Cuantificación del contenido de azúcares reductores

Cuantificación del contenido de azúcares reductores
XIII Congreso de Fitomejoramiento:
Contribuyendo al sostenimiento de la vida a través del fitomejoramiento
6 - 8 de noviembre, Corpoica, Tibaitatá – Mosquera, Cundinamarca
Cuantificación del contenido de azúcares
reductores y no reductores y su asociación genética con marcadores
SNPs en Solanum tuberosum grupo Phureja
(Resultados preliminares)
Diana Duarte-Delgado, Luz Patricia Restrepo, Ajjamada Kushalappa y Teresa Mosquera
Introducción
Incremento en la
demanda de alimentos
procesados (FAO, 2009)
Cambios en los hábitos
de consumo a nivel
mundial (FAO, 2009)
Oportunidad: Papa criolla
(Solanum tuberosum grupo Phureja)
Incrementar valor
agregado
Contribuir a la seguridad
alimentaria en
comunidades vulnerables
Cultivar de papa criolla para
procesamiento en hojuela:
necesita desarrollo
Problema: contenido
de azúcares reductores
Werij et al., 2012
Contenido de azúcares reductores
Reacción de Maillard
+
Reductores
+
amino acid
No reductores
Degradación del almidón en células de almacenamiento
Nader, 2011
Cultivar de papa criolla para
procesamiento en hojuela:
necesita desarrollo
Problema: contenido
de azúcares reductores
Werij et al., 2012
Contenido de azúcares reductores
Calidad de procesamiento en hojuela: rasgo
complejo
Basic science
Genome structure
and evolution
Genomic
sequencing
Comparative maps
Application
The molecular basis of
complex traits
*omics
Precision breeding
Association studies
Diagnostic markers
for population-based
MAS
Biodiversity,
haplotypes
Engineering
agronomic traits
Candidate genes
Function maps for
pathogen resistance
and tuber traits
Molecular maps
R-gene cloning
Markers for
introgression
breeding
Ch. Gebhardt
MPIZ
Mapeo por asociación
Phenotypic
trait
Balding, 2006
Cuello de botella…
Pregunta de investigación
¿Cuáles regiones del genoma de papa se asocian al contenido de
azúcares reductores y no reductores en una población natural de
Solanum tuberosum grupo Phureja, al emplear marcadores SNPs
distribuidos ampliamente por el genoma y en regiones de genes
candidatos?
Objetivo General
Explorar la variación alélica de Solanum
tuberosum grupo Phureja
y su
asociación genética con contenidos de
azúcares reductores y no reductores
Objetivos específicos
1.Ajustar la metodología para la cuantificación de azúcares
reductores y no reductores en grupo Phureja a través de la
técnica de HPLC.
2.Caracterizar fenotípicamente la Colección Central Colombiana
(CCC) de grupo Phureja y otros genotipos por su contenido de
azúcares.
3.Asociar genéticamente los contenidos de azúcares reductores
y no reductores con marcadores SNPs distribuidos ampliamente
por el genoma y en regiones de genes candidatos.
Materiales y métodos
Ajustes para el análisis
del contenido de
azúcares
• Agua
• Doble tratamiento con MeOH
• MeOH con carbón activado
• MeOH con reflujo
Métodos de extracción de
azúcares
Equipo: UHPLC Ultimate 3000 Dionex
Detector: Índice de refracción Shodex
Columna: Aminex HPX 87H 300
mm x 7.8 mm
Fase movil: Ácido sulfúrico 10 mM
4 Cultivares comerciales
Aproximación GWAS:
Metodología GBS
Mapeo por
Asociación
10 genes candidatos:
Diseño y amplificación de
primers
Identificación de SNPs
Condiciones cromatográficas
Caracterización
fenotípica del
contenido de
azúcares :
Latice rectangular triple
8 accessiones IPK
German Germplasm Bank
110 accessiones Colección
Central Colombiana (CCC)
Materiales y métodos
Ajustes para el análisis
del contenido de
azúcares
• Agua
• Doble tratamiento con MeOH
• MeOH con carbón activado
• MeOH con reflujo
Métodos de extracción de
azúcares
Equipo: UHPLC Ultimate 3000 Dionex
Detector: Índice de refracción Shodex
Columna: Aminex HPX 87H 300
mm x 7.8 mm
Fase móvil: Ácido sulfúrico 10 mM
4 Cultivares comerciales
Aproximación GWAS:
Metodología GBS
Mapeo por
Asociación
10 genes candidatos:
Diseño y amplificación
de Primers
Identificación de SNPs
Condiciones cromatográficas
Caracterización
fenotípica del
contenido de
azúcares :
Latice rectangular triple
8 accessiones IPK
German Germplasm Bank
110 accessiones Colección
Central Colombiana (CCC)
Resultados
Objetivo específico 1
Ajustar la metodología para la cuantificación de azúcares reductores y no
reductores en grupo Phureja a través de la técnica de HPLC.
