COMPENDIUM OF INTERNATIONAL METHODS OF ANALYSIS

RESOLUCIÓN OIV-OENO 511-2013
MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE LA RELACIÓN ISOTÓPICA 18O/16O DEL AGUA EN EL VINAGRE DE VINO
POR ESPECTROMETRIA DE MASAS ISOTOPICAS
LA ASAMBLEA GENERAL,
Visto el artículo 2 párrafo 2 iv del Acuerdo del 3 de abril de 2001 por el que se crea la Organización
Internacional de la Viña y el Vino,
18
16
Considerando la resolución Oeno 2/96 relativa a la determinación de la relación isotópica O/ O del
agua en el vino y el estudio interlaboratorios,
Considerando la resolución OIV/OENO 353/2009 relativa a la determinación de la relación isotópica
18
16
O/ O del agua en el vino y el mosto,
Por propuesta de la Subcomisión “Métodos de análisis”,
DECIDE completar el Compendio de los métodos internacionales de análisis de los vinagres de vino con el
siguiente método:
1. Título
Método de determinación de la relación isotópica 18O/16O del agua en el vinagre de vino por
espectrometría de masas
Método de tipo: II
2. Objetivo/ámbito de aplicación
Este método permite determinar la relación isotópica 18O/16O del agua en el vinagre de vino tras alcanzar
un equilibrio con CO2 y por espectrometría de masas de relaciones isotópicas (IRMS).
3. Definiciones
18
O/16O
Relación isotópica del oxígeno 18 y del oxígeno 16 en una muestra dada.
δ18OV-SMOW
Escala relativa usada para expresar la relación isotópica de oxígeno 18 y del oxígeno 16
en una muestra dada. Se calcula según la fórmula siguiente:
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1
 18OV  SMOW
  18O 

