DESARROLLO DE UNA FERMENTACION ALCOHOLICA A PH

DESARROLLO DE UNA FERMENTACION ALCOHOLICA A PH
REGULADO Y TEMPERATURA DE 25°C EN EL
BIORREACTOR BIOFLO 3000 M1227 Y ESTUDIO INICIAL DE
FERMENTACIONES EN SISTEMA CONTINUO
GABRIEL MAURICIO RAMIREZ NIETO
JULIAN FELIPE PEDROZA FLOREZ
Proyecto de grado para optar por el título de
Ingeniero de Producción Agroindustrial
Director
BERNADETTE KLOTZ
Bióloga
ROSA ERLIDE PRIETO
Química
UNIVERSIDAD DE LA SABANA
FACULTAD DE INGENIERIA DE PRODUCCION AGROINDUSTRIAL
BOGOTA, D.C.
2001
Nota de aceptación
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
Presidente del Jurado
________________________________
Jurado
________________________________
Jurado
Bogotá D.C, 16 de Julio del 2001
A mis Padres por su paciencia y
colaboración durante estos dos años.
Julián Pedroza
A mis Padres, mi hermana y mi esposa Vilma
y mis hijos.
Mauricio Ramírez
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan sus agradecimientos a:
La Doctora Bernadette Klotz y la Doctora Erlide Prieto, directoras del presente proyecto,
por su valiosa colaboración y orientación para el desarrollo del mismo.
CONTENIDO
Pág
RESUMEN ---------------------------------------------------------------------------- XIV
INTRODUCCION --------------------------------------------------------------------- XV
1. OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------- 16
1.1 GENERAL -------------------------------------------------------------------------- 16
1.2 ESPECÍFICOS--------------------------------------------------------------------- 16
2. REVISION BIBLIOGRAFICA---------------------------------------------------- 17
2.1 CONDICIONES DE LA FERMENTACION ALCOHOLICA
EN EL CRECIMIENTO DE LA LEVADURA SACCHAROMYCES
CEREVISIAE --------------------------------------------------------------------------- 17
2.1.1 Biología de las fermentaciones ------------------------------------------------------------ 17
2.1.1.1 Glucólisis -------------------------------------------------------------------------------------- 17
2.1.1.2 Ciclo de crecimiento de microorganismos-------------------------------------------- 21
2.1.2 Requerimientos nutricionales de la levadura------------------------------------------- 22
2.1.2.1 Substratos utilizados como fuente de carbono-------------------------------------- 23
2.1.2.2 Substratos utilizados como fuente de nitrógeno ------------------------------------ 23
2.1.3 Condiciones de la fermentación ----------------------------------------------------------- 24
2.2 VARIABLES QUE AFECTAN LA FERMENTACION ALCOHOLICA 25
2.2.1 Temperatura ------------------------------------------------------------------------------------ 25
2.2.2 pH-------------------------------------------------------------------------------------------------- 26
2.2.2.1 Ajuste del pH --------------------------------------------------------------------------------- 27
2.2.2.2 Buffers ----------------------------------------------------------------------------------------- 27
V
Contenido
VI
2.2.3 Aireación ----------------------------------------------------------------------------------------- 28
2.3 BIORREACTORES ------------------------------------------------------------------------- 28
2.3.1 Monitoreo y control de biorreactores ----------------------------------------------------- 28
2.3.2 Monitoreo de la fermentación -------------------------------------------------------------- 29
2.3.3 Retroalimentación ----------------------------------------------------------------------------- 30
2.4 CULTIVOS CONTINUOS ---------------------------------------------------------------- 30
2.4.1 Diferencias entre cultivo continuo y discontinuo --------------------------------------- 32
2.4.2 Cinética del cultivo continuo----------------------------------------------------------------- 32
3. MATERIALES Y METODOS ------------------------------------------------------------- 35
3.1 PROCEDIMIENTO -------------------------------------------------------------------------- 35
3.2 DISEÑO EXPERIMENTAL -------------------------------------------------------------- 36
3.2.1 Diagramas de flujo ---------------------------------------------------------------------------- 36
3.2.1.1 Pruebas preliminares ---------------------------------------------------------------------- 36
3.2.1.2 Pruebas en el Bioflo ------------------------------------------------------------------------ 36
3.2.2 Preparación de los medios de cultivo para pruebas preliminares ---------------- 37
3.2.3 Esterilización de los erlenmeyer y adecuación de los medios de cultivo ------- 38
3.2.4 Activación e inoculación de la levadura ------------------------------------------------- 38
3.2.5 Variables a medir durante la fermentación preliminar ------------------------------- 39
3.2.5.1 pH ----------------------------------------------------------------------------------------------- 39
3.2.5.2 Número de microorganismos ------------------------------------------------------------ 39
3.2.5.3 Sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa--------------------------------- 39
3.2.6 Análisis de los datos obtenidos en las pruebas preliminares ---------------------- 39
3.2.7 Pruebas preliminares en el Bioflo --------------------------------------------------------- 39
3.2.8 Fermentación alcohólica en el Bioflo ----------------------------------------------------- 40
3.2.9 Fermentación alcohólica sin regulación de pH ---------------------------------------- 40
3.2.10 Diagrama de flujo de puesta en marcha de una fermentación en el Bioflo--- 40
3.2.11 Reproducibilidad de la fermentación alcohólica en el Bioflo --------------------- 41
3.2.11.1 Variables a medir durante la fermentación ----------------------------------------- 41
3.2.11.2 Técnicas utilizadas------------------------------------------------------------------------ 42
3.2.11.3 Validación estadística de los datos --------------------------------------------------- 42
Contenido
VII
3.2.12 Pruebas preliminares para trabajo de cultivos continuo--------------------------- 42
3.3 MATERIALES Y METODOS------------------------------------------------------------ 42
3.3.1 Método Kjeldahl para la determinación de nitrógeno total-------------------------- 42
3.3.1.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 42
3.3.1.2 Reacciones que se presentan ----------------------------------------------------------- 43
3.3.1.3 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 43
3.3.1.4 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 43
3.3.1.5 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 44
3.3.1.6 Cálculo y expresión de los resultados ------------------------------------------------- 45
3.3.2 Método para la determinación de azúcares reductores por titulación
de Lane y Enyon --------------------------------------------------------------------------------------- 45
3.3.2.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 45
3.3.2.2 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 46
3.3.2.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 46
3.3.2.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 47
3.3.2.5 Cálculo y expresión de los resultados ------------------------------------------------- 48
3.3.3 Determinación del número de microorganismos por recuento en cámara
de conteo Neubauer Improved --------------------------------------------------------------------- 48
3.3.3.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 48
3.3.3.2 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 49
3.3.3.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 49
3.3.3.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 49
3.3.3.5 Cálculo y expresión de los resultados ------------------------------------------------- 49
3.3.4 Método para la determinación del contenido alcohólico de etanol por
el método de destilación simple ------------------------------------------------------------------- 50
3.3.4.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 50
3.3.4.2 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 50
3.3.4.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 50
3.3.4.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 50
3.3.5 Determinación de sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa ------------ 51
3.3.5.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 51
3.3.5.2 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 51
Contenido
VIII
3.3.5.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 51
3.3.5.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 51
4. PRESENTACIÓN DE RESULTADOS ---------------------------------------- 53
4.1 GUIA DE MANEJO DEL SISTEMA DE BOMBAS
PERISTÁLTICAS ---------------------------------------------------------------------- 53
4.1.1 Configuración de sistema de bombas peristálticas para control de pH -------- 55
4.2 RESULTADOS DE FERMENTACIONES PRELIMINARES ------------- 56
4.2.1 Porcentajes de variación de pH para los medios semisintético y natural ------ 57
4.3 RESULTADOS DE PRUEBAS PRELIMINARES EN EL BIOFLO ---- 57
4.3.1 Determinación de velocidad de agitación para una fermentación alcohólica-- 57
4.3.2 Determinación de la concentración de ácido y base --------------------------------- 58
4.3.3 Fermentación preliminar en el Bioflo ----------------------------------------------------- 58
4.4 ESTANDARIZACION DE METODOLOGIAS ----------------------------------- 58
4.4.1 Calibración de método de determinación de nitrógeno total ----------------------- 59
4.4.1.1 Curva de calibración del método Kjeldahl con urea ------------------------------- 59
4.4.1.2 Curva de calibración para etapa de destilación y titulación---------------------- 60
4.4.2 Calibración del método de determinación de azúcares reductores
por titulación de Lane y Enyon --------------------------------------------------------------------- 62
4.5 RESULTADOS DE LAS FERMENTACIONES ALCOHOLICAS
EN EL BIOFLO -------------------------------------------------------------------------------------- 63
4.5.1 Datos de crecimiento de microorganismos --------------------------------------------- 63
4.5.2 Datos de contenido de nitrógeno total en la biomasa-------------------------------- 65
4.5.3 Datos de sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa----------------------- 66
4.5.4 Datos de azúcares reductores residuales y contenido de etanol ----------------- 66
4.5.5 Volúmenes consumidos de ácido y base por el sistema de regulación
de pH ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 67
4.5.6 Variación de pH en las fermentaciones sin control de pH -------------------------- 68
5. DISCUSION DE RESULTADOS ------------------------------------------------------- 69
Contenido
IX
5.1 SELECCION DE MEDIO DE CULTIVO CON MAYOR
RANGO DE FLUCTUACION DE PH ----------------------------------------------------- 69
5.2 ANALISIS DE LAS PRUEBAS PRELIMINARES EN EL BIOFLO ---- 70
5.3 ANALISIS DE METODOLOGIAS ESTANDARIZADAS -------------------- 70
5.3.1 Análisis de la estandarización del método de determinación de
nitrógeno total------------------------------------------------------------------------------------------- 70
5.3.2 Análisis de la estandarización del método de determinación de
azúcares reductores residuales -------------------------------------------------------------------- 71
5.4 ANALISIS DE FERMENTACION CON REGULACION DE PH
RESPECTO A UNA FERMENTACION SIN REGULACION DE PH------- 72
5.4.1 Crecimiento de microorganismos --------------------------------------------------------- 72
5.4.2 Contenido de nitrógeno en la biomasa ------------------------------------------- 73
5.4.3 Sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa ----------------------------------- 76
5.4.4 Azúcares reductores residuales y contenido de etanol ----------------------------- 76
5.4.4.1 Balance de masa de azúcar consumido en las fermentaciones---------------- 77
5.4.5 Comportamiento del pH en fermentaciones sin regulación de pH --------------- 82
5.5
ANALISIS DE LA EVALUACION DE BOMBAS PERISTALTICAS
DEL BIOFLO Y SEGUIMIENTO DE UNA FERMENTACION EN EL
CRECIMIENTO MICROBIANO-------------------------------------------------------------- 82
CONCLUSIONES-------------------------------------------------------------------------------------- 85
RECOMENDACIONES------------------------------------------------------------------------------- 87
ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------- 88
BIBLIOGRAFÍA --------------------------------------------------------------------------------------- 105
LISTA DE TABLAS
Pág
Tabla 2.1 Requerimientos de nutrientes ---------------------------------------------------------23
Tabla 2.2 Composición del extracto de levadura producido mediante autólisis------- 24
Tabla 2.3 Parámetros medidos o controlados en biorreactores -------------------------- 29
Tabla 3.1 Normas y métodos utilizados--------------------------------------------------------- 35
Tabla 3.2 Medio de cultivo semisintéticos ------------------------------------------------------ 37
Tabla 3.3 Medio de cultivo naturales------------------------------------------------------------- 38
Tabla 4.1 Ciclo de funcionamiento de bombas peristálticas------------------------------- 54
Tabla 4.2 Caudales de bombas peristálticas para flujos de entrada y salida
empleando tubo de silicona de 1/8”--------------------------------------------------------------- 55
Tabla 4.3 Resultados para medio semisintético ----------------------------------------------- 56
Tabla 4.4 Resultados para medio natural ------------------------------------------------------ 56
Tabla 4.5 Porcentajes de variación de pH------------------------------------------------------ 57
Tabla 4.6 Resultados de volúmenes consumidos de ácido y base, y
tiempo de operación a diferentes velocidades de agitación -------------------------------- 57
Tabla 4.7 Resultados de volúmenes consumidos de ácido y base, y
tiempo de operación a diferentes concentraciones ------------------------------------------- 58
Tabla 4.8 Resultados de calibración para método total de Kjeldahl--------------------- 59
Tabla 4.9 Resultados para etapa de destilación y titulación del método
Kjeldahl --------------------------------------------------------------------------------------------------- 61
Tabla 4.10 Resultados de calibración para método de determinación de
azúcares reductores----------------------------------------------------------------------------------- 62
Tabla 4.11 Resultados de crecimiento de microorganismos ------------------------------ 64
Tabla 4.12 Resultados de contenido de nitrógenos celular por mililitro ---------------- 65
Tabla 4.13 Resultados de toma de °Brix a 20 °C--------------------------------------------- 66
Tabla 4.14 Resultados de determinación de azúcares reductores residuales-------- 67
X
Lista de Tablas
Tabla 4.15 Resultados de contenido de etanol ----------------------------------------------- 67
Tabla 4.16 Variación de pH en una fermentación sin control de pH -------------------- 68
Tabla 5.1 Porcentajes de error del método de determinación de nitrógeno total
en diferentes estandarizaciones realizadas---------------------------------------------------- 71
Tabla 5.2 Mayor crecimiento de microorganismos en fermentaciones
en el Bioflo ----------------------------------------------------------------------------------------------- 72
Tabla 5.3 Mayor contenido de nitrógeno en fermentaciones en el Bioflo -------------- 73
Tabla 5.4 Rangos de contenido de nitrógeno por célula ----------------------------------- 74
Tabla 5.5 Rangos de porcentaje peso a peso de nitrógeno por célula ----------------- 75
Tabla 5.6 Balance de azúcares en fermentaciones en el Bioflo
para 10 litros de medio ------------------------------------------------------------------------------- 79
Tabla 5.7 Porcentajes de consumo de azúcares en diferentes
fermentaciones en el Bioflo ------------------------------------------------------------------------- 80
Tabla 5.8 Valores de se y xe a diferentes valores de tasa de dilución
y µmax para una fermentación en sistema continuo.---------------------------------------- 84
XI
LISTA DE FIGURAS
Pág
Figura 2.1 Secuencia de la glucólisis ------------------------------------------------------------ 19
Figura 2.2 Vía anaerobia de la glucólisis ------------------------------------------------------- 20
Figura 2.3 Vía aeróbica de la glucólisis --------------------------------------------------------- 20
Figura 2.4 Relación de concentración de substrato y velocidad
específica de crecimiento de un microorganismo --------------------------------------------- 21
Figura 2.5 Curva de crecimiento típica de una población celular ------------------------ 22
Figura 2.6 Componentes del retroalimentador ------------------------------------------------ 30
Figura 2.7 Efectos de la tasa de dilución y concentración de substrato
en un quimiostato -------------------------------------------------------------------------------------- 31
XII
LISTA DE ANEXOS
Pág
Anexo A Datos de fermentaciones preliminares----------------------------------------------- 88
Anexo B Datos de fermentaciones en el Bioflo ------------------------------------------------ 90
Anexo C Datos del seguimiento de una fermentación con flujos de
entrada y de salida ------------------------------------------------------------------------------------ 94
Anexo D Sistema de bombas peristálticas del Bioflo 3000 M1227 --------------------- 100
XIII
RESUMEN
En la línea de investigación de fermentación, se continuó con el conocimiento en el
manejo y funcionamiento del biorreactor; este trabajo presentó un aporte
complementario enfocado a la evaluación del sistema de regulación de pH y su
incidencia en el desarrollo de una fermentación alcohólica. Para establecer la influencia
de la variable pH se determinó parámetros como crecimiento de microorganismos,
contenido de nitrógeno, consumo de sólidos solubles totales, contenido de sacarosa,
contenido de etanol y contenido de azúcares residuales, comparando una fermentación
con regulación de pH contra una sin regulación, presentando mejor rendimiento al
controlar el pH. Para el estudio inicial de fermentaciones en sistema continuo, el
biorreactor presentó inconsistencias en los flujos que no permitieron desarrollar dicho
proceso.
Abstract: The purpose of this project was to establish the effect of a regulated pH on an
ethanolic fermentation at 25°C. Also, through this study it was want to complete
instruction manual of the biorreactor Bioflo. Following parameters were determined
during the growth of Saccharomyces cerevisiae in a system with controlled and non
controlled pH: total nitrogen content, growth of microorganism, consumption of total
soluble solids, sucrose content, ethanol content and residual sugars content. In
addition, initial steps for the establishment of a continuos culture realized.
XIV
INTRODUCCION
La facultad de Ingeniería de la Universidad de La Sabana adquirió un biorreactor para
investigación en el área de fermentaciones y como apoyo en la formación académica.
Los trabajos anteriormente realizados en el Bioflo se centraron en establecer una guía
de manejo y funcionamiento de éste, determinando la precisión y la reproducibilidad de
fermentaciones alcohólicas a temperatura constante de 30 °C y 25 °C. El presente
trabajo es un complemento al manejo del biorreactor, en el cual se evalúa el sistema de
regulación de pH y los sistemas continuos de cultivo, brindando un aporte al protocolo
de operación del equipo.
El monitoreo y control de una fermentación es un área activa de investigación que
busca mejorar la eficacia de los bioprocesos, alcanzando uniformidad y confiabilidad en
el proceso de fermentación. La variable pH es de gran importancia ya que afecta al
proceso fermentativo de diversas maneras, produciendo reacciones no deseadas,
inhibiendo la actividad enzimática de las levaduras y formando productos no esperados
en el proceso de fermentación. Es por esto que el trabajo está orientado al manejo y
funcionamiento del biorreactor en el desarrollo de una fermentación alcohólica a pH
regulado y temperatura óptima de 25 °C para el crecimiento de la levadura
Saccharomyces cerevisiae. Con el fin de medir la reproducibilidad de esta fermentación
se realiza el seguimiento de parámetros tales como crecimiento de microorganismos,
contenido de nitrógeno en la biomasa, consumo de sacarosa, variación de sólidos
solubles, contenido de azúcares reductores residuales y contenido de etanol.
Adicionalmente se continuó con la estandarización de los métodos analíticos aceptados
internacionalmente a las condiciones del laboratorio de investigación de la Facultad. Se
han realizado nuevas adquisiciones de equipos, que ofrecen mejor exactitud y precisión
en los análisis, como lo es la determinación de contenido de nitrógeno total en una
muestra. A la vez se empleo el método de titulación de Lane y Enyon, alternativo para
determinación de azúcares reductores residuales diferente al método colorimétrico
empleado en las anteriores investigaciones.
Como parte principal de la guía complementaria de manejo y funcionamiento del Bioflo,
se encuentra la configuración de los sistemas de bombas peristálticas, necesarias para
controlar variables como pH en una fermentación alcohólica y dar pie al uso del
biorreactor en sistema continuo, lo cual se evaluó de manera preliminar en el presente
trabajo y servirá para el que desee profundizar las investigaciones realizadas por la
facultad
de
Ingeniería
en
la
línea
de
fermentación.
XV
CAPITULO 1
OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar una fermentación alcohólica a pH regulado y temperatura constante en el
Bioflo y realizar un estudio preliminar de fermentaciones en sistema continuo.
1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
•
Determinar mediante fermentaciones alcohólicas preliminares, qué medio de
cultivo, semisintético o natural, presenta un mayor rango de variación de pH.
•
Determinar la concentración necesaria de ácido y base a ser utilizada en la
regulación de pH y configurar de manera preliminar los sistemas de bombas
peristálticas del Bioflo.
•
Determinar la reproducibilidad de una fermentación alcohólica en el biorreactor
a pH constante y temperatura de 25 °C.
•
Establecer una guía de manejo y funcionamiento del sistema de bombas
peristálticas del biorreactor en una fermentación alcohólica utilizando el
sistema de regulación de pH.
•
Realizar pruebas iniciales para el manejo del Bioflo en cultivos continuos
16
CAPITULO 2
REVISION BIBLIOGRAFICA
En éste capítulo se presenta el marco teórico para el desarrollo del siguiente
trabajo. Básicamente se hace una revisión sobre la fermentación alcohólica,
variables que afectan la fermentación, el funcionamiento de un Biorreactor y la
teoría básica sobre fermentaciones en sistema continuo.
2.1 CONDICIONES DE LA FERMENTACION ALCOHOLICA EN EL
CRECIMIENTO
DE
LA
LEVADURA
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE.
La fermentación en gran escala puede llevarse a cabo mediante el uso de hongos,
levaduras o bacterias, pero las levaduras son las más utilizadas por su papel en la
fabricación de bebidas alcohólicas. Son los microorganismos que más se usan en
la bioindustria, se pueden cultivar por las células mismas y por los productos
finales que se producen durante la fermentación alcohólica.
La producción de alcohol por levadura se realiza por una fermentación alcohólica
anaeróbica, del cual resulta un rendimiento menor de células, pero cantidades
satisfactorias de alcohol y CO2.
Durante los primeros días del proceso de fermentación, las células de levadura
crecen por respiración consumiendo oxigeno y creando un medio anaerobio. Tan
pronto como él oxigeno desaparece se inicia la fermentación, produciendo alcohol.
La levadura pasa de metabolismo aerobio al anaerobio.
La tolerancia al alcohol depende, además de las características genéticas de la
cepa, de diversos factores ambientales como la concentración de azúcares en el
medio desde el inicio de la fermentación y en fases posteriores, temperatura, pH y
de manera importante la concentración del etanol en las diferentes etapas de la
fermentación.
2.1.1 Biología de las fermentaciones.
1
Aproximadamente el 96% de la producción del etanol mediante fermentación a
nivel industrial se lleva a cabo mediante cepas de Saccharomyces cerevisiae. El
etanol se produce en la ruta de glucólisis, específicamente en la vía anaeróbica,
en la que el piruvato producido se convierte en acetaldehído y etanol. La reacción
global es la siguiente:
Glucosa + 2 ADP + 2 Pi
2 Etanol + 2 CO2 +ATP + Energía
El rendimiento teórico de 1 gramo de glucosa es de 0.51 gramos de etanol y 0.49
gramos de CO2. Aproximadamente el 10% de la glucosa se transforma en
biomasa y el rendimiento en etanol y CO2 alcanzan el 90% del valor teórico. El
ATP formado se utiliza para las necesidades energéticas de la célula (Owen,
1991, 134).
En cuanto a la estructura celular de la levadura, la envoltura de la célula de
levadura incluye una membrana plasmática, un espacio periplásmico y una pared
celular constituida principalmente por polisacáridos y una pequeña cantidad de
péptidos. La pared tiene una estructura semirrígida permeable al soluto que
proporciona a las levaduras una considerable fuerza compresional y tensil.
2.1.1.1
Glucólisis
La glucólisis ejemplifica de que manera los procesos bioquímicos de una célula se
desarrollan en pequeños pasos secuenciales, los cuales son catalizados cada uno
por una enzima específica. Los primeros pasos de la glucólisis requieren de un
ingreso de energía, que es suministrada por el acoplamiento de estos pasos al
sistema ATP/ADP.
La secuencia completa comienza con una molécula de
glucosa. Se invierte energía en los pasos 1 y 3 por transferencia, en cada paso,
de un grupo fosfato desde una molécula de ATP a la molécula de azúcar. La
molécula de 6 carbonos, proveniente de la glucosa presenta la lisis en el paso 4 y
a partir de este paso en adelante la secuencia produce energía. Cabe anotar que
en este paso se producen 2 moléculas de gliceraldehído fosfato que en el paso
final producirá las dos moléculas de ácido pirúvico. En los pasos 6 y 9 las
moléculas de ADP toman energía del sistema, fosforilándose a ATP. De esta
forma la molécula de glucosa se ha convertido en dos moléculas de ácido pirúvico.
La ganancia neta de energía son dos moléculas de ATP y dos moléculas de
NADH por molécula de glucosa.
El ácido pirúvico obtenido en la glucólisis puede seguir dos vías. Una vía es
aeróbica (respiración) y la otra es anaeróbica (fermentación). La vía aeróbica es
la vía principal del metabolismo energético de las levaduras en presencia de
oxígeno y la vía anaeróbica es la vía fermentativa que funciona en ausencia de un
aceptor externo de electrones. En ausencia del oxígeno el ácido pirúvico se
convierte en etanol.
La siguiente gráfica muestra las dos etapas de la glucólisis; La primera etapa usa
ATP y la segunda produce ATP y NADH.
2
Figura 2.1 Secuencia de la glucólisis
Fuente: CURTIS, Helena. Biología.
•
Vía anaeróbica o fermentación: Los pasos por los cuales el ácido pirúvico,
formado por la glucólisis, se convierte anaerobiamente en etanol. En el primer
paso se desprende CO2. En el segundo, se oxida el NADH y se reduce el
acetaldehído. La mayoría de la energía potencial de la glucosa permanece en
3
el alcohol, que es el producto final de la secuencia. Se producen 2 moléculas
de etanol más 2 moléculas de CO2 a partir una molécula de glucosa.
Glucosa
2 Etanol + 2 CO2
Figura 2.2 Vía anaerobia de la glucólisis
Fuente: CURTIS, Helena. Biología.
•
Vía aeróbico o respiración: En presencia de oxígeno, la siguiente etapa de la
degradación de la glucosa implica la oxidación progresiva del ácido pirúvico a
CO2 y agua, proceso conocido como respiración. El paso previo es la
oxidación del ácido pirúvico a un grupo acetilo de dos carbonos que se
combina con la coenzima A para formar el acetilCoA. El acetilCoA entra en el
ciclo de Krebs que es el siguiente paso de la respiración, en el cual los
carbonos donados por el grupo acetilo se oxidan a CO2 y los átomos de
hidrógeno pasan a los transportadores de electrones. Lo mismo que en la
glucólisis, en cada paso interviene una enzima específica.
Figura 2.3 Vía aeróbica de la glucólisis
Fuente: CURTIS, Helena. Biología
4
La secuencia respiratoria completa es:
Glucosa + 6 O2
6 CO2 + 6 H2O + Energía
2.1.1.2 Ciclo de crecimiento de microorganismos
Una población de microorganismos presenta generalmente un patrón de
crecimiento característico cuando se inocula en un medio de cultivo fresco.
•
Fase de retraso: En esta fase las células se ajustan a las nuevas condiciones.
Si un cultivo que crece exponencialmente es inoculado al mismo medio bajo
las mismas condiciones de crecimiento, no se observa fase de retraso y el
crecimiento exponencial continua a la misma velocidad.
•
Fase exponencial: Es la etapa en la cual la velocidad de crecimiento de las
células aumenta progresivamente. Transcurrido un periodo de tiempo, las
células crecen a una velocidad máxima constante y no dependen de la
concentración de substrato. La siguiente gráfica ilustra este comportamiento.
Figura 2.4 Relación de concentración de substrato y velocidad específica de
crecimiento de un microorganismo
Fuente: TREVAN, M. Biotecnología: principios biológicos.
La zona B a C equivale a la fase exponencial del cultivo, con substrato en exceso
y un crecimiento a una velocidad máxima constante. La zona A a B corresponde a
la desaceleración de la velocidad de crecimiento, desde el final de la fase
exponencial hasta el inicio de fase estacionaria.
En la fase exponencial, el comportamiento del crecimiento de un microorganismo
en un cultivo puede describirse mediante la siguiente ecuación:
Nt = N0 x 2n
donde:
Nt es número de células en un tiempo t
N0 es el número de células inoculadas
n es el número de generaciones al tiempo t
5
•
Fase estacionaria: Lo que limita el crecimiento en esta fase es que alguno de
los nutrientes indispensables se agota o algún producto de desecho fabricado
en el medio llega a un nivel en el que es inhibidor y cesa el crecimiento
exponencial. En la fase estacionaria no hay incremento ni decremento en la
cantidad de células, pero muchas de las funciones celulares pueden continuar,
incluyendo el metabolismo energético y la producción de metabolitos
secundarios.
•
Fase de muerte: Después de alcanzar la fase estacionaria y continuar con la
incubación de las células, estas pueden seguir vivas y continuar
metabolizando, pero lo más probable es que mueran. En algunos casos, la
muerte se acompaña por lisis celular, dando a lugar a disminución en el conteo
microscópico directo junto con la disminución del conteo de viabilidad.
Gráficamente, en escala semilogarítmica se observa el comportamiento típico del
crecimiento de una población de microorganismos.
Figura 2.5 Curva de crecimiento típica de una población celular
Fuente: BROCK, T. Microbiología.
2.1.2
Requerimientos nutricionales de la levadura
Los microorganismos se cultivan en agua, a la que se le han añadido los
nutrientes apropiados. La solución acuosa que contiene los nutrientes necesarios
6
se denomina medio de cultivo. Lo nutrientes existentes en el medio de cultivo dan
a la célula microbiana todos los ingredientes requeridos para que produzca más
células semejantes a ella misma. Además de las fuentes de energía, que pueden
ser substancias orgánicas o inorgánicas, o luz, el medio de cultivo debe de tener
fuentes de carbono, de nitrógeno y macro y micro nutrientes respectivos.
Un medio de cultivo óptimamente equilibrado es obligatorio para considerar la
máxima producción.
La composición de los medios de cultivo debe ser
constantemente adaptada a los procesos de fermentación. En general los
requerimientos básicos de nutrientes para los microorganismos y las formas
comunes de satisfacerlos en los cultivos se enuncian en la siguiente tabla.
Tabla 2.1 Requerimientos de nutrientes
NUTRIENTE
FORMA QUIMICA SUMINISTRADA AL MEDIO DE CULTIVO
CARBONO
GLUCOSA, ACETATO, PIRUVATO, MEDIOS COMPLEJOS COMO EXTRACTO
DE LEVADURA, PEPTONA
NITROGENO
ORGANICOS: AMINOACIDOS Y BASES NITRGENADAS, INORGANICOS: KNO3,
(NH4)2SO4,
FOSFORO
Na2HPO4, KH2PO4
AZUFRE
Na2SO4, H2S
POTASIO
KCL, K2HPO4
MAGNESIO
MGSO4, MgCL2
SODIO
NaCl
HIERRO
QUELATOS DE HIERRO, FeCl3
MICRONUTRIENTES
MnSO4, CuCl2, ZnCl2, CoCl2, NiCl2, Na2MoO4, Na2Se4
Fuente: BROCK, T. Microbiología
2.1.2.1
Substratos utilizados como fuente de carbono
Los carbohidratos son tradicionalmente las fuentes de energía en la industria de la
fermentación. Por razones económicas la glucosa o la sacarosa puras rara vez
son utilizadas como única fuente de carbono, excepto en los procesos que exigen
el control exacto de la fermentación. La melaza, el extracto de malta, el almidón,
las dextrinas, la celulosa y los aceites vegetales son utilizados comúnmente como
fuentes de carbono en diversos procesos fermentativos.
7
2.1.2.2
Substratos utilizados como fuente de nitrógeno
Muchos procesos a gran escala utilizan amonio, sales, urea o amonio gaseoso
como fuente de nitrógeno. Una fuente de nitrógeno que es metabolizada
eficientemente es el líquido de maceración del maíz, que se forma durante la
formación de almidón a partir de maíz. Los extractos de levadura son excelentes
substratos para muchos microorganismos. El extracto de levadura contiene
aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en agua y carbohidratos. Las peptonas
pueden ser utilizadas por muchos microorganismos pero son relativamente caras
para la aplicación industrial. Las fuentes de peptonas incluyen la carne, la
caseina, la gelatina, la queratina, las semillas de maní, la harina de soya, las
semillas de algodón y las semillas de girasol.
El extracto de levadura es medio complejo y su composición se presenta a
continuación.
Tabla 2.2 Composición del extracto de levadura producido mediante autólisis
COMPOSICIÓN (%)
MATERIA SECA
70
NITROGENO TOTAL
8.8
PROTEINA (N * 6.25)
55
AMINOACIDOS
38.4
CONTENIDO EN VITAMINAS (ppm)
TIAMINA
20-30
RIVOFLAVINA
50-70
PIRIDOXINA
25-35
ACIDO PANTOTENICO
200
NIACINAMINDA
600
Fuente: CRUEGER, W. Biotecnología: Manual de microbiología industrial.
El extracto de levadura al ser un medio complejo, provee de la mayoría de los
factores potenciales de crecimiento, factores que consisten en vitaminas,
aminoácidos, purinas y pirimidinas, los cuales no pueden ser sintetizados por
algunos microorganismos.
Se establece que los medios de cultivo para llevar a cabo una fermentación
alcohólica a nivel laboratorio, que muestran mayor rendimiento son los que utilizan
extracto de levadura, acompañado de un complejo vitamínico (Alba y Sierra, 1999,
123)
2.1.3 Condiciones de la fermentación.
En la fermentación alcohólica las levaduras utilizan los azúcares sacarosa,
fructosa, maltosa y maltotriosa en este orden.
La sacarosa es hidrolizada
primeramente por la invertasa localizada en el espacio periplásmico extracelular.
8
Aunque las fermentaciones alcohólicas son en gran medida anaerobias, las
levaduras necesitan algo de oxígeno para sintetizar algunos esteroles y ácidos
grasos insaturados.
Muchas cepas de Saccharomyces cerevisiae pueden producir concentraciones de
etanol de hasta el 12 % al 14%. Existen cepas seleccionadas capaces de producir
hasta un 18% a 20% de alcohol, aunque la velocidad de fermentación se ve
fuertemente reducida cuando la concentración de etanol aumenta (Owen, 1991,
136).
En las levaduras, los valores de pH comprendidos entre 3 y 6 son la mayoría de
las veces favorables al crecimiento y actividad fermentaria. La velocidad de
fermentación aumenta generalmente con la temperatura entre los 15°C y los 35 °C
y los niveles de glicerol, acetona, acetaldehído y piruvato se elevan en los medios
de fermentación. La formación de niveles elevados de alcohol también depende
de la temperatura (Owen, 1991, 136).
En la producción de bebidas alcohólicas deben controlarse las fermentaciones de
forma que, por un lado se asimilen los carbohidratos y otros nutrientes y se
conviertan en alcohol y en compuestos con aromas característicos y deseables, y
por otro lado, se minimice la formación de aromas y sabores indeseables. Entre
los componentes del aroma y sabor se encuentran otros alcoholes diferentes del
etanol, ésteres, compuestos carbonílicos, ácidos orgánicos, compuestos
azufrados, aminas y fenoles.
A medida que la riqueza alcohólica aumenta, la población de otras levaduras que
se encuentran en el medio a fermentar decrece y va siendo sustituida como
población dominante por la Saccharomyces cerevisiae. Este patrón de sucesión
está fuertemente influenciado por las condiciones de fermentación como son la
temperatura y el pH; por ejemplo, a una temperatura de 25°C y pH de 3.0 a 3.5,
las cepas de Saccharomyces cerevisiae dominan la fermentación y las otras
especies mueren. Como también la adición de SO2 reduce la población de
levaduras silvestres en el medio y de esta manera favorece la preponderancia de
Saccharomyces cerevisiae, ya que esta especie es más resistente a este biocida
(García, 1993, 295).
2.2
VARIABLES
ALCOHOLICA
QUE
AFECTAN
LA
FERMENTACION
La fermentación es un proceso determinante en la composición final del producto
fermentado. Son muchos los factores que influyen en el desarrollo de una
fermentación: Temperatura, pH y aireación.
2.2.1 Temperatura
La temperatura es el factor de influencia decisiva para las actividades de las
levaduras. La temperatura más adecuada para su reproducción y la fermentación
9
oscila entre 22 °C a 27 °C y se reproduce con mayor rapidez cuando la
temperatura es de 25 °C. A temperaturas superiores a 30 °C, las levaduras
pierden capacidad para desdoblar los azúcares y al aproximarse a 40 °C dejan de
crecer y reproducirse (Alvarez, 1991, 112). En una fermentación alcohólica nunca
se debe superar temperaturas de 32 °C durante el periodo fermentativo ya que se
corren varios riesgos(Madrid, Marzo de 1991):
• Inactivación de las levaduras responsables de la transformación de los
azúcares en alcohol y CO2.
• Pérdida de alcohol por evaporación con merma de grado alcohólico.
• Iniciación de fermentaciones indeseables.
La influencia de la temperatura sobre el poder fermentativo, medida del porcentaje
de etanol que una cepa de levadura es capaz de producir, es diferente. Cuando
se fermenta a temperatura baja o moderada las fermentaciones son lentas, pero el
grado alcohólico alcanzado es generalmente mayor que a temperaturas elevadas
o superiores a los 30 °C ó 35 °C (Suárez, 1990, 211).
Además las fermentaciones alcohólicas efectuadas a 25 °C obtienen mejores
resultados que las efectuadas a 30 °C ya que:
El crecimiento de microorganismos determinado, muestra que a 25 °C la levadura
se desarrolla un 25.5% más que a 30 °C; El consumo de sólidos solubles,
sacarosa y grado alcohólico a 25 °C es de 42.8 %, 71.0 % y 7.3 °GL
respectivamente mientras que a 30 °C es de 36.4%, 63.8 % y 6.0 °GL(Merchan y
Castillo, 1999, 120).
El buen desarrollo de la fermentación esta en parte ligado a la necesidad de evitar
que las levaduras sean sometidas a temperaturas demasiado elevadas. La
experiencia ha demostrado que son tanto más sensibles a la elevación de
temperaturas cuanto más vieja sea la población, lo que constituye una causa de
ralentización y a veces de parada de la marcha fermentativa, mientras quedan en
el medio azúcares aun no transformados en alcohol.
A partir de 30 °C se puede considerar que las levaduras reducen progresivamente
su actividad, hasta cesarla completamente cuando se aproxima a los 40 °C. El
hecho de tratar de mantener la temperatura a un nivel razonablemente bajo no
aspira solamente a la mayor regularidad de la fermentación y mayor grado
alcohólico, si no que tiende a frenar la perdida por volatilización de una fracción
importante de compuestos aromáticos (Suárez, 1990, 211).
2.2.2 pH
El crecimiento de la levadura y la velocidad de fermentación no se ve afectado por
la variación de pH entre 3.5 y 6.0 en el medio, pero a valores de pH entre 3.05
hasta 3.50 en el medio, se logra alcanzar un máximo de rendimiento de acuerdo a
la formación de producto y crecimiento de la levadura (Aleixandre, Noviembre de
1998).
En una fermentación alcohólica, el pH varía normalmente entre un mínimo de 2.8 y
un máximo de 3.8, rango que depende básicamente de la composición del medio
10
a ser fermentado (De Rosa, 1998, 194). Se establece que el pH en valores
menores que 3.0 en un proceso fermentativo, se presenta el fenómeno de
inhibición por pH, el cual se debe al efecto que esta variable tiene sobre los centro
activos de las enzimas. Estos centros presentan actividad en un determinado
estado de ionización y este estado varía en función del pH el medio. Por lo tanto,
la actividad enzimática es función del número de centros activos y estos,
dependen del pH del medio. Por otra parte, este fenómeno puede interpretarse
por el importante efecto que el pH del medio tiene sobre la estructura y la
permeabilidad de la membrana celular (Revista Alimentación, equipos y
tecnología, Junio de 1993).
La marcha fermentativa depende además del pH del medio y los productos que
resultan son mejores en cuanto a rendimiento a valores de pH bajos. También el
conjunto de las floculaciones coloidales están reguladas por el pH del medio, así
como algunas de sus características organolépticas tales como color y sabor.
En la levadura Saccharomyces cerevisiae el crecimiento se da más rápido que en
las bacterias a bajos valores de pH, ofreciendo la ventaja de operar una
fermentación alcohólica evitando contaminación. Si se utiliza sacarosa como
fuente de carbono el sistema es más sensible al pH que al utilizar glucosa, ya que
la inversión de la sacarosa se acelera a pH bajos.
El producto final de una fermentación alcohólica esta constituido esencialmente
por una solución hidroalcohólica de ácidos orgánicos salificados en distintas
proporciones, especialmente de potasio, magnesio y calcio. Esta solución
contiene diferentes sustancias, que pueden permanecer en estado de solución
verdadera, de solución coloidal o de simple suspensión. Las proporciones de
estos constituyentes pueden ser sensiblemente variables entre ellos y esto en
función de diversos factores tales como pH. El pH es una característica de
primaria importancia, y esto por diferentes motivos. Ante todo organolépticamente
el pH influye fuertemente sobre la sensación de acidez, dado que ésta depende
más de la concentración hidrogeniónica (fuerza ácida) que de la cantidad de
ácidos contenidos. Sobre la formación del fosfato férrico y consiguiente quiebra
fosfática tiene fuerte influencia el pH, y se ha podido demostrar que el pH óptimo
para el pleno desarrollo de éste fenómeno se sitúa sobre el valor de 3.3. A valores
sensiblemente inferiores o superiores el enturbiamiento no aparece. Se puede
comprender como las desviaciones de pH pueden hacer aparecer riesgos que no
se tenían, hecho que se produce, por ejemplo, a continuación del tratamiento de
un vino con un desacidificante o también por la adición directa de un ácido (De
Rosa, 1998, 239).
2.2.2.1 Ajuste del pH
•
Adición de ácido tartárico o de ácido cítrico: Los dos únicos ácidos que se
pueden usar tanto tecnológicamente como legalmente, son el ácido tartárico y
el cítrico.
11
•
Desacidificación:
Los desacidificantes utilizables técnicamente en las
fermentaciones son: el carbonato de calcio, el bicarbonato de potasio y el
tartrato neutro de potasio.
2.2.2.2 Buffers
En los medios de cultivo es deseable mantener un pH constante (rango 3.0 –3.5)
durante el proceso fermentativo y esto se logra mediante el empleo de
amortiguadores o buffers. También sucede que el pH en un medio de cultivo se
ajusta adicionando un compuesto alcalino, por ejemplo hidróxido de sodio si el pH
es demasiado ácido; o un compuesto ácido, por ejemplo el ácido clorhídrico, si el
pH es demasiado alcalino. Como los microorganismos suelen provocar cambios
en el pH de sus ambientes al desarrollarse, lo mejor es adicionar al medio de
cultivo un amortiguador de pH, actuando dentro de los límites máximos de pH; por
lo tanto, se deben seleccionar amortiguadores para diferentes regiones de pH.
Para límites próximos a la neutralidad (pH 6.0 a 7.5) el fosfato constituye un
amortiguador apropiado (Brock, 1993, 349). Generalmente los sistemas proteicos
de un medio de cultivo permiten un efecto buffer en el mismo.
2.2.3 Aireación
La velocidad de fermentación al inicio del proceso fermentativo, depende
estrechamente de las condiciones de aireación,
desarrollándose dicha
fermentación más rápidamente cuando las levaduras están mejor aireadas. Por lo
tanto, es conveniente airear el medio hasta el máximo, máximo que coincidirá con
él limite de solubilidad de un gas (oxígeno) en un liquido y que es muy bajo. Por
mucho que se airee al principio, se tenderá a alcanzar muy pronto la saturación
del mosto en oxígeno.
La utilización del oxígeno por levaduras sólo tiene lugar al comienzo de la
fermentación. Una vez arrancada ésta, no necesita oxigenación o de lo contrario
se desviaría el proceso alcohólico, y comenzaría entonces la metabolización de
los azúcares por vía respiratoria, produciendo mayor cantidad de células.
La fermentación con agitación es ligeramente más rápida que la fermentación sin
agitación. A pesar de ello, los niveles finales de etanol y azúcar obtenidos son
similares en ambas condiciones de operación, observándose un ligero aumento en
el grado alcohólico y el azúcar residual en la fermentación sin agitación (López,
Marzo de 1995, 55).
2.3 BIORREACTORES
Son dispositivos para el cultivo de microorganismos que permiten el control tanto
de la densidad de la población, como de la velocidad de crecimiento. Su
aplicación incluye la preparación de bebidas alcohólicas, como una amplia gama
en la industria biotecnológica.
Se pueden adaptar para realizar cultivos
12
discontinuos o continuos. En cultivos discontinuos, el microorganismo crece a
partir de una limitada cantidad de medio hasta que se agota un nutriente esencial
o se acumulan subproductos tóxicos hasta niveles que inhiben el crecimiento. En
cambio en el tipo continuo se emplean dos elementos en su control, la velocidad
de flujo y la concentración de un nutriente limitante.
2.3.1 Monitoreo y control de biorreactores
En el ambiente dentro de un biorreactor se debe asignar la óptima actividad
catalítica para las levaduras mediante parámetros como temperatura, pH, oxígeno
disuelto, velocidad de flujo, velocidad de agitación, que tienen un significativo
efecto en el desarrollo de la fermentación y las reacciones enzimáticas. Para
proveer el ambiente deseado, las propiedades del sistema deben ser
monitoreadas y se deben tomar acciones de control para rectificar cualquier
desviación de los valores deseados. El monitoreo y control de las fermentaciones
es un área activa de investigación destinada a mejorar la productividad de los
bioprocesos y alcanzar una confiable y uniforme operación de fermentación.
Varios niveles de procesos de control existen en la industria de la fermentación. El
control manual es el más simple, requiere de operación humana para manipular
dispositivos tales como bombas, motores y válvulas. La retroalimentación es
usada para mantener parámetros a valores específicos. Con la creciente
aplicación de los sistemas de computadoras en la industria de la fermentación,
también se quiere apuntar a la implementación de controles avanzados y
estrategias de optimización basado en modelos de fermentación.
2.3.2 Monitoreo de la fermentación
Para entender el control del estado de una fermentación se debe conocer las
variables críticas que afectan a un bioproceso. Estas variables pueden ser
agrupadas en tres categorías: físicas, químicas y biológicas. Muchas de las
medidas físicas están establecidas en la industria; otras están actualmente siendo
desarrolladas o son foco de investigación para obtener nuevos instrumentos.
Idealmente las medidas deben realizarse in situ y en línea. Actualmente el
monitoreo en línea tiene aplicación en los siguientes grupos:
•
Producción de biomasa.
•
Producción de enzimas microbianas.
•
Producción de metábolitos microbianos: etanol, ácido cítrico, acetona, butanol,
polisacaridos, vitaminas.
•
Procesos de transformación: glucosa a etanol, etanol a vinagre, producción de
antibióticos.
Las medidas que son realizadas en línea generalmente son: temperatura, presión,
pH, oxígeno disuelto, velocidad de flujo, velocidad de agitación, consumo de
energía, nivel de espuma.
13
Tabla 2.3 Parámetros medidos o controlados en biorreactores
FISICOS
TEMPERATURA, PRESION,
NIVEL DE LIQUIDO, NIVEL DE
ESPUMA, VELOCIDAD DE
AGITACION, CONSUMO DE
ENERGIA, VELOCIDAD DE
FLUJO DE GAS, VELOCIDAD
DE FLUJO DE MEDIO,
VISCOSIDAD DEL CULTIVO
QUIMICOS
PH, OXIGENO Y CO2
DISUELTO, POTENCIAL
REDOX, COMPOSICION DE
GAS DE SALIDA,
CONDUCTIVIDAD,
COMPOSICION DEL MEDIO
BIOLOGICOS
CONCENTRACION DE
BIOMASA, CONCENTRACION
DE ENZIMAS, COMPOSICION
DE BIOMASA(ADN, ARN,
PROTEINA,
ATP/ADP/AMP/NAD),
MORFOLOGIA.
FUENTE: DORAN, Pauline. Bioprocess Engineering principies.
2.3.3 Retroalimentación
Cuando se necesita mantener el valor de una variable constante durante el
proceso, por ejemplo el pH a un valor dado, se tienen diferentes sistemas
controladores. Uno de los controladores más simples es el de retroalimentación,
el cual consta de un aparato de medición (potenciómetro) que envía el valor de la
medición al controlador. En el controlador el valor medido es comparado con el
valor establecido o fijo y se registra la diferencia. La desviación con respecto al
valor real se llama error, el cual es usado por el controlador para determinar que
acción debe seguir para corregir el proceso. El controlador produce una señal la
cual es transmitida al ejecutar encendiéndolo o apagándolo; Para el caso del pH,
si la medida baja del punto determinado, una bomba adiciona álcali a la
fermentación hasta retornar el valor de pH requerido.
Figura 2.6 Componentes del retroalimentador
FUENTE: DORAN, Pauline. Bioprocess Engineering principles.
2.4 CULTIVOS CONTINUOS
14
Si se prepara un cultivo de tal forma que el cese del crecimiento se deba al
agotamiento del medio, es decir, limitación del substrato, en lugar de la
acumulación de metabolitos tóxicos, entonces la fase exponencial del crecimiento
puede prolongarse mediante la adición de nuevo medio al recipiente. Esta
operación puede repetirse hasta que el recipiente se llene, No obstante, si se
instala un sistema de flujo continuo en un fermentador de tal forma que el cultivo
fresco desplace, en un volumen igual, al cultivo agotado, entonces se puede
conseguir una producción de células de forma continua. Un fermentador continuo
de tanque agitado contiene dispositivos para la alimentación y descarga en
continuo. El contenido del recipiente se encuentra en estado estacionario, es
decir, no varia con el tiempo; esto se aplica a la retención de microorganismos y a
la concentración de los componentes del medio en el fermentador. Las
condiciones de estado estacionario pueden alcanzarse operando sobre principios
quimiostáticos, que implican ajustar el caudal del alimento al fermentador a un
valor apropiado y constante, permitiendo a las concentraciones de
microorganismos, substrato y producto bioquímico alcanzar sus niveles naturales.
En el quimiostato, el crecimiento de las células se controla ajustando la
concentración de un substrato mediante la fijación de una tasa de dilución que
fijará la tasa de crecimiento en el sistema. Cualquier substrato que se requiera
puede ser utilizado como substrato limitante. Generalmente los substratos
limitantes que más incidencia tienen en el crecimiento de la Saccharomyces
cerevisiae son el ion amonio, glucosa y fosfato (Crueger, 1991, 79).
Los efectos de diferentes tasas de dilución y concentración del substrato limitante
para la proliferación de los microorganismos se explican así: Cuando las tasas de
dilución son altas, el organismo no puede crecer lo suficientemente rápido para ir
de acuerdo con su dilución y el cultivo es lavado del quimiostato. En el otro
extremo, con tasas de dilución muy lentas una fracción importante de las células
pueden morir de inanición, puesto que el nutriente limitante no llega con la
suficiente rapidez para mantener el metabolismo celular. La concentración de
microorganismos en el quimiostato se controla por la cantidad de nutriente
limitante. Si la concentración de éste (nutriente en el medio que llega) se elevara
dejando constante la tasa de dilución, la concentración de microorganismos
aumentaría aunque la tasa de crecimiento seguiría siendo la misma y la
concentración de substrato en el quimiostato seguiría siendo virtualmente cero.
De esta manera, ajustando la tasa de dilución y la concentración de substrato,
experimentalmente se puede obtener a voluntad una variedad de concentración de
microorganismos y tasas de crecimiento. La figura 2.7 explica el comportamiento
del efecto de diferentes tasas de dilución respecto a la concentración de
microorganismos y las tasas de crecimiento.
15
Figura 2.7 Efectos de la tasa de dilución y concentración de substrato en un
quimiostato
Fuente: BROCK, T. Microbiología
De acuerdo a la gráfica anterior, se nota que a altas tasas de dilución, el
crecimiento no puede equilibrar la dilución, la población se extingue y la
concentración del substrato alcanza un máximo. Sin embargo, en el mayor rango
de tasas de dilución, la concentración de microorganismos permanece constante y
la concentración de substrato conserva un valor muy bajo.
Aunque la
concentración de microorganismos permanece constante, la tasa de crecimiento y
el tiempo de duplicación varía en un intervalo amplio.
En conclusión, los dispositivos para cultivo continuo (quimiostatos) son un medio
para mantener la población en crecimiento exponencial durante largos periodos.
Lo principal de un dispositivo para cultivo continuo es reabastecer lentamente el
recipiente del cultivo con medio fresco, en tanto se elimina el medio ya usado y las
células a la misma velocidad. La velocidad a la que se realiza esta dilución rige la
velocidad de crecimiento de la población celular en el recipiente del cultivo.
2.4.1 Diferencias entre cultivo continuo y discontinuo
•
•
•
El cultivo continuo opera bajo condiciones de un estado de equilibrio, es decir,
las concentraciones de todos los componentes del cultivo son constantes.
El cultivo continuo opera bajo condiciones limitantes de substrato mientras que
el cultivo discontinuo, en la fase exponencial, funciona en presencia de exceso
de substrato.
La velocidad de crecimiento en el cultivo continuo está controlada por la
velocidad de dilución (y por ello bajo el control del operario) y su valor es
siempre menor que la velocidad máxima de crecimiento µmax. Por en
contrario, la velocidad específica de crecimiento µ en la fase exponencial de un
16
cultivo discontinuo alcanzará la velocidad máxima de crecimiento µmax
correspondiente a las condiciones que prevalezcan en el cultivo.
2.4.2 Cinética del cultivo continuo
En un proceso continuo en condiciones de equilibrio la perdida de células debida
al fluido que sale debe ser balanceada por el crecimiento del
microorganismo(Trevan, 1990,86).
D=µ
La velocidad de flujo D se define como la velocidad de flujo volumétrico que entra
y sale a través del volumen del fermentador. D es definida como:
D=F/V
Donde D es la velocidad de dilución en h-1, V es el volumen de fermentador en ml
y F es el flujo en ml*h-1.
La concentración de substrato en el quimiostato viene determinada por la
velocidad de dilución. En efecto, esto se debe a que el crecimiento está
consumiendo el substrato hasta una concentración que permite que la velocidad
de crecimiento iguale a la velocidad de dilución.
Si el substrato se agota hasta un grado en que su concentración tenga un nivel
inferior al que soporta la velocidad de crecimiento impuesta por la velocidad de
dilución, se da la siguiente secuencia de sucesos (Trevan, 1990, 87):
•
La velocidad de crecimiento de las células será menor que la velocidad de
dilución y saldrán del quimiostato a una velocidad superior a la que se está
formando, por lo que decrece la producción.
•
La concentración de substrato en el quimiostato aumentará dado que existe un
número menor de células para consumir el substrato.
•
La mayor concentración de substrato ocasionará que las células crezcan a una
velocidad mayor que la velocidad de dilución, con lo que aumentará la
concentración de biomasa.
La disminución de la velocidad de crecimiento y el cese del crecimiento debido al
agotamiento de substrato puede describirse por la relación entre µ y la
concentración residual de substrato limitante esencial. El substrato limitante es
aquel componente del medio que primero se agota y esto se explica de acuerdo a
la relación de Monod. El efecto controlador de la velocidad de dilución está
regulado, esencialmente, por la relación entre µ y s(Trevan, 1990, 87):
µ = µmax x s / Ks + s
donde s es la concentración residual del substrato limitante y Ks es la constante de
utilización o saturación para el substrato limitante y equivale a la concentración de
substrato cuando el valor de µ es la mitad que el de µmax.
En un estado de equilibrio µ = D; por lo tanto:
17
D = µmax x se / Ks + se
Donde se es la concentración del substrato residual en el estado de equilibrio.
Despejando se de la ecuación anterior resulta:
se = Ks x D / µmax – D
Esta ecuación predice que la concentración de substrato en el quimiostato viene
determinada por la velocidad de dilución. En efecto, esto se debe a que el
crecimiento está consumiendo el substrato hasta una concentración que permite
que la velocidad de crecimiento iguale a la velocidad de dilución.
La concentración de células en el quimiostato en el estado de equilibrio viene
definida por la ecuación:
xe = Y ( SR – ( Ks x D / µmax – D ) )
donde:
Y es factor de rendimiento para el substrato limitante (g biomasa/ g substrato
consumido).
SR es la concentración original del substrato en el medio.
La velocidad específica máxima de crecimiento en los procesos industriales se
escoge de forma que se obtenga el rendimiento más alto en el volumen más
pequeño del fermentador y en el tiempo más corto.
El modelo de Monod no es generalmente aplicable a la fermentación continua a
velocidades muy bajas o muy altas de dilución. A velocidades medias de dilución
la relación molar entre la biomasa producida y el CO2 que se desprende es
constante. A bajas velocidades de dilución la proporción de CO2 se hace más
grande. Esto se debe a que se utiliza más fuente de energía para el
mantenimiento de la estructura celular, para la regulación osmótica o para la
motilidad de la célula. Por otra parte, a velocidades altas de flujo una parte del
carbono añadido es oxidado incompletamente (a productos como piruvato, acetato
o ácidos tricarboxílicos) y de esta forma se reduce la productividad. A bajas
velocidades de flujo, con nitrógeno como substrato limitante, se forman materiales
de reserva, como polisacáridos, lo que resulta en un aumento en el tamaño de la
célula y por tanto de la biomas
18
CAPITULO 3
MATERIALES Y METODOS
En este capítulo se describen las metodologías que fueron utilizadas para la
realización de este trabajo. Las metodologías internacionalmente aceptadas,
fueron adaptadas a las infraestructuras de los laboratorios con los que cuenta la
Facultad de Ingeniería.
3.1
PROCEDIMIENTO
Para la implementación de las normas se realizaron los siguientes pasos:
Tabla 3.1 Normas y métodos utilizados
DETERMINACION
NORMA/METODOS
Nitrógeno
Norma AOAC 960.52
Etanol
Manual de métodos analíticos para el
control de calidad de bebidas
alcohólicas (NTC) y norma AOAC
969.12
Azúcares reductores
Sólidos solubles totales y % Sacarosa
Norma AOAC 923.09
Refractómetro y Sacarómetro
Conteo de microorganismos
Método cámara de conteo
FUENTE: Autores
− Elaboración de curvas de calibración para los métodos de determinación de
nitrógeno y azúcares reductores, utilizando muestras de concentración
conocida, para los métodos empleados.
1
− Cálculo del porcentaje de error de exactitud al comparar el valor teórico de las
muestras de concentración conocida con el valor de las muestras
experimentales.
3.2
DISEÑO EXPERIMENTAL
3.2.1 Diagramas de flujo
3.2.1.1 Pruebas preliminares
Preparación de medios de cultivo s1,
s2, s3, n1, n2, n3 (s= medio
semisintético, n= medio natural)
Cada medio se prepara por
triplicado en erlenmeyer de
500
ml
debidamente
Activación de levadura a 35°C en
solución 5% de azúcar
Inocular la levadura activada a
cada medio preparado
Desarrollo de las fermentaciones a
temperatura de 25 °C hasta
estabilización de sólidos solubles
totales
Determinación de parámetros en
función del tiempo: número de
microorganismos, sólidos solubles
totales, %sacarosa, pH
Evaluación de las fermentaciones:
selección del medio de mayor
fluctuación de pH
3.2.1.2
Se toma una muestra diaria de
15 ml cada medio (s1, s2, s3,
n1, n2, n3). Se determina
media aritmética y desviación
Se
determina
mediante
regresión lineal la pendiente
para cada medio de cultivo y
el porcentaje de variación de
Pruebas en el Bioflo
Configuración del funcionamiento del
bioflo: velocidad de agitación,
concentración de ácido y base para
regulación de pH y bombas de
alimentación
Para la velocidad de agitación
se observan los tiempos de
operación a velocidades de
50, 75 y 100 r.p.m. Para la
concentración de ácido y
base,
se
emplea
concentraciones de 1 N y 5 N
2
Fermentación alcohólica en el
biorreactor, preparación de medio de
cultivo a 10 litros bajo condiciones
constantes de temperatura 25 °C y pH
de 4.5, paralelo a una fermentación
sin funcionamiento del sistema de
regulación de pH a 25°C.
Determinación de parámetros en
función del tiempo: número de
microorganismos, sólidos solubles
totales y %sacarosa, nitrógeno total.
Determinación de parámetros finales:
contenido de etanol y azúcares
residuales
Elaborar guía de manejo y
funcionamiento del bioflo bajo trabajo
de regulación de pH
Trabajo preliminar para manejo del bioflo
en cultivos continuos: concentración de
substrato limitante y tasa de dilución.
El número de réplicas de cada
fermentación es de dos (2)
empleando el medio s2.
Se realiza por triplicado
tomando una muestra diaria
de 30 ml a excepción de
porcentaje de sacarosa que se
toma
al
final
de
la
fermentación Se determina la
Se realiza al final de cada
fermentación por triplicado
determinando media aritmética
y desviación estándar
Se emplea el medio s2 a un
volumen de 10 litros, tomando
muestra diaria para determinar
crecimiento
de
microorganismos, contenido
3.2.2 Preparación de los medios de cultivo para pruebas preliminares
El medio de cultivo utilizado para este estudio se presenta en la tabla 3.2 y 3.3
Tabla 3.2 Medios de cultivo semisintéticos
CONTENIDO
MEDIO S1
MEDIO S2
MEDIO S3
Extracto de levadura
(g/l)
8.00
8.00
8.00
Sacarosa (g/l)
100.00
100.00
100.00
Metabisulfito de
Sodio (g/l)
0.05
0.05
0.05
Solución Madre de
Complejo vitamínico
(ml/l de medio)
0.11
0.11
0.11
3
Sulfato de Amonio
(NH4)2SO4 (g/l)
0.25
Fosfato de Amonio
(NH4)2HPO4(g/l)
0.25
Fuente: Autores
Tabla 3.3 Medio de cultivo naturales
CONTENIDO
MEDIO N1
MEDIO N2
MEDIO N3
Piña (Ananas
comosus) (g/l)
1000.00
1000.00
1000.00
Metabisulfito de
Sodio (g/l)
0.05
0.05
0.05
Solución Madre de
Complejo vitamínico
(ml/l de medio)
0.11
0.11
0.11
Sulfato de Amonio
(NH4)2SO4 (g/l)
Fosfato de Amonio
(NH4)2HPO4(g/l)
0.25
0.25
Fuente : Autores
Cada medio se elaboró por triplicado. Posteriormente se debe llegar a 20°Brix con
más adición de sacarosa.
3.2.3 Esterilización de los erlenmeyer y adecuación de los medios de cultivo
Para la esterilización de los 18 erlenmeyer se utilizó una estufa WTB-BINDER,
para ello se procedió a cerrarlos con papel aluminio, con el fin de que
permanecieran estériles hasta el tiempo en el que fueran utilizados. La
esterilización se llevó a cabo a 200oC durante dos horas. Se procedió a la
introducción del medio en los erlenmeyer, este proceso se realizó dentro de una
cámara de flujo laminar CAE ET (30"x36"x6"), para evitar la contaminación de los
medios de cultivo. Luego se aumentó la temperatura de los medios a 25oC, al
colocarlos en una estufa Binder adecuada a esta temperatura. En la preparación
del medio de cultivo se agregó el metabisulfito de sodio con el fin de realizar una
inhibición bacteriana química, y de esta forma, evitar el crecimiento de la flora
bacteriana que podría contaminar el medio, formada principalmente por bacterias
fermentativas tolerantes a medios ácidos.
4
3.2.4 Activación e inoculación de la levadura
La levadura Saccharomyces cerevisiae se activó previamente antes de ser
inoculada en cada cultivo. Esta preparación es necesaria para 1 litro de medio.
Se pesó 5 gramos de sacarosa comercial y se depositaron en el balón aforado de
100 ml completando el volumen con agua destilada. Se colocó en el baño
termostatizado hasta que llegó a una temperatura de 35 °C. Se pesó 0.6 gramos
de levadura y se colocó en el vaso de precipitado de 100 ml. Se añadió 6 ml de la
solución azucarada y se dejó en el baño termostatizado a 35 °C hasta que se
notara la presencia de gas (CO2). (Alba y Sierra, 1999, 76)
Se depositaron los 6 ml de la levadura activada para inocular el medio de cultivo el
cual se fijo a 20 °Brix adicionando sacarosa.
La inoculación de la levadura se realizó tomando en consideración los
procedimientos para el manejo estéril de cultivos.
Para ello todas las
inoculaciones se realizaron en la cámara de flujo laminar CAE ET, utilizando
material previamente esterilizado (pipetas, erlenmeyer) y utilizando el mechero
para flamear todo el material que tuviera contacto con los medios.
3.2.5 Variables a medir durante la fermentación preliminar
3.2.5.1
pH
Para medir el pH, se tomó una muestra diaria de cada medio durante la
fermentación, agitando previamente de manera suave durante 30 segundos el
medio de cultivo. El pH fue medido mediante un potenciómetro debidamente
calibrado.
3.2.5.2
Número de microorganismos
El conteo se realizó diariamente por triplicado durante la fermentación, empleando
la cámara de conteo Neubauer Improved en el microscopio.
3.2.5.3
Sólidos solubles totales y %sacarosa
Los sólidos solubles totales se tomaron diariamente y por triplicado durante la
fermentación, empleando el refractómetro y el porcentaje de sacarosa se tomó el
día final de la fermentación utilizando el aerómetro-sacarómetro, según °Brix Tp 20
°C.
3.2.6 Análisis de los datos obtenidos en las pruebas preliminares
Para la determinación de los parámetros se tomaron muestras diarias de manera
estéril y por triplicado. El análisis se realizó mediante un manejo estadístico
simple, determinando cual es el medio de cultivo que presenta mayor rango de
5
fluctuación de pH. Las metodologías que se siguieron para la determinación de
los parámetros se presentan en la sección 3.3.
3.2.7 Pruebas preliminares en el Bioflo
Se realizaron ensayos preliminares con el medio que presentó mayor rango de
fluctuación de pH, a un volumen de 6 litros; Estas pruebas permitieron configurar
las siguientes condiciones para llevar a cabo la fermentación alcohólica:
•
Determinación de velocidad de agitación. De manera previa empleando agua y
posteriormente con medio.
•
Concentración de ácido y base para regulación de pH empleando ácido cítrico
y carbonato de calcio, solo con funcionamiento del sistema regulador del Bioflo.
Se determinó mediante las necesidades volumétricas de ácido y base para
regular el pH en el funcionamiento del mismo sistema regulador.
•
Configuración de bombas de alimentación peristálticas para salida y entrada de
flujos del biorreactor.
3.2.8 Fermentación alcohólica en el Bioflo.
Se utilizó el medio de cultivo evaluado en ensayos preliminares. El número de
réplicas de las fermentaciones son dos (2) con un volumen total de 10 litros.
Las fermentaciones en el biorreactor se llevaron a las siguientes condiciones
constantes:
•
Temperatura de 25° C
•
pH de 4.5: pH que permite evaluar mejor el sistema de bombas peristálticas y
observar el desarrollo continuo del sistema de regulación de pH, ya que difiere
del pH normal del desarrollo de una fermentación (pH de 2.8 hasta 3.8).
3.2.9 Fermentación alcohólica sin regulación de pH.
Se utilizó el medio de cultivo evaluado en ensayos preliminares. El número de
réplicas de las fermentaciones son dos (2) con un volumen total de 10 litros.
Las fermentaciones en el biorreactor se llevaron a las siguientes condiciones
constantes:
•
Temperatura de 25° C
•
Se realizó la comparación de las dos fermentaciones mediante los datos de las
variables medidas a lo largo de cada fermentación.
3.2.10 Diagrama de flujo de puesta en marcha de una fermentación en el
Bioflo
Lavar y esterilizar el vaso del Bioflo en autoclave
6
Preparar medio de cultivo en recipiente de 10 litros
Ajustar sólidos solubles totales a 20° Brix
Instalar el vaso en la cabina de control y agregar el medio de cultivo
Conectar mangueras del condensador y adaptar el motor al vaso
Insertar la termocupla y abrir la válvula de agua a una presión de 20 psi
Encender el Biorreactor y seleccionar modo 2 de fermentación.
Calibrar e instalar el potenciómetro
Fijar la temperatura y pH de trabajo: 25°C y 4.5 respectivamente
Inocular la levadura y fijar agitación al medio.
Medir a diario: Número de m.o, sólidos solubles totales, Contenido de nitrógeno, y
pH en fermentación sin regulación.
Determinar al final de la fermentación: azúcares reductores, contenido alcohólico y
% de sacarosa.
3.2.11 Reproducibilidad de la fermentación alcohólica en el Bioflo
La reproducibilidad de la fermentación alcohólica se determinó por medio de las
variables a ser medidas durante el desarrollo de cada fermentación tanto para la
fermentación con regulación de pH y sin regulación.
3.2.11.1 Variables a medir durante la fermentación
•
Número de microorganismos: Se tomó una muestra diaria durante la
fermentación para conteo total mediante cámara Neubauer Improved.
7
•
Sólidos solubles totales y % sacarosa: Se tomó una muestra diaria, se realizó
por refractómetro y sacarómetro respectivamente. El porcentaje de sacarosa
se tomó solo al final de cada fermentación.
•
Nitrógeno total: Se tomó una muestra diaria, se realizó mediante método
Kjeldahl.
•
Contenido de etanol: Al final de la fermentación se tomó una muestra, se
realizó mediante destilación alcohólica, según Norma Icontec.
•
Azúcar residual: Al final de la fermentación, se realizó mediante método de
AOAC 923.09.
•
pH: Se realizó la lectura en el monitor del Bioflo diariamente.
3.2.11.2
Técnicas utilizadas
•
Número de microorganismos: Cámara de conteo Neubauer Improved.
•
Sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa: Refractómetro y aerómetro
(sacarómetro).
•
Nitrógeno total: Método Kjeldahl, según Norma AOAC 960.52.
•
Contenido de etanol: Método de destilación, según el Manual de Métodos
analíticos para el control de calidad de bebidas alcohólicas (ICONTEC).
•
Azúcar residual: Norma AOAC 923.09.
3.2.11.3 Validación estadística de los datos
El análisis se realizó mediante un manejo estadístico simple, determinando media
aritmética y desviación estándar en cada una de las variables medidas a lo largo
del proceso de fermentación con un intervalo de confianza del 95%.
3.2.12 Pruebas preliminares para trabajo de cultivos continuos
Se trabajó de manera preliminar un cultivo continuo en el Bioflo, utilizando el
medio semisintético con fosfato de amonio, que fue alimentado durante el proceso
con el mismo. Se trabajó un cultivo con un volumen constante de 10 litros en el
vaso del Biorreactor.
Se establecieron los siguientes parámetros:
•
Concentración de sustrato limitante.
•
Tasa de dilución, que determina la tasa de crecimiento. Los cultivos
preliminares en sistema cerrado permiten establecer la tasa de crecimiento en
la fase exponencial; en la fase exponencial se encuentra el máximo consumo
de sustrato limitante y formación de producto. En el cultivo continuo, la salida
de producto determina la entrada de sustrato limitante al sistema abierto.
8
3.3 MATERIALES Y METODOS
3.3.1 Método Kjeldahl para la determinación de nitrógeno total
3.3.1.1 Fundamento del método
En este método la muestra analizada se descompone con ácido sulfúrico
concentrado en caliente, para convertir el nitrógeno en ion amonio. Cuando la
descomposición se completa, la solución resultante se enfría, se diluye y se
alcaliniza con hidróxido de sodio. El amonio liberado se separa por destilación y
se recoge en una solución ácida y posteriormente se cuantifica por titulación.
El ácido sulfúrico que se utiliza para descomponer la muestra, oxida al carbono e
hidrógeno a dióxido de carbono y agua, siendo esta etapa la más crítica en este
método.
3.3.1.2 Reacciones que se presentan
muestra + H2 SO4 + H2O
(NH4)2 SO4 + 2 NaOH
(NH4)2 SO4 + CO2
Digestión
2NH3 + Na2 SO4 + 2H2O Destilación
2 NH3 + 2H3BO3
2H2BO3- + 2NH4+ Destilado
2H2 BO3- + 2HCl
2H3 BO3 + 2Cl- Titulación
Para calcular un volumen teórico de HCl con una normalidad dada se tiene de la
estequiometría de la reacción:
ml de HCl x Normalidad = Xg N [(132g (NH4)2 SO4 x 34g NH3 x121g H2BO3 x 73 g
HCl x 1 equiv. HCl x 1000ml) / (28g N x 132g (NH4)2 SO4 x 34g NH3 x121g H2BO3
x 36.5 g HCl)]
Donde se obtiene:
ml de HCl x Normalidad HCl = Xg Nitrógeno x 71.43
3.3.1.3 Materiales
− Sistema de digestión de KJELDAHL BUCHI B-316
− Unidad de destilación BUCHI B-316
− Centrífuga HERMLE Z320
− Tubos de vidrio para digestión BUCHI
− Vaso de precipitado de 1000 ml (plásticos)
− Bureta de 10 ml ( + 0.05 ml)
− Pipetas de 5 y 10 ml (+ 0.045 - 0.05 ml) respectivamente
9
− Erlenmeyer de 250 ml
− Placa de calefacción y agitación
− Tubos para centrífuga
− Balanza analítica
3.3.1.4 Reactivos
− Acido sulfúrico concentrado r.a
− Pastillas catalizadoras de Kjeldahl sin selenio
− Indicador de Taschiro
− Acido bórico al 2%
− Solución de hidróxido de sodio al 32%
− Acido clorhídrico 1 N
− Agua destilada
− Carbonato de sodio
3.3.1.5 Procedimiento
!
Digestión
− Tomar una muestra homogenizada de 20 ml del fermento y colocarla en un
tubo de ensayo para centrifugarla a 4000 r.p.m. durante 20 minutos.
− Una vez centrifugado eliminar el
pipeta de 5 ml.
líquido sobrenadante con ayuda de una
− Adicionar al tubo de ensayo 20 ml agua destilada y agitar vigorosamente para
que el sedimento se separe de la parte inferior del tubo.
− Verter esta solución en un tubo de vidrio para digestión de Kjeldahl y enjuagar
dos veces más el tubo de ensayo con agua destilada, vertiendo el agua de
enjuague en el tubo de vidrio para digestión.
− Adicionar 20 ml de ácido sulfúrico concentrado y una pastilla de catalizador de
Kjeldahl sin selenio.
− Encender el sistema de digestión BUCHI dejando el control de temperatura
10 e instalar el tubo de vidrio con la muestra junto con el sistema
evacuación de gases.
Se debe asegurar debidamente el sistema
evacuación de gases para evitar fugas, observando que los gases circulen
el sentido correcto.
en
de
de
en
− Al iniciar la digestión se debe regular la temperatura del sistema de digestión,
observando la formación de un anillo de gases en la parte media del tubo de
vidrio de digestión.
10
− Calentar hasta que se complete la reacción, esto se verifica cuando la solución
resultante toma una coloración verde manzana traslúcida.
− Dejar enfriar y permitir la completa evacuación de los gases de digestión.
− Desmontar el sistema y pasar a la unidad de destilación.
!
Destilación:
− Verificar el correcto funcionamiento de la unidad de destilación BUCHI,
observando los contenedores de ácido bórico, NaOH y agua destilada. A la
vez, se debe abrir la llave de refrigerante.
− Configurar la unidad de destilación en el panel de control, seleccionando el
debido método de trabajo, que establece una destilación de 5 minutos.
− Adaptar el tubo de vidrio de digestión en la unidad de destilación y a la vez
colocar un erlenmeyer de 250 ml para recoger el destilado.
− Iniciar la destilación oprimiendo la tecla “enter”, en este momento la unidad
adiciona 80 ml de NaOH al 32% al tubo de digestión y 75 ml de ácido bórico al
2% al erlenmeyer.
− Una vez terminado el tiempo de destilación se retira el tubo de digestión y el
erlenmeyer que contiene el destilado.
− Adicionar indicador taschiro y se procede a valorar la solución del erlenmeyer
recolector de 250 ml con ácido clorhídrico 1 N debidamente valorado, con un
viraje de color verde a azul oscuro.
3.3.1.6 Cálculo y expresión de los resultados
El contenido de nitrógeno de la muestra se calcula de la siguiente manera:
Nm= (VHCl * NHCl)/71.43
Donde:
Nm: contenido de nitrógeno de la muestra en gramos.
VHCl: volumen de HCl gastados en la titulación en ml.
NHCl: Normalidad de HCl (equivalentes por litro). En éste caso 0.94656 N (Solución
de HCl 1N debidamente valorada con NaOH 1 N valorado con biftalato de potasio)
71.43: constante de la estequiometría de las reacciones.
3.3.2 Método para la determinación de azúcares reductores por titulación de
Lane y Enyon
3.3.2.1 Fundamento del método
Los azúcares reductores están constituidos por aquellos azúcares que poseen
acción reductora directa sobre una solución cupro-tartárico-alcalina.
11
Esta determinación comprende los siguientes pasos:
!
Clarificación
!
Determinación de azúcares reductores totales por titulación. (Método
volumétrico).
El método volumétrico o la titulación de Lane y Eynon para la determinación de
azúcares reductores consiste en la adición de la muestra a determinar azúcares
reductores a una solución de reactivo de Felhing. La titulación termina cuando la
solución que contiene los azúcares reductores reduce la solución de Felhing con la
aparición de un precipitado de coloración roja debido al óxido cuproso.
3.3.2.2 Materiales
− Balón aforado de 100 ml (+ 0.1 ml)
− Balón aforado de 1000 ml (+ 0.4 ml)
− Balón aforado de 2000 ml (+ 0.6 ml)
− Balón aforado de 250 ml
− Balanza analítica METTLER TOLEDO (+ 0.1 mg)
− Pipeta volumétrica de 10 ml (+ 0.05 ml)
− Vaso de precipitado de 1000 ml
− Vaso de precipitado plástico de 1000 ml
− Vaso de precipitado de 250 ml
− Erlenmeyer de 500 ml
− Embudo de Buchner
− Papel filtro diámetro de poro de 0.2 µm
− Perlas de vidrio
− Placa calefactora y de agitación
− Bureta de 10 ml (+ 0.05 ml)
− Bureta de 50 ml (+ 0.1 ml)
3.3.2.3 Reactivos
•
Solución de azúcar invertido al 1% (2 litros)
− Sacarosa pura y seca = 23.75 granos
− Acido benzoico = 4 gramos
− Acido clorhídrico = 9 ml r.a.
− Agua destilada = 2000 ml
12
•
Solución A (1 litro)
− Sulfato cúprico puro 5H2O = 69.3 gramos
− Agua destilada = 1000 ml
•
Solución B (1 litro)
− Tartrato de sodio y potasio tetrahidratado = 354 gramos
− Hidróxido de sodio puro = 100 gramos
− Agua destilada = 1000 ml
•
Clarificación del fermento
− Solución saturada de acetato neutro de plomo
− Oxalato de potasio anhidro
•
Titulación
− Azul de metileno
3.3.2.4 Procedimiento
•
Preparación de solución estándar de azúcar invertido
− Disolver 23.75 gramos de sacarosa pura en cerca de 120 ml de agua en un
matraz volumétrico de 250 ml. Añadir 9 ml de HCl concentrado y déjese en
reposo durante 8 días a temperatura ambiente. Diluir hasta la marca con agua.
Transferir 200 ml a un matraz volumétrico de 2 litros. Añadir cerca de 200 ml
de agua agitando y 71.4 ml de una solución de NaOH 1 N y 4 gramos de ácido
benzoico. Agregar 1 litro de agua, mezclar y verificar con papel indicador que
la solución tenga aproximadamente un pH de 3. Ajustar si es necesario y diluir
hasta la marca. Esto produce una solución estable al 1% (m/v) de azúcar
invertido.
•
Clarificación del fermento
− Tomar 100 ml del fermento y colocarlo en un vaso de precipitado.
− Neutralizar exactamente con solución de NaOH 1N.
Para soluciones
coloreadas es conveniente utilizar
un potenciómetro para controlar la
neutralización.
− Agregar por pequeñas porciones, solución de acetato neutro de plomo, hasta
que no se observe la formación de más precipitado.
− Diluir con agua hasta la marca del matraz, mezclar y dejar en reposo.
− Filtrar la parte sobrenadante, utilizar papel y embudos secos (filtrar a vacío).
− Agregar por pequeñas porciones, oxalato de potasio anhidro, agitando después
de cada adición hasta que no se observe la formación de más precipitado.
Volver a filtrar.
13
El filtrado que se obtiene corresponde, volumen a volumen, con el fermento
original.
•
Determinación de azúcares por titulación
− Colocar en un erlenmeyer de 500 ml, 15 ml de agua destilada, 5 ml de la
solución B y 5 ml de la solución A.
− Añadir algunas perlas de vidrio y colocar el erlenmeyer con la solución de
Felhing en una placa calefactora.
− Hervir la solución exactamente 2 minutos.
− Agregar 4 gotas de azul de metileno 5 segundos antes de terminar el periodo
de ebullición.
− Añadir desde la bureta el fermento a la solución en ebullición hasta que
desaparezca el color azul dejando la coloración roja debida a la aparición de
óxido cuproso. Esta titulación no debe sobrepasar los 3 minutos.
3.3.2.5
Cálculo y expresión de los resultados
La concentración de azúcares reductores en el fermento se determina de la
siguiente manera:
[ ] Azúcares reductores = g de azúcar invertido que reducen 10 ml de Felhing/
Volumen de titulación en ml.
Los gramos de azúcar invertido que reducen 10 ml de Felhing se obtienen a partir
de una titulación con la solución patrón de azúcar invertido al 1%.
3.3.3 Determinación del número de microorganismos por recuento en
cámara de conteo Neubauer Improved.
3.3.3.1 Fundamento del método
Las cámaras de conteo se utilizan para determinar microscópicamente el número
de microorganismos totales (vivos y muertos) en un determinado volumen de
suspensión. Este método se emplea en muestras con concentraciones de
microorganismos mayores o iguales 106 m.o/ ml y que no contengan partículas
que impidan determinar de manera precisa el número de microorganismos.
En las cámaras de conteo hay una retícula grabada sobre la superficie de una
placa de vidrio, con cuadros de un área pequeña y conocida. Sobre cada cuadro
hay un volumen de magnitud conocida, muy pequeña, pero medida con mucha
precisión. Se debe contar la cantidad de células por unidad de área de la retícula,
empleando el microscopio de contraste, obteniendo una medida del número de
células por el pequeño volumen de la cámara. De aquí se determina fácilmente el
número de células por mililitro de suspensión, multiplicándolo por un factor de
dilución basado en el volumen de la cámara donde se colocó la muestra.
14
La cámara de conteo Neubauer Improved es detallada a continuación. La
profundidad de la cámara es de 0.1 mm. La cuadrícula de recuento muestra 9
cuadros grandes, cada uno de 1 mm2. Los 4 cuadros grandes de las esquinas
están divididos en 16 cuadros con aristas de 0.25 mm. Se utilizan para recuento
de leucocitos. El cuadrado grande central esta dividido en 25 cuadrados
medianos con aristas de 0.2 mm y cada cuadrado mediano esta subdividido en 16
cuadrados pequeños con aristas de 0.05 mm y una superficie de 0.0025 mm2.
Todos los cuadrados medianos tienen líneas de límite triple. La línea central es la
frontera y decide si las células de esta zona se deben contar o no.
3.3.3.2 Materiales
− Microscopio de contraste de fases
− Cámara de conteo Neubauer Improved
− Tubos de ensayo
− Pipeta de 10 ml (+0.075 ml)
− Pipeta de 1 ml (+0.01 ml)
− Mechero de alcohol
− Macropipeta
− Goteros
3.3.3.3 Reactivos
− Formaldehído
− Agua destilada
3.3.3.4 Procedimiento
− Tomar por triplicado muestras de fermento de manera homogénea de 1 ml y
diluir a 1x10-1 en un tubo de ensayo (9ml de agua destilada y 1 ml del medio
fermentado).
− Adicionar dos gotas de solución de formaldehído al 40%.
− Agitar y tomar una o dos gotas de la suspensión homogénea, colocándola
sobre la cámara Neubauer Improved. Cubrir con un cubreobjetos el área de
las celdas.
− Colocar la cámara de conteo en el microscopio y enfocar con el lente de 40X,
ajustando el debido contraste.
− Situarse en el cuadro grande central de los 9 cuadrados existentes de la
cámara.
15
− Hacer el conteo de los cinco cuadrados que conforman el cuadrado grande
central, preferiblemente en forma diagonal. Cada cuadrado tiene a su vez 16
cuadrados pequeños.
3.3.3.5 Cálculos y expresión de los resultados
Realizar los cálculos correspondientes según la siguiente fórmula estadística:
NMO = P / (SC x Pf x Fd)
•
NMO = Número de microorganismos por microlitro (µl). Si el resultado se
requiere expresar por ml, se debe multiplicar por 1000 el resultado obtenido.
•
P = Número de partículas contadas. Corresponde al promedio de 5 cuadros.
•
SC = Superficie contada que corresponde a 0.04 mm2.
•
Pf = Profundidad de la cámara que corresponde a 0.1 mm.
•
Fd = Factor de dilución utilizado
3.3.4 Método para la determinación del contenido alcohólico de etanol por el
método de destilación simple
3.3.4.1 Fundamento del método
La muestra se somete a destilación simple en condiciones específicas y en el
destilado se determinan los grados alcoholimétricos (porcentaje de etanol en
volumen), utilizando un alcoholímetro.
3.3.4.2 Materiales
− Alcoholímetros Gay Lussac – Cartier a 15 °C(+ 0.1 °G.L)
− Mechero de gas
− Probeta de 250 ml
− Aparato de destilación
− Balón aforado de 250 ml
− Perlas de vidrio
3.3.4.3 Reactivos
− Agua destilada
3.3.4.4 Procedimiento
•
Destilación
16
− En un balón aforado de 250 ml adicionar la muestra y llenar hasta la marca.
− Instalar el aparato de destilación.
− En el balón de destilación verter la muestra, a continuación lavar el balón que
contenía la muestra con agua destilada, llenándolo hasta las tras cuartas
partes del mismo. Adicionar el agua de lavado al balón de destilación.
− Agregar perlas de vidrio para regular la ebullición. Comenzar la destilación con
un calentamiento regulado y continuo.
− Recoger el destilado en el mismo balón en que se midió la muestra, éste balón
debe estar sumergido en agua con hielo para evitar pérdidas debido a la alta
volatilidad del etanol.
− La destilación termina cuando se han completado las ¾ partes del balón que
recibe el destilado, retirando el tubo ubicado en la parte inferior del refrigerante
y lavándolo con agua por dentro y por fuera sobre el mismo balón.
− Completar a volumen con agua destilada hasta la marca.
•
Estimación del grado alcoholímetrico
− Llenar la probeta del alcoholímetro e introducir el mismo en la probeta.
− Dejar en reposo el alcoholímetro hasta que se estabilice realizando la lectura
por el menisco inferior del alcoholímetro.
3.3.5 Determinación de sólidos solubles totales y % de sacarosa
3.3.5.1 Fundamento del método
La determinación de sólidos solubles totales se basa en una medición
refractométrica de la cual se obtiene el valor a una temperatura dada.
El porcentaje de sacarosa se realiza mediante el uso de un aerómetro, el cual se
introduce en una solución y la lectura se realiza por el menisco que forma.
3.3.5.2 Materiales
− Refractómetro
− Sacarómetro
− Termómetro (0-110 °C)
− Probeta de 250 ml
3.3.5.3 Reactivos
− Alcohol
17
3.3.5.4
•
Procedimiento
Sólidos solubles totales
− Limpiar el prisma del refractómetro con alcohol y agua destilada, utilizando
algodón para evitar ralladuras.
− Verificar que la lectura sea cero colocando dos o tres gotas de agua destilada.
− Llevar a 20 °C la muestra del fermento.
− Hacer la respectiva medición con dos o tres gotas de fermento dejándolas caer
sobre el prisma.
− Observar la medición ajustando debidamente el refractómetro.
•
Porcentaje de sacarosa
− Tomar una muestra de 250 ml de fermento, llevarla a 20 °C y colocarlo en una
probeta
− Introducir el sacarómetro en la probeta, esperar a que se estabilice cuidando
de que no se pegue en las paredes. Realizar la lectura.
18
CAPITULO 4
PRESENTACION DE RESULTADOS
En este capítulo se presentan los resultados de las pruebas correspondientes al
diseño experimental presentado. Además se presenta la guía de manejo y
funcionamiento del sistema de bombas peristálticas del Biorreactor en una
fermentación alcohólica aplicando el sistema de regulación de pH. Cabe anotar
que en la metodología utilizada para determinar nitrógeno total y azúcares
reductores fue necesario realizar una estandarización del equipo previo al
desarrollo del método respectivo. En cuanto a las tablas de resultados, las celdas
que se encuentran sombreadas corresponden a los días en que no se tomó la
medida por ser fin de semana y el laboratorio no se encuentra disponible para su
uso.
4.1
GUIA DE MANEJO
PERISTALTICAS
DEL
SISTEMA
DE
BOMBAS
El Biorreactor Bioflo 3000 M1227 consta de un sistema de cinco bombas
peristálticas asignables dependiendo la variable a controlar. Cada bomba tiene un
modo de funcionamiento y operación dependiendo del parámetro a controlar en
una fermentación discontinua o continua. Los modos de funcionamiento son los
siguientes:
− Modo Off: En éste modo la bomba no tiene ningún funcionamiento ya que no
responde al Feedback Control Loop. La bomba se encuentra apagada.
− Modo Manual: Este modo funciona cumpliendo ciclos variables de las bombas.
Se le asigna un valor especifico entre 0% y 100%, que determina un caudal
para un porcentaje de velocidad.
− Modo Base y Acido: Cuando el sistema de regulación de pH entra en
funcionamiento, el modo ácido y base en las bombas peristálticas son los que
realizan la acción de control de pH a un valor especifico.
− Modo On: Este modo funciona cumpliendo una operación de velocidad fija en
la bomba y su valor es de 125%, donde la bomba funciona de manera
continua.
1
− Modos LVL1, LVL2, LVL3: Estos modos se utilizan cuando los sensores de
control de niveles en el Bioflo están presentes en el sistema. Generalmente
estos modos se utilizan para fermentaciones en continuo. Cada uno de los
modos de nivel pueden a la vez seleccionarse para manejo del sistema
continuo. Los modos de función del LVL1, 2 y 3 son Off, Add y Harvest. Esto
indica que cada sensor de nivel puede ser utilizado para alimentar de medio de
cultivo o para cosechar respectivamente, teniendo en cuento que cada sensor
de nivel se le asigna una bomba.
En general, para el sistema de bombas peristálticas se emplean como entrada o
salida de flujos del Biorreactor, las cuales deben instalarse apropiadamente para
su correcto funcionamiento (Ver Anexo D). La configuración de las bombas
depende de su uso y se instalan en el sistema así:
− Para flujos de entrada al Biorreactor: se adapta el tubo de silicona de 1/8 de
pulgada al puerto necesario. El tubo va desde el puerto hasta la parte baja de
la bomba seleccionada y debe dar vuelta a la bomba, para esto se coloca la
bomba en modo “ON”, hasta que se adapta totalmente el tubo. El tubo de
silicona termina por acoplarse al recipiente contenedor. La bomba se configura
en los modos mencionados.
− Para flujos de salida del Biorreactor: se adapta el tubo de silicona de 1/8 de
pulgada al puerto necesario. El tubo va desde el puerto designado hasta la
parte alta de la bomba seleccionada y debe dar vuelta a la bomba para
terminar acoplado en el recipiente contenedor.
Las bombas en su funcionamiento tienen unos ciclos variables de velocidad con
los cuales determinan caudales de entrada y de salida del Biorreactor. Los ciclos
variables se enuncian a continuación.
Tabla 4.1 Ciclos de funcionamiento de bombas peristálticas
D
%
V E L O C
I D
5
1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0
5
0
0
0
0
0
0
0
0
1 0 0
A T O S
F U N C
A D
D E
I O N
C I C L O S
D
A M I E N T O
T I E M P O
M U E R T O
( s e g )
1 5 . 0
1 3 . 5
1 3 . 0
1 2 . 8
1 1 . 5
1 0 . 9
8 . 9
7 . 8
6 . 8
5 . 5
5 . 2
3 . 0
E
C I C L O
D E
T R A B A J O
( # G I R O )
1 / 8
1 / 4
3 / 8
5 / 8
7 / 8
1
1 / 8
1
3 / 8
1
3 / 4
2
2
1 / 4
2
1 / 2
2
3 / 4
Fuente: Autores
2
A la vez se presenta los caudales determinados a diferentes porcentajes de
velocidad para las bombas peristálticas, medidos para caudales de entrada y de
salida, de acuerdo a las diferencias presentadas en el desarrollo posterior del
sistema en continuo empleando los puertos designados para cosecha y
alimentación del Bioflo ( Ver Anexo D). Se determinaron los caudales entre un
rango de 5 % – 50 % de velocidad de la bomba debido a su frecuencia de uso
para cultivos continuos.
Tabla 4.2 Caudales de bombas peristálticas para flujos de entrada y salida
empleando tubo de silicona de 1/8 “
%
VELOCIDAD
5
15
20
25
30
35
40
50
100
CAUDAL DE
ALIMENTACION
(m l/m in)
0.175
0.475
0.630
0.785
0.940
1.095
1.250
1.565
3.125
CAUDAL DE
COSECHA
(m l/m in)
0.200
0.575
0.780
0.985
1.190
1.395
1.600
2.004
4.031
% DIFERENCIA ENTRE
CAUDAL DE ALIMENTACION
Y COSECHA
12.50
17.39
19.23
20.30
21.01
21.51
21.88
21.91
22.48
Fuente: Autores
4.1.1 Configuración de sistema de bombas peristálticas para control de pH
Para la utilización del sistema de regulación de pH, en el Bioflo se deben
seleccionar dos bombas peristálticas para la adición de ácido y de base de
acuerdo a la acción de control. Los pasos a seguir son:
− Seleccionar el ácido y la base a utilizar para la regulación de pH. En éste caso
se utilizó ácido cítrico e hidróxido de potasio respectivamente.
− Adaptar dos tubos de silicona a las bombas seleccionadas. El tubo se instala
de la siguiente manera: desde el puerto de adición que se encuentra en la
tapa del vaso del Bioflo, hasta la parte de abajo de la bomba peristáltica,
dándole la vuelta alrededor de ella hasta el recipiente donde se encuentra el
ácido y la base respectivamente. Los recipientes a utilizar son erlenmeyer de
500 ml con tapón de caucho por donde se inserta el tubo de silicona. Cada
bomba debe configurarse en el modo ácido o base correspondiente.
− Después de adaptar los tubos de silicona de 1/8 de pulgada a las bombas se
deben conectar a los puertos de adición de ácido y base que se encuentran en
la tapa del Bioflo, según la figura incluida en el Anexo D.
− Para seleccionar el modo de funcionamiento de la bomba, en la pantalla del
Bioflo, se coloca el cursor en la columna “FEED1” y “FEED2” respectivamente,
con la tecla “ALTER” se pasa al modo base y ácido respectivamente. La
bomba se mueve en sentido horario, por lo cual el fluido se moverá en dicha
3
dirección. Verificar si el ácido o la base están siendo bombeados dentro del
vaso de acuerdo al siguiente paso.
− Escribir el valor del pH de trabajo, colocando el cursor en la columna de “pH1”
y fila “SET” y oprimir “ENTER”.
− En la pantalla “MASTER” del Bioflo, llevar el cursor a la columna “pH1” y fila
“CONTROL”, donde inicialmente aparece el letrero “OFF”. Oprimir la tecla
“ALTER” hasta que aparezca el titulo “P.I.D” para luego oprimir “ENTER”.
En el Anexo D se presentan las figuras de guía para la instalación y configuración
de sistema de bombas peristálticas y la configuración de los puertos de entrada y
salida de flujos del Bioflo.
4.2
RESULTADOS DE FERMENTACIONES PRELIMINARES
Se presenta las siguientes tablas de resultados para las fermentaciones en
erlenmeyer empleando medio semisintetico y natural.
Tabla 4.3 Resultados para medio semisintético
S1
DIA
pH
°Brix
Rango +
Rango -
Rango +
Rango -
S2
N° m .o/m l
pH
°Brix
Rango + Rango -
Rango +
Rango -
Rango +
Rango -
S3
N° m .o/m l
pH
°Brix
N° m .o/m l
Rango + Rango -
Rango +
Rango -
Rango +
Rango -
Rango + Rango -
0
6.35
6.32
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
6.76
6.72
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
6.36
6.34
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
1
4.69
4.62
20.1
19.5
3.4E+07
2.8E+07
4.82
4.76
20.1
19.7
4.4E+07
3.1E+07
4.60
4.58
20.1
19.3
3.7E+07
2.6E+07
4
3.93
3.65
9.3
8.9
6.1E+07
5.8E+07
3.77
3.60
9.4
8.2
6.6E+07
4.4E+07
3.73
3.67
8.5
8.1
8.8E+07
4.4E+07
5
3.94
3.66
8.7
7.8
1.1E+08
8.6E+07
3.78
3.62
8.3
7.3
9.6E+07
6.4E+07
3.75
3.70
7.8
6.8
1.5E+08
8.2E+07
6
3.94
3.65
8.2
7.1
1.5E+08
1.1E+08
3.80
3.64
7.5
6.6
1.1E+08
6.6E+07
3.77
3.72
6.9
6.2
1.1E+08
9.2E+07
8
3.98
3.68
6.5
6.0
7.5E+07
5.6E+07
3.83
3.67
6.8
6.2
6.9E+07
5.4E+07
3.80
3.76
6.6
6.0
7.9E+07
6.6E+07
11
3.96
3.72
6.1
5.8
6.3E+07
4.0E+07
3.86
3.71
6.5
6.0
5.7E+07
4.0E+07
3.84
3.80
6.3
5.5
6.5E+07
6.0E+07
Fuente: Autores
Tabla 4.4 Resultados para medio natural
N1
DIA
pH
°Brix
Rango +
Rango -
Rango +
Rango -
N2
N° m .o/m l
pH
°Brix
Rango + Rango -
Rango +
Rango -
Rango +
Rango -
N3
N° m .o/m l
pH
°Brix
N° m .o/m l
Rango + Rango -
Rango +
Rango -
Rango +
Rango -
Rango + Rango -
0
3.56
3.53
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
3.61
3.58
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
3.54
3.52
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
1
3.68
3.66
17.3
12.0
2.7E+07
2.3E+07
3.71
3.69
19.9
17.5
3.1E+07
2.6E+07
3.67
3.66
19.5
17.5
2.5E+07
2.4E+07
4
3.82
3.80
6.7
6.6
4.5E+07
3.0E+07
3.72
3.70
7.0
6.9
4.8E+07
4.0E+07
3.73
3.72
6.6
6.5
5.1E+07
3.6E+07
5
3.94
3.90
6.6
6.4
1.1E+08
8.1E+07
3.90
3.86
6.6
6.4
1.0E+08
6.5E+07
3.88
3.85
6.6
6.4
1.2E+08
9.0E+07
6
3.95
3.94
6.9
6.7
1.1E+08
8.3E+07
3.88
3.86
7.0
6.9
9.8E+07
8.7E+07
3.87
3.85
7.0
6.7
1.3E+08
9.2E+07
8
3.96
3.95
6.7
6.2
1.0E+08
9.2E+07
3.89
3.88
6.9
6.5
1.3E+08
8.1E+07
3.89
3.88
6.8
6.6
9.4E+07
8.9E+07
11
3.98
3.96
6.6
6.0
1.2E+08
9.7E+07
3.91
3.89
6.7
6.3
1.5E+08
8.2E+07
3.89
3.88
6.7
6.5
1.1E+08
7.5E+07
Fuente: Autores
El porcentaje de sacarosa medido para todos los medios en el día 11 de la
fermentación fue del 0 %.
4
4.2.1 Porcentajes de variación de pH para los medios semisintético y
natural
Para calcular la variación de pH a lo largo de las fermentaciones, se presenta los
porcentajes de variación de pH. El porcentaje de variación se calculó comparando
dos valores en la fermentación, uno comparando el valor de pH del día final
respecto al inicial y otro comparando el valor de pH mayor durante la fermentación
respecto al pH más bajo en la misma. Los porcentajes de variación de pH
calculados día a día se presentan en al Anexo A.
Tabla 4.5 Porcentajes de variación de pH
MEDIO SEMISINTETICO
% DE
VARIACION
MEDIO NATURAL
S1
S2
S3
N1
N2
N3
PH INICIAL –
PH FINAL
39.3
43.7
39.8
11.8
8.3
10.2
PH MAYOR
–PH MENOR
40.1
45.4
41.7
10.6
7.7
9.2
Fuente: Autores
4.3
RESULTADOS DE PRUEBAS PRELIMINARES EN EL BIOFLO
4.3.1 Determinación de velocidad de agitación para una fermentación
alcohólica
El Bioflo permite variar las velocidades de agitación. Se determinó una velocidad
de agitación óptima para efectuar una fermentación alcohólica en el Biorreactor;
con éste fin se configura el sistema de regulación de pH del Bioflo y se trabaja a
diferentes velocidades de agitación, empleando agua y posteriormente con medio
de cultivo para determinar la concentración de ácido cítrico y como base carbonato
de calcio a utilizar.
Tabla 4.6 Resultados de volúmenes consumidos de ácido y base, y tiempo de
operación a diferentes velocidades de agitación
Agitación (R.P.M)
pH Inicial
pH Final
Tiempo de
operación (min.)
50
7
3
22.20
50
3
5
32.11
75
7
3
21.00
75
3
5
25.09
100
7
3
18.08
5
100
3
5
24.00
Fuente: Autores
A velocidad de agitación de 125 r.p.m. se presenta turbulencia y formación de
espuma, lo cual no es deseable que se presente en el proceso de fermentación.
4.3.2 Determinación de la concentración de ácido y base
Utilizando el medio de cultivo que presentó mayor variación de pH en las
fermentaciones preliminares (Ver Tabla 4.5) se trabajó a diferentes
concentraciones de ácido y base con funcionamiento del sistema de regulación de
pH.
Tabla 4.7 Resultados de volúmenes consumidos de ácido y base, y tiempo de
operación a diferentes concentraciones
Volumen consumido (ml)
CONCENTRACION
1N
5N
pH inicial
pH final
7
3
3
5
7
3
3
5
Acido
Base
694
Tiempo de
operación
(min.)
115
870
435
195
75
600
142
Fuente: Autores
4.3.3 Fermentación preliminar en el Bioflo
Los resultados de ésta fermentación respecto al uso del sistema de regulación de
pH se presentan a continuación. Unicamente de manera preliminar se observó los
consumos de ácido y base empleando el sistema de regulación de pH del Bioflo.
El consumo total durante los 10 días de fermentación de ácido y base fueron
respectivamente de: 600 ml de ácido cítrico 5 N y 1750 ml de carbonato de calcio
5N.
Se observó que al transcurso de la fermentación se formó un precipitado debido a
la baja solubilidad del Carbonato de calcio en el medio, presentando problemas
para realizar conteo de microorganismos. Para solucionar dicho problema se
implemento el uso de KOH.
El comportamiento del crecimiento de
microorganismos bajo el efecto del KOH 5 N como base fue positivo, presentando
valores de crecimiento de 2.7 x107 m.o/ml hasta 3.9 x107 m.o/ml en los dos
primeros días de fermentación y permite el uso de dicha base en las
fermentaciones propuestas para el proyecto con fines de análisis.
6
4.4 ESTANDARIZACION DE METODOLOGIAS
A continuación se presentan las calibraciones de los métodos de determinación de
nitrógeno total y de azúcares reductores.
4.4.1 Calibración del método de determinación de nitrógeno total
En el presente trabajo, se utilizó un equipo de digestión y destilación BUCHI, el
cual provee una mayor exactitud en la determinación de nitrógeno respecto al
equipo anteriormente usado por los otros trabajos de investigación referentes a la
línea de fermentación de La Universidad de La Sabana.
4.4.1.1 Curva de calibración del método Kjeldahl con urea
− Pesar en papel copia diferentes cantidades de urea previamente seca desde
0.005 g. hasta 0.5 g. Realizar un blanco, utilizando únicamente el papel para
restar al resultado de los demás puntos y obtener el nitrógeno total.
− Seguir la metodología enunciada para la determinación de nitrógeno total.
− Graficar el nitrógeno recuperado en función del peso de urea correspondiente.
La urea teóricamente contiene 46.62% de nitrógeno (Bonilla y Martínez, 1999,
40).
Tabla 4.8 Resultados de calibración para método total de Kjeldahl
U R E A (g)
0.0051
0.0080
0.0100
0.0156
0.0202
0.0252
0.0503
0.0752
0.1006
0.1500
0.2003
0.2502
0.3006
0.3503
0.4006
0.5005
N IT R O G E N O
N IT R O G E N O
T E O R IC O (g)
R E C U P E R A D O (g)
0.002354
0.002318
0.003730
0.003643
0.004678
0.004638
0.007273
0.007067
0.009417
0.009329
0.011733
0.011480
0.023434
0.022960
0.035058
0.034230
0.046900
0.045710
0.069914
0.067580
0.093364
0.091210
0.116643
0.113300
0.140140
0.135500
0.163310
0.157300
0.186760
0.179900
0.233333
0.225900
P R O M E D IO % E R R O R M E T O D O =
P R O M E D IO % R E C U P E R AC IO N =
C O R R E L AC IO N T O D O S L O S D AT O S =
% ERRO R
% R E C U P E R A C IÓ N
1.54
2.32
0.85
2.83
0.94
2.15
2.02
2.36
2.54
3.34
2.31
2.87
3.31
3.68
3.67
3.19
98.46
97.68
99.15
97.17
99.06
97.85
97.98
97.64
97.46
96.66
97.69
97.13
96.69
96.32
96.33
96.81
2.49
97.51
0.99999
Fuente: Autores
7
La gráfica de la curva de calibración correspondiente se presenta a continuación.
Gráfica 4.1 Curva de calibración para el método total de Kjeldahl
CURVA DE CALIBRACION METODO TOTAL
0.250000
0.200000
NITROGENO(g)
0.150000
0.100000
0.050000
0.000000
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
UREA(g)
Nitrógeno teórico (g)
Nitrógeno recuperado (g)
Fuente: Autores
4.4.1.2
Curva de calibración para etapa de destilación y titulación
− Preparar una solución madre de sulfato de amonio al 0.9428% donde 1 ml de
la solución madre contiene 0.002 g. de nitrógeno.
− Tomar diferentes volúmenes de solución madre desde 2.5 ml hasta 90 ml
incorporándolos en los tubos de vidrio para trabajar en el sistema BUCHI de
destilación. Seguir el procedimiento para la destilación y titulación.
− Graficar el nitrógeno recuperado en función del volumen de solución madre del
sulfato de amonio.
0.6
Tabla 4.9 Resultados de calibración para etapa de destilación y titulación del
método Kjeldahl
SOLUCION
SULFATO
0.9428% (ml)
2.5
5.0
10.0
15.0
20.0
30.0
45.0
50.0
55.0
60.0
70.0
80.0
90.0
NITROGENO
TEORICO(g)
NITROGENO
RECUPERADO(g)
%ERROR
%RECUPERACION
0.005000
0.010000
0.020000
0.030000
0.040000
0.060000
0.090000
0.100000
0.110000
0.120000
0.140000
0.160000
0.180000
0.004858
0.009938
0.019870
0.029810
0.039750
0.059400
0.089220
0.098940
0.108800
0.117600
0.136800
0.156100
0.174900
2.84
0.62
0.65
0.63
0.63
1.00
0.87
1.06
1.09
2.00
2.29
2.44
2.83
97.16
99.38
99.35
99.37
99.38
99.00
99.13
98.94
98.91
98.00
97.71
97.56
97.17
PRO M EDIO %ERRO R M ET O DO =
PRO M EDIO %RECUPE RACIO N=
CO RRELACIO N T O DO S LO S DAT O S =
1.46
98.54
0.999939
Fuente: Autores
Gráfica 4.2 Curva de calibración para destilación y titulación en método Kjeldahl
C U R V A D E C A L IB R A C IO N P A R A D E S T IL A C IO N T IT U L A C IO N
0 .2
0 .1 8
0 .1 6
0 .1 4
NITROGENO (g)
0 .1 2
0 .1
0 .0 8
0 .0 6
0 .0 4
0 .0 2
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
S U L F A T O ( m l)
N it r ó g e n o t e ó r ic o ( g )
N it r ó g e n o r e c u p e r a d o ( g )
Fuente: Autores
10
El error del método total (digestión, destilación y titulación) es del 2.49%, el error
para destilación y titulación es de 1.46%, por lo tanto el error para la etapa de
digestión es de 1.03%.
4.4.2
Calibración del método de determinación de azúcares reductores por
titulación de Lane y Enyon
Los trabajos anteriores en la línea de investigación de fermentación emplearon el
método colorimétrico, el cual se diferencia en su fundamentación teórica pero
tienen la misma finalidad. La diferencia más notable es que el método empleado
en el presente trabajo permite fijar un error de exactitud.
− Con la solución de azúcar invertido al 1% se realizó la titulación por el método
de Lane y Enyon descrito previamente. La titulación se trabajo para reducir 10
ml de solución Felhing, de donde se determina que 0.0545 g. de azúcar
invertido reduce 10 ml de la solución Felhing.
− De acuerdo a lo anterior se fijan 5 volúmenes teóricos de titulación de 15, 20,
30, 40 y 50 mililitros y cada volumen debe contener 0.0545 g. de azúcar
invertido, por lo cual se deben preparar a partir de la solución madre de azúcar
invertido al 1%.
− Siguiendo el método enunciado para la titulación, se procede a determinar los
volúmenes reales en la titulación a las concentraciones teóricas establecidas.
La concentración real de azúcar invertido se determina así:
[ ] Azúcares reductores = g. de azúcar invertido que reducen 10 ml de Felhing(0.0545g)
/ Volumen de titulación en ml.
Tabla 4.10 Resultados de calibración para método de determinación de azúcares
reductores.
VOLUMEN CONCENTRACI
CONCENTRACI
TEORICO DE ÓN REAL DE VOLUMEN REAL
ÓN DE
SOLUCION DE SOLUCION DE DE SOLUCION
SOLUCION DE
AZUCAR
AZUCAR
DE AZUCAR
AZUCAR
INVERTIDO INVERTIDO(g./ INVERTIDO (ml)
INV.(g./ml)
(ml)
ml)
0.00363
15
0.00368
14.8
0.00272
20
0.00275
19.8
0.00182
30
0.00182
29.9
0.00136
40
0.00137
39.9
0.00109
50
0.00109
49.9
Fuente: Autores
% ERROR
1.3
1.0
0.3
0.2
0.2
El porcentaje de error total del método es el promedio de los cinco puntos
determinados y es de 0.6 %.
11
Gráfica 4.3 Curva de calibración del método de determinación de azúcares
reductores por titulación de Lane y Enyon
C A L IB R A C IO N M E T O D O D E D E T E R M IN A C IO N D E A Z U C A R E S R E D U C T O R E S
0 .0 0 4 0
CONCNETRACION DE SOLUCION DE AZUCAR INVERTIDO (g/ml)
0 .0 0 3 5
0 .0 0 3 0
0 .0 0 2 5
0 .0 0 2 0
0 .0 0 1 5
0 .0 0 1 0
0 .0 0 0 5
0 .0 0 0 0
0
10
20
30
40
50
60
V O L U M E N D E S O L U C IO N D E A Z U C A R IN V E R T ID O (m ililitr o s )
V O L U M E N T E O R IC O (m l)
V O L U M E N R E A L (m l )
Fuente: Autores
4.5
RESULTADOS DE LAS FERMENTACIONES ALCOHOLICAS
EN EL BIOFLO
A continuación se presentan los datos de las variables medidas durante el
desarrollo de las fermentaciones con regulación de pH y sin regulación.
4.5.1
Datos de crecimiento de microorganismos
Para las cuatro fermentaciones, dos con regulación de pH y dos sin regulación del
mismo, se presentan los datos de crecimiento determinados por el conteo cámara
Neubauer Improved con los rangos de error de precisión respectivos. Se calculó
de acuerdo a la formula enunciada en el procedimiento para conteo de
microorganismos.
Los triplicados realizados para el conteo de microorganismos en cada
fermentación se presentan en el Anexo B.
12
Tabla 4.11 Resultados de crecimiento de microorganismos
N°M.O/ml FERM. 1
N°M.O/ml FERM. 2
N°M.O/ml FERM. 1 SIN
CONTROL DE PH
N°M.O/ml FERM. 2 SIN
CONTROL DE PH
DIA
0
1
2
3
4
7
8
9
10
RANGO
MENOR
RANGO
MAYOR
RANGO
MENOR
RANGO
MAYOR
RANGO
MENOR
RANGO
MAYOR
RANGO
MENOR
RANGO
MAYOR
2.1E+07
9.8E+07
1.1E+08
1.4E+08
1.4E+08
1.2E+08
7.2E+07
6.8E+07
6.2E+07
2.4E+07
1.0E+08
1.2E+08
1.4E+08
1.4E+08
1.2E+08
7.7E+07
7.1E+07
6.5E+07
2.2E+07
1.0E+08
1.2E+08
1.4E+08
1.5E+08
1.1E+08
6.6E+07
6.3E+07
5.7E+07
2.5E+07
1.1E+08
1.3E+08
1.4E+08
1.5E+08
1.1E+08
7.0E+07
6.5E+07
5.8E+07
2.4E+07
7.1E+07
8.3E+07
9.4E+07
2.5E+07
7.4E+07
8.5E+07
9.7E+07
2.3E+07
7.5E+07
8.7E+07
9.9E+07
2.4E+07
7.8E+07
9.1E+07
1.0E+08
7.1E+07
6.6E+07
6.1E+07
5.2E+07
7.6E+07
6.9E+07
6.3E+07
5.5E+07
7.4E+07
6.8E+07
6.4E+07
5.5E+07
7.8E+07
7.0E+07
6.8E+07
5.8E+07
Fuente: Autores
Las gráficas de crecimiento para cada fermentación se presentan a continuación
con el fin comparativo de las mismas.
Gráfica 4.4 Curvas de crecimiento de microorganismos para fermentaciones con
control y sin control de pH.
C U R V A S D E C R E C IM IE N T O D E M IC R O O R G A N IS M O S
N° CELULAS POR MILILITRO
1 .0 E + 0 9
1 .0 E + 0 8
1 .0 E + 0 7
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
T IE M P O (D ÍA S )
N °M .O /M L F E R M . 1
N °M .O /M L F E R M . 1 S IN C O N T R O L
N °M .O /M L F E R M . 2
N °M .O /M L F E R M . 2 S IN C O N T R O L
Fuente: Autores
13
4.5.2
Datos de contenido de nitrógeno total en la biomasa
El nitrógeno determinado corresponde a la cantidad de nitrógeno celular por
mililitro de fermento, utilizando la formula descrita en el procedimiento para el
método Kjeldahl.
De acuerdo a los volúmenes de titulación de HCL 0.94656 N, determinados por
triplicado para cada día de la fermentación, la desviación estándar es cero (Ver
Anexo B). De acuerdo a esto se tomó el porcentaje de error del método de
determinación de nitrógeno total, que es de 2.49 %, para determinar los rangos de
nitrógeno celular por mililitro.
Tabla 4.12 Resultados de contenido de nitrógeno celular por mililitro
FERM. 1 mg N / ml
FERM. 1 SIN CONTROL DE PH
mg N / ml
FERM. 2 mg N / ml
FERM. 2 SIN CONTROL DE PH
mg N / ml
DIA
RANGO
INFERIOR
RANGO
SUPERIOR
RANGO
INFERIOR
RANGO
SUPERIOR
RANGO
INFERIOR
RANGO
SUPERIOR
RANGO
INFERIOR
RANGO
SUPERIOR
0
0.0644
0.0676
0.0965
0.1015
0.0644
0.0676
0.0644
0.0676
1
0.2257
0.2373
0.2257
0.2373
0.1936
0.2034
0.2257
0.2373
2
0.2584
0.2716
0.2584
0.2716
0.2257
0.2373
0.2584
0.2716
3
0.2906
0.3054
0.3228
0.3392
0.2584
0.2716
0.2906
0.3054
4
0.3549
0.3731
0.3876
0.4074
7
0.2906
0.3054
0.2906
0.3054
0.1936
0.2034
0.2257
0.2373
8
0.2584
0.2716
0.2257
0.2373
0.1936
0.2034
0.1936
0.2034
9
0.2257
0.2373
0.1936
0.2034
0.1614
0.1696
0.1614
0.1696
10
0.1936
0.2034
0.1614
0.1696
0.1614
0.1696
0.1614
0.1696
Fuente: Autores
Utilizando el rango para todos los días de las fermentaciones, se realizo la gráfica
de contenido de nitrógeno celular por mililitro.
Gráfica 4.5 Curva de nitrógeno celular por mililitro para fermentaciones con control
y sin control de pH
C O N T E N ID O
D E
N IT R O G E N O
C E L U L A R
0 .4 6
0 .4 1
MILIGRAMOS DE NITROGENO/MILILITRO
0 .3 6
0 .3 1
0 .2 6
0 .2 1
0 .1 6
0 .1 1
0 .0 6
0 .0 1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1 0
1 1
T IE M P O (D IA S )
F E R M . 2 m g N / m l
F E R M . 1 S IN C O N T R O L D E
P H
m g N
/ m l
F E R M . 1 m g N / m l
F E R M . 2 S IN C O N T R O L D E
P H
m g N
/ m l
Fuente: Autores
14
4.5.3
Datos de sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa
Debido a que todas las muestras tomadas se midieron a 20 °C no fue necesario
realizar corrección con tablas a los datos obtenidos.
Tabla 4.13 Resultados de toma de °Brix a 20°C
D IA
F E R M .1 C O N
R E G U L A C IO N
FERM . 2 CO N
R E G U L A C IO N
F E R M . 1 S IN
R E G U L A C IO N
F E R M . 2 S IN
R E G U L A C IO N
0
1
2
3
4
7
8
9
10
2 0 .0
1 7 .9
1 4 .1
1 0 .7
8 .2
7 .4
7 .0
6 .5
6 .2
2 0 .0
1 7 .5
1 4 .0
1 0 .1
8 .0
7 .2
6 .8
6 .4
6 .0
2 0 .0
1 8 .0
1 4 .7
1 1 .8
2 0 .0
1 7 .3
1 4 .1
1 0 .5
7 .7
7 .1
6 .8
6 .4
7 .3
6 .8
6 .4
6 .0
Fuente: Autores
Gráfica 4.6 Curva de °Brix para fermentaciones con control y sin control de pH
°Brix a 20° C
°B rix
2 0 .0
1 8 .0
1 6 .0
1 4 .0
1 2 .0
1 0 .0
8 .0
6 .0
4 .0
2 .0
0 .0
0
2
4
6
8
10
12
T ie m p o (d ía s )
F E R M .1 C O N R E G U LA C IO N
F E R M . 1 S IN R E G U L A C IO N
F E R M . 2 C O N R E G U LA C IO N
F E R M . 2 S IN R E G U L A C IO N
Fuente: Autores
El porcentaje de sacarosa medido en el día 10 de cada fermentación fue de 0 %
de sacarosa.
4.5.4
Datos de azúcares reductores residuales y contenido de etanol
Al final de cada fermentación se determinó la concentración de azúcares
reductores. A manera de ejemplo para la fermentación 1 con control de pH se
presenta el calculo:
[ ] Azúcares reductores = 0.0545 g. Azúcar reductor / 40.8 ml fermento
donde 40.8 es el volumen gastado en la titulación para dicha determinación. [ ] de
azúcares reductores es igual a 0.00133 g/ml ó 0.133% p/v de azúcar reductor en
15
el fermento. El porcentaje de error del método de determinación de azúcares
residuales es muy bajo (0.62%), por lo cual los datos obtenidos no tienen rango
alguno.
Tabla 4.14 Resultados de determinación de azúcares reductores residuales
CONCENTRACION DE AZUCARES REDUCTORES EN g/ ml
DIA
10
FERMENTACION 1 FERMENTACION 2
FERMENTACION 1 FERMENTACION 2
CON
CON
SIN REGULACION SIN REGULACION
REGULACION DE REGULACION DE
DE PH
DE PH
PH
PH
0.00133
0.00141
0.00157
0.00151
Fuente: Autores
Para el contenido de etanol, la temperatura de trabajo fue de 15°C debido a la
calibración del alcoholímetro. Para el día final de la fermentación se tiene que la
para las fermentaciones con regulación de pH el contenido de alcohol es de 10
°G.L y para las fermentaciones sin regulación de pH el contenido de alcohol es de
8 °G.L. La toma de contenido de etanol no presento error de precisión ni error de
exactitud en el método.
Tabla 4.15 Resultados de contenido de etanol
CONTENIDO DE ETANOL EN °G.L
DIA
10
FERMENTACION 1 FERMENTACION 2
FERMENTACION 1 FERMENTACION 2
CON
CON
SIN REGULACION SIN REGULACION
REGULACION DE REGULACION DE
DE PH
DE PH
PH
PH
10
10
8
8
Fuente: Autores
4.5.5
Volúmenes consumidos de ácido y base por el sistema de regulación
de pH
El sistema de regulación de pH y sus acciones de control a lo largo de una
fermentación consumen las siguientes cantidades de ácido cítrico 5N e hidróxido
de potasio 5N respectivamente:
− Para la fermentación 1 con control de pH los volúmenes fueron de 349 ml de
ácido y 234 ml de base.
− Para la fermentación 2 con control de pH los volúmenes fueron de 352 ml de
ácido y 259 ml de base.
Los consumos día a día en cada fermentación se presentan en el Anexo B.
Aunque se trabajó a concentraciones de ácido y base 5N, los volúmenes
consumidos por el sistema de regulación no son iguales debido a que el KOH es
una base fuerte y el ácido cítrico es una ácido débil con una disociación baja (K =
16
7.4 x 10-7) en relación con el KOH, lo que ocasiona un mayor consumo de ácido
respecto a la base.
4.5.6
Variación de pH en las fermentaciones sin control de pH
Tomando la medida directamente del panel de control del Biorreactor se reportan
los valores de pH día a día.
Tabla 4.16 Variación de pH en una fermentación sin control de pH
D
I A
0
1
2
3
7
8
9
1 0
F E R
M
E
N
6
4
3
3
4
4
4
4
.
.
.
.
.
.
.
.
T
8
2
9
9
0
0
0
1
A
5
1
6
0
3
5
8
0
C
I O
N
1
F E R
M
E
N
6
4
4
3
4
4
4
4
.
.
.
.
.
.
.
.
T
7
3
0
9
0
0
0
0
A
8
3
2
4
1
3
6
9
C
I O
N
Fuente: Autores
17
2
CAPITULO 5
DISCUSION DE RESULTADOS
En éste capítulo se analizan los resultados obtenidos del presente trabajo. Como parte
importante, se encuentra el análisis del crecimiento de microorganismos, contenido de
nitrógeno, sólidos solubles totales, sacarosa, azúcares reductores totales y contenido
de etanol entre una fermentación alcohólica con funcionamiento del sistema de
regulación de pH en el Bioflo y otra fermentación a las mismas condiciones sin
regulación de pH. También se discute la reproducibilidad de estas fermentaciones de
acuerdo a las variables medidas en una fermentación alcohólica.
5.1
SELECCION DE MEDIO DE CULTIVO CON MAYOR RANGO
FLUCTUACION DE PH
Para lograr observar el funcionamiento continuo del sistema de regulación de pH en el
Bioflo y facilitar el desarrollo de la guía de manejo del sistema de bombas peristálticas,
es necesario que de manera preliminar se determine que medio de cultivo presenta
mayor fluctuación de pH a lo largo de una fermentación.
El medio de cultivo seleccionado para trabajar en una fermentación alcohólica en el
Bioflo bajo regulación de pH fue el preparado con base semisintética adicionando
fosfato de amonio. De acuerdo a los resultados de los datos tomados diariamente de
pH, se determinó que el medio presenta un porcentaje de variación entre el inicio y la
finalización de la fermentación del 43.7%, como un porcentaje de variación entre el pH
más alto y el menor del 45.4% (Ver Tabla 4.5). De acuerdo a la tendencia lineal del pH
respecto al tiempo, se parametrizaron los primeros cuatro días de cada fermentación
preliminar para determinar la mayor pendiente que indica un mayor rango de fluctuación
de pH. La regresión lineal mediante el método de los mínimos cuadrados, determinó
que el medio S2 presenta una pendiente negativa de 0.673 con una correlación de
0.905, siendo éste el de mayor pendiente respecto a los otros medios de cultivo
analizados. En el Anexo A se incluyen los datos de parametrización para cada una de
las fermentaciones preliminares.
69
Discusión de resultados
70
5.2 ANALISIS DE LAS PRUEBAS PRELIMINARES EN EL BIOFLO
La velocidad de agitación seleccionada para trabajar una fermentación alcohólica con
funcionamiento del sistema de regulación de pH en el Bioflo fue de 100 r.p.m., ya que
de acuerdo a los tiempos de operación para efectuar una regulación dentro de unos
rangos de pH de 7 hasta 3 y de 3 a 5 respectivamente, fueron de 18.08 minutos para
regulación con ácido y 24 minutos para regulación con base. Los resultados son los
mejores respecto al tiempo de operación del sistema de regulación de pH de acuerdo a
las diferentes velocidades de agitación evaluadas(Ver Tabla 4.6). La agitación a 100
r.p.m. provee una homogenización apropiada para la toma de muestra en el
seguimiento del crecimiento microbiano y logra una estabilización rápida del pH en el
cultivo. Al trabajar a velocidad de agitación de 125 r.p.m. se presentó turbulencia en el
medio, observándose exceso de burbujas de aire y formación de espuma, lo cual
presentaría una tendencia a un metabolismo respiratorio en la levadura que no favorece
una fermentación alcohólica.
Se emplearon dos concentraciones diferentes de ácido y base para evaluar cual
concentración es la indicada para usar en el sistema de regulación de pH. La
concentración de ácido cítrico 5 N y de carbonato de calcio 5 N mejoran la operación
del sistema de regulación de acuerdo a los volúmenes consumidos y el tiempo de
acción y no se emplearon concentraciones mayores ya que la levadura puede ser
afectada en su estado fisiológico. En un rango de regulación de pH son menores
respecto a una concentración 1 N (Ver Tabla 4.7). El funcionamiento del Bioflo es
apropiado bajo las concentraciones de 5 N y se evita excesos de volumen en una
fermentación alcohólica, que dificultaría el manejo de las bombas peristálticas
destinadas al sistema de regulación de pH. Ajustando aun más el funcionamiento del
sistema de regulación de pH del Bioflo, se opto por utilizar KOH como base, porqué en
la fermentación preliminar en el biorreactor el carbonato de calcio presentó problemas
debido a la baja solubilidad del mismo, afectando la toma de muestras para realizar la
determinación de recuento de microorganismos, y el uso del KOH presentó un
crecimiento de microorganismos positivo y no influye en el metabolismo de la levadura.
5.3
ANALISIS DE METODOLOGIAS ESTANDARIZADAS
5.3.1 Análisis de la estandarización del método de determinación de nitrógeno
total
La metodología de determinación de nitrógeno por el método Kjeldahl tiene a lugar su
estandarización en un equipo que permite obtener mayor confiabilidad en los datos
obtenidos, disminuyendo errores del procedimiento. El porcentaje de error para el
método total es del 2.49 % obteniendo una recuperación de nitrógeno de 97.51% para
determinaciones de nitrógeno que contengan desde 0.002 g hasta 0.23 g del mismo. El
error es menor a valores de nitrógeno de 0.0035 g y a medida que aumenta la cantidad
de nitrógeno el error aumenta paulatinamente. El error para la etapa de destilación y
Discusión de resultados
71
titulación es de 1.46% y permite definir que el error en la etapa de digestión es de
1.03%.
Respecto a las anteriores estandarizaciones realizadas en la línea de investigación, se
presentó una notable mejora en cuanto al porcentaje de error del método. En la
siguiente tabla se presenta la comparación de los porcentajes de error del método de
determinación de nitrógeno total.
Tabla 5.1 Porcentajes de error del método de determinación de nitrógeno total en
diferentes estandarizaciones realizadas
AUTORES
ALBA, D Y
SIERRA, R.
(EQUIPO
KJElDAHL
NACIONAL)
BONILLA, H Y
MARTINEZ, V.
(EQUIPO
KJElDAHL NACIONAL)
MERCHAN, C Y
CASTILLO, A.
(EQUIPO
KJElDAHL NACIONAL)
RAMIREZ, G Y
PEDROZA, J. (EQUIPO
BUCHI)
PORCENTAJE ERROR
METODO TOTAL
6.26 %
7.45 %
8.00 %
2.49 %
PORCENTAJE ERROR
ETAPA DESTILACION Y
TITULACION
2.75 %
4.50 %
6.00 %
1.46 %
PORCENTAJE DE ERROR
ETAPA DE DIGESTION
3.51 %
2.95 %
2.00 %
1.03 %
RANGO PARA
DETERMINACION DE
NITROGENO (g)
0.002 – 0.05
0.004 – 0.025
0.004 – 0.025
0.002 – 0.23
ESTANDARIZACION
Fuente: Tesis de línea de investigación en fermentación. Universidad de La Sabana.
El equipo BUCHI reduce errores sistemáticos y aleatorios que se puedan presentar por
parte del operario como también el error que presenta el equipo en el procedimiento, lo
cual representa mayor confiabilidad en los datos obtenidos.
5.3.2 Análisis de la estandarización del método de determinación de azúcares
reductores residuales
Para la metodología de determinación de azúcares mediante la titulación de Lane y
Enyon, el porcentaje de error de 0.62% indica que el método es apropiado y los datos
obtenidos son confiables debido al bajo porcentaje de error. Cabe anotar que el método
exige un estricto seguimiento en su procedimiento para que el error sea mínimo.
Las anteriores estandarizaciones utilizaron el método colorimétrico el cual se basa en
una curva de calibración y una estimación lineal para determinar la concentración de
azúcar reductor. La determinación de azúcares por titulación es alternativo y no es
comparable con el método anteriormente trabajado en cuanto al error del método. Pero
cabe recalcar que debido al bajo error presentado, el método empleado en el presente
proyecto puede ser utilizado para posteriores análisis en la línea de investigación y
lograr una mejora en su procedimiento.
Discusión de resultados
5.4
72
ANALISIS DE FERMENTACION CON REGULACION DE PH
RESPECTO A UNA FERMENTACION SIN REGULACION DE PH
Para efectos de análisis se discute el comportamiento de las variables medidas a lo
largo de las fermentaciones con regulación y sin regulación de pH en el Bioflo,
comparando con los antecedentes presentados por los anteriores trabajos de
investigación realizados en el biorreactor.
5.4.1 Crecimiento de microorganismos
En la siguiente tabla se presenta los valores de mayor número de microorganismos
durante la totalidad de cada una de las fermentaciones realizadas en el Bioflo.
Tabla 5.2 Mayor crecimiento de microorganismos en fermentaciones en el Bioflo
FERMENTACIONES
1 CON REGULACION
DE PH
2 CON REGULACION
DE PH
1 SIN REGULACION
DE PH
2 SIN REGULACION
DE PH
NUMERO DE
MICROORGANISMOS
/ MILILITRO
1.4 E+08
1.5 E+08
9.5 E+07
1.0 E+08
DESVIACION
ESTANDAR
2.5 E+06
1.0 E+06
1.6 E+06
1.6 E+06
Fuente: Autores
Observando las gráficas de crecimiento se tiene que las fermentaciones realizadas con
regulación de pH a valor de 4.5, temperatura de 25°C y agitación a 100 r.p.m. presentan
un mayor crecimiento de microorganismos respecto a las fermentaciones sin regulación
de pH. El crecimiento en las fermentaciones con regulación de pH es 47.15% - 50.20%
mayor respecto a las que no regulan el pH, debido a que al no regular el pH, hay una
tendencia a la producción de metabolitos secundarios (ácido cítrico, ácido málico y
otros), los cuales acidifican el medio impidiendo una mayor producción de biomasa y
etanol, pero con un consumo de sólidos solubles similar para ambas fermentaciones,
comportamiento observado en la variación de pH que presentan las fermentaciones sin
utilizar la regulación de pH (Ver Tabla 4.16); al inicio de la fermentación se tiene un pH
de 6.85 y al día 1 el pH disminuye a un valor de 4.21 y para las fermentaciones que
utilizan el sistema de regulación, el pH permanece constante a un valor de 4.5, fijado
desde el inicio del proceso.
Para fermentaciones alcohólicas desarrolladas en el biorreactor por los anteriores
trabajos de la línea de investigación, controlando únicamente la variable temperatura, el
mayor crecimiento microbiano a 25 °C fue de 1.4E+08 y a 30 °C fue de 7.6E+07. Al
desarrollar una fermentación regulando el pH a 4.5 se obtiene un crecimiento 6.60%
mayor respecto a una fermentación a temperatura constante de 25 °C, pero significativa
respecto a una temperatura constante de 30 °C al ser un 97.50% mayor el crecimiento
en la fermentación a 25 °C y pH de 4.5. El comportamiento que se observa en la
comparación de este parámetro, indica que a 25 °C el crecimiento de microorganismos
se favorece ya que es la temperatura óptima para el desarrollo de una levadura.
También se observa que al regular el pH esta tendencia de mayor crecimiento se
Discusión de resultados
73
beneficia levemente ya que el pH fijado a 4.5 difiere del pH óptimo para el desarrollo de
la levadura en una fermentación, el cual es de 3.5 y fue ajustado al inicio de las
fermentaciones que no controlan el pH a lo largo del proceso (Aleixandre, Noviembre de
1998). Otro factor que favorece el crecimiento de microorganismos es el medio de
cultivo, ya que el extracto de levadura es el medio que más provee de requerimientos
nutricionales a la levadura, respecto al preparado a base de peptona utilizado por
fermentaciones realizadas en el Bioflo. Las fermentaciones desarrolladas en el
presente trabajo mantuvieron una agitación constante mientras que los antecedentes
presentados solo realizan agitación antes de tomar la muestra.
Gráfica 5.1 Comparación del mayor crecimiento de microorganismos para distintas
fermentaciones en el Bioflo.
2.0E+08
1.5E+08
1.4E+08
1.5E+08
TEMPERATURA 25°C Y PH 4.5
7.6E+07
m.o por ml 1.0E+08
TEMPERATURA 25°C
TEMPERATURA 30°C
5.0E+07
0.0E+00
CRECIMIENTO
Fuente: Autores
5.4.2 Contenido de nitrógeno en la biomasa
Los datos de contenido de nitrógeno que se presenta en la siguiente tabla corresponden
a los días en que se obtuvo el mayor crecimiento de microorganismos en las
fermentaciones en el Bioflo bajo las condiciones ya establecidas.
Tabla 5.3 Mayor contenido de nitrógeno en fermentaciones en el Bioflo
FERMENTACIONES
FERM. 1 CON
REGULACION DE PH
FERM. 2 CON
REGULACION DE PH
FERM. 1 SIN
REGULACION DE PH
FERM. 2 SIN
REGULACION DE PH
RANGOS DE
NITROGENO
MILIGRAMOS DE
NITROGENO /
MILILITRO
0.3549 – 0.3731
0.3876 – 0.4074
0.2584 – 0.2716
0.2906 – 0.3054
Fuente: Autores
De acuerdo a los rangos de contenido de nitrógeno, para las fermentaciones con
regulación de pH la diferencia es de un 3.7% y para las de sin regulación la diferencia
es del 6.5%, diferencias calculadas tomando los datos más cercanos de cada rango.
Los parámetros determinados en las fermentaciones realizadas presentan
reproducibilidad debido a la similitud en sus datos y sus porcentajes de diferencia son
bajos, teniendo en cuenta que se trata de un sistema biológico.
Se observa una tendencia de un menor contenido de nitrógeno en las fermentaciones
que no regulan el pH. El contenido de nitrógeno para las fermentaciones con regulación
de pH es entre 33.37% - 37.34% mayor que el contenido de nitrógeno para las
fermentaciones sin regulación de pH.
Discusión de resultados
74
Para las fermentaciones desarrolladas en el Bioflo por los anteriores trabajos de
investigación, controlando únicamente la variable temperatura, el nitrógeno en la
biomasa para el día donde se presenta el máximo contenido, a 25 °C fue de 0.2649
mg/ml –0.3110 mg/ml y para 30°C fue de 0.1934 mg/ml - 0.2245 mg/ml. El contenido
de nitrógeno es mayor para una fermentación con regulación de pH en un 21.50 %
respecto a una fermentación con temperatura de 25 °C y un 67.00 % mayor respecto a
una fermentación con temperatura de 30 °C. Estos porcentajes son amplios debido a
que el medio que más provee de requerimientos nutricionales y favorece la producción
de biomasa es el preparado a base de extracto de levadura respecto al preparado a
base de peptona utilizado por los anteriores trabajos de investigación; respecto a la
fermentación a 30 °C es mucho mayor porqué al trabajar a 25 °C se favorece el
crecimiento de la levadura ya que es la temperatura óptima para su desarrollo. Según
los resultados de contenido de nitrógeno en la biomasa, se confirma la tendencia del
crecimiento de microorganismos en una fermentación alcohólica, observando que al
regular el pH la concentración de microorganismos concuerda con el contenido de
nitrógeno determinado siendo este mayor respecto a la fermentación que no regula pH.
Nuevamente se establece que la temperatura y la regulación de pH son determinantes
para que el crecimiento de microorganismos sea más eficiente.
Para efecto de balance entre contenido de nitrógeno celular y el conteo de
microorganismos se analiza el contenido de nitrógeno en miligramos por célula para
cada fermentación. El contenido de nitrógeno por célula presenta significativas
fluctuaciones para los análisis del día cero (0) debido a que en la determinación de
nitrógeno se pudo haber cometido errores en el método, específicamente en la
centrifugación de la muestra y retiro del sobrenadante para obtener únicamente las
levaduras presentes, ya que la cantidad de biomasa al inicio de cada fermentación es
baja y dificulta el análisis de nitrógeno en la muestra. Concretamente se descartó el
dato del día 0 para la fermentación 2, ya que la determinación de nitrógeno para todas
las fermentaciones en el día 0 fueron tomadas 30 minutos después de inocular la
levadura al medio y el resultado debe ser similar, por lo cual este dato presentó un error
en el procedimiento de la toma de muestra. En la siguiente tabla se presenta el análisis
a partir de los valores de las Tablas 4.11 y 4.12.
Tabla 5.4 Rangos de contenido de nitrógeno por célula
C O N T E N ID O D E N IT R O G E N O (m g ) / C E L U L A
F E R M .1
FERM. 2
F E R M . 1 S IN C O N T R O L
DE PH
F E R M . 2 S IN C O N T R O L
DE PH
RANGOS
RANGOS
RANGOS
RANGOS
D IA
0
1
2
3
4
7
8
9
10
2 .8 E -0 9
2 .2 E -0 9
2 .0 E -0 9
2 .2 E -0 9
2 .4 E -0 9
2 .5 E -0 9
2 .9 E -0 9
3 .3 E -0 9
3 .1 E -0 9
Fuente: Autores
3 .0 E -0 9
2 .3 E -0 9
2 .1 E -0 9
2 .3 E -0 9
2 .6 E -0 9
2 .6 E -0 9
3 .0 E -0 9
3 .4 E -0 9
3 .2 E -0 9
4 .1 E -0 9
2 .1 E -0 9
2 .0 E -0 9
2 .4 E -0 9
2 .6 E -0 9
2 .6 E -0 9
2 .8 E -0 9
3 .0 E -0 9
2 .8 E -0 9
4 .3 E -0 9
2 .2 E -0 9
2 .1 E -0 9
2 .5 E -0 9
2 .7 E -0 9
2 .7 E -0 9
3 .0 E -0 9
3 .2 E -0 9
2 .9 E -0 9
2 .6 E -0 9
2 .6 E -0 9
2 .8 E -0 9
2 .6 E -0 9
2 .8 E -0 9
2 .7 E -0 9
3 .0 E -0 9
2 .8 E -0 9
2 .7 E -0 9
3 .0 E -0 9
3 .1 E -0 9
2 .8 E -0 9
2 .9 E -0 9
3 .1 E -0 9
3 .2 E -0 9
2 .9 E -0 9
2 .7 E -0 9
2 .8 E -0 9
2 .7 E -0 9
3 .0 E -0 9
2 .9 E -0 9
2 .9 E -0 9
2 .8 E -0 9
3 .2 E -0 9
2 .9 E -0 9
2 .9 E -0 9
2 .5 E -0 9
2 .9 E -0 9
3 .1 E -0 9
3 .0 E -0 9
2 .7 E -0 9
3 .0 E -0 9
Discusión de resultados
75
Se observa una tendencia a un menor contenido de nitrógeno por célula durante los
primeros días de las fermentaciones que regulan pH, ya que el pH interactua con el
estado fisiológico de la levadura, comportamiento reflejado en el conteo de
microorganismos. Durante la fase estacionaria de crecimiento no se observan
fluctuaciones del contenido de nitrógeno por célula para cada una de las
fermentaciones. De acuerdo a los valores de contenido de nitrógeno por célula para los
días donde se tiene el mayor crecimiento de microorganismos (día 4 para fermentación
con regulación de pH y día 3 para fermentación sin regulación de pH), el contenido de
nitrógeno por célula es mayor en 8.14 % en una fermentación sin regulación de pH
respecto a una fermentación con pH regulado. De manera concreta, una levadura que
se desarrolla en una fermentación sin regulación de pH tiende a una mayor cantidad de
nitrógeno que una que se desarrolla en una fermentación a pH regulado. En la
siguiente tabla se presenta los rangos de porcentaje peso a peso de nitrógeno por
célula en cada una de las fermentaciones desarrolladas.
Tabla 5.5 Rangos de porcentaje peso a peso de nitrógeno por célula
% P /P N IT R O G E N O / C E L U L A
F E R M .1
FERM. 2
F E R M . 1 S IN C O N T R O L
DE PH
F E R M . 2 S IN C O N T R O L
DE PH
RANGOS
RANGOS
RANGOS
RANGOS
D IA
0
1
2
3
4
7
8
9
10
P R O M E D IO S
1 1 .1 6
8 .5 2
8 .0 1
8 .7 3
9 .5 6
9 .6 5
1 1 .3 3
1 2 .7 6
1 1 .9 8
1 0 .1 9
1 1 .7 3
8 .9 5
8 .4 2
9 .1 7
1 0 .0 5
1 0 .1 4
1 1 .9 1
1 3 .4 1
1 2 .5 9
1 0 .7 1
1 6 .0 9
8 .0 4
7 .7 6
9 .2 4
1 0 .0 6
1 0 .0 8
1 1 .0 4
1 1 .8 5
1 0 .9 6
9 .8 8
1 6 .9 2
8 .4 5
8 .1 6
9 .7 1
1 0 .5 7
1 0 .6 0
1 1 .6 0
1 2 .4 5
1 1 .5 2
1 0 .3 8
1 0 .2 9
1 0 .1 8
1 1 .0 1
1 0 .2 5
1 0 .8 2
1 0 .7 0
1 1 .5 7
1 0 .7 7
1 0 .7 3
1 1 .5 6
1 2 .0 5
1 0 .9 7
1 1 .2 8
1 2 .1 5
1 2 .6 6
1 1 .5 3
1 0 .6 6
1 0 .8 3
1 0 .5 3
1 1 .8 2
1 0 .7 0
1 1 .2 1
1 1 .3 9
1 1 .0 6
1 2 .4 2
1 1 .2 4
1 1 .4 0
1 1 .3 5
9 .9 4
1 1 .1 9
1 1 .1 5
1 1 .9 8
1 1 .9 3
1 0 .4 5
1 1 .7 6
1 1 .7 2
Fuente: Autores
De acuerdo a los promedios obtenidos de toda la marcha fermentativa, se observa que
el porcentaje de nitrógeno por célula es mayor en un rango del 8.15 % - 8.18 % de una
fermentación sin regulación de pH respecto a la fermentación con regulación de pH a
4.5.
Estos porcentajes de diferencia que se observan en la anterior comparación, se deben
a la directa incidencia de la variable pH en cuanto a su comportamiento en la
fermentación sin regulación de pH durante el proceso fermentativo, ya que los valores
de pH en las fase de crecimiento presentan un valor cercano al pH óptimo (3.05 – 3.50)
para el desarrollo de la levadura (Aleixandre, Noviembre de 1998). La variación de pH
en el desarrollo de una fermentación sin regulación de pH se observa en la Tabla 4.16.
El porcentaje de nitrógeno por célula tiende a ser más estable a lo largo de la
fermentación sin regulación de pH debido a que la levadura como sistema biológico,
maneja de manera natural el pH, lo que no sucede al regular el pH debido a que el valor
fijado de 4.5 desde el inicio de la fermentación esta alejado del rango óptimo de pH para
el desarrollo de la levadura en una fermentación alcohólica y no es un manejo natural
del pH.
Discusión de resultados
76
5.4.3 Sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa
El comportamiento del consumo de sólidos solubles totales durante las fermentaciones
desarrolladas fue similar tanto para la fermentación con regulación de pH como para las
que no regulan (Ver Gráfica 4.6). En el día 4 para las fermentaciones que no regulan
pH no se tuvo registro de datos (día festivo), pero la tendencia del consumo de sólidos
solubles es semejante para todas las fermentaciones, y dicho dato (día 4) también tiene
un comportamiento similar a pesar de no registrarse así en la Gráfica 4.6. En el día
final de las fermentaciones el porcentaje de sacarosa es cero, es decir toda la sacarosa
fue desdoblada por la levadura en su metabolismo; se observa que los sólidos solubles
totales disminuyen hasta un valor aproximado a 6.0 °Brix ya que la levadura en la última
etapa de las fermentaciones termina de consumir la sacarosa presente en el medio
quedando en el mismo sólidos solubles diferentes a la sacarosa y compuestos que la
misma levadura produce. El mayor consumo de sólidos solubles se dió durante los
primeros cuatro días de cada fermentación debido a que la levadura se encuentra en la
fase exponencial de crecimiento, fase en la cual existe mayor demanda de nutrientes
para su desarrollo y producción de metabolitos con una tasa de crecimiento de 0.019
h-1 y un número de duplicaciones para las fermentaciones que regulan pH de n=2.6 y
para las que no regulan pH de n=2.0, disminuyendo los sólidos solubles a valores
aproximados de 8.0 °Brix. De aquí al final de la fermentación la levadura se encuentra
en la fase estacionaria de crecimiento, debido a que los nutrientes empiezan a agotarse
y la levadura se encuentra en un metabolismo de mantenimiento, y el consumo de
sólidos solubles pasa de 8.0 °Brix hasta valores de 6.0 °Brix. De acuerdo al
comportamiento del consumo de sólidos solubles en las fermentaciones con y sin
regulación de pH, se observa que el pH no influye en dicho consumo, pero los
resultados presentados por anteriores trabajos en fermentaciones en el Bioflo muestran
que existe un bajo consumo de sólidos solubles totales llegando hasta valores de 13.1
°Brix para una fermentación alcohólica a 30 °C y de 11.7 °Brix para una fermentación
alcohólica a 25 °C. Estas fermentaciones no presentaron agitación constante durante la
marcha fermentativa, por lo cual existe menos oxígeno disuelto en el medio y las
levaduras destinan el consumo de sólidos solubles al proceso de fermentación. A la
vez estas fermentaciones realizan un ajuste inicial de pH a valor de 3.5 y por lo tanto la
levadura no requiere de una producción alta de metabolitos secundarios para acidificar
el medio, donde la variación de pH durante la marcha fermentativa se encuentra en un
rango de 3.5 hasta 2.9, presentando un consumo de sólidos solubles bajo para dicha
producción de metabolitos.
5.4.4 Azúcares reductores residuales y contenido de etanol
Las fermentaciones con regulación de pH presentan una menor cantidad de azúcares
reductores al final de la fermentación respecto a las fermentaciones sin regulación. La
cantidad de azúcares reductores al final de las fermentaciones es mínima, con valores
muy próximos a cero (0.00133 g/ml – 0.00157 g/ml), concordando con el contenido de
sacarosa que fue de cero. De acuerdo a los resultados (Ver Tabla 4.14) la fermentación
con regulación de pH tiene una concentración de azúcares reductores 11% menor que
la concentración en la fermentación sin regulación de pH, indicando que hay un mayor
Discusión de resultados
77
consumo de azúcares por las levaduras en una fermentación con pH regulado para la
producción de etanol, y en producción de biomasa.
Respecto al contenido de etanol al final de cada fermentación, se obtiene mayor grado
alcohólico en una fermentación con regulación de pH, un 25 % mayor que una
fermentación sin regulación de pH, de acuerdo a los resultados presentados en el
numeral 4.5.4. La menor producción de alcohol en una fermentación sin regulación de
pH se debe a que en la fase inicial del proceso existe una mayor demanda energética
por parte de la levadura para la producción de metabolitos secundarios que disminuyen
el pH de un valor de 6.8 hasta valores aproximados de 4.0, lo que causa una
disminución en el grado alcohólico. En si la levadura tuvo la necesidad de acidificar el
medio disminuyendo la producción de metabolitos primarios (etanol) y con tendencia a
la producción de metabolitos secundarios (ácidos orgánicos).
Al regular el pH a lo largo de una fermentación la levadura se adaptó a las condiciones
dadas para producir mayor cantidad de alcohol y a su vez consumir los azúcares
proporcionados obteniendo menor cantidad de azúcares reductores residuales al final
de la fermentación. La levadura en su metabolismo se adapta mejor al mantener
constantes las variables en el proceso tales como pH y temperatura, a pesar de no
manejar un pH óptimo. Esto se confirma de acuerdo a los antecedentes presentados
en fermentaciones realizadas en el Bioflo sin regulación de pH, donde la fermentación
desarrollada a 30 °C el porcentaje de azúcares reductores finales fue del 10.60 % y el
contenido alcohólico fue de 6.2 °G.L y para una fermentación a 25 °C el porcentaje de
azúcares reductores finales fue de 6.30 % y el contenido alcohólico fue del 7.0 °G.L.
De acuerdo al contenido de alcohol, al utilizar el medio semisintético con extracto de
levadura, dicho contenido fue mayor respecto a las fermentaciones que utilizaron el
medio a base de peptona debido a que el medio con extracto de levadura provee a las
células los nutrientes necesarios y adecuados para su crecimiento y producción de
metabolitos (Alba y Sierra, 1999, 120).
El balance de consumo de azúcares expresa de mejor manera las diferencias
presentadas entre una fermentación con regulación de pH y sin regulación.
5.4.4.1
Balance de masa de azúcar consumido en las fermentaciones
El balance de azúcares representa la cantidad de azúcares consumidos en respiración,
fermentación y el transformando en biomasa en una fermentación alcohólica.
AZUCAR ADICIONADO AL MEDIO = AZUCAR CONSUMIDO EN RESPIRACION Y
PRODUCTOS SECUNDARIOS + AZUCAR CONSUMIDO EN FERMENTACION +
AZUCAR TRANSFORMADO EN BIOMASA + AZUCAR NO FERMENTADO O
RESIDUAL
Para efecto de expresar los cálculos se presentan a continuación tomando como
ejemplo la fermentación 1 con regulación de pH:
− Azúcar consumido en fermentación: Se calcula a partir de la reacción general de la
fermentación presentada en la revisión bibliográfica. Esta reacción no incluye los
metábolitos secundarios producidos que no se tendrán en cuenta para facilitar los
Discusión de resultados
78
cálculos debido a que se encuentran en cantidades mínimas. De la fermentación 1
con regulación de pH se tiene 10 °G.L de alcohol. Esto se expresa como 10
mililitros de alcohol en 100 mililitros de mezcla etanol – agua. Para el fermento en el
volumen de 10 litros del Bioflo se tiene:
10000 ml Fermento x 0.10 ml (alcohol/ml fermento) = 1000 ml alcohol
La densidad de alcohol puro a 15 °C es 0.793 g / ml
Gramos de alcohol = 1000 ml alcohol x 0.793 g / ml = 793 gramos de alcohol
producidos en la fermentación.
De la reacción general de fermentación se tiene:
Gramos de glucosa consumida en la fermentación =
Gramos de alcohol producido x 180 g glucosa / 92 g de alcohol =
793 g alcohol x 1.956 g glucosa / g alcohol =
1551 g glucosa consumido en la fermentación
− Azúcar transformado en biomasa: La levadura Saccharomyces cerevisae contiene
un 45 % de carbono en base seca (Bonilla y Martínez, 1999, 89). El peso de una
levadura seca activa se puede hallar a partir del recuento inicial y la cantidad de la
levadura que se inoculo para iniciar la fermentación así:
•
Para 10 litros de medio se inoculo 6 g de levadura seca
•
El recuento inicial de microorganismos se obtiene de la Tabla 4.11 para el día cero
de fermentación y es: 2.26 x 1011 m.o
•
El peso de una levadura seca es igual a 6 g levadura inoculada/ 2.26 x 1011
levaduras = 2.65 x 10-11 g / levadura.
•
Gramos de carbono en una levadura = 2.65 x 10-11 g / levadura
1.19 x 10-11 g de Carbono / levadura.
•
El azúcar transformado en biomasa implica tomar el mayor recuento de
microorganismos durante cada fermentación; para el caso de la fermentación 1con
regulación de pH se presenta el día cuarto. De acuerdo a esto se tiene: 1.41 x 1012
microorganismos y el contenido de carbono en éste conteo es:
x 0.45 =
Gramos de carbono final = 1.19 x 10-11 g de Carbono / levadura x 1.41 x 1012 levadura
= 16.77 g Carbono
•
Gramos de carbono producido = Gramos de Carbono final – Gramos de Carbono
iniciales = 16.77 g Carbono – (6 g x 0.45) = 16.77 g C – 2.7 g C = 14.07 g Carbono
producido en una fermentación.
•
El contenido de carbono en la glucosa representa el 40 %. Los gramos de glucosa
que se transforman en biomasa son iguales: 14.07 g C x g glucosa /0.40 g carbono
= 35.17 gramos glucosa transformados en Biomasa.
− Azúcar no fermentado o residuales: De acuerdo a la Tabla 4.14 la concentración de
azúcares reductores residuales en la fermentación 1 con regulación de pH fue de
Discusión de resultados
79
0.00133 gramos de azúcar residual / mililitro de fermento. Para 10000 mililitros de
fermento = 13.30 gramos de azúcar residuales.
− Para el balance total el azúcar adicionado al medio para cada fermentación llevada a
20 ° Brix es de 2100 g. La conversión del azúcar adicionado para expresarlo como
glucosa es: 2100 g sacarosa x (360 g glucosa/342 g sacarosa)= 2210.50 g Glucosa.
El balance general queda así:
2210.50 g glucosa adicionado = Azúcar consumido en respiración y productos
secundarios + 1551 g de azúcar consumido en fermentación + 35.17 g de azúcar
transformada en Biomasa + 13.30 g de azúcar residual
Azúcar consumido en respiración y productos secundarios = 611.03 gramos
La siguiente tabla presenta el balance de consumo de azúcares para cada una de las
fermentaciones realizadas, junto con los porcentajes de consumo.
