte, por lo que los elevados niveles de 13-galactosidasa producidos por
la cepa MC4lOO (pROHí, pREl) en ausencia del efector (figura 44), podrían deberse a
174
DISCUSIÓN
una hiperproducción de HpaA, la cual, como en el caso de XylS (Marques y Ramos,
1993), provocaría la dimerización de la proteína y por tanto activaría el promotor PBC.
Desde el punto de vista cualitativo, la activación del promotor PBC cuando el gen
hpaA se expresa mediante el promotor PA, es similar a la de la cepa E. cok ATCC 11105
(pROHí) (figuras 44 y 45). Todos estos resultados sugieren que la expresión mediada
por el promotor Px podría estar controlada por algún represor en la estirpe salvaje el cual
no está presente en la cepa MC4 100. En este sentido, los ensayos realizados con la cepa
MC4 100 (pRX2, pHCR2), donde se expresan conjuntamente la fusión Px-lacZ y el gen
JipaR (datos no mostrados), indican que el regulador HpaR no parece estar implicado en
la expresión mediada por P>-o. No obstante, hay que tener en cuenta que, a pesar de que
los experimentos desarrollados en este trabajo aportan información muy valiosa sobre el
mecanismo de regulación del promotor F~c, los sistemas multicopia no son los más
apropiados para analizar promotores desde el punto de vista cuantitativo, puesto que el
nivel de expresión del gen lacZ depende del número de copias del plásmido. En cambio,
un sistema en el que, tanto el gen regulador como la fusión PBC-lacZ, hubieran sido
insertados en el cromosoma, reproduciría más exactamente la situación existente en la
cepa salvaje (Kessler y cols., 1992). Por ello, hasta que no se disponga de un sistema
monocopia en el que el gen hpaA se exprese, por una parte a partir de
PA
y, por otra, a
partir de Px, no podremos confirmar cuál es el promotor implicado en la expresión de
hpaA.
Los únicos sustratos de la 4-HIPA-hidroxilasa que se comportan como efectores
de la proteína HpaA son el 3-HPA y el 4-NIPA. En cambio, el PA induce la producción
de la 4-1-ll’A-hidroxilasa pero no es transformado por esta enzima. Dado que E. coli W
es capaz de utilizar el PA como única fuente de carbono, la inducción de la 4-NiPAhidroxilasa por este compuesto en la estirpe salvaje (figura 41, tabla 12) podría sugerir la
existencia de una PA-monooxigenasa mediante la cual el PA sería transformado en 3- ó
4-HIPA, que serían los verdaderos responsables de la inducción. Esta enzima permitiría
conectar las rutas del PA y del 4-NiPA. Sin embargo, el hecho de que el PA también
provocara la activación de la proteína HpaA en la cepa MC4100 (pRA2) (figura 45)
excluye esa posibilidad ya que, como se ha demostrado en esta Tesis, E. cali K12 no
175
DISCUSIÓN
contiene la ruta del 4-NIPA, y por otra parte, la transformación de PA en esta estirpe no
origina la acumulación de 4-NiPA (Cooper y cols., 1985). Por tanto, es más coherente
sugerir que, en este caso, la proteína HpaA se comporta de una forma inespecífica en el
reconocimiento del efector. Además, este efecto también se ha observado en la proteína
XyIS, ya que algunos efectores son compuestos metabolizables por la ruta TOL como el
benzoato y sus derivados 3-metil-, 3-etil, 4-metil y 3,4-metil-benzoato. Sin embargo, el
2-metil-benzoato y ciertos derivados halogenados del benzoato son capaces de activar la
proteína pero no son mineralizables por esta ruta (Ramos y cols., 1986).