 18O 
  16 
  16 

  O  muestra  O  patrón 

  1000 ‰
 18O 


 16 
O



 patrón
El patrón V-SMOW se toma como referencia para la escala relativa δ.
BCR
Oficina Comunitaria de Referencia
OIEA
Organismo Internacional de la Energía Atómica, con sede en Viena (Austria)
IMMR
Instituto de Medidas y Materiales de Referencia
IRMS
Espectrometría de masas de relaciones isotópicas
m/z
Relación masa/carga
NIST
Instituto Nacional Estadounidense de Patrones y Tecnología
MR
Material de referencia
V-SMOW
Viena Standard Mean Ocean Water (Patrón de Viena para la composición promedio del
agua oceánica) (18O/16O = RV-SMOW = 0,0020052)
GISP
Greenland Ice Sheet Precipitacion (Precipitaciones en la calota glacial de Groenlandia)
SLAP
Standard Light Antarctic Precipitation (Precipitaciones ligeras estándar en la Antártica)
4. Principio
La técnica que se describe a continuación está basada en el equilibrio isotópico del agua presente en
muestras de vinagre de vino con un gas CO2 estándar, según la siguiente reacción de intercambio
isotópico:
C16O 2  H 2 18 O C16 O18 O  H 2 16 O
Tras alcanzar el equilibrio, el dióxido de carbono en fase gaseosa se utiliza para analizar mediante IRMS
la relación isotópica 18O/16O.
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2
5. Reactivos y materiales
Los productos y los materiales fungibles dependen del método elegido (véase el apartado 6).
Pueden utilizarse los siguientes materiales de referencia, soluciones de trabajo y materiales fungibles:
5.1. Materiales de referencia
Nombre
V-SMOW, RM 8535
BCR-659
GISP, RM 8536
SLAP, RM 8537
Organismo responsable
OIEA / NIST
IMMR
OIEA / NIST
OIEA / NIST
δ18O con respecto a V-SMOW
0‰
- 7,18 ‰
- 24,78 ‰
- 55,5 ‰
5.2. Soluciones de trabajo
5.2.1. Dióxido de carbono (anhídrido carbónico) como gas de referencia secundario para la
medición (Núm. CAS: 00124-38-9)
5.2.2. Dióxido de carbono para el equilibrado (dependiendo del instrumento, este gas puede ser
el mismo que el que se relaciona en el punto 5.2.1. o bien en el caso de sistemas de flujo continuo puede
ser una bala que contenga una mezcla de helio y dióxido de carbono.
5.2.3. Soluciones de trabajo cuyos valores de δ18OV-SMOW se hayan calibrado con arreglo a
materiales de referencia internacionales.
5.3. Materiales fungibles
Helio para análisis (Núm. CAS: 07440-59-7)
6. Equipo
6.1 Espectrómetro de masas de relaciones isotópicas
El espectrómetro de masas de relaciones isotópicas determina el contenido relativo de 18O respecto al de
16
O en el gas CO2 con una precisión interna de 0,05 ‰. La precisión interna se define como la diferencia
entre dos medidas de la misma muestra de CO2.
El espectrómetro de masas destinado a determinar la composición isotópica del gas CO2 está
generalmente equipado con un triple colector, que puede medir simultáneamente las siguientes
corrientes iónicas:
- m/z = 44 (12C16O16O)
- m/z = 45 (13C16O16O y 12C17O16O)
- m/z = 46 (12C16O18O, 12C17O17O y 13C17O16O)
Al medir las intensidades correspondientes, la relación isotópica 18O/16O se ve determinada por la
relación de intensidad m/z= 46 y m/z= 44 tras llevar a cabo una serie de correcciones en las especies
isobáricas 12C17O16O y 13C17O16O, cuya contribución podría calcularse en función de la intensidad
observada para m/z= 45 y en función de la abundancia isotópica de 13C y 17O naturales.
El espectrómetro de masas de relaciones isotópicas debe estar equipado con:
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- un sistema de doble entrada (sistema de doble ingreso) para medir de forma alterna la muestra y una
muestra de referencia
- o un sistema de flujo continuo que transfiera de forma cuantitativa en el espectrómetro de masas el
CO2 de los recipientes que contienen las muestras en equilibrio y el patrón de CO2.
6.2 Instrumental y materiales
Los instrumentos y materiales deben satisfacer las exigencias del método o del equipo utilizado
(especificadas por el fabricante). No obstante, también se pueden utilizar otros instrumentos o
materiales con las mismas prestaciones.
6.2.1 Viales con septum adaptado al sistema empleado
6.2.2 Pipetas volumétricas con las puntas apropiadas
6.2.3 Sistema de control de la temperatura para que la reacción de intercambio isotópico se lleve a cabo
a una temperatura constante (normalmente a ± 1 °C)
6.2.4 Bomba de vacío (si el sistema lo requiere)
6.2.5 Automuestreador (si el sistema lo requiere)
6.2.6 Jeringas para las muestras (si el sistema lo requiere)
6.2.7 Columna de GC para separar el CO2 de otros gases elementales (si el sistema lo requiere)
6.2.8 Sistema para extraer el agua (p. ej.: cryo-trap o membranas permeables selectivas)
7. Preparación de las muestras
Las muestras de vinagre de vino y los materiales de referencia se utilizan para el análisis sin tratamiento
previo. Si la muestra contiene impurezas, conviene filtrarla con un filtro de diámetro de poro de 0,22 µm.
A ser posible, los materiales de referencia usados para calibrar y corregir los datos deberán colocarse al
inicio y al final de cada serie e intercalarse cada diez muestras.
8. Procedimiento
A continuación se recoge el procedimiento usual para determinar la relación isotópica 18O/16O mediante
equilibrio del agua con una solución de trabajo de CO2 y posterior análisis por IRMS. Los procedimientos
pueden adaptarse en función de los equipos e instrumentos utilizados, ya que existen diferentes tipos de
sistemas de equilibrado con diferentes funcionamientos. Los dos procedimientos técnicos más
importantes para la introducción de CO2 en el espectrómetro de masas son: un sistema de doble
entrada y un sistema de flujo continuo.
Nota: los volúmenes, temperaturas, presiones y tiempos se dan a título indicativo. Los valores adecuados