Tabla 5.6 Balance de azúcares en fermentaciones en el Bioflo para 10 litros de medio
FERMENTACION
FERMENTACION 1
CON REGULACION
DE PH
FERMENTACION 2
CON REGULACION
DE PH
FERMENTACION 1
SIN REGULACION
DE PH
FERMENTACION 2
SIN REGULACION
DE PH
Cantidad de
azúcar en
gramos
%azúcar
Consumido
Cantidad de
azúcar en
gramos
%azúcar
Consumido
Cantidad de
azúcar en
gramos
%azúcar
Consumido
Cantidad de
azúcar en
gramos
%azúcar
Consumido
AZUCAR CONSUMIDO
EN FERMENTACION
1551
70.16
1551
70.16
1241
56.14
1241
56.14
AZUCAR
TRANSFORMADO EN
BIOMASA
35.17
1.59
35.14
1.58
19.48
0.88
22.03
0.99
AZUCAR RESIDUAL
13.30
0.60
14.10
0.63
15.70
0.71
15.10
0.68
AZUCAR CONSUMIDO
EN RESPIRACION Y
PRODUCTOS
SECUNDARIOS
611.03
27.65
610.26
27.63
934.32
42.26
932.37
42.17
CONSUMO
AZUCARES
AZUCAR ADICIONADO
2210.50
2210.50
2210.50
2210.50
Fuente : Autores
De acuerdo a los porcentajes de azúcar consumido en fermentación, no se alcanzo el
rendimiento reportado en la bibliografía del 95% debido a que la levadura tuvo una
tendencia a consumir azúcares para el proceso de respiración y la producción de
metabolitos secundarios. El rendimiento se acerca más al teórico al regular el pH y es
menor al no regular el pH debido a la acidificación que se presenta en el proceso.
También este rendimiento no fue el máximo debido a que se manejo un medio
semisintético en las fermentaciones y dicho rendimiento se basa en requerimientos
nutricionales óptimos para la levadura proveídos por medios naturales como lo es un
mosto de uva.
Discusión de resultados
80
El azúcar consumido en respiración y productos secundarios es un 52.80 % mayor en
una fermentación sin regulación de pH respecto a una que no regula pH, lo que indica
que en la fermentación sin regulación se producen una mayor cantidad de productos
secundarios diferentes al etanol, incluyendo el CO2 producido por respiración, productos
secundarios que pueden ser tóxicos e inhiben el desarrollo de microorganismos, lo cual
se observa en el conteo de microorganismos en cada fermentación y en la cantidad de
azúcar transformado en biomasa, estableciendo que una fermentación con regulación
de pH presenta mejor eficiencia en la producción de etanol y crecimiento de
microorganismos, observando que el consumo fue del 70.16 % de sus azúcares para la
producción de etanol y la fermentación sin regulación de pH solo consume el 56.14 %
del azúcar adicionado para la fermentación.
Si todo el azúcar adicionado al medio se hubiera consumido, sin quedar azúcar residual
al final de la fermentación entonces este azúcar se repartiría en los porcentajes de
consumo de azúcar respectivos para fermentación, transformación en biomasa y el
consumido en respiración y productos secundarios. Tomando como ejemplo la
fermentación 1 con regulación de pH, el azúcar consumido en fermentación aumentaría
e implica un leve aumento en el grado alcohólico final. De acuerdo a los valores de la
Tabla 5.5 el azúcar consumido en fermentación llegaría a un valor de 1561 gramos,
resultando en un grado alcohólico de 10.06 °G.L, determinado por el cálculo de azúcar
consumido en fermentación explicado anteriormente, que implica un aumento solo del
0.60 % en el grado alcohólico, lo que indica que prácticamente todo el azúcar
adicionado fue consumido en el proceso. Para las fermentaciones sin regulación de pH
el azúcar consumido en fermentación llegaría a 1250 gramos, resultando en un grado
alcohólico de 8.06 °G.L ó sea un aumento del 0.75 %.
Como antecedente en fermentaciones realizadas en el Bioflo por anteriores trabajos de
investigación se tienen los siguientes porcentajes de consumo de azúcares para
fermentaciones a 25 °C y 30 °C sin regulación de pH y sin agitación.
Tabla 5.7 Porcentajes de consumo de azúcares en diferentes fermentaciones en el
Bioflo
CONSUMO DE AZUCARES
FERMENTACION A 30 °C
FERMENTACION A 25 °C
% DE AZUCAR CONSUMIDO EN
FERMENTACION
42.54
54.12
% AZUCAR TRANFORMADO EN
BIOMASA
0.86
1.23
% AZUCAR CONSUMIDO EN
RESPIRACION Y PRODUCTOS
SECUNDARIOS
16.59
15.00
% AZUCAR RESIDUAL
40.00
29.50
Fuente: Tesis de línea de investigación en fermentación. Universidad de La Sabana.
Discusión de resultados
81
De acuerdo a los datos que se observan en la Tabla 5.6, el porcentaje de azúcar
consumido en una fermentación trabajada a 25 °C es similar al obtenido en una
fermentación trabajada a 25 °C con agitación y sin regulación de pH (Ver Tabla 5.5); Al
agitar el consumo es mayor en un 3.53 % respecto a la fermentación a 25 °C sin
agitación. Respecto a la fermentación a 30 °C la diferencia aumenta en dicho consumo,
siendo un 31.96 % mayor el consumo en la fermentación a 25 °C sin regulación de pH
y con agitación. Esta diferencia es mayor debido a que la temperatura de 30 °C
disminuye la producción de alcohol y la levadura pierde capacidad de desdoblar los
azúcares (Alvarez, 112, 1991), lo que se explica en la gran cantidad de azúcar no
consumido o residual en estas fermentaciones.
Al regular el pH a un valor de 4.5, bajo agitación constante de 100 r.p.m. y temperatura
de 25 °C, aumenta notablemente la cantidad de azúcar consumido en fermentación, ya
que el consumo es un 29.63 % mayor respecto a una fermentación a 25 °C sin
agitación y sin regulación de pH. Respecto a una fermentación a 30 °C bajo las
condiciones descritas para 25 °C el consumo de azúcar en fermentación es un 64.92 %
mayor. Este significativo aumento del consumo de azúcar se debe a la regulación del
pH ya que la levadura se adapta mejor a la marcha fermentativa, tolerando
concentraciones mayores de alcohol y también a que el medio semisintético con
extracto de levadura proporcionó todos los requerimientos nutricionales en cantidades
suficientes para su metabolismo.
Otra diferencia notable es el consumo de azúcares en respiración, el cual es mayor en
fermentaciones con agitación, regulando o no regulando el pH y a temperatura de 25 °C
respecto a las fermentaciones que controlan únicamente la variable temperatura
realizadas por los trabajos anteriores en la línea de investigación. Esto se debe a que
la agitación tiende a aumentar la cantidad de oxígeno disuelto en el medio y la levadura
continua empleando el metabolismo respiratorio.
Porcentajes de consumo de
azúcares
Gráfica 5.2 Comparación de porcentajes de consumo de azúcares para diferentes
fermentaciones en el Bioflo
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Fermentación a 25 °C
Fuente: Autores
Fermentación a 30 °C
Fermentaciön a 25 °C, con agitación y
pH regulado a 4.5
% Azúcar consumido en fermentación
% Azúcar transformado en biomasa
% Azúcar consumido en respiración
% Azúcar residual
Discusión de resultados
82
5.4.5 Comportamiento del pH en fermentaciones sin regulación de pH
En las fermentaciones sin regulación de pH no se realizó un ajuste inicial de pH. El pH
del medio al inicio de la fermentación es de 6.8, cercano a la neutralidad y se acidifica
hasta el tercer día de fermentación, bajando hasta un valor de 3.9. Esta baja de pH
obedece a la formación de productos por parte de la levadura que acidifican el medio,
productos tales como ácidos orgánicos provenientes del metabolismo (ácido cítrico,
ácido málico, ácido láctico), pero a partir del tercer día en adelante el pH se estabiliza
en valores de 4.0, debido al efecto buffer por parte del medio utilizado, ya que el
extracto de levadura es un medio complejo, que contiene proteínas, aminoácidos,
peptidos que ejercen dicho efecto en el medio.
5.5
ANALISIS DE LA EVALUACION DE BOMBAS PERISTALTICAS
DEL BIOFLO Y SEGUIMIENTO DE UNA FERMENTACION EN EL
CRECIMIENTO MICROBIANO
Al trabajar en el biorreactor una prueba inicial en sistema continuo para una
fermentación alcohólica, la configuración de las bombas peristálticas para entrada y
salida, se realiza de acuerdo a la guía presentada en el Capitulo 4. Lo normal en el
funcionamiento del Bioflo es que a una misma velocidad fijada para las bombas que
alimentan de medio y cosechan no existan diferencias en sus caudales, sin importar el
flujo que se alimente o desaloje del biorreactor o sin importar los puertos a los cuales se
conecten los tubos de silicona (de igual diámetro para salida y entrada). Las
diferencias presentadas en los flujos hacen que en el desarrollo del cultivo continuo
preliminar llevado a cabo, el flujo de cosecha sea mayor que el flujo de alimentación de
medio al sistema (Ver Tabla 4.2), disminuyendo el volumen contenido en el vaso del
Bioflo a razón de 300 ml diarios aproximadamente, sin cumplir con el sistema
quimiostatico en el cual el volumen del sistema debe ser constante.
Para trabajar de manera correcta el Bioflo en sistema continuo como quimiostato se
deben corregir las diferencias presentadas en los caudales de entrada y salida a un
mismo porcentaje de velocidad de las bombas peristálticas. Confirmando el
comportamiento presentado en el desarrollo de la fermentación en cultivo continuo, se
optó por determinar los flujos de entrada y de salida a diferentes velocidades de la
bomba peristálitica empleando como flujo agua, estableciendo que dichos flujos no son
iguales a la misma velocidad configurada en la bomba peristáltica.
En si, el cultivo continuo en estado quimiostatico no se lleva a cabo debido a la
diferencia entre los flujos de alimentación de medio y de cosecha o salida de flujo. Para
cumplir con el quimiostato se debe equilibrar las velocidades de las bombas de acuerdo
a las diferencias existentes (Ver Tabla 4.2) de tal forma que el medio de alimentación
desplace, en un volumen igual, al medio agotado en el Biorreactor para conseguir una
producción de células de forma continua. A causa de este comportamiento y para
efectos de estudio de lo que involucraría un cultivo en sistema continuo se empleó el
modelo matemático basado en la ecuación de Monod para determinar la concentración
Discusión de resultados
83
de substrato limitante dada una tasa de dilución y evaluar el crecimiento de células en el
quimiostato bajo condiciones de equilibrio.
De acuerdo a la teoría, la tasa de dilución en el quimiostato es igual a la tasa de
crecimiento en la que se presenta el equilibrio. En la tabla C.1 del Anexo C, se calculó
cada una de las tasas de crecimiento para un cultivo cerrado, y de la teoría se tiene:
D=µ en equilibrio
Para que se presente el estado de equilibrio en el quimiostato es necesario fijar una
tasa de dilución a partir de las tasas de crecimiento calculadas a largo de la fase
exponencial en una fermentación con regulación de pH. Para el desarrollo del modelo
de Monod, la tasa de dilución se fijo a un valor de D = 0.011 h-1, que proviene del
intervalo de 24-48 horas de un cultivo cerrado, dado que en el primer día de cultivo la
tasa de crecimiento es máxima con un valor de 0.062 h-1 y posterior a las 48 horas de
cultivo la tasa de crecimiento disminuye notablemente hasta 0.003 h-1. La tasa de
dilución fijada favorece el equilibrio de forma que no se presente una disminución en la
población de microorganismos debido a tasas de dilución muy altas, que hace que el
cultivo sea lavado del quimiostato, o una deficiencia en la alimentación de substrato por
tasas de dilución muy bajas ya que el nutriente no llega con suficiente rapidez y las
células pueden morir por inanición, extremos que no se deben presentar en el
desarrollo de un cultivo continuo.
De acuerdo a la Gráfica 4.4 el valor de µmax se encuentra dentro del intervalo de
tiempo de cultivo de 0-24 horas, ya que después de 24 horas de fermentación viene un
estado de desaceleración, por lo tanto µmax = 0.062 h-1 (tasa de crecimiento para
primer intervalo de Tabla C.1).
De la teoría se tiene el modelo matemático:
se = Ks x D / µmax – D
donde Ks para Saccharomyces cerevisiae y como substrato limitante glucosa es 2.5E-5
g/ml (Trevan, 1990, 85). se es la concentración de substrato limitante en el equilibrio.
De acuerdo a estos valores en la ecuación se tiene:
se = 2.5E-5 g/ml x 0.011 h-1 / 0.062 h-1 – 0.011 h-1
La concentración de substrato limitante en el equilibrio para el desarrollo de un cultivo
en sistema continuo se = 5.4E-6 g/ml. Para un volumen de 10000 ml en el biorreactor
se tiene una cantidad de 0.05 gramos de glucosa a lo largo del desarrollo de un sistema
continuo. La concentración de células para el estado de equilibrio en el sistema
continuo se define por la siguiente ecuación:
x e = Y ( SR – s e )
El valor de SR es la concentración original de substrato en el medio y equivale 0.22 g/ml
(Ver Tabla 5.6) y el valor de se es el ya calculado. Y es el factor de rendimiento para el
substrato limitante:
Y = gramos de biomasa producida / gramos de substrato consumido
Discusión de resultados
84
De la Tabla 5.6 (datos del balance de azúcares en fermentaciones en un cultivo
cerrado) se obtiene el valor de gramos de substrato consumido, el cual es el azúcar
adicionado menos el azúcar residual = 0.21 g / ml. Los gramos de biomasa producida
se obtienen de la diferencia entre los gramos finales de biomasa y los gramos iniciales
de biomasa (gramos de levadura inoculada). De acuerdo a esto para la fermentación 1
con regulación de pH los gramos finales de biomasa por mililitro son: 2.6E-11
g/levadura x 1.4E8 levaduras = 3.64E-3 g / ml y los gramos iniciales de biomasa
corresponden a lo inoculado que fueron 6.00 gramos / 10000 mililitros = 6E-4 g / ml. El
valor de Y es igual a 0.014. La concentración de células es:
xe = 0.014 ( 0.21 g/ml – 5.4E-6 g/ml )
El valor de xe es igual a 2.9E-3 gramos de biomasa / ml. Al dividir este valor entre el
peso de una levadura (2.6E-11g/levadura) se tiene el número de levaduras presente en
el equilibrio que es igual a 1.1E8 levaduras / ml.
En un sistema continuo de fermentación se puede variar la tasa de dilución y el valor de
µmax teórico para la Saccharomyces cerevisiae esta comprendido entre 0.3 h-1 – 0.5 h-1
(Tuite, 1991, 125) para condiciones ideales de crecimiento. Para complementar el
análisis del modelo matemático, se evalúa el comportamiento de se y xe a partir de
valores ideales de µmax = 0.5 h-1 y tasa de dilución muy altas D = 0.4 h-1. La siguiente
tabla ilustra los diferentes valores de se y xe a diferentes valores de tasa de dilución y
µmax.
Tabla 5.8 Valores de se y xe a diferentes valores de tasa de dilución y µmax para una
fermentación en sistema continuo.
VARIABLES EN
SISTEMA CONTINUO
µmax = 0.062 h
-1
-1
µmax = 0.5 h
-1
-1
µmax = 0.5 h
-1
-1
D = 0.011 h
D = 0.011h
D = 0.4 h
se (g / ml)
5.4E-6
5.6E-7
1.0E-4
xe (g / ml)
2.9E-3
2.9E-3
2.9E-3
Fuente: Autores
De acuerdo a la tabla anterior la concentración de microorganismos permanece
constante variando la tasa de dilución en un amplio rango, pero la concentración de
substrato residual en el equilibrio se aumenta 177 veces al aumentar notablemente la
tasa de dilución, desde 0.011 h-1 hasta 0.4 h-1 y un valor ideal de µmax = 0.5 h-1. En el
rango presentado de tasas de dilución la concentración de microorganismos permanece
constante y la concentración de substrato conserva un valor muy bajo, aumentando a
medida que se aumenta la tasa de dilución.
CONCLUSIONES
•
El desarrollo de una fermentación alcohólica bajo regulación de pH a 4.5 y
temperatura constante de 25 °C en el Bioflo 3000 M1227 presentó un mayor
rendimiento en cuanto a variables tales como crecimiento de microorganismos,
contenido de nitrógeno en la biomasa y contenido de etanol. El crecimiento de
microorganismos, el contenido de nitrógeno y el contenido de etanol fueron un
48.67%, 35.35% y un 25.00% respectivamente mayor con respecto a una
fermentación alcohólica sin regulación de pH y a temperatura de 25 °C. El control
de la variable pH presentó una incidencia directa en el desarrollo de una
fermentación alcohólica mejorando el rendimiento de acuerdo a la formación de
producto y crecimiento de la levadura.
•
El medio de cultivo que presentó el mayor porcentaje de variación de pH a lo largo
de una fermentación en erlenmeyer fue el preparado a base de extracto de levadura
con fosfato de amonio y su rango de variación de pH fue del 43.7% entre el pH
inicial y el pH final. El ácido y base empleados en el funcionamiento del sistema de
regulación de pH del biorreactor Bioflo fue el ácido cítrico e hidróxido de potasio a
una concentración de 5 N cada uno, ya que permiten un óptimo funcionamiento del
sistema de regulación de pH en cuanto al tiempo de operación empleado para
regular diferentes rangos de pH.
•
De acuerdo a los parámetros determinados en una fermentación con regulación de
pH, el crecimiento de microorganismos, contenido de nitrógeno en la biomasa,
consumo de sacarosa, variación de sólidos solubles, contenido de azúcares
reductores residuales y contenido de etanol son reproducibles en el biorreactor ya
que presentan similitud en las dos fermentaciones realizadas.
•
Se elaboró una guía complementaria de manejo y funcionamiento del sistema de
bombas peristálticas del Bioflo, dirigida al uso del sistema de regulación de pH y
para el manejo de flujos de entrada y salida en el biorreactor a diferentes
velocidades de flujo.
•
Se estandarizó la metodología de determinación de contenido de nitrógeno total
empleando un equipo de digestión – destilación BUCHI B-316 el cual presentó un
error del método total del 2.49% y un error de la etapa de destilación y titulación del
1.46%, trabajando una curva de calibración para rangos de contenido de nitrógeno
entre 0.002 g – 0.23 g. Se realizó la estandarización del método de determinación
85
Conclusiones
86
de azúcares reductores por titulación de Lane y Enyon, el cual presentó un error del
0.62% para un rango de determinación de azúcares entre 0.109% - 0.363% (%p/v).
• El biorreactor Bioflo no permite el montaje de un cultivo continuo en estado
quimiostático debido a diferencias notables en los flujos de entrada y de salida.
RECOMENDACIONES
Después de haber realizado el presente trabajo se sugiere:
•
Trabajar un fermentación con pH regulado de 3.5, que de acuerdo a la teoría es el
pH óptimo en el desarrollo de una fermentación alcohólica, comparando sus
resultados con los obtenidos en el presente trabajo.
•
Trabajar con el Biorreactor una fermentación alcohólica con diferentes substratos
para observar el efecto que tiene sobre el sistema de regulación de pH del Bioflo.
•
Además de los parámetros evaluados en una fermentación alcohólica, se sugiere
determinar la acidez a lo largo de la fermentación, relacionando esta variable con la
incidencia del pH, con o sin regulación de pH.
•
Trabajar con el Biorreactor una fermentación alcohólica con agitación midiendo la
variable de oxigeno disuelto, observando su comportamiento en el proceso
fermentativo.
•
El biorreactor debe someterse a una revisión técnica con el fin de establecer si
existe falla técnica en cuanto al uso de las bombas peristálticas en flujos de entrada
y de salida en el Bioflo y lograr dar continuidad al trabajo de fermentaciones en
sistema continuo.
•
El biorreactor posee un sistema de configuración de medidores de niveles los cuales
permiten determinar flujos de entrada y de salida del Bioflo y puede ser estudiado.
•
Respecto al trabajo en los laboratorios de la Universidad, se sugiere habilitar el
trabajo por lo menos los días Sábado con el fin de dar continuidad a un proceso que
requiera control diario.
•
Para efectos de eficiencia y economía en el uso del agua para la bomba de
refrigeramiento se recomienda instalar un sistema de recirculación de agua.
•
Adaptar un sistema de esterilización para el vaso del Bioflo dentro del laboratorio de
Operaciones Unitarias con el fin de evitar posibles accidentes y mayor eficiencia de
la esterilización.
87
ANEXO A
DATOS DE FERMENTACIONES PRELIMINARES
Tabla A.1 Datos de pH medido a 25°C
M EDIO NATURAL
M EDIO SEM ISINTETICO
DIA
A
S1
B
C
A
S2
B
C
A
S3
B
C
A
N1
B
C
A
N2
B
C
A
N3
B
C
0
6.33
6.35
6.32
6.72
6.76
6.74
6.34
6.36
6.35
3.53
3.55
3.56
3.58
3.60
3.61
3.52
3.54
3.54
1
4.62
4.68
4.67
4.76
4.81
4.80
4.58
4.60
4.59
3.66
3.68
3.68
3.70
3.71
3.69
3.66
3.67
3.67
4
3.74
3.95
3.68
3.75
3.71
3.59
3.69
3.67
3.73
3.80
3.81
3.82
3.70
3.72
3.72
3.73
3.72
3.73
5
3.75
3.96
3.69
3.76
3.74
3.61
3.73
3.70
3.75
3.91
3.94
3.90
3.88
3.86
3.90
3.85
3.88
3.86
6
3.73
3.96
3.69
3.78
3.76
3.63
3.75
3.72
3.77
3.94
3.95
3.95
3.86
3.87
3.88
3.85
3.85
3.87
8
3.76
4.00
3.73
3.81
3.79
3.66
3.79
3.76
3.80
3.95
3.96
3.96
3.88
3.89
3.89
3.89
3.88
3.89
11
3.80
3.97
3.75
3.83
3.83
3.70
3.83
3.80
3.83
3.98
3.96
3.97
3.89
3.90
3.91
3.89
3.89
3.88
A
N3
B
C
Tabla A.2 Datos de conteo tomado a 20°C
M EDIO NATURAL
M EDIO SEM ISINTETICO
DIA
N1
B
N2
B
A
S1
B
C
A
S2
B
C
A
S3
B
C
1
13.0
11.0
13.0
18.0
13.0
14.0
11.0
15.0
12.0
9.8
9.4
11.0
11.6
12.1
10.4
9.6
10.1
9.5
4
24.0
23.0
24.0
20.0
27.0
19.0
36.0
24.0
19.0
18.0
15.1
11.9
18.3
15.7
18.5
14.4
20.5
17.4
5
40.0
34.0
43.0
25.0
33.0
38.0
52.0
55.0
31.0
35.8
34.1
45.8
29.8
42.8
29.0
35.1
46.8
44.4
6
49.0
62.0
48.0
25.0
40.0
39.0
37.0
43.0
39.0
34.0
37.4
45.1
36.3
35.2
39.6
35.8
47.5
48.1
8
22.0
28.0
29.0
22.0
28.0
24.0
27.0
28.0
32.0
38.5
36.7
40.3
52.2
35.1
37.4
35.9
36.4
37.9
11
18.0
18.0
26.0
16.0 23.0
-1
19.0
25.0
24.0
26.0
49.1
39.8
42.1
60.4
46.2
33.2
42.6
35.6
30.4
A
C
A
C
Factor de Dilución 10
Tabla A.3 Datos de sólidos solubles totales a 20°C
DIA
A
0 20.0
1 20.0
4 8.9
5 8.8
6 8.3
8 6.0
11 5.8
MEDIO SEMISINTETICO
MEDIO NATURAL
S1
S2
S3
N1
N2
N3
B
C
A
B
C
A
B
C
A
B
C
A
B
C
A
B
C
20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0
19.5 19.9 20.0 20.0 19.7 19.8 20.0 19.3 12.2 14.3 17.5 20.1 18.0 18.1 17.5 19.5 18.6
9.1 9.3 9.3 8.1 9.0 8.2 8.5 8.1 6.6 6.7 6.7 6.9 7.0 7.0 6.5 6.6 6.6
8.0 8.0 8.1 7.2 8.0 7.0 7.1 7.9 6.6 6.4 6.4 6.6 6.4 6.5 6.5 6.4 6.6
7.3 7.3 7.4 6.5 7.2 6.4 6.3 7.0 6.7 6.8 6.9 6.9 6.9 7.0 6.8 6.7 7.0
6.2 6.5 6.4 6.3 6.8 6.2 6.0 6.6 6.2 6.6 6.6 6.5 6.7 6.9 6.6 6.6 6.8
6.0 6.1 6.1 6.1 6.5 5.5 5.8 6.3 6.0 6.5 6.4 6.3 6.5 6.7 6.5 6.5 6.7
88
Tabla A.4 Porcentajes de variación de pH día a día
Tabla A.5
Datos de parametrización de pH respecto a tiempo en cultivos
INTERVALO
DE DIAS
MEDIO SEMISINTETICO
MEDIO NATURAL
S1
26.30
18.60
0.26
0.26
1.05
0.26
46.73
S2
28.90
23.10
0.54
0.54
0.80
1.06
54.94
S3
27.70
19.30
0.81
0.54
0.80
1.05
50.20
N1
3.38
3.81
2.88
0.76
0.25
0.25
11.33
N2
2.77
0.27
4.58
0.25
0.51
0.25
8.63
N3
3.96
1.63
3.48
0.00
0.77
0.00
9.84
MEDIOS
S1
S2
S3
N1
N2
N3
PENDIENTE
0.555
0.673
0.578
0.066
0.042
0.053
CORRELACION
0.895
0.905
0.893
0.983
0.861
0.935
0_1
1_4
4_5
5_6
6_8
8_11
SUMATORIA DE %
preliminares
89
ANEXO B
DATOS DE FERMENTACIONES EN EL BIOFLO
Tabla B.1 Datos de conteo en cámara Neubauer Improved
P A R
D
T IC
IA
0
1
2
3
4
7
8
9
1 0
P A R
D
T IC
F E R M E N T A C IO N
1 C O N
R E G U L A C IO N
U L A S
C O N T A D A S
E N
C A M A R A
N E U B A U E R
T R IP L IC A D O
P R
1
2
3
8 .5
9 .2
9 .5
4 0 .2
3 9 .5
4 1 .1
4 4 .5
4 2 .3
4 5 .3
5 4 .7
5 5 .8
5 4 .5
5 6 .3
5 7 .9
5 6 .1
4 8 .5
4 6 .2
4 7 .3
2 8 .8 5
2 9 .3
3 0 .8
2 7 .2
2 7 .5
2 8 .5
2 5 .4
2 4 .8
2 5 .8
F E R M E N T A C
U L A S
C O N T A D A S
T R
IA
0
1
2
3
4
7
8
9
4
4
5
5
4
2
2
2
1 0
P A R
D
T IC
U L A S
T IC
U L A S
IA
0
1
2
3
7
8
9
1 0
P A R
D
IA
0
1
2
3
7
8
9
1 0
1
9
2
6
6
8
5
7
6
3
.
.
.
.
.
.
.
.
3
3
2
9
2
1
1
4
IO N
E N
2 C O N
R E G U L A C IO N
C A M A R A
N E U B A U E R
IP L IC
2
9 .
4 3
4 5
5 5
5 9
4 4
2 7
2 5
2 3
5
.5
.8
.8
.3
.3
.8
.3
.1
A D
D E
P H
IM P R O
O
M
4
4
5
5
4
2
2
2
9 .
0
4
5
6
7
9
7
5
E D
V E D
A
2 0 ° C
D E S V IA C IO
N
E S T A N D A R
0 .5 1
0 .8 0
1 .5 5
0 .7 0
0 .9 9
1 .1 5
1 .0 2
0 .6 8
0 .5 0
IO
0 7
.2 7
.0 3
.0 0
.7 7
.3 3
.6 5
.7 3
.3 3
D E
P H
IM P R O
V E D
A
2 0 ° C
D
O
P R
3
9 .
4 2
4 7
5 7
5 8
4 4
2 6
2 5
2 2
8
.8
.1
.3
.5
.1
.2
.5
.8
O
M
4
4
5
5
4
2
2
2
9 .
2
6
6
8
4
7
5
3
E D
4 3
.8 7
.4 0
.4 3
.9 0
.5 3
.0 3
.6 3
.1 0
IO
E S V IA C IO
N
E S T A N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
0
.
.
.
.
.
.
.
.
.
4
6
6
7
4
5
8
4
3
0
0
6
8
0
9
0
2
0
F E R M E N T A C IO N
1 S IN
R E G U L A C IO N
D E
P H
C O N T A D A S
E N
C A M A R A
N E U B A U E R
IM P R O V E D
A
2 0 ° C
D E S V IA C IO
T R IP L IC A D O
P R O M E D IO
N
1
2
3
E S T A N D A R
9 .5
9 .8
1 0 .2
9 .8 3
0 .3 5
2 8 .8
2 8 .6
2 9 .5
2 8 .9 7
0 .4 7
3 3 .5
3 4 .2
3 3 .1
3 3 .6 0
0 .5 6
3 8 .2
3 7 .5
3 8 .8
3 8 .1 7
0 .6 5
2 8 .2
3 0 .1
2 9 .5
2 9 .2 7
0 .9 7
2 6 .8
2 6 .2
2 7 .4
2 6 .8 0
0 .6 0
2 5 .1
2 4 .8
2 4 .2
2 4 .7 0
0 .4 6
2 1 .3
2 0 .8
2 2 .1
2 1 .4 0
0 .6 6
F E R M E N T A C IO N
2 S IN
R E G U L A C IO N
D E
P H
C O N T A D A S
E N
C A M A R A
N E U B A U E R
IM P R O V E D
A
2 0 ° C
D E S V IA C IO
T R IP L IC A D O
P R O M E D IO
N
1
2
3
E S T A N D A R
9 .2
9 .4
9 .7
9 .4 3
0 .2 5
3 0 .1
3 0 .5
3 1 .2
3 0 .6 0
0 .5 6
3 5 .5
3 4 .8
3 6 .3
3 5 .5 3
0 .7 5
3 9 .8
4 0 .5
4 1 .1
4 0 .4 7
0 .6 5
3 0 .2
2 9 .7
3 1 .5
3 0 .4 7
0 .9 3
2 8 .1
2 7 .5
2 7 .3
2 7 .6 3
0 .4 2
2 6 .5
2 7 .1
2 5 .8
2 6 .4 7
0 .6 5
2 2 .8
2 3 .1
2 1 .9
2 2 .6 0
0 .6 2
90
Tabla B.2 Datos de °Brix
D IA
0
1
2
3
4
7
8
9
10
F E R M E N T A C IO N 1 C O N R E G U L A C IO N D E P H
° B R IX A 2 0 ° C
T R IP L IC A D O
P R O M E D IO
1
2
3
20
20
20
2 0 .0
1 8 .2
1 7 .8
1 7 .9
1 8 .0
1 4 .3
14
1 4 .2
1 4 .2
1 0 .6
1 0 .8
1 0 .6
1 0 .7
8
8 .2
8 .4
8 .2
7 .4
7 .4
7 .5
7 .4
7
7
7
7 .0
6 .5
6 .6
6 .5
6 .5
6 .1
6 .2
6 .2
6 .2
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.2
.1
.1
.2
.0
.0
.0
.0
0
1
5
2
0
6
0
6
6
F E R M E N T A C IO N 2 C O N R E G U L A C IO N D E P H
° B R IX A 2 0 ° C
T R IP L IC A D O
D IA
0
1
2
3
4
7
8
9
10
D IA
0
1
2
3
7
8
9
10
D IA
0
1
2
3
7
8
9
10
P R O M E D IO
1
2
3
20
1 7 .5
1 4 .1
1 0 .1
7 .8
7 .2
6 .8
6 .4
6
20
1 7 .4
1 4 .2
1 0 .1
8 .2
7 .3
6 .9
6 .3
5 .9
20
1 7 .6
1 3 .9
1 0 .2
8 .1
7 .2
6 .8
6 .4
6
2 0 .0
1 7 .5
1 4 .1
1 0 .1
8 .0
7 .2
6 .8
6 .4
6 .0
F E R M E N T A C IO N 1 S IN R E G U L A C IO N D E P H
° B R IX A 2 0 ° C
T R IP L IC A D O
P R O M E D IO
1
2
3
20
18
1 4 .6
1 1 .5
7 .4
7 .2
6 .7
6 .4
20
18
1 4 .6
1 2 .2
7 .8
7
6 .8
6 .3
20
18
1 4 .8
1 1 .8
7 .9
7 .2
6 .8
6 .4
2 0 .0
1 8 .0
1 4 .7
1 1 .8
7 .7
7 .1
6 .8
6 .4
F E R M E N T A C IO N 2 S IN R E G U L A C IO N D E P H
° B R IX A 2 0 ° C
T R IP L IC A D O
P R O M E D IO
1
2
3
20
20
20
2 0 .0
1 7 .2
1 7 .4
1 7 .3
1 7 .3
1 4 .2
1 4 .2
14
1 4 .1
1 0 .5
1 0 .1
1 0 .8
1 0 .5
7 .2
7 .2
7 .4
7 .3
6 .8
6 .9
6 .8
6 .8
6 .4
6 .4
6 .5
6 .4
6
6 .1
6
6 .0
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.1
.1
.0
.2
.0
.0
.0
.0
0
0
5
6
1
6
6
6
6
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.0
.1
.3
.2
.1
.0
.0
0
0
2
5
6
2
6
6
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.1
.1
.3
.1
.0
.0
.0
0
0
2
5
2
6
6
6
91
Tabla B.3 Datos de contenido de nitrógeno
F E R M E N T A C IO N 1 C O N R E G U L A C IO N D E P H
D E T E R M IN A C IÓ N D E N IT R O G E N O C E L U L A R
V O L U M E N
D IA
0
1
2
3
4
7
8
9
1 0
1
0 .1
0 .3 5
0 .4
0 .4 5
0 .5 5
0 .4 5
0 .4
0 .3 5
0 .3
D E T IT U L A C IO N H C L 0 . 9 4 6 5 6 N
T R IP L IC A D O ( m l )
2
0 .1
0 .3 5
0 .4
0 .4 5
0 .5 5
0 .4 5
0 .4
0 .3 5
0 .3
/
P R O M E D IO
3
0 .1
0 .3 5
0 .4
0 .4 5
0 .5 5
0 .4 5
0 .4
0 .3 5
0 .3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
.1
.3
.4
.4
.5
.4
.4
.3
.3
0
5
0
5
5
5
0
5
0
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
F E R M E N T A C IO N 2 C O N R E G U L A C IO N D E P H
D E T E R M IN A C IÓ N D E N IT R O G E N O C E L U L A R
V O L U M E N
D IA
0
1
2
3
4
7
8
9
1 0
D E T IT U L A C IO N H C L 0 . 9 4 6 5 6 N
T R IP L IC A D O ( m l )
1
2
3
0 .1 5
0 .3 5
0 .4
0 .5
0 .6
0 .4 5
0 .3 5
0 .3
0 .2 5
0 .1 5
0 .3 5
0 .4
0 .5
0 .6
0 .4 5
0 .3 5
0 .3
0 .2 5
0 .1 5
0 .3 5
0 .4
0 .5
0 .6
0 .4 5
0 .3 5
0 .3
0 .2 5
/
P R O M E D IO
0
0
0
0
0
0
0
0
0
.1
.3
.4
.5
.6
.4
.3
.3
.2
5
5
0
0
0
5
5
0
5
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
F E R M E N T A C IO N 1 S IN R E G U L A C IO N D E P H
D E T E R M IN A C IÓ N D E N IT R O G E N O C E L U L A R
V O L U M E N
D IA
0
1
2
3
7
8
9
1 0
D E T IT U L A C IO N H C L 0 . 9 4 6 5 6 N
T R IP L IC A D O ( m l )
1
2
3
0 .1
0 .3
0 .3 5
0 .4
0 .3
0 .3
0 .2 5
0 .2 5
0 .1
0 .3
0 .3 5
0 .4
0 .3
0 .3
0 .2 5
0 .2 5
0 .1
0 .3
0 .3 5
0 .4
0 .3
0 .3
0 .2 5
0 .2 5
/
P R O M E D IO
0
0
0
0
0
0
0
0
.1
.3
.3
.4
.3
.3
.2
.2
0
0
5
0
0
0
5
5
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
0
0
0
0
0
0
0
0
F E R M E N T A C IO N 2 S IN R E G U L A C IO N D E P H
D E T E R M IN A C IÓ N D E N IT R O G E N O C E L U L A R
V O L U M E N
D IA
0
1
2
3
7
8
9
1 0
1
0 .1
0 .3 5
0 .4
0 .4 5
0 .3 5
0 .3
0 .2 5
0 .2 5
D E T IT U L A C IO N H C L 0 . 9 4 6 5 6 N
T R IP L IC A D O ( m l )
2
0 .1
0 .3 5
0 .4
0 .4 5
0 .3 5
0 .3
0 .2 5
0 .2 5
3
0 .1
0 .3 5
0 .4
0 .4 5
0 .3 5
0 .3
0 .2 5
0 .2 5
/
P R O M E D IO
0
0
0
0
0
0
0
0
.1
.3
.4
.4
.3
.3
.2
.2
0
5
0
5
5
0
5
5
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
0
0
0
0
0
0
0
0
Tabla B.4 Consumo de ácido y base por sistema de regulación de pH
92
FERMENTACION 1
ACIDO
KOH 5 N
CITRICO 5 N
(ml)
(ml)
88
65
25
34
25
16
31
18
89
50
25
14
31
19
35
18
DIA
1
2
3
4
7
8
9
10
FERMENTACION 2
ACIDO
KOH 5 N
CITRICO 5 N
(ml)
(ml)
91
72
28
38
26
15
32
18
98
62
21
15
30
19
26
20
Tabla B.5 Datos de azúcares reductores
DIA
FERMENTACION
1
FERMENTACION
2
10
41.0
38.2
FERMENTACION
1 SIN CONTROL
DE PH
FERMENTACION
2 SIN CONTROL
DE PH
VOLUMEN DE TITULACION (ml)
40.8
40.5
38.5
39.2
35.0
34.5
34.7
36.5 35.5. 36.0
Tabla B.6 Calculo de tasa de multiplicación y n° de generaciones de acuerdo a #
de células
INTERVALO
DE DIAS
N° de Generaciones
FERMENTACION 1
TASA DE
MULTIPLICACION
N° de Generaciones
FERMENTACION 2
TASA DE
MULTIPLICACION
0-24
0-48
0-72
0-96
2.1
2.5
2.6
2.6
0.09
0.05
0.04
0.03
2.2
2.5
2.6
2.6
0.09
0.05
0.04
0.03
N° de Generaciones
FERMENTACION 1
SIN CONTROL
TASA DE
MULTIPLICACION
N° de Generaciones
FERMENTACION 2
SIN CONTROL
TASA DE
MULTIPLICACION
1.6
1.8
2.0
0.07
0.04
0.03
1.7
1.9
2.1
0.07
0.04
0.03
93
ANEXO C
DATOS DEL SEGUIMIENTO DE UNA
FERMENTACION CON FLUJOS DE ENTRADA Y DE
SALIDA
El presente anexo presenta los resultados del estudio preliminar para el montaje
de un cultivo continuo en el biorreactor.
RESULTADOS
DE
LA
EVALUACION
DE
PERISTALTICAS DEL BIOFLO Y SEGUIMIENTO
FERMENTACION EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO
BOMBAS
DE UNA
Previo al establecimiento de una fermentación alcohólica con flujo de entrada de
nutriente y flujo de salida de cosecha, se determinó la tasa de crecimiento de
acuerdo a las fermentaciones en sistema discontinuo previamente trabajadas en el
Bioflo. La tasa de crecimiento se calculó para la fase exponencial.
µ = ln( xf / xi ) / ∆t
Donde:
µ : Tasa de crecimiento
xf : Número de microorganismos día final
xi : Número de microorganismos día inicial
∆t : Intervalo de tiempo entre final e inicial
Para las cuatro fermentaciones realizadas se tiene el cálculo de las tasas de
crecimiento durante la fase exponencial de crecimiento, la cual se presento
durante los primeros cuatro días de la fermentación con control de pH y durante
los primeros tres días para la fermentación sin control de pH.
Tabla C.1 Tasas de crecimiento para fermentaciones en sistema discontinuo
IN T E R V A LO
DE HORAS
TASA DE
C R EC IM IE N T O
FER M . 1 C O N
R E G U LA C IO N D E
P H (h -1 )
0-24
24-48
48-72
72-96
Fuente: Autores
0.062
0.011
0.003
0.001
TASA DE
TASA DE
TASA DE
C R EC IM IE N T O
C R EC IM IE N T O
C R EC IM IE N T O
FER M . 2 SIN
FER M . 1 SIN
FER M . 2 C O N
R E G U LA C IO N C O N T R O L D E P H (h - C O N T R O L D E P H (h 1
1
D E P H (h -1 )
)
)
0.063
0.011
0.002
0.001
0.045
0.006
0.005
0.049
0.006
0.005
De acuerdo a las tasas calculadas y a la teoría que define que la tasa de
crecimiento es igual a la tasa de dilución, y se calculó el flujo necesario para
desarrollar un sistema continuo de fermentación. La tasa de dilución a emplear es
la tasa de crecimiento para la fase exponencial. De acuerdo a esto se tiene que
para una fermentación con control de pH la tasa de dilución es igual a 0.011 h-1
por lo tanto el flujo para un volumen del sistema de 10000 mililitros es igual a 110
ml / hr ó 1.8 ml / minuto, para condiciones de equilibrio.
Resultados de una fermentación empleando flujos de entrada y flujos de
salida
Para fijar los flujos de entrada de nutriente y de salida de producto o cosecha se
emplea el sistema de bombas peristálticas descrito en el numeral 4.1. Utilizando
el modelo matemático para fermentaciones en sistemas continuos, se fijó la tasa
de dilución de acuerdo a las fermentaciones en sistema discontinuo, siendo
necesario medir el crecimiento de microorganismos y confrontando el resultado
con contenido de nitrógeno y sólidos solubles totales. Los resultados se presentan
a continuación.
Tabla C.2 Resultados del seguimiento de una fermentación con flujo de entrada y
flujo de salida
D IA
0
1
2
5
6
7
8
12
13
N ° M .O /m l
R a n g o s u p e rio r
2 .6 E + 0 7
6 .4 E + 0 7
7 .5 E + 0 7
1 .0 E + 0 8
8 .5 E + 0 7
7 .3 E + 0 7
7 .1 E + 0 7
5 .6 E + 0 7
5 .8 E + 0 7
R a n g o in fe rio r
1 .9 E + 0 7
4 .8 E + 0 7
6 .4 E + 0 7
7 .2 E + 0 7
6 .2 E + 0 7
5 .7 E + 0 7
3 .8 E + 0 7
5 .2 E + 0 7
4 .7 E + 0 7
C O N T E N ID O D E N IT R O G E N O /M L
m g N IT R O G E N O /m l.
0 .0 6 6 0
0 .1 9 8 5
0 .2 6 5 0
0 .3 3 1 0
0 .2 6 5 0
0 .2 4 8 0
0 .1 9 8 5
0 .1 9 8 5
0 .1 9 8 5
S O L ID O S
SOLUBLES
T OT ALES
° B R IX A 2 0 ° C
2 0 .0
1 8 .8
1 5 .8
9 .0
8 .5
8 .6
9 .0
8 .9
1 0 .0
Fuente: Autores
De acuerdo al conteo de microorganismos se calculó la tasa de crecimiento que
define la tasa de dilución necesaria para establecer los flujos de entrada y salida
en el Biorreactor.
Tabla C.3 Tasas de dilución y flujos en la fermentación con flujo de entrada y flujo
de salida
INTERVALO DE
HORAS
TASA DE
CRECIMIENTO (hr-1)
0-24
0-48
0-120
0-144
0-168
0-192
0-288
0-312
0.040
0.023
0.011
0.008
0.006
0.005
0.003
0.003
FLUJO(ML/MIN)
% VELOCIDAD DE
BOMBAS
PERISTALTICAS
FLUJO BIOFLO
COSECHA(ML/MIN)
3.88
1.79
1.24
0.92
0.75
0.42
0.37
40%
5%
15%
15%
15%
5%
15%
1.60
0.20
0.58
0.58
0.58
0.20
0.58
FLUJO BIOFLO
TASA DE DILUCIÓN
ALIMENTACIONML/
COSECHA (hr-1)
MIN)
0.010
0.001
0.004
0.004
0.004
0.002
0.005
1.25
0.18
0.48
0.48
0.48
0.18
0.48
TASA DE DILUCIÓN
ALIMENTACION (hr-1)
0.008
0.001
0.003
0.003
0.004
0.002
0.004
Fuente: Autores
Para el día final de fermentación, se determinó el contenido alcohólico y
concentración de azúcares reductores dando como resultado 10 °G.L y 0.0218 g
azúcar reductor/ mililitro.
El conteo de microorganismos se realizó tomando muestra directamente del vaso
del biorreactor y se observó que hasta el quinto día se asemeja a un crecimiento
exponencial similar a de un cultivo discontinuo(Ver Tabla C.2), notando que la tasa
de dilución para el cultivo continuo se fijó a partir del segundo día de fermentación.
Entre el intervalo del quinto hasta el octavo día de fermentación se notó un
descenso desde 8.5E7 m.o/ml hasta 5.4E7 m.o/ml. Esto se debe a la diferencia
ya expresada para los caudales de entrada y salida de flujo del biorreactor, lo que
implica una diferente tasa de dilución para la cosecha y alimentación (Ver Tabla
C.3). Del día 8 hasta el día 13 donde se finalizo la fermentación no existen
variaciones en el crecimiento de microorganismos ni variación en el contenido de
nitrógeno. La gráfica de nitrógeno por célula presentó un comportamiento
constante a lo largo de la fermentación, lo que indica que el conteo realizado es
equivalente al contenido de nitrógeno durante la fermentación. Para la curva de
grados Brix se observa que desde el día quinto hay una estabilización de los
mismos hasta finalizar la fermentación en valores aproximados a 9 °Brix. Esto
indica que solo hubo consumo de sólidos solubles durante los primeros 5 días de
fermentación en continuo. En los siguientes días es probable que la concentración
de sólidos solubles se mantuviera constante debido a la tasa de dilución, que
alimenta de sólidos al cultivo pero también los desaloja del biorreactor.
De acuerdo a los valores de tasas de dilución para cosecha y para alimentación,
se tiene que la tasa de dilución fue menor que la tasa de crecimiento hasta el día
12 de fermentación. El día 13 la tasa de dilución tiene un valor mayor, tanto para
la alimentación como para la cosecha, respecto a la tasa de crecimiento para el
intervalo de días de fermentación. Los fines de semana la tasa de dilución debió
adaptarse a un caudal bajo para lograr dar continuidad a la fermentación, evitando
el desgaste del medio alimentador.
Tabla C.4 Datos de conteo en cámara Neubauer Improved
D IA
0
1
2
5
6
7
8
12
13
8.60
26.10
28.00
39.40
28.10
23.00
15.50
22.30
20.50
T R IP L IC AD O S
10.60
20.90
25.50
28.40
25.60
29.30
21.40
20.85
18.90
7.90
20.40
29.75
35.10
34.60
25.60
28.70
21.20
23.48
P R O M E D IO
9.03
22.47
27.75
34.30
29.43
25.97
21.87
21.45
20.96
DESV. ST D
1.40
3.16
2.14
5.54
4.65
3.17
6.61
0.76
2.32
Tabla C.5 Datos de °Brix tomados a 20°C
D IA
0
1
2
5
6
7
8
12
13
P R O M E D IO
T R IP L IC A D O S
2 0 .0
1 8 .6
1 5 .8
9 .0
8 .4
8 .7
9 .0
8 .8
1 0 .0
2 0 .0
1 9 .0
1 5 .8
9 .0
8 .5
8 .6
9 .0
8 .9
9 .9
2 0 .0
1 8 .7
1 5 .8
8 .9
8 .6
8 .6
8 .9
9 .0
1 0 .0
2 0 .0
1 8 .8
1 5 .8
9 .0
8 .5
8 .6
9 .0
8 .9
1 0 .0
Tabla C.6 Datos de contenido de nitrógeno
D IA
0
1
2
5
6
7
8
12
13
T R IP L IC A D O S V O L U M E N H C L 0 .9 4 6 5 6 N ( m l)
0 .1 0
0 .3 0
0 .4 0
0 .5 0
0 .4 0
0 .3 5
0 .3 0
0 .3 0
0 .3 0
0 .1 0
0 .3 0
0 .4 0
0 .5 0
0 .4 0
0 .3 5
0 .3 0
0 .3 0
0 .3 0
0 .1 0
0 .3 0
0 .4 0
0 .5 0
0 .4 0
0 .3 5
0 .3 0
0 .3 0
0 .3 0
P R O M E D IO
0 .1 0
0 .3 0
0 .4 0
0 .5 0
0 .4 0
0 .3 5
0 .3 0
0 .3 0
0 .3 0
Gráfica C.1 Curva de crecimiento de microorganismos
C R E C IM IE N T O D E M IC R O O R G A N IS M O S
N° M.O/ml.
1 .0 0 E + 0 8
Fuente: Autores
1 .0 0 E + 0 7
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
T IE M P O ( D IA S )
N ú m e ro d e m ic ro o rg a n is m o s / m l
Fuente: Autores
Gráfica C.2 Curva de contenido de nitrógeno
C O N T E N ID O D E N IT R O G E N O E N M IL IG R A M O S D E N /M L
0 .4 0 0 0 0
0 .3 5 0 0 0
mg NITROGENO/MILILITRO
0 .3 0 0 0 0
0 .2 5 0 0 0
0 .2 0 0 0 0
0 .1 5 0 0 0
0 .1 0 0 0 0
0 .0 5 0 0 0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
T IE M P O ( D IA S )
C O N T E N ID O D E N IT R O G E N O /M L
Fuente: Autores
9
10
11
12
13
14
Gráfica C.3 Curva de Grados Brix
° B R IX A 2 0 ° C
25
20
°BRIX
15
10
5
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
13
14
T IE M P O (D IAS )
Fuente: Autores
Gráfica C.4 Contenido de nitrógeno por célula.
N /C E L U L A
1 .0 0 E -0 8
1
2
3
4
5
6
7
N(mg)/n° microorganismos
0
1 .0 0 E -0 9
T IE M P O ( D IA S )
N /C E L U L A
Fuente : Autores
8
9
10
11
12
ANEXO D
SISTEMA DE BOMBAS PERISTALTICAS DEL
BIOFLO 3000 M1227
Figura D.1 Bombas peristálticas
Figura D.2 Configuración de bombas para salida de flujo del Bioflo
Figura D.3 Configuración de bombas para entrada de flujo del Bioflo
Figura D.4 Configuración de puerto de entrada de flujo en el Bioflo
Figura D.5 Configuración de puerto de salida de flujo en el Bioflo
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proceso de fermentación utilizando Saccharomyces. Tesis de grado. Universidad
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Factores que intervienen en la
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10. GARCIA, QUINTERO, LOPEZ. Biotecnología alimentaria. Editorial Limusa. México,
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Control en un proceso de
17. SUAREZ, J. A. Microbiología enológica. Editorial Mundiprensa. España, 1990.
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