2.3. La or2anización fisica de los senes
Como se mencionó al comienzo del apartado 2., uno de los criterios utilizados
para relacionar las rutas catabólicas desde el punto de vista evolutivo es la conservación
en la organización fisica de los genes. Esta premisa permite confirmar el orígen común de
los genes que componen la ruta me/a de algunas rutas catabólicas. Por ejemplo, la
secuencia de reacciones que conllevan a la mineralización del catecol de las rutas TOL,
Dmp y de la ruta del naftaleno de P. pu/ida PpG7 (NAH) (figura 2) es la misma, ya que
las
tres
contienen
las
enzimas que
codifican para
la ramas
hidrolasa y
deshidrogenasa/descarboxilasa, y el porcentaje de similitud entre las enzimas equivalentes
es muy elevado (Harayama y Rekik, 1993). Además, el orden de transcripción de los
genes xYITEGFJQKIH (ruta me/a) de la ruta TOL, es idéntico al de los genes
equivalentes de la ruta Dmp y prácticamente igual al de la ruta NAI-I. Sin embargo, esta
similitud disminuye entre las enzimas que codifican para las rutas periféricas, cuyos genes
están localizados en la región inmediatamente anterior al primer gen de la ruta me/a
(xylT, dmpQ y nahT) formando parte del mismo operón (figura 2) (Williams y Sayers,
1994). Estos genes suelen estar relacionados con los equivalentes de otras rutas, así por
ejemplo, en el caso de la ruta TOL, los genes que codifican para la toluato dioxigenasa
(xylXYZ), son muy similares a los genes que codifican para la benzoato dioxigenasa de A.
calcoace/icus (benABC) (figura 2) (van der Meer y cols., 1992). En consecuencia,
algunos autores han sugerido que la evolución de las rutas metabólicas se produce
mediante el ensamblaje de módulos funcionales, en el que están implicados procesos de
176
DIScUSIÓN
duplicación génica, recombinación y transposición (van der Meer y cols., 1992; Williams
y Sayers, 1994; Wyndham y cols., 1994).
Los resultados obtenidos en esta Tesis sugieren que, teniendo en cuenta
solamente la similitud entre proteínas equivalentes, los únicos genes de la ruta del 4-HPA
que podrían tener un origen ancestral común a otros genes equivalentes de la rutas de
tipo nieta, son los genes hpaG, hpaH, hpaE y hpaA. En cambio, el orden de
transcripción de los genes de esta ruta no permite establecer ninguna relación evolutiva
con ninguna ruta catabólica que no sea la de E. coli C (figuras 2 y 24).
Por otra parte, se ha demostrado que el clus/er de genes de la ruta del 4-HPA ha
sido adquirido por la estirpe W como un cassette catabólico (figuras 36 y 37). Este
proceso de adaptación microbiana permite relacionar esta ruta con otros sistemas, ya que
la adquisición de rutas metabólicas completas mediante procesos de transferencia
genética ha sido ampliamente demostrada en otros microorganismos (Reineke y
Knackmuss, 1979; van der Meer y cols., 1992). De hecho, se han descrito algunos casos
en los que todos los genes responsables de la mineralización de un compuesto están
incluidos en un transposón, como por ejemplo la ruta TOL y la ruta NAH (Wyndham y
cols., 1994). Hasta el momento, no se ha encontrado ninguna evidencia que permita
especular sobre el mecanismo implicado en la adquisición de la ruta del 4-NIPA por la
estirpe W, aunque la ausencia de un gen que codifique para una típica transposasa, así
como la ausencia de secuencias invertidas en los extremos del clus/er, sugieren que no se
ha adquirido mediante un proceso típico de transposición.
