actina

varios videos interesantes en
http://cellix.imolbio.oeaw.ac.at/Videotour/video_tour.html
Extensiones citoplasmáticas basadas en el citoesqueleto de actina
órgano
mecanosensorial
células epiteliales
intestinales, riñón
células mecanosensoras (Drosohila)
fibroblastos, conos de crecimiento neuronales
células sensoriales
del órgano de Corti
Revenu et al., Nature RMCB2004
Lamelas, pliegues y filopodios son extensiones citoplasmáticas
dinámicas observables en células migratorias
Extensiones planas y delgadas adheridas al substrato se denominan lamelas; extensiones
que no se adhieren y que se pliegan sobre la parte ¨superior¨ de la célula se conocen como "ruffles".
Proyecciones con forma de aguja adheridas al substrato se denominan filopodios.
ruffles
microscopía electrónica de barrido de fibroblastos
filopodios
lamela
videos accesibles
Los conos de crecimiento neuronales son sitios de elongación
de axones y dendritas
Los conos de crecimiento varían en morfología, extienden una lamela con numerosos filopodios.
La estructura y dinámica de la región periférica de los conos de crecimiento (P) depende del
citoesqueleto de actina (en rojo). Los microtúbulos abundan en la región central (C) del cono.
actina
microtúbulos
Dent & Gertler, Neuron, 2003
La videomicroscopía revela que los filopodios y lamelas
son estructuras dinámicas
Robles et al, Neuron 2003
0.5'
2'
4'
18'
20'
22'
filopodios
Paglini et al JCB 1998
La marcación con falloidina fluorescente revela la abundancia de los
filamentos de actina en filopodios, lamela y lamelipodio
lamelipodio
fibroblasto
citoesqueleto de actina (rojo)
predominante en la lamela y
filopodios. Los microtúbulos (verde)
terminan en un dominio proximal.
lamela
de
avance
citoplasma
en retracción
(cola)
axón
filopodios
Paglini et al JCB 1998
lamela
Suter & Forscher J. Neurobiol. 2000
Numerosas proteínas contribuyen a la organización tridimensional
de los filamentos de actina
Varias proteínas se unen a actina mediante dominios CH (Calponin-Homology). Proteínas monoméricas con más
de un dominio CH, o diméricas, con un solo CH cada monómero, contribuyen a interconectar los filamentos de actina.
CH
Lodish et al., MCB2004
Diferentes arreglos 3D: Fascículos y redes de microfilamentos
fascículos contráctiles
"fibras de estrés"
El número y ubicación de los dominios CH
en las proteínas que unen actina determinan
el arreglo tridimensional que estabilizan. Los
sitios de unión a actina se muestran en rojo.
redes bidimensionales
fascículos no
contráctiles
Organización 3D de los microfilamentos. Microscopía electrónica
Fascículos de microfilamentos
unidos por fimbrina
Redes de microfilamentos conectados por
filamina
Lodish et al., MCB2004
El espaciamiento de los filamentos de actina en las distintas
estructuras celulares depende del tipo de proteínas accesorias
Fascí
Fascículo contrá
contráctil
Fascí
Fascículo no contrá
contráctil
el mayor espaciamiento
permite la unión de miosina II
entre los filamentos. Ej. en
fibras de estrés.
el empaquetamiento denso de
microflamentos impide la
asociación de miosina. Ej. en filopodios.
et al, Ne
AlbertsRobles
et al., MCB2002
Visualización de una red de filamentos de actina en
lamelas y lamelipodios de keratinocitos
lamela de
keratinocito
filamina estabiliza la red
interaccionando con filamentos
orientados perpendicularmente.
la parte distal de la lamela,
denominada lamelipodio,
exhibe una red dendrítica
de filamentos de actina
nucleados y anclados en
complejos Arp2/3 (flechas).
actina
videos disponibles
Svitkina et al, JCB 1997
En el lamelipodio los complejos Arp2/3 nuclean actina y anclan los nuevos
filamentos a filamentos preexistentes
Los complejos Arp2/3 se
asocian lateralmente a
microfilamentos preformados
y facilitan el ensamble de
actina formando
filamentos ¨ramificados¨.
Los filamentos de actina formados
a partir de Arp2/3 emergen del
filamento parental a un ángulo de 70°
arreglo
dendrítico
Alberts et al., MCB2002
La fasciculación y crecimiento de filamentos de actina en la región
distal de la lamela puede generar filopodios
filopodio
red dendrítica
de actina
Los filopodios se forman a
partir de filamentos de actina
de la lamela.
los círculos señalan ramas a partir
de las cuales se originan filamentos
de actina que se empaquetan y
forman el esqueleto del filopodio.
Svitkina et al JCB 2003
La proteína fascina contribuye a fascicular los filamentos de
actina en los precursores de los filopodios
La clave para la iniciación de un filopodio es la
fasciculación (mediada por fascina) y la inhibición
del “capping” o terminación de la elongación
(mediada por proteínas de la familia ENA/VASP).
Esquema de formación de un filopodio
(ENA/VASP)
fasciculación - elongación
Svitkina et al JCB 2003
Fascículos contráctiles de microfilamentos o fibras de estrés le
permiten a la célula traccionar sobre el substrato
focos de adhesión (flechas)
microscopía de reflexión
focos de adhesión (verde) y fibras de
estrés (rojo). Microscopía de fluorescencia
la asociación de las fibras de estrés
con miosina les permite ejercer
fuerzas de tracción sobre
las adhesiones focales
fibras de estrés
microscopía de fluorescencia
fibra de estrés
α−actinina
actina
adhesión
focal
vinculina
las fibras de estrés se anclan a las
integrinas de las adhesiones focales
mediante proteínas tales como
talina y paxilina
talina
integrinas
Vinculina es un proteína abudante de focos de adhesión
que ancla las fibras de estrés a las adhesiones focales
focos de adhesión
(vinculina)
La unión a PIP2 induce la conformación activa
de vinculina lo cual promueve su interacción
con actina y con otras proteínas que unen actina.
conformación
inactiva
Zamir & Geiger, JCS 2001.
conformación
activa
Las proteínas ERM anclan el citoesqueleto cortical de actina a la
membrana plasmática en células epiteliales polarizadas
Ezrina, Radixina y Moesina son miembros de la familia de proteínas ERM.
La asociación de las proteínas ERM a la actina y a proteínas de la membrana plasmática
es regulado por fosforilación o unión a fosfoinosítidos fosforilados (PIP2).
Espectrina y actina forman una red cortical
que estabiliza la membrana de eritrocitos
microscopía electrónica de la red cortical de espectrina
complejo de
anclaje
s = spectrin
Espectrina es un heterodímero que se asocia cabeza con cabeza formando tetrámeros de unos
200 nm de longitud. Los tetrámeros se unen a filamentos de actina en sitios denominados "nodos"
o complejos de anclaje formando una malla bidimensional. Espectrina se ancla a la membrana
plasmática a través de su unión a las proteínas periféricas ankirina y banda 4.1.
complejos de anclaje
a actina
Varias proteínas contribuyen a remodelar la red de actina.
Gelsolina, cofilina y severina inducen la fragmentación de los microfilamentos y el
“capping” de los extremos (+). La actividad de gelsolina es regulada por calcio y PIP2
el fragmento formado se
depolimeriza por el extremo (-)
(-)
(+)
Ca++
Vía de señ
señalizació
alización
que activa a gelsolina
trombina
receptor acoplado
a proteína G
PLC
“capping” del extremo (+)
impide el crecimiento
↑DAG/IP3
Ca++
↑gelsolina
Cambios en las concentraciones de calcio citosólico
afectan la reorganización de la actina
El compuesto fluorescente Fura 2 emite a una longitud de onda determinada cuando esta unido a Ca++. Esta
fluorescencia puede ser visualizada en un microscopio. Debajo se visualiza en pseudocolor los niveles de calcio
(azul = min
rojo = max) en un leucocito. Observe la existencia de un gradiente con máximo niveles de calcio
en la región de la célula opuesta al margen de avance.
margen de
avance
↑ Ca++
El aumento de Ca++ estimula la actividad de gelsolina, la cual promueve el desensamble
de microfilamentos en la región de la célula opuesta al margen de avance.
Remodelación del citoesqueleto de actina en plaquetas
La activación de plaquetas involucra cambios morfológicos rápidos que son promovidos por la reorganización del
citoesqueleto de actina. Varias proteínas que regulan el estado de polimerización de la actina (gelsolina, profilina)
actúan de manera coordinada por señales citosólicas como el Ca2+ y el PIP2.
trombina
INACTIVATES
plaqueta inactiva
activa
lamela
contracción mediada por miosina II
La plasticidad del citoesqueleto de actina es regulada por
señales extracelulares
(a) en una célula epitelial en reposo villina estabiliza los ramilletes de filamentos de actina en las microvellosidades; una
pequeña fracción se encuentra asociada a PIP2 en membranas. (b) En respuesta a la estimulación de ciertos receptores
(ej. EGFR) se hidroliza el PIP2 y aumenta el calcio citosólico. El calcio activa a villina y a otras proteínas que fragmentan
filamentos de actina de las microvellosidades y promueven cambios en el arreglo tridimensional de la actina.
estimulación
Revenu et al, Nature RMCB 2004
Comparación de proteínas accesorias que regulan el estado de
polimerización de la actina y tubulina
proteínas que se unen a las
subunidades no ensambladas *
tubulina
actina
stathmin
thymosin
stathmin-P
profilin
*las proteínas promueven la depolimerizacion (↓)o
polimerizacion (↑) de los respectivos polímeros
proteínas que causan la fragmentación
de los polímeros
microtúbulos
microfilamentos
katanin
gelsolin, severin
proteínas que se asocian a las paredes
de los polímeros y los estabilizan
microtúbulos
microfilamentos
MAP2, Tau
XMAP215
tropomyosin
proteínas que se unen a los
extremos de los polímeros
microtúbulos
γ-TuRC (-) nucleación
catastrophins (+ y -)
microfilamentos
CapZ (+) capping
Arp2/3 (-) nucleación
proteínas que se asocian a las paredes
de los polímeros y los desestabilizan
microtúbulos
XMAP215-P
KIF2, Op18
microfilamentos
cofilin
Las GTPasas rho, rac y Cdc42 controlan la actividad de las
proteínas involucradas en la organización tridimensional de la actina
Fibroblastos quiescentes microinyectados con mutantes de GTPasas constitutivamente activas. Se muestra el
citoesqueleto de actina y los focos de adhesión (vinculina). La microinyección de rho activo induce la formación
de fibras de estrés; Rac induce la formación de lamelipodio; Cdc42 induce la formación de filopodios
actina
vinculina
células quiescentes
actina
rho activo
vinculina
formación de fibras de estrés
lamelipodio
rac activo
formación de lamelipodio
Cdc42 activo
formación de filopodios
La actividad de rho, rac y Cdc42 es regulada
por señales extracelulares
La señalización de diversos receptores de superficie convergen en la activación de rho, rac y Cdc42
suero
ECM
ECM
Arp2/3
La depolimerización de microtúbulos promueve la activación de rho,
la formación de fibras de
estrés y adhesiones focales
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
control, microtúbulos
control, actina
nocodazol 3 min, microtúbulos
nocodazol 3 min, actina
nocodazol 30 min, actina
control, vinculina
nocodazol 30 min, vinculina
Bershadsky et al Curr. Biol., 1996
La extensión de la lamela de avance requiere de la
activación de la GTPasa rac
la activación de rac promueve la extensión de la lamela de
avance a través de la activación de los complejos Arp2/3.
localización de rac activo mediante FRET
no interaction = no FRET
interaction = FRET
Rac-GDP
Rac-GTP
efector
(-)
nivel de activación
(+)
efector
dirección del movimiento
(del Pozo, Kiosses, Schwartz)
lamela de avance
integrinas
factores
de crecimiento
↑Rac
↑Scare/WAVE
Pak
LIMK
↑Arp2/3
cofilina
↑polimerización de actina
Modelo de protrusión del lamelipodio: “treadmilling” de la red de actina
En el lamelipodio la red dendrítica de actina experimenta un “treadmilling”, con
un ensamble neto en el frente de avance y un desensamble neto por detrás de él.
empuje
CapZ
Extensión de la membrana en
el frente de avance. Nucleación de
actina-ATP (proteínas Arp2/3);
elongación de filamentos en un ángulo
de 70°; terminación de la polimerización
(proteínas CapZ). La polimerización
de actina empuja la membrana hacia
adelante (protrusión).
Desensamble de la red de filamentos detrás
del frente de avance. Asociación de cofilina
(en verde) a la actina-ADP (en rojo) de los
polímeros, evento que promueve el
desensamble de la actina de los extremos (-).
extensión
remodelación
Señales extracelulares activan a la GTPasa rac. Rac activa a las proteínas WASP/Scar y éstas a los complejos Arp2/3.
Los complejos Arp2/3 activos se asocian a filamentos pre-existentes y nuclean actina. Este proceso da lugar a nuevos
filamentos de actina (ramas).
Alberts et al MBC 4th Ed
La polaridad de las células migratorias involucra la actividad
coordinada de las GTPasas rho, rac y Cdc42
Ridley et al, Science 2003
La polimerización de actina genera fuerzas de empuje
sobre la membrana plasmática
La reacción acrosomal en espermatozoides es
disparada al contacto con la zona pelúcida del huevo
y es mediada por una rápida polimerización de actina
http://worms.zoology.wisc.edu/urchins/SUfert_acrosome.html
La polimerización de actina es explotada por algunos
parásitos para impulsar su movimiento intracelular
La proteína ActA localizada en el polo caudal de la bacteria Listeria monocytogenes recluta y activa el complejo Arp2/3
de la célula huesped, induciendo la nucleación y polimerización de actina en ese polo. La nucleación y polimerización de
actina es acelerada por otras dos proteínas del huesped, VASP y profilin. La rápida polimerización de actina en el polo
caudal de la bacteria le permite moverse en el citosol de la célula huesped.
dirección del movimiento
polimerización de actina
homólogos de ActA en eucariotas son las proteínas WASP/Scar
video disponible
Cameron et al, Nature RMCB 2001
Movimiento de Listeria monocytogenes basado en la polimerización de actina
Visualización del movimiento de L. monocytogenes dentro de la célula empleando microscopía de fluorescencia.
La bacteria se visualiza en rojo, y la actina polimerizada en el polo caudal se visualiza como una cometa en verde
video disponible MBC2004
La migración de un fibroblasto
involucra eventos que se repiten
cíclicamente
polimerización
de actina en el
lamelipodio. Arp2/3
adhesión
mediada por
integrinas
contracción
mediada por
miosina II
desensamble de
los complejos
adhesivos
La migración direccional es una propiedad autónoma de la lamela de avance
filamentos
ramificados
lamelipodio
los filamentos de actina son el
componente estructural dominante
de la lamela. En el lamelipodio, los
complejos Arp2/3 generan filamentos
ramificados que empujan la
membrana hacia adelante.
video disponible
Pollard & Borisy, Cell 2003
Miosina II asociada a los filamentos de actina contribuye
a la translocación del núcleo en la dirección de avance
La miosina se asocia a los
filamentos de actina en la
región de la lamela mas
cercana al núcleo. Las
moléculas de miosina se
muestran en amarillo.
La actividad de la miosina II sobre la actina se traduce
en fuerzas de tracción sobre el substrato
La fuerzas de tracción pueden visualizarse sembrando las células sobre un substrato deformable.
La inhibición de la miosina elimina las fuerzas de tracción.
contracción mediada por miosina II
contracción inhibida
Experimentos con trampas láser revelan fuerzas asociadas al
citoesqueleto de actina en la lamela
Con la ayuda de una trampa láser los investigadores posicionaron una microesfera cubierta con fibronectina
sobre el borde de la lamela (a). A continuación midieron la velocidad y trayectoria de la microesfera filmando
su posición en función del tiempo (línea blanca en a, y gráfico en b).
a
microesfera
a
b
integrinas
actina
microesfera
El escape de la microesfera de la trampa láser y su movimiento
retró
retrógrado hacia el centro de la célula requiere del anclaje de las
integrinas al citoesqueleto de actina.
actina.
Choquet et al, Cell 1997
video disponible MBC
Las células orientan las fuerzas de tracción y la dirección de
la migración en respuesta a la rigidez del substrato
substrato
deformable
microesfera
substrato
no deformable
la migración direccionada de las células hacia regiones mas rígidas del substrato se denomina durotaxis
redireccionamiento de la migración en respuesta a la
tensión del substrato. En este experimento una célula
sembrada en el borde un substrato que exhibe un
gradiente de rigidez es filmada a distintos tiempos.
redireccionamiento de la migración en respuesta al
incremento de tensión ejercido por una micropipeta.
Note la formación de una nueva lamela orientada
hacia la región tensionada por la micropipeta.
lamela
tensión
lamela
micro
pipeta
Note que la célula produce una lamela (flecha) y migra hacia la
región mas rígida (stiff) del substrato.
En este experimento las células estan adheridas
a un substrato deformable (poliacrilamida).
Lo et al. Biophys J. 2000
Las fibras de estrés y la elongación de las células
endoteliales se orientan en dirección del flujo de fluído
la figura muestra que a las 16 h de exposición a un flujo laminar de medio de cultivo,
la forma de las células y los filamentos de actina (en rojo) se orientan en dirección
de la corriente del fluído (flecha)
Noria et al Am. J. Pathol. 2004
Las miosinas constituyen una gran superfamilia de
proteínas motoras asociadas a filamentos de actina
microscopía electrónica. "Freeze etch"
Todas las miosinas consisten de una o dos cadenas pesadas y una o varias
cadenas livianas. Las cadenas pesadas exhiben tres dominios, cabeza, cuello
y cola. Las colas de las miosinas I y V interaccionan con membranas. Las colas
de las miosinas II interaccionan entre si formando filamentos gruesos bipolares
de cuyos extremos proyectan las cabezas.
Las cabezas de las miosinas se desplazan sobre filamentos de actina
en una manera dependiente de la hidrólisis de ATP
filamentos de actina (1-3 en b) se desplazan sobre moléculas de miosina adsorbidas a un vidrio.
Las cabezas se desplazan hacia el extremo (+) de los filamentos en un proceso dependiente de ATP.
Miosina II es requerida en diversos eventos celulares
estructuras contráctiles formadas por actina y miosina II
Mecanismos de regulación de la actividad de la miosina II
En células musculares esqueléticas la actividad de la miosina II (MLC) es regulada por fosforilación mediada por MLCK. MLCK es
activada por calcio y calmodulina. En células musculares lisas y no musculares la activación de MLC depende de la Rho kinasa.
Rho
kinase
Rho
kinase
integrinas
 Rho
 Rho kinasa
MLC-Pi + actina
MLC fosfatasa
contractilidad
filamento grueso (empaquetamiento de las colas)
Modelo del movimiento
de la miosina II sobre
el filamento de actina
brazo móvil
Las cabezas motoras (en azul) se conectan por
un cuello móvil (en amarillo) a la región
rígida "coiled coil" (en gris) de las colas. La
hidrólisis del ATP extiende el brazo móvil
~ 10 nm hacia el extremo (+).
(+) 
La cabeza de miosina unida a ADP-Pi
interacciona con baja afinidad con la
actina (en verde) del microfilamento.
Pi
La liberación del Pi de la cabeza motora
incrementa la afinidad por la actina e induce
un cambio conformacional del brazo móvil
y una fuerza de torque que mueve al resto
de la molécula de miosina sobre el filamento
de actina ~10 nm (flecha)
El reemplazo del ADP por ATP induce
la disociación de la miosina del microfilamento.
Vale & Milligan, Science 2000
Comparación de los ciclos mecano-químicos de kinesina y miosina
miosina ejecuta un paso y se disocia
del filamento. En contraste, kinesina
es un motor áltamente procesivo y
ejecuta varios cientos de pasos antes
de disociarse del microtúbulo.
Vale & Milligan, Science 2000
- Son polímeros no polares extremadamente estables
- Los monómeros son proteínas fibrosas ricas en alfa hélice
- Los monómeros no unen nucleótidos
- El ensamblaje no requiere de hidrólisis de nucleótidos
- No participan en motilidad celular ni se conocen motores asociados a IFs
- Proveen resistencia al estrés mecánico
Los filamentos intermedios se forman a partir de una
familia de subunidades muy variada
IF P ro te in
M W (1 0
3
)* T issu e D istrib u tio n
TYPE I
A cid ic k e ra tin s
40
57
E pithelia
T Y P E II
B asic k e ra tin s
53
67
E pithelia
T Y P E III
V im e ntin
D e sm in
G lia l fib rillary a c id ic p ro tein
P eriph e rin
T Y P E IV
N F-L
N F-M
N F-H
In te rn ex in
57
53
50
57
62
10 2
11 0
66
M e se n c h ym e
M u sc le
G lia l ce lls a nd astro c yte s
Pe rip h e ra l a n d ce ntral n e u ro n s
M a tu re n e u ro n s
M a tu re n e u ro n s
M a tu re n e u ro n s
D eve lo p in g c e n tra l n e rvo us syste m
N O N S T A N D A R D T Y PE IV
File n sin
P ha k inin
83
45
Le n s fib e r c e lls
TYPE V
La m in A
La m in B
La m in C
70
67
67
N uc le us o f a ll c ells
N uc le us o f a ll c ells
N uc le us o f a ll c ells
Las diferentes subunidades de los filamentos intermedios comparten un dominio
rígido rico en alfa hélice, y difieren en las regiones amino y carboxilo
Los filamentos intermedios son polímeros no polares que se ensamblan
por interacciones laterales de dímeros y tetrámeros
monómero
2 monómeros se asocian
por sus α-hélice y forman
un dímero coiled coil
2 dímeros se asocian
lateralmente en orientación
antiparalela. Tetrámero
2 tetrámeros se asocian
lateralmente. Protofilamentos
8 protofilamentos asociados
lateralmente forman los
filamentos de 10 nm.
Las células epiteliales poseen filamentos de la proteína queratina
Los filamentos de queratinas se anclan en desmosomas y hemidesmosomas
estabilizando la estructura del epitelio
desmosomas
filamentos de queratinas
desmogleinas
y desmocolinas
integrinas (α6β4)
hemidesmosomas
miembros de
la familia de
las caderinas
Mutaciones en la queratina desestabilizan la estructura de la epidermis
Sección normal de piel
epidermis
esquema de epitelio mutante.
La flecha indica la ruptura de
las células debido a la fragilidad
de los filamentos de queratina
Sección de piel de ratón mutante
en un gen de queratina
Filamentos de la proteína desmina estabilizan la estructura de
los sarcómeros en las células musculares
Skelemina y sinemina alinean los filamentos de desmina con las miofibrillas.
Ankirina y paranemina anclan los filamentos de desmina a la membrana plasmática.
H Zone
sarcomero
Los Neurofilamentos (NFs) son esenciales para la estructura del axon
Neurofilamentos axonales
note la alta densidad de NFs en el axon
Los NFs axonales
estan áltamente
interconectados por
puentes de NFH
Alteraciones en proteínas de neurofilamentos en neuronas motoras estan asociadas
a la enfermedad neurodegenerativa amyotrophic lateral sclerosis (ALS).
subunidades:
- NF-L (light)
NFs - NF-M (middle)
- NF-H (heavy)
Los filamentos de laminas estabilizan la envoltura nuclear
Hay tres tipos de laminas: A, B y C. Las laminas son fosforiladas por Cdks-M al comienzo
de la mitosis provocando el desensamble de los filamentos y el desarmado de la red.
Los filamentos intermedios se asocian con microtúbulos
mediante proteínas puente: plectina
microscopía electrónica de barrido