La Expresión de Fas en Medula Osea Injuriada con Taxol se

Resumen: M-061
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2005
La Expresión de Fas en Medula Osea Injuriada con Taxol
se Relaciona con Apoptosis y Proliferación
Todaro, Juan S. - Juaristi, Julián A. - Aguirre, María V. - Alvarez, Mirta A. - Brandan, Nora
Cátedra de Bioquímica-Facultad de Medicina-UNNE.
M.Moreno 1240. (3400). Corrientes. Argentina.
[email protected]
Antecedentes
La hematopoyesis que incluye proliferación y diferenciación de varios tipos de células progenitoras en médula ósea,
está regulada para mantener una adecuada producción de células sanguíneas maduras. Esta regulación, es producto de
un balance entre proliferación y apoptosis de las células precursoras (Koury 1992), dependiendo de la presencia de
factores de crecimiento (Debatin, 2000). Fas (CD95/Apo-1), es una proteína transmembrana de tipo I, miembro de la
superfamilia de receptores de TNF, denominados "Receptores de muerte", constitutivamente expresados en varios tipos
de células pudiendo ser inducidas por estímulos apropiados, (Nagata l995; Ming 1999).Varias drogas citotóxicas usadas
en quimioterapia evidenciaron que la activación de Fas y su ligando (FasL), contribuyen a la muerte celular inducida
por drogas (Fulda 1997). Taxol, droga ampliamente utilizada en oncología, induce apoptosis in vitro en diferentes
líneas celulares (De María 1999) e in vivo en diferentes tejidos (Park, K. 2004) incluidos la médula ósea (Romero
Benitez 2004), aunque hasta el momento no son bien conocidos los caminos involucrados en la actviación del
programa de muerte celular.
El objetivo de este estudio fue analizar in vivo la apoptosis inducida por Taxol y relacionar la expresión de Fas
(CD95/Apo-1), durante la recuperación hematopoyética.
Materiales y Métodos
Animales: Ratones hembra de la cepa isogénica Swiss CF-1 de tres meses (peso: 26-28 g, n=4 ratones por lote). Se
siguieron las normativas internacionales GLP (Good Laboratory Practices) para el uso de animales de experimentación.
Drogas: Paclitaxel (Taxol®, Bristol Myers Squibb).Una dosis total de 29 mg/kg (equivalente a una dosis humana de 97
mg/m2) via intra peritoneal. Las muestras de médula ósea fueron tomadas a 0,1,2,3,4,5,6,7 y 10 días post-administración
de Taxol (Paclitaxel, Px).
Eritropoyetina recombinante humana (Epo) Hemax 2000, Biosidus, Argentina, para los ensayos clonogénicos.
Anticuerpos: Anticuerpos Primarios: anti Fas policlonal. (Santacruz, Biotech) (Santa Cruz Biotechnology Inc; Ca USA)
Anticuerpos Secundarios: IgG goat anti-rabbit , IgG goat anti-rat marcadas con HRP para westernblotting (Jackson
Immunoresearch Inc, Canada).
Determinación de celularidad: Las muestras de Médula Ósea (M.O.) de cada día del esquema experimental fueron
obtenidas por flusheo de los fémures con 500µl de buffer PBS. Se determinó el recuento celular en cámara de Nebauer,
utilizando diluciones en solución de Turk (1/20), por triplicado. Los resultados se expresaron como promedio de células
nucleadas por fémur x 106 ± SEM.
Obtencion de lisados de tejido hemopoyetico: Las suspensiones de médula ósea provenientes de ratones con y sin
incubación previa con Epo rh fueron centrifugadas a 700 rpm por 5 minutos y lavadas con PBS. Los pellets obtenidos se
trataron con buffer RIPA por 20 minutos en baño de hielo. Se procedió a romper las células a través de pasaje por
agujas de diámetro decreciente, realizando por último una centrifugación refrigerada a 14000 rpm por 20 minutos
recuperando los sobrenadantes y conservados a -20ºC.
Electrotransferencia: La electrotransferencia se realizó utilizando soporte de membrana de nitrocelulosa en buffer de
transferencia. La calidad de la electrotransferencia se evaluó con la tinción reversible convencional de rojo Pounceau S.
Inmunodetección: Tanto para los lavados como para la preparación de anticuerpos y solucion bloqueante , se trabajó
con buffer TBS-T ( 50mM Tris-ClH, 150mM NaCL, 0,05% Tween pH7,5). El electroblotting preincubado toda la
noche con agitación a 4ºC en solución bloqueante (5% leche descremada en TBS-T), lavado con TBS-T e incubado con
el anticuerpo secundario, diluido en solucion bloqueante, durante 1h, a temperatura ambiente y nuevamente lavado con
el buffer correspondiente.
El revelado se realizó con 4 cloronaftol sustrato diluido en buffer TBS(Tris-NaCl,pH 7,5) y H2O2 (Opti4CN Bio Rad)
Las bandas obtenidas correspondiente a las proteínas de interés, fueron semicuantificadas utilizando el software Scion
Image 3.0.
Detección de Apoptosis: Extendidos de médula ósea fijados con formaldehido al 4% fueron teñidos con el kit de
Apoptosis de fluoreceína, Apototag (Intergen Co; NY) de acuerdo a las instrucciones del fabricante y observados con
microscopio de fluorescencia. Los núcleos apoptóticos fueron identificados por su tinción verde flourescente en contrate
con la flouresencia roja del iduro de propidio de las células no apoptoticas. El porcentaje de células apoptoticas fue
calculado a partir de 5 a 10 campos en cada extendido.