Por último, se ha descrito la tendencia de algunos genes a insertarse en el
cromosoma en una posición muy cercana a la de otros genes que codifican para enzimas
relacionadas fisiológicamente con las proteínas producidas por los primeros. Aunque
todavía no se conocen los factores que determinan estos procesos, algunos autores han
sugerido que no se trata de un hecho aleatorio (Houghton y cols., 1995). Por tanto, no
debería descartarse la posibilidad de que el proceso de inserción del gen pac en la región
del cromosoma próxima a la del clus/er de la ruta del 4-NIPA, haya sido controlado por
algún proceso de adaptación microbiana, dirigido a ampliar la capacidad biodegradativa
177
DISCUSIÓN
de E. cotí W. Por otra parte, seria interesante investigar si existe alguna relación
funcional entre genes de la ruta del 4-NIPA y las OREs 12 y 13 ya que, aunque la fUnción
del producto del gen cstA no ha sido determinada con exactitud, hay que tener en cuenta
que este gen se ha localizado en E. cali MC4 100 a 600 pb del operón en/CEBA-P15,
que es responsable de la síntesis del compuesto aromático enterobactina, y que la
expresión de algunos genes de este tipo se induce en presencia de ciertos compuestos
aromáticos (Schultz y Matín, 1991; Blom y cols., 1992).
178
DISCUSIÓN
3. PERSPECTIVAS DE FUTURO EN LA UTILIZACIÓN DE LOS GENES DE
LA RUTA DEL 4-HPA EN LA DESCONTAMINACIÓN MEBIOAMBIENTAL
Aunque el 3- y 4-NIPA no son compuestos xenobióticos, la acumulación masiva
de éstos puede acarrear problemas de toxicidad además de provocar otros efectos
nocivos, desde el punto de vista medioambiental, derivados de su mal olor (Spoelstra,
1978). Ya se ha comentado que, puesto que E. coli W es capaz de mineralizar estos
compuestos, este microorganismo podría ser utilizado en los procesos de depuración
biológica de residuos con alto contenido en 4-NiPA, como el alpechín (apartado 5.2 de la
Introducción). En este sentido, la caracterización de la ruta del 4-NiPA realizada en este
trabajo, ha permitido determinar cuáles son los genes implicados en esta ruta, y así
disponer de la información necesaria para desarrollar un sistema que permita transferir a
otros microorganismos la capacidad de metabolizar el 3- y 4-NIPA (figuras 48-50). La
viabilidad del uso de mini-transposones derivados de
ms
en procesos de transferencia
genética se ha comprobado en diferentes especies de los géneros Pseudomonas,
Escherichia, Klebsiella, Salmonella, Proteus, Vibrio, Borde/ella, Actinobacillus,
Rhizobiuní, Rhodobac/er, Agrobac/erium y Alcaligenes (de Lorenzo y Timmis, 1994).
Por tanto, la construcción de un módulo transponible con los genes de la ruta del 4-NIPA
en derivados mini-TaS, hace posible que los microorganismos antes mencionados puedan
ser también considerados como candidatos en el diseño de biorreactores para la
depuración biológica del alpechín.
En esta Tesis también se ha demostrado que la producción de la 4-NiPA
hidroxilasa de E. cok W en P. pu/ida, permite a este microorganismo utilizar el fenol
como única frente de carbono (figura 51), constituyendo un claro ejemplo de la
aplicación de la ingeniería genética en la expansión de la capacidad metabólica
microbiana. La baja especificidad de sustrato que presenta esta enzima deja abierta la
posibilidad de utilizar el vector-transposón pAJ224 para insertar el operón hpaBC en el
genoma de otros microorganismos capaces de mineralizar algún producto de la reacción
mediada por la 4-NIPA-hidroxilasa, y así ampliar el espectro de sustancias metabolizables
por dichos microorganismos.
179
DISCUSIÓN
Por otra parte, el catecol se utiliza en la industria farmaceútica y alimentaria
como compuesto base para la síntesis de algunos medicamentos y aromatizantes.
Actualmente, la obtención del catecol se lleva a cabo mediante un proceso de oxidación
química del fenol que da lugar una mezcla de productos aromáticos hidroxi]ados Esta
mezcla se somete posteriormente a una serie de procesos de purificación que elevan
considerablemente el coste total del proceso. En este sentido, seria interesante estudiar la
posibilidad de obtener catecol enzimáticamente mediante el uso de la 4-NIPA-hidroxilasa
de E. cali e incluso mediante procesos de fermentación bacteriana.
