HIDROXILACION DE LA PROLINA Y DE LA LISINA EN LA

Arch.
N ? 13
Biol. M e d . E x p e r . 1:122-130,
1964
HIDROXILACION DE LA PROLINA Y D E LA LISINA EN LA BIOSINTESIS DE
COLÁGENO (*)
Proline and lysine hydroxylation in collagen biosynthesis.
ALFONSO
Instituto
CORONADO, ELVIRA
de Química
Fisiológica
MARDONES
y Patológica,
Escuela
y
JORGE
de Medicina,
ALLENDE.
Universidad
de
Chile.
R e c i b i d o para su p u b l i c a c i ó n el 2 2 de A b r i l de 1 9 6 4 .
RESUMEN
En
un
sistema
libre
de
células
que
contiene
amino-acil-sRNA-sintetasas
(enzimas de p H 5 ) y ácido ribonucleico de transferencia
embriones
de pollo
y prolina-C
11
se
aisla
un
(sRNA)
obtenidos de
1J
aminoacil-C -sRNA. El
análisis
cromatográfico de los productos de la hidrólisis alcalina de este compuesto demostró la presencia de prolina y de hidroxiprolina marcadas. L a hidroxiprolina
representó el 2 0 % del total de la actividad incorporada en el
Experimentos
de hidroxilisina
en el
análogos
realizados
con
lisina-C
11
sRNA.
demostraron
en proporción de un 5 % del total de la actividad
la
aparición
incorporada
sRNA.
El s R N A
del hígado de rata y de la levadura en iguales
condiciones
que
11
el s R N A de e m b r i ó n de pollo se m u e s t r a n capaces de incorporar l i s i n a - C , pero
no se obtiene
el hidroxiaminoácido
correspondiente.
En condiciones anaeróbicas, la hidroxilación de la prolina d i s m i n u y ó a m e nos de un
5 % . El p r o l i l - s R N A aislado
en
estas condiciones
y reincubado
en
presencia de oxígeno en el sistema de embrión de pollo mencionado, se mostró
susceptible
de ser hidroxilado, en tal forma que se obtuvo prolina e h i d r o x i -
prolina en proporción semejante a los
testigos.
Estos resultados sugieren que los procesos de hidroxilación de la prolina y de
la lisina que ocurren en la biosíntesis del colágeno, tienen un lugar en la etapa en
que estos aminoácidos se encuentran unidos al s R N A y que esta hidroxilación es
dependiente
de un s R N A
específico
q u e se encuentra
en las preparaciones
de
e m b r i ó n de pollo y no en las otras preparaciones ensayadas. Estos resultados hacen pensar en que existen p o r lo m e n o s dos s R N A para la prolina y dos para la
lisina y que sólo uno de ellos permite la hidroxilación. Esto implicaría una a m bigüedad de uno de los codones en la clave genética de la prolina y de la lisina,
el cual podría
incorporar indiferentemente
el
aminoácido
o su
respectivo
hi-
droxiaminoácido.
INTRODUCCIÓN
mente se demostró que la hidroxiprolina
N
era veinte veces menos efectiva que
la prolina como precursora de la hidroxiprolina del colágeno ( 2 ) . Estos hechos,
que han sido ampliamente confirmados
por diferentes autores (3, 4, 5 ) , indican
que la hidroxiprolina del colágeno deriva esencialmente de la prolina sin pasar
per el estado de hidroxiprolina libre.
La importancia de este descubrimiento
reside en que constituye una excepción
ir>
Hace algunos años Stetten et al (1)
encontraron que en ratas jóvenes la administración de prolina N
determinaba
la aparición de hidroxiprolina marcada
en las proteínas' corporales. Posterior1 5
es
.
Esta investigación fue financiada,
en parte, por
la F a c u l t a d
de M e d i c i n a .
Universidad
de
Chile
(Proyecto
6 2 - 2 6 ) y p o r la F u n d a c i ó n
Rockefeller
( G r a n t 60038), s e g ú n u n programa c o n j u n t o , y en
p a r t e p o r la J a n e C o f f i n C h i l d s M e m o r i a l
Fund
for M e d i c a l Research, Proyecto 64.
A b r e v i a t u r a s que aparecen en e l t e x t o :
ATP,
adenosin
5' trifosfato;
C T P , citidin
tano; D N a s a , desoxiribonucleasa;
sRNA,
ácido
ribonucleico
5' tiifosfato; T R I S ,
R N a s a , ribonucleasa; m R N A ,
ro; P E P , fosfoenolpiruvato; P E P k i n a s a ,
tris
de
transferencia;
(hidroximetil)-aminome-
ácido ribonucleico
fosfoenolpiruvatoquinasa.
mensaje-
HIDROXILACIÓN
DE L A
con respecto a lo que se observa generalmente en la síntesis de proteínas, la que
se realiza comúnmente a partir de los
aminoácidos libres q u e las constituyen
( 6 ) . El único caso semejante hasta ahora encontrado es la hidroxilisina del colágeno, la que se forma a partir de lisina
y no de la hidroxilisina libre ( 7 , 8 ) .
La mayor parte de los trabajos mencionados han sido realizados en animales
enteros, pero en los últimos años se ha
trabajado con éxito sistemas in vitro, utilizando preparaciones tales como cortes
de tumor inducido por carrageenan en
cobayos ( 9 ) , cortes de cartílago ( 1 0 ) y
más recientemente Peterkofsky et al. (11,
12, 13, 14) han informado de un sistema
libre de células obtenido de embrión de
pollo capaz de hidroxilar e incorporar la
prolina en una proteína que tiene muchas propiedades físicas y químicas semejantes al colágeno.
Como todos los trabajos mencionados
son concordantes en el sentido que tanto la hidroxiprolina c o m o la hidroxilisina
libres no constituyen intermediarios en
la síntesis del colágeno, es necesario aceptar que sus precursores, la prolina y la
lisina, deben hidroxilarse en alguna de
las etapas del proceso de síntesis.
Estudios recientes parecen demostrar
que la molécula de colágeno se sintetiza
de acuerdo con el esquema propuesto para la biosíntesis de las proteínas en general (9, 11, 12, 13, 1 4 ) . Por lo tanto, la
hidroxilación podría suceder ya sea cuando el aminoácido ha sido activado y se encuentra formando parte del complejo
aminoacil-adenilato-enzima, ya sea cuando ha sido transferido al ácido ribonucleico soluble formando un aminoacil-sENA
o, por último, cuando ha sido incorporado en la cadena polipeptídica.
Respecto a esta última posibilidad, se
ha tratado infructuosamente de encontrar
una proteína o polipéptido semejante al
colágeno pero sin hidroxiprolina (15, 1 6 ) .
Sin embargo, trabajos recientes de Peterkofsky et al. ( 1 4 ) parecen demostrar
indirectamente que la hidroxilación de la
prolina durante la síntesis del colágeno
podría suceder después de su incorporación en la cadena polipeptídica.
Por otra parte, los estudios acerca de
la incorporación de prolina en el colágeno del granuloma producido por carrageenan en cobayos escorbúticos (17, 1 8 ) .
así como la presencia de hidroxiprolina
no unida a proteína, que se observa durante la inhibición que ocasiona el Corti-
PROLINA
Y
123
LISINA
sol en la biosíntesis del colágeno en cortes de cartílago ( 1 0 ) y durante la inhibición que produce la puromicina sobre
la síntesis del colágeno en tejido óseo en
animales enteros ( 1 9 ) , sugieren fuertemente que la hidroxiprolina se encuentra unida a un intermediario en una etapa previa a la formación de la molécula
de colágeno.
Finalmente, Manner y Goul Í 2 0 ) , Kalf
(21) y nuestro grupo (22, 23, 24, 25)
han informado haber aislado en un sistema de embrión de pollo un hidroprolilsRNA y un hidroxilisil-sRNA, a partir de
prolina y lisina marcadas con C \
M A T E R I A L Y MÉTODOS
Los embriones de pollo fueron donados
gentilmente por el Departamento de V i r o l o gía de la Escuela de Medicina de la U n i v e r sidad de Chile.
E l A T P , el glutation reducido, el T R I S
( S i g m a 1 2 1 ) y la ninhidrina se obtuvieron de
S i g m a C h e m i c a l C o ; la p r o l i n a - C
(33 m e /
m m o l e ) , de N u c l e a r Chicago Corp; la lisinaC " ( 1 4 0 m c / m m o l ) , de Schwartz Bio R e search Inc.: la prolina, la hidroxiprolina, la lisina y la hidroxilisina, de M a n n C h e m i c a l
Co; e'í 2-MercaptoetanoI, de Eastman K o d a k
C o ; el acetato de magnesio, el n-butanol, el
ácido acético, el fenol y el resto de los reactivos generales, de E. M e r c k , y la resina
D o w e x 5 0 - x 8 , de B i o - R a d Laboratories.
14
Preparación
de enzimas de pH 5. Todas las
operaciones se realizaron entre 0 y 4 ° C . E n
cada preparación se emplearon 12 a 30 e m briones de pollo de 9 a 12 días cuyo peso
varió entre 2 y 5 g.
Inmediatamente después de extraídos, los
embriones se lavaron con mezcla de h o m o genización y se homogenizaron en u n aparato Lourdes durante 30 segundos con dos
v o l ú m e n e s de la siguiente m e z c l a : amortiguador T R I S p H 7,8 0,01 M ; acetato de m a g nesio 0,01 M ; cloruro de potasio 0,06 M , y
mercaptoetanol 0.006 M . El homogenizado se
centrifugó a 3 0 . 0 0 0 g durante 30 minutos. E l
sobrenadante de esta centrifugación se centrifugó nuevamente a 1 0 5 . 0 0 0 g durante 120
minutos. Este nuevo sobrenadante se precipitó a p H 5.2 con ácido acético 1 N , y se
centrifugó a 3 0 . 0 0 0 g durante 30 minutos. El
precipitado de esta centrifugación se juspendió con un h o m o g e n i z a d o r m a n u a l de vidrio
en la siguiente m e z c l a : amortiguador T R I S
p H 7,8 0.01 M , acetato de magnesio 0,01 M ,
cloruro de potasio 0,06 M , y glutation 0,03
M . El p H se ajustó a 7,5 con amortiguador
T R I S p H 7,5 2 M .
o
La concentración final de proteína de
preparación fue de 20 a 2 5 m g por m i .
la
Preparación
de sRNA.
S e extrajo de embriones de pollo de 12 días de edad, aplicando el procedimiento propuesto por Rosenb a u m y B r o w n ( 2 6 ) con las siguientes m o d i ficaciones: la preparación después de la ex-
124
A.
CORONADO,
E. M A R D O N E S
tracción con fenol se precipitó con dos volúmenes de etanol 9 5 % a - 2 0 ° C , se dejó durante 6 horas a -20"C y se centrifugó a 15.000 g
durante 2 0 minutos. E l precipitado se extraj o con cloruro de sodio 1 M a 0 ° C durante la
noche, luego se centrifugó a 15.000 g y el
sobrenadante se precipitó n u e v a m e n t e con
etanol 9¡5>% a - 2 0 C . Se dejó durante 6 horas a p r o x i m a d a m e n t e a -20" y se centrifugó
en la f o r m a ya indicada. Este último precipitado se secó y se disolvió en agua bidestilada y se digirió con D N a s a ( 2 0 \ig por m i )
durante 3 0 minutos a la temperatura a m biente. F i n a l m e n t e se dializó contra agua
bidestilada durante la noche.
L a concentración de la solución se determ i n ó por su densidad óptica a 2 6 0 m u , aceptando que 20 unidades de D . O . equivalen a
1 m g de s R N A por m i de solución.
U
Mezcla de incubación.
Las incubaciones se
llevaron a cabo directamente en los tubos de
centrífuga a 3 7 ° C durante 30 minutos. E l v o l u m e n de incubación varió en los diversos
experimentos.
Cada mililitro de la mezcla contenía las
siguientes cantidades de substancias: a m o r tiguador T R I S p H 7,0, 30 umoles; A T P , 2
inmoles; acetato de magnesio, 5 umoles; glutatión, 2 umoles; s R N A , 1 m g y enzimas de
p H 5 entre 6 y 10 m g .
L a concentración y la actividad específica
de la prolina C * y de la lisina C fueron diferentes en los diversos experimentos.
L a reacción se detuvo al final del tiempo
de incubación agregando dos v o l ú m e n e s de
una solución fría de etanol al 6 7 % con cloruro de sodio 0,5 M . L a mezcla se centrifugó
a 15.000 g durante 15 minutos a 0 ° C y el
precipitado se lavó por resuspensión cuatro
veces en la solución etanol-sal.
E l precipitado final se disolvió en hidróxido de a m o n i o 1,5 N y en una alícuota de esta
solución se midió la radioactividad en un contador de flujo.
En algunos experimentos, la incubación se
detuvo con fenol saturado en agua y se siguió el método de Gierer y S c h r a m ( 2 7 ) para extraer el R N A de la preparación.
1
1 4
Separación
y medición
de prolina e hidroxiprolina.
E l precipitado final obtenido de la
incubación se hidrolizó con hidróxido de
amonio 2 N a 3 7 ° C durante 2 horas. Posteriormente, previa neutralización con ácido
clorhídrico, se precipitó con la solución etanol-sal antes mencionada y con la m i s m a solución se lavó por resuspensión hasta que no
existiera radioactividad en los sobrenadantes.