•  Condiciones cromatográficas:
Condiciones cromatográficas Temperatura de la columna 18°C Temperatura del detector 35°C Fase móvil Ácido sulfúrico 10mM Fase de almacenamiento Ácido sulfúrico 5mM Fase de limpieza Acetonitrilo 2,5% en ácido sulfúrico 5mM Flujo 0,3ml/min Volumen de inyección 20 µl Tiempo por muestra 35 min •  Selección de la metodología para extracción de azúcares: Análisis
de un DCA y pruebas de Tukey
Método Concentración promedio
sacarosa (ppm) Agua (Cunningham et al., 1988) 2566,22 a Doble tratamiento con MeOH (Karkacier et al., 2003) 4925,64 c MeOH con carbón activado (Marangoni et al., 1997) 3479,68 ab MeOH con reflujo (Arevalo & Sastoque, 1999) 4322,76 b •  Validación del método de cuantificación
Límite de
Límite de
% de Recuperación
detección (ppm) cuantificación (ppm)
Glucosa
4
5
111.47
Fructosa
2
3
103.10
Sacarosa
2
2
96.13
Glucosa
Fructosa
Sacarosa
Reproducibilidad Repetibilidad Linealidad Promedio (ppm) CV (%) Promedio (ppm) CV (%) Promedio R² SD 40.08 40.42 40.41 1.21 0.83 0.72 52.06 41.33 40.49 4.61 3.67 4.44 0.9998 0.9997 0.9997 0.00015 0.00021 0.00016 Cromatogramas de patrones y de tubérculo crudo
a.
b.
a. Cromatograma de patrones en mezcla b. Cromatograma de Col 102
Cromatogramas para azúcares en tubérculo crudo
a.
b.
Cromatogramas de genotipos contrastantes a. Col 52 b. IPK-170031
Objetivo específico 3
Asociar genéticamente los contenidos de azúcares reductores y no
reductores con marcadores SNPs distribuidos ampliamente por el genoma
y en regiones de genes candidatos.
Genes candidatos seleccionados para diseño de primers
Gen Candidato
InvGE
Pain-1
Stp23
StpL
AGPaseS-a
SssI
GWD
UGPase
Sps
G6pdh
Función
Apoplastic invertase
Vacuolar acid invertase
Plastidic starch phosphorylase
Plastidic starch phosphorylase
ADP-glucose pyrophosphorylase
Soluble starch synthase
Glucan-water dikinase
UDP-glucose pyrophosphorylase
Sucrose phosphate synthase
Glucose-6-phosphate dehydrogenase
Cromosoma
IX
III
III
V
I
III
V
XI
VII
II
Degradación del almidón en células de almacenamiento
Nader, 2011
Conclusiones y perspectivas
•  Se ha ajustado una metodología cromatográfica precisa,
reproducible y repetible para la cuantificación de azúcares en
tubérculos de grupo Phureja.
•  Los resultados obtenidos revelan variabilidad en el contenido de
azúcares de genotipos de grupo Phureja.
•  Una vez se cuenten con los datos fenotípicos completos, el análisis
de asociación será llevado a cabo a partir de SNPs con el propósito
de identificar regiones genómicas con influencia en la calidad de
fritura, en este importante grupo de papas cultivadas para
Colombia.
Seguridad Alimentaria y Nutrición
El mejoramiento de la producción de papa como contribución a la seguridad alimentaria en comunidades nativas en Colombia Agradecimientos
Contrato de acceso al recurso genético RGE0069
Grupo: Genética de rasgos de interés agronómico
Proyecto desarrollado con el apoyo financiero del International Development Research Centre (IDRC), www.idrc.ca, y el Gobierno de Canadá, a través del Department of
Foreign Affairs, Trade and Development Canada (DFATD), Canada, www.international.gc.ca
¡Gracias por su atención!