Por último, la activación efector-dependiente de la proteína HpaA permite
considerar a esta proteína como un candidato para el desarrollo de bionsensores (van der
Lelie y cols., 1994) que permitan la detección de la presencia de PA, 3- y 4-NIPA en un
entorno determinado, como por ejemplo en alimentos, puesto que, como ya se ha
comentado, la concentración de PA y alguno de sus derívados es un parámetro a tener en
cuenta en la clasificación de ciertos alimentos (Steeg y Montag, 1988).
180
V. CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
De los resultados presentados en esta memoria se derivan las siguientes
conclusiones:
1. La ruta catabólica del 4-NIPA de E. col] W está compuesta por once genes; ocho
genes estructurales organizados en los operones hpaGEDFHJ y hpaBC, los genes
reguladores JipaR y hpaA, y el gen hpaX que podría actuar como una 4-NIPA-permeasa.
2. El operón hpaBC codifica para la hidroxilasa HpaB y la proteína cooperadora NipaC,
siendo ambos componentes necesarios para que se manifieste la máxima actividad
hidroxilasa
3. La 4-HPA-hidroxilasa es un sistema enzimático dependiente de FAD y NADH que
presenta un rango muy amplio de especificidad de sustrato ya que además del 3- y 4NIPA puede hidroxilar otros compuestos aromáticos.
4. La 4-NIPA-hidroxilasa no presenta similitud con ninguna de las monooxigenasas
secuenciadas hasta la fecha, por lo que puede considerarse como el primer miembro de
una nueva familia.
5. La expresión del operón hpafiC está regulada positivamente por la proteína HpaA,
perteneciente a la familia de reguladores XyIS/AraC. Entre los distintos compuestos
ensayados en este trabajo, sólo el 4-NiPA, el 3-NiPA y el PA se comportan como
efectores de la proteína HpaA. La expresión de la proteína HpaA está sujeta a represión
catabólica.
6. El operón hpaGEDFHI está situado en una posición adyacente al operón ¡¡paRC y es
similar al operón me/a de la ruta catabólica del HPC de E. col] C.
7. El gen JipaR es similar al gen hpcR de E. coli C que codifica para el represor del
operón me/a en esta estirpe. Los productos de ambos genes no se parecen a ninguna
proteína reguladora secuenciada hasta el momento.
182
CONCLUSIONES
8. La descarboxilasa HpaG, la deshidrogenasa HpaE y la hidratasa HpaH presentan una
similitud significativa con las enzimas equivalentes de otras rutas catabólicas de
compuestos aromáticos-o Por el contrario, la dioxigenasa HpaD, la isomerasa HpaF y la
aldolasa HpaI sólo muestran similitud con las enzimas equivalentes de la ruta del NIPC de
E. cali C.
9. El análisis de las regiones flanqueantes de los genes de la ruta catabólica del 4-NIPA de
E. cok W ha permitido concluir que este clus/er se ha insertado en el cromosoma de esta
estirpe como un módulo funcional. La comparación de esta región con la secuencia de
nucleótidos localizada entre los minutos 92,8 y 0,1 del cromosoma de la estirpe MG1655
de E. cali K12, ha permitido determinar que la ruta del 4-NIPA se ha insertado
exactamente a 61 pb del codon de iniciación del gen tsr de E. cok, que codifica para la
proteína quimiorreceptora de serma.
10.
Todos los genes necesarios para que E. cali K12 niineralice el 4-NIPA están
contenidos en este cluster, ya que su expresión en este microorganismo le permite
utilizar 4-HPA como fuente de carbono.
11.
La expresión del operón hpaBC en P. pu/ida KT2442 capacita a este
microorganismo para mineralizar fenol, lo que supone una expansión vertical de su
capacidad degradativa.
183
VI. BIBLIOGRAFÍÁ
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