El precipitado se disolvió n u e v a m e n t e en
hidróxido de a m o n i o y una alícuota se colocó en el contador para comprobar que no
existía radioactividad. En caso contrario, la
operación se repitió hasta obtener ausencia
de radioactividad.
L o s sobrenadantes de la precipitación y de
los lavados se juntaron y se evaporaron a
sequedad; luego se disolvieron en a p r o x i m a damente 5 m i de agua bidestilada y se acidificaron a p H 2,0 con ácido clorhídrico 0,1 N .
S e agregaron c o m o portadores, prolina e hidroxiprolina no marcadas, 10 umoles de ca-
Y J.
ALLENDE
da una, y se les retiraron las sales en una
columna de D o w e x 5 0 - X 8 f o r m a H de la
cual se eluyeron con hidróxido de amonio
2N. Este eluido se v o l v i ó a concentrar por
evaporación y se sometió a cromatografía en
papel.
Para la cromatografía se usó papel W h a t m a n N 1 y como solvente una mezcla de nbutanol, ácido acético, agua ( 6 3 : 27 : 1 0 ) .
Se corrió en forma descendente durante 12
horas. Previo revelado e identificación por
medio de ninhidrina e isatina de los testigos
marginales, que dieron R 0,41 para prolina
y R 0,27 para hidroxiprolina, el papel se
cortó en bandas y se eluyó con agua bidestilada durante la noche. Los eluídos se concentraron por evaporación y su radioactividad
se midió en un contador de flujo.
f
f
En otra serie de experimentos, los sobrenadantes desprovistos de sales y concentrados fueron analizados con respecto a su contenido de prolina e hidroxiprolina, usando
una columna de D o w e x 5 0 - X 8 forma N a + según el m é t o d o de M o o r e y Stein ( 2 8 ) .
La recuperación final del n ú m e r o total de
cuentas medidas inicialmente en los sobrenadantes fue, en todos los experimentos, alrededor de un 50 %. Sin e m b a r g o , en las cromatografías en papel el n ú m e r o de cuentas
eluídas de las bandas correspondientes a las
manchas de prolina e hidroxiprolina representaban el 9 4 % del total de cuentas recuperables de todo el papel.
Separación
y medición
de lisina e
hidroxilisina. En los experimentos con lisina se procedió esencialmente con igual metodología,
sólo que en la separación final de los aminoácidos se usó el método de Piez ( 2 9 ) .
RESULTADOS
Estudio del sistema
de
incubación.
A l comienzo de este trabajo se partió
de los datos publicados por Berg et al.
(30) acerca de la incorporación de aminoácidos en el ácido ribonucleico de transferencia; pero ensayos progresivos nos indujeron a modificar el sistema adaptándolo a las condiciones óptimas para embrión de pollo, que son las que aparecen
expuestas en Material y Métodos.
La actividad de las enzimas de pH 5
varió en las diferentes preparaciones; pero, en general, se obtuvo una carga de
0,03 a 0,12 mumoles de aminoácidos marcados por miligramo de sRNA. Hay que
considerar, sin embargo, que las preparaciones enzimáticas contienen una cantidad apreciable, que no hemos determinado, de prolina, lo que implica una dilución del isótopo y, por otra parte, la
preparación de sRNA de embrión de pollo puede no ser lo suficientemente pura,
HIDROXILACIÓN
DE
lo que induciría a error en la apreciación
de la cantidad colocada en el sistema.
En estas condiciones, considerando como 100 la actividad máxima del sistema,
la incorporación de radioactividad en el
material precipitable con etanol depende
esencialmente de la preparación de enzimas de pH 5, del sRNA agregado y del
A T P . (Tabla I ) . La pequeña cantidad
de cuentas incorporadas en ausencia de
sRNA adicionado, puede atribuirse a la
presencia de sRNA en la preparación de
enzimas de pH 5, lo que es un hecho conocido ( 3 1 ) . P o r este motivo se practicó
una incubación en presencia de RNasa,
y no se encontraron cuentas detectables
en el material precipitado.
Formación
de
hidroxiprolil-sRNA.
LA
PROLINA
1 4
TABLA
I
125
LISINA
TABLA
II
1 4
Hidroxilación
de Prolina C
en
de Embrión de Pollo.
Prolina
c.p.m.
el
Sistema
Hidroxiprolina C "
c.p.m.
Hidroxiprolina
20,2
Experimento 1
552
140
Experimento 2
171
30
18,5
Experimento 3
623
158
20,0
1944
4
0,2
Testigo
(Sobrenad a n t e d e la i n c u bación )
Medio de
incubación
TRIS
7,0
30,0
5,0
(¿moles;
pH
magnesio
En los primeros experimentos realizados se usó una prolina C de una actividad específica de 10,8 y el sRNA marcado
se aisló por el método de Gierer y Schram
ya mencionado, con el objeto de reconocer que el producto marcado obtenido en
la reacción se comportaba como ácido ribonucleico. (Tabla II, experimentos 1 y
2 ) . Sin embargo, la gran pérdida de
marcación, comparada con la radiactivi-
Y
(10,8 m c / m m o l )
en
experimento
rie
pH
5 : 4,0 a
Volumen
en
20
ATP
glutation
u
6,0
2,0
2,0
experimentos 1
3, 1,2 m m o l e s ;
incubado,
Incubación,
(contenido por m i ) :
(¿moles;
amortiguador
(¿moles;
(¿moles;
y 2,
sRNA
(33
acetato
prolina
de
C"
mc/mmol)
1,0 m g ;
enzimas
mg.
10,0
minutos
mi.
a 37"C.
dad del producto aislado por precipitación con la solución de etanol-sal, nos hizo
desistir del método de extracción por fenol.
El análisis de la hidrólisis alcalina del
producto formado, aislado por uno u otro
método, dio resultados equivalentes, encontrándose en la hidroxiprolina C
aproximadamente el 20% del total de las
cuentas recuperadas.
1 4
1
Incorporación
de Prolina-C *
en Acido
Ribonucleico
de
Transferencia.
Incorporación
M e d i o de i n c u b a c i ó n
Formación
de
hidroxilisil-sRNA.
%
Sistema completo
Los experimentos ya descritos fueron
repetidos usando lisina C * de 140 m e /
mmol. Se encontró hidroxilisina C " equivalente a un 5% del total de las cuentas
recuperadas. (Tabla I I I ) .
100
(*)
S i s t e m a c o m p l e t o sin A T P
50
Sistema completo sin PEP,
PEPkinasa
Sistema completo sin A T P , PEP,
91
PEPkinasa
0
Incorporación
e hidroxilación de lisina
C
en sRNA de diferentes
orígenes.
92
Sistema completo sin C T P
1 4
Sistema completo sin s R N A
5
Sistema completo con RNasa
0
(")
Sistema
dor
TRIS
de
u
magnesio
moles;
C
1 1
(3S
pollo
6
completo
pH
1,0
7,0
5,0
L t
30,0
moles;
PEPkinasa
mc/mmol)
mg;
(contenido
(¿moles;
20,0
1,2
enzimas
glutation
^g;
CTP
mamóles;
de
pH
mg.
Volumen
incubado,
Incubación,
1,0
30 m i n u t o s
mi.
a 37"C.
por
ATP
5
mi):
2
amortigua-
(¿moles;
2,0
^moles;
0,8
¡¿moles;
sRNA
de
de
acetato
PEP
prolina
embrión
embrión
4,2
de
de
pollo
Estudiando la especificidad del sistema
con relación al sRNA de diferentes orígenes, se encontró que el sistema de embrión de pollo era capaz de incorporar
lisina C en el sRNA de levadura, obtenida del comercio, y que, por el contrario, el sRNA d e hígado de rata incorporaba muy poco o nada. El sRNA obtenido
de estas incubaciones se analizó previa
hidrólisis alcalina, y no se encontró hi1 4
126
A.
TABLA
Hidroxilación
CORONADO,
E.
MARDONES
de Lisina C
Embrión
de
en el Sistema
Pollo.
J.
ALLENDE
aparecía en presencia de RNasa. Tratando de analizar este hecho, se incubó
sRNA de levadura con una preparación
de enzimas de pH 5 de hígado de rata. La
incorporación de lisina-C fue muy eficiente, pero no se encontró hidroxilisina
en el análisis del producto final formado.
El lisil-C -sRNA se extrajo con fenol y
se reincubó con el sistema de enzimas de
pH 5 de embrión de pollo, en presencia
de un exceso de lisina no marcada y tampoco se encontró hidroxilisina-C . (Tabla I V ) .
Finalmente se incubó la preparación
de enzimas de pH 5 con el resto del sistema en presencia de RNasa y no se encontró incorporación en el precipitado
final de la incubación, ni se detectó hidroxilisina en el sobrenadante.
III
1 4
Y
de
14
Lisina
C"
c.p.m.
Hidroxilisina
l í
r
r
14
Experimento 1
9100
480
5.0
Experimento 2
183.11
972
5,4
10000
o
o
por m i ) :
amortiguador
Testigo
dante
de
Medio
TRIS
la
incu-
de i n c u b a c i ó n
de
(contenido
p H 7,0 3 0 , 0 p i n o l e s ;
moles;
(140
14
(Sobrena-
bación)
u
Hidroxilisina C
c.p.m.
acetato
mc/mol)
p H 5 : 3,6
Volumen
de
1,64
magnesio
m moles;
u
u
5,0
moIes;
u
sRNA
glutatión
moles;
1,0
lisina
mg;
2,0
C
1 4
enzimas
14
Obtención de un prolil-C -sRNA
en condiciones anaeróbicas y su hidroxilación en
presencia de oxígeno.
mg.
incubado,
Incubación,
A T P 2,0
10,0 m i .
30 m i n u t o s
a 37"C.
Como se sabe que el sistema hidroxilante de la prolina, presente en los cortes
de tejidos, utilizaba O " molecular en el
proceso de hidroxilación (17, 32, 3 3 ) , se
estudió el efecto de la anaerobiosis en el
sistema descrito.
La incubación se hizo en tubos de
Thumberg llenos con helio.
Los resultados demostraron que en
anaerobiosis la aparición de la hidroxiprolina unida a sRNA fue sólo aproxima-
droxilisina marcada, aunque en el caso
de los experimentos realizados con sRNA
de levadura se logró detectar una pequeña cantidad de hidroxilisina-C , la que
se atribuyó a la presencia del sRNA de
embrión de pollo en las preparaciones de
enzimas de pH 5. En efecto, en los experimentos con prolina-C habíamos observado que en ausencia de sRNA de embrión de pollo se incorporaba cierta cantidad de aminoácido marcado que des14
14
TABLA
Incorporación
e Hidroxilación
de Lisina
Sistema de incubación
sRNA
E m b r i ó n de pollo
IV
1
C * en sRNA
Lisina C
c.p.m.
1 4
de Diferentes
Hidroxilisina C
c.p.m.
Orígenes.
1 1
Hidroxilisina
%
Enz. p H 5
E m b r i ó n de pollo
18311
972
5,4
0,9
Levadura
E m b r i ó n de pollo
20000
180
Levadura
H í g a d o de rata
49340
0
0
E m b r i ó n de pollo
12500
0
0
LisilC"-sRNA
(levadura)
Medio de incubación (concentración por m i ) : amortiguador T R I S p H 7,0 30,0 umoles; A T P
2,0 umoles; acetato de magnesio 5,0 timóles; glutatión 2,0 umoles; lisina C ' ( 1 4 0 m c / m m o l )
1,64 mumoles; s R N A 1,0 m g ; enzimas de p H 5 : 3,6 m g . En el último experimento se agregó
lisina no marcada 1,0 umol.
Incubación: 30 minutos a 37°C.
1
HIDROXILACIÓN
TABLA
1 1
1623
58
3,4
1172
31
2,5
Experimento 3
2197
87
3,8
623
158
Medio
de
tato
incubación
prolina
(concentración
T R I S p H 7,0 30,0 ( ¿ m o l e s ;
de
magnesio
C
enzimas
Volumen
1 4
de
5,0
5 : 6,0
incubado,
Incubación,
[¿moles;
(33 m c / m m o l )
pH
1.2
por
mi):
amorti-
A T P 2,0 ¡ ¿ m o l e s ;
glutatión
m moles;
l t
10,0
2,0
sRNA
u
ace-
moIes;
1,0
mg;
de Prolil C -sRNA
en el
de Embrión
de Pollo.
Prolina
C"
c.p.m.
Aminoacil
C
-sRNA
VI
1]
Hidroxilación
Sistema
Hidroxiprolina C
c.p.m.
Hidroxiprolina
1 4
%
Obtenido en incubación
anaeróbica
2197
87
3,8
R e i n c u b a d o en c o n diciones aeróbicas
893
284
24,0
Medio
de
guador
tato
incubación
de
magnesio
prolina
no
•1,0
enzimas
mg;
damente u n " 5 % del total de cuentas recuperadas, mientras que en los testigos
incubados en condiciones aeróbicas se encontró aproximadamente 2 0 % . (Tabla V ) .
La incorporación de prolina-C
en el
sRNA en anaerobiosis fue, sin embargo,
igual o superior a la que se observó en
los testigos. De esta manera pudimos obtener un aminoacil-sRNA marcado con
prolina-C y con baja proporción de hidroxipro lina-C .