deben buscarse en las especificaciones facilitadas por el fabricante o determinarse experimentalmente.
8.1 Equilibrio inducido manualmente
Con una pipeta, transferir una alícuota de la muestra o de solución de trabajo a un matraz. Ajustar el
matraz al extractor.
Enfriar a menos de –80 °C para que se congelen las muestras (los extractores equipados con tubos de
apertura capilar no requieren la fase de congelado). A continuación, se produce el vacío en todo el
sistema.
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Una vez alcanzado un vacío estable, se distribuye CO2 procedente de la solución de trabajo en los
matraces de fondo redondo. Para inducir el proceso de equilibrio se utiliza un baño de agua a 25 °C (± 1
°C) durante 12 horas (por la noche). Es muy importante que la temperatura del baño de agua se
mantenga constante y homogénea.
Una vez terminado el proceso de equilibrado, transferir el CO2 resultante de los matraces al fuelle
regulador de la muestra del sistema de doble entrada. Las medidas se llevan a cabo por comparación de
las relaciones isotópicas del CO2 de la muestra con las de CO2 de la solución de trabajo, situadas en el
fuelle regulador de la solución de trabajo (gas estándar de referencia: CO2). Repetir hasta que se hayan
medido todas las muestras de la serie.
8.2 Equilibrio inducido automáticamente
Con una pipeta, transferir una alícuota de la muestra o de solución de trabajo a un matraz de fondo
redondo. Los matraces que contienen las muestras se ajustan al aparato de equilibrio y se enfrían a
menos de –80 °C para que se congelen las muestras (los sistemas equipados con tubos de apertura
capilar no requieren la fase de congelado). A continuación, se produce el vacío en todo el sistema.
Una vez alcanzado un vacío estable, se distribuye CO2 procedente de la solución de trabajo en los
matraces de fondo redondo. El equilibrio se alcanza a 22 ± 1 °C transcurridas 5 horas como mínimo y, a
ser posible, con agitación suave. Dado que la duración del proceso depende de varios parámetros (por
ejemplo, la forma del matraz, la temperatura y la agitación), el tiempo mínimo requerido ha de
determinarse experimentalmente.
Una vez terminado el proceso de equilibrado, el CO2 resultante se transfiere de los matraces al fuelle
regulador de la muestra del sistema de doble entrada. El análisis se lleva a cabo por comparación de las
relaciones isotópicas del CO2 de la muestra con las de CO2 de la solución de trabajo (situadas en el fuelle
regulador de la solución de trabajo). Repetir hasta que se hayan medido todas las muestras de la serie.
8.3 Preparación manual y equilibrado automático y análisis mediante un sistema de doble entrada
acoplado al espectrómetro de masas de flujo continuo
Con una pipeta, transferir una alícuota de la muestra o de solución de trabajo (p. ej. 200 μL) a un vial. Los
viales abiertos se colocan en una cámara cerrada que contiene el CO2 utilizado para el equilibrado
(5.2.2). Después de varias purgas para eliminar todo resto de aire, los viales se cierran y se colocan en la
bandeja térmica del automuestreador. El equilibrado se alcanza después de al menos 8 horas a 40 °C.
Una vez que se ha terminado el procedimiento de equilibrado, secar el CO2 obtenido y transferir al lugar
de la muestra del sistema de inducción con doble entrada. Las medidas se realizan comparando varias
veces las relaciones del CO2 contenido en el lado de la muestra y en el lado de la solución de trabajo (CO2
gas estándar de referencia) de la doble entrada. Este procedimiento se repite hasta que se haya medido
la última muestra de la secuencia.
8.4 Equilibrio inducido automáticamente y mediante un sistema de flujo continuo
Con una pipeta, transferir una alícuota de la muestra o de solución de trabajo a un vial. Se colocan los
viales en una bandeja con control de temperatura.
Con una jeringa de gases, introducir en los frascos una mezcla de He y CO2. El CO2 permanece en el
espacio de cabeza.
El equilibrio se alcanza transcurridas, como mínimo, 18 horas, normalmente a una temperatura de 30 ± 1
°C.
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Una vez terminado el proceso, transferir el CO2 obtenido mediante el sistema de flujo continuo a la
fuente iónica del espectrómetro de masas. También se utiliza el flujo continuo para introducir el patrón
de CO2. La medida se efectúa según el protocolo propio de cada espectrómetro.
9. Cálculos
En cada serie de medidas, se registran las intensidades para m/z = 44, 45 y 46 en cada muestra y material
de referencia. El ordenador calcula, a través del software del equipo IRMS, las relaciones isotópicas
18
O/16O según lo explicado en el apartado 6.1. En la práctica, las relaciones isotópicas 18O/16O se cotejan
con una solución de trabajo previamente calibrada con respecto al V-SMOW. Durante la medida en línea,
los cambios en las condiciones instrumentales pueden comportar pequeñas variaciones. Si esto
ocurriera, se ha de corregir el valor de δ 18O de las muestras según la diferencia existente entre el valor
de la solución de trabajo y el valor asignado a δ 18O , previamente calibrado con respecto al V-SMOW. La
corrección que se aplica a las muestras varía de forma lineal con respecto al sesgo del valor de las dos
soluciones de trabajo que preceden y siguen a las muestras. La solución de trabajo se intercala al
principio y al final de cada serie. De este modo, se puede calcular la corrección para cada muestra por
interpolación entre dos valores (la diferencia entre el valor asignado y el valor medido de la solución de
trabajo).
Los resultados finales se expresan en ‰ y como valores δ18OV-SMOW.
Los valores en δ18OV-SMOW se calculan según la fórmula siguiente:
 18OV  SMOW
  18O 

 18O 
  16 
  16 

 O  muestra  O V  SMOW 


 1000 ‰


 18O 
 16 




 O V  SMOW
El valor de δ18O normalizado respecto de la escala V-SMOW/SLAP se calcula según la fórmula siguiente:
  18Omuestra   18OV  SMOW 
  55,5 ‰
18
18

O


O
V  SMOW
SLAP 

 18OV  SMOW / SLAP  
El valor δ18OV-SMOW aceptado para SLAP es de -55,5 ‰ (véase el apartado 5.1.).
10. Validación del método
Se llevó a cabo un estudio colaborativo a nivel internacional (Thomas y Jamin, 2009) para la validación
del método.
El límite de repetibilidad (r) es de 0,15 ‰ de media.
El límite de reproducibilidad (R) es de 0,54 ‰ de media.
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En el Anexo A se recogen los datos y resultados del estudio colaborativo a nivel internacional.
11. Bibliografía
OIV-MA-AS1-08: Precisión de los métodos analíticos (Resolución 5/99)
OIV-MA-AS1-09: Protocolo para la planificación, el desarrollo y la interpretación de los ensayos para la
validación de los métodos de análisis (Resolución 6/2000)
OIV-MA-AS2-12: Método de determinación de la relación de isótopos 18O/16O del agua en vinos y mostos
Protocolo IUPAC de W. Horwitz, Pure Appl. Chem. 67 (2) (1995) 331
Thomas, F., Jamin, E. (2009). (2)H NMR and (13)C-IRMS analyses of acetic acid from vinegar, (18)O-IRMS
analysis of water in vinegar: International collaborative study report. Analytica Chimica Acta, 649, 98-105
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ANEXO A
RESULTADO DEL ESTUDIO COLABORATIVO A NIVEL INTERNACIONAL
Este documento recoge los resultados del estudio de validación del método de análisis de la relación
18
O/16O en el agua del vinagre de vino (Thomas y Jamin, 2009).
El estudio se ha llevado a cabo con arreglo al documento OIV-MA-AS1-08 y OIV-MA-AS1-09.
1. Laboratorios participantes
En el estudio participaron 14 laboratorios:
Bundesinstitut für Risikobewertung, Berlín
Central Science Laboratory, York
Custom Technical Laboratory, Praga
Chemical Institute of the Hungarian Customs and Finance Guard, Budapest
Eurofins, Nantes
FEM-IASMA, San Michele all’Adige, Trento
Joint Reasearch Center, Ispra
Arbitral Agroalimentario Del MAPA, Madrid
Landesuntersuchungsamt, Speyer
Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, Wurzburg
Service Commun des Laboratoires, Burdeos
Service Commun des Laboratoires, Montpellier
Service Commun des Laboratoires, París
Unione Italiana Vini, Verona
Alemania
Reino Unido
Rep. Checa
Hungría
Francia
Italia
Italia
España
Alemania
Alemania
Francia
Francia
Francia
Italia
2. Muestras
El estudio se llevó a cabo sobre 5 muestras dobles ciegos: tres muestras de vinagre de vino (B, C, D), una
muestra de vinagre de alcohol (A) y una muestra de vinagre de vino con un 20% de A (Thomas y Jamin,
2009).
Para cada muestra, se analizó el 18C del agua. Los resultados se indican en la tabla siguiente.
3. Evaluación estadística
Los cálculos estadísticos se realizaron con arreglo al protocolo OIV-MA-AS1-09, que se basa en el
protocolo IUPAC de Horwitz. Los valores atípicos se eliminaron de la siguiente forma: prueba de Cochran
para eliminar a los laboratorios con mayor varianza, prueba de Grubbs individual o por pares para los
valores atípicos individuales o individuales por pares, después, una nueva prueba de Cochran, etc.
manteniendo una proporción de valores atípicos <2/9. La desviación estándar para la repetibilidad (sr) y
la reproducibilidad (sR) de cada material se calcula a partir de los pares de resultados válidos de los
dobles ciegos.
Para obtener más datos, consulte la publicación de Thomas y Jamin, 2009.
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Descripción Núm. de
de la
resultados
Núm. de
muestra
válidos
repeticiones
A
8
2
B
8
2
C
8
2
B+20 %A
8
2
D
5
2
Media
δ18C (‰)
-6,96
-0,86
-1,38
-1,79
-1,23
sr (‰)
0,06
0,08
0,02
0,05
0,05
Límite de
repetibilidad
r (2,8×Sr) ‰
0,17
0,22
0,06
0,14
0,14
sR (‰)
0,22
0,21
0,2
0,2
0,14
Límite de
reproducibilidad
R (2,8× SR) ‰
0,62
0,59
0,56
0,56
0,39
El límite de repetibilidad medio (r) es de 0,15 ‰ y el límite de reproducibilidad medio (R) es de 0,54 ‰,
por lo que son comparables con los observados en el alcohol del vino (OIV-MA-AS2-12).
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