Imágenes y analisis estadístico: Los blottings escaneados y analizados usando Scion Image 3.0(NHS USA). Los
resultados fueron analizados utilizando el Software INSTAT y PRISM versión 2.0 (Graph Pad Software,San Diego,Ca
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USA), considerando estadísticamente significativo un p < 0.05. (*p<.05, **p<.01, ***p<.001). Los gráficos obtenidos
fueron analizados mediante el uso del software Graph Pad Prism. Para los estudios de correlación se utilizó el test de
Spearman.
Células nucleadas X 106/ fémur
Discusión de Resultados:
Celularidad: La celularidad total en la médula ósea decrece 3,7 veces (p <.05) a partir del día 1 post paclitaxel (29
mg/kg ) comparados con los valores control y permanece disminuido durante los próximos 3 días (p<.05). A partir del
día 5 y hasta el fin de la experiencia la celularidad retorna a los valores normales. Los resultados se muestran en la
figura 1.
Fig. 1. Celularidad en M.O.
25
Celularidad en M.O.
20
15
10
5
0
0
3
5
8
10
Días post Tx.
Figura 1.
Efecto de Taxol sobre la celularidad de médula ósea. Los resultados se expresan como la Media ± SEM de tres
diferentes experiencias (6 ratones por lote).
Apoptosis: Se utilizó la técnica del TUNEL para cuantificar apoptosis en células de M. O. seguida a la injuria con Taxol
(Fig 2). El porcentaje de apoptosis fue máximo al día 1 (24 ± 0,81 % , p<.01) , unas cinco veces mayor que el control
(4,85 ± 0.74 %). Estos valores decrecen progresivamente al día 2 (12,32 ± 0.80 %, p<.01 ) y retornando a los valores
control a partir del día 3 (3,08 ± 0,61 %) y hasta el final de la experiencia.
Fig. 2. Porcentaje de Apoptosis post Tx
**
25
Apoptosis (%)
20
15
**
10
5
0
0
1
2
3
4
Dias
5
6
7
10
Figura 2.
Efecto de Taxol sobre la apoptosis en médula ósea en porcentaje de células apoptóticas en relación al total de células
nucleadas. Los resultados se expresan como la Media ± SEM de tres diferentes experiencias indicando diferencias
entre el control y los animales pretratados
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Expresión de Fas (CD 95 , APO- 1)
A cada día del protocolo experimental se determinó en células de M.O. por westernblotting la expresión de Fas con y
sin incubación con Epo-rh (UI/ml) Fig 3A y 3B. En ambos casos la expresión de Fas se incremento significativamente
entre el día 1 y 2. A partir del día 3 la expresión de Fas desciende por debajo de los valores normales hasta el fin de la
experiencia (p< .01)
Expresión de Fas en U.A.
Fig. 3. A. Expresión de Fas en M.O. en función del tiempo post Tx
60
**
50
Fas post Tx con Epo
**
40
**
30
** **
20
**
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
10
Días post Tx
Fig. 3. B. Expresión de Fas en M.O. en función del tiempo post Tx.
Expresión de Fas en U.A.
40
**
Fas post Tx sin Epo
30
** ** **
20
**
** **
6
7
10
0
0
1
2
3
4
5
Días post Tx
10
Figura 3.
Efecto del Taxol sobre la expresión de Fas en médula ósea, los resultados se expresan en unidades arbitrarias
como la Media ± SEM de tres diferentes experiencias. A. Sin incubación con Epo rh. B. Con incubación con Epo
rh. (U.A.=Unidades densitométricas del westernblott /µ g de proteína por well)
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Correlación entre la expresión de Fas y la celularidad de M.O.: Se relaciona la expresión de Fas con el número de
células nucleadas totales en M.O. post tratamiento con Taxol. En la figura 4 , se observa el alto grado de coarrelación
entre ambas variables (r = - 0,9756). Estos resultados indican que durante las 48 horas siguientes a la administración del
citotóxico el bajo número de células sobrevivientes en M.O., sobrexpresan Fas, en concordancia con la mayor
apoptosis, mientras la baja expresión de Fas es concordante con el incremento de la proliferación y la recuperación
hemopoyetica
6
60
40
50
30
40
30
20
20
10
10
0
Celularidad
U. A. Fas
Unidades Arbitrarias
Celularidad X10 / Fémur
Fig. 4 Correlación entre expresión de Fas y Celularidad de M.O.
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Dias post Tx
Figura 4.
Relación entre la expresión de Fas y la celularidad de la médula ósea.
Conclusiones
- La médula ósea injuriada con taxol produce entre los días 1 y 2 la máxima caída de la celularidad femoral
simultáneamente con el mayor porcentaje de apoptosis e incremento en la expresión de Fas.
- El descenso en la expresión de Fas a partir del día 3 se relaciona con un aumento de la proliferación celular
involucrada en la recuperación hematopoyetica que se evidencia a partir del día 5.
- Estos resultados refuerzan la hipótesis de un feed back regulatorio negativo entre las células maduras e
inmaduras hematopoyeticas, pudiendo representar el sistema Fas-Fas-L un mecanismo de control apoptótico en
la homeostasia de médula ósea.
Bibliografía
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