El prolil-C -sRNA aislado se reincubó
con el sistema de embrión de pollo en
condiciones de aerobiosis y con un exceso
de prolina no marcada, comprobándose
que la prolina-C unida al sRNA podía
hidroxilarse, pues se obtuvo una alta proporción de hidroxiprolina en los análisis
finales. (Tabla V I ) . Es de notar que durante la reincubación una alta proporción, que varió entre un 40 y un 5 0 % , de
la actividad unida al sRNA se descargó
de tal modo que pudo recuperarse en los
sobrenadantes de la precipitación y en los
líquidos de lavado. El análisis cromatográfico demostró la presencia de hidroxiprolina-C , pero siempre en proporción
menor que la encontrada en el análisis
del aminoacil-sRNA aislado.
14
14
14
14
14
14
DISCUSIÓN
La hidroxiprolina y la hidroxilisina son
aminoácidos que se encuentran casi ex-
5,0
marcada
de
incubado,
Incubación,
37°C.
(concentración
por
mi):
amorti-
T R I S p H 7,0 30,0 ¡ ¿ m o l e s ; A T P 2,0 ¡ ¿ m o l e s ;
Volumen
mi.
a
127
LISINA
20,0
mg.
30 m i n u t o s
Y
1 1
%
Experimento 1
guador
el
Hidroxiprolina
Experimento 2
Testigos (incubación aeróbica)
PROLINA
TABLA
Hidroxiprolina C
c.p.m.
1 1
LA
V
Incubación
Anaeróbica
de Prolina C " en
Sistema de Embrión
de Pollo.
Prolina
C
c.p.m.
DE
20
¡¿moles;
1,0
pH
5,0
minutos
glutatión
¡¿moles;
5:6,0
2,0
a-minoacil
ace-
¡¿moles;
C
1 J
-sRNA
mg.
mi.
a 37"C.
elusivamente en el colágeno. En cuanto
a su biosíntesis, no se ha podido demostrar ninguna vía diversa de la hidroxilación en el curso de la formación de esta
molécula. Por este motivo conviene estudiar la hidroxilación de ambos aminoácidos en conjunto con la biosíntesis del
colágeno.
Estos hidroxiaminoácidos no son incorporados en el colágeno directamente, sino
que a través de sus precursores, la prolina y la lisina. Por otra parte la proporción en que se encuentran el hidroxiaminoácido y su precursor dentro de la molécula de colágeno puede variar, como
está demostrado por lo menos en el caso
de prolina, en los casos de carencia de
ácido ascórbico o en condiciones de anaerobiosis (,14, 17, 1 8 ) . Todos estos hechos
obligan a plantear un problema de orden
general, respecto a la clave que determina la secuencia de los aminoácidos dentro de la molécula d e colágeno.
El hallazgo de hidroxiprolil-sRNA e
hidroxilisil-sRNA en el sistema de embrión de pollo empleado en nuestros experimentos, en concordancia con lo encontrado por otros investigadores (20,
21) habla en favor de la hipótesis (10,
17, 18, 19) de que la hidroxilación de la
prolina y la lisina sucedería en una etapa previa a su incorporación en la molécula de colágeno. Si esta hipótesis fuera verdadera, se plantearían dos nuevas
128
A.
CORONADO,
E.
MARDONES Y
posibilidades, a saber: que la hidroxilación ocurra durante la etapa de la activación de los aminoácidos o bien cuando
éstos han sido ya incorporados en el
sRNA.
Los resultados de nuestros experimentos no nos permiten eliminar la primera
posibilidad. Sin embargo, como en las incubaciones hechas en presencia de RNasa
no fue posible detectar hidroxiaminoácidos marcados en el material precipitable
ni en el sobrenadante de la reacción, esta posibilidad aparece muy poco probable. La misma consideración vale para la
posibilidad de que existiera una reacción
de hidroxilación intermedia, previa a la
formación del complejo aminoaciladenilato-enzima.
En cambio, el aislamiento de los hidroxiaminoacil-sRNA, la dependencia de la
reacción de hidroxilación de la presencia
de sRNA y más aún de un sRNA específico que se encuentra en las preparaciones de embrión de pollo y no en las de
levadura, y finalmente, el hecho de que
la prolina ya incorporada en el sRNA
pueda ser hidroxilada, nos inclinan a
aceptar la segunda posibilidad.
El hecho de que un aminoácido unido
al sRNA pueda ser transformado en otro
e incorporado en la molécula de proteína
empleando, por decirlo así, una clave
prestada, ha sido observado en otro tipo
de experimentos por Chapeville et al.
( 3 4 ) , lo que demuestra además que la
especificidad de la incorporación de un
aminoácido en la proteína depende solamente del sRNA.
La ubicación del proceso de hidroxilación que hemos considerado más probable implicaría una situación semejante y
plantearía, por lo tanto, un caso de am-
J.
ALLENDE
bigüedad en la clave para prolina y su
correspondiente hidroaminoácido, lo mismo que para la lisina y la hidroxilisina,
aminoácidos que podrían ser incorporados indiferentemente en un mismo sitio
de la molécula proteica.
Como la prolina y la lisina son aminoácidos que se encuentran ampliamente
distribuidos en toda clase de proteínas y,
por el contrario, la hidroxiprolina y la
hidroxilisina se encuentran solamente en
el colágeno, se hace indispensable postular la existencia de por lo menos dos
sRNA diferentes para cada uno de estos
aminoácidos; uno de los cuales no permitiría la reacción de hidroxilación y
cuya clave sería universal para todas las
proteínas incluyendo el colágeno, y otro
que sería compatible con la reacción de
hidroxilación, posterior y su clave existiría exclusivamente en el R N A mensajero que informa la secuencia de la molécula de colágeno.
Esta posible ambigüedad de la clave
genética del colágeno podría no ser necesaria si en condiciones normales la reacción de hidroxilación estuviera fuertemente desplazada en el sentido de la formación de hidroxiaminoacil-sRNA.
En el esquema que aparece en la Fig. 1
se ha resumido, para mayor simplicidad,
la hipótesis planteada en esta discusión.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al Dr. L . L u k e n s de
la Universidad de Y a l e por su ayuda y sugerencias en las etapas iniciales de este trabajo, al Dr. G u i l l e r m o Contreras del Departamento de Virología de la Escuela de Medicina
por haberles proporcionado los embriones de
pollo empleados en esta investigación, y a las
señoritas María M a t a m a l a y Lucinda N ú ñ e z
por su eficiente ayuda técnica.
,Clave 1
mRNA
A m m o a c i l - s R I M A , (Clave V
1
Aminoácido -
-Clave 1
Clavel
de o t r a s
proteínas
Aminooal-AMP-Enz.-
Aminoacn-sRNA
2
(Clave 2)\
Hidroxilación
Clave 1
Clave 1
m R N A de
colágeno
¡Clave 2
Hidroxiaminoacil-sRNA
FIG. 1. Representación esquemática de la i n c o r p o r a c i ó n
2
(Clave?)-
hipotética de p r o l i n a e h i d r o x i p r o l i n a en p r o t e í n a .
HIDROXILACIÓN
DE L A P R O L I N A
Y
129
LISINA
REFERENCIAS
SUMMARY
A cell-free system composed of aminoacyl-RNA synthetases ( p H 5 enzymes)
and soluble R N A from chick embryos
after incubation with C " - p r o l i n e incor­
porates radioactivity into sRNA. After
alkaline hydrolysis of the product chro­
matographic analysis of the radioactive
material shows the presence of radio­
active proline and hydroxyproline. The
hydroxyproline counts were 20% of the
total radioactivity bound to the sRNA.
(Tables I and I I ) .
Analogous experiments performed with
C -lysine likewise showed the appearence of hydroxy lysine ( 5 % of the bound
radioactivity) linked to the sRNA. ( T a ­
ble I I I ) .
When sRNA from ofther sources such
as yeast and rat liver were utilized, in­
corporation of radioactivity was obtained
but no hydroxyaminoacids could b e demostrated. (Table I V ) .
Under anaerobic conditions the amount
of hydroxyproline was reduced to less
than 5%. of the counts. The C - p r o l y l sRNA isolated after anaerobic incubation
was reincubated in the presence of oxy­
gen with the chick embryo system in the
presence of added C -proline as a trap­
ping agent against discharging of the ra­
dioactive compound. T h e product isola­
ted after this incubation contained ap­
proximately
2 0 % of hydroxyproline
which is similar to the control values.
(Tables V and V I ) .
These results suggest that the hydroxylation of lysine and proline for col­
lagen biosynthesis occurs at the level of
the aminoacyl-sRNA. T h e hydroxylation
seems to be dependent on a specific
sRNA which is present in the chick em­
bryo system but not in yeast.
To explain these results a proposal has
been made of the existence of t w o sRNA
specific for each of these aminoacids, in
only one of which could occur the hydro­
xylation reaction.
This introduces a problem of posible
ambiguity in the genetic code for proli­
ne and lysine in collagen biosynthesis.
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