Detección de mutaciones
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Detección de Mutaciones y diagnóstico prenatal Curso de Genética Molecular Ciencias Biológicas Universidad de Jaén Detección de mutaciones: Objetivos •Detección de enfermedades hereditarias •Detección de polimorfismos asociados a predisposición frente a enfermedades •Detección de polimorfismos genéticos asociados a resistencias a •enfermedades •Genética forense: Identificación de haplotipos específicos •Genética de poblaciones: Caracterización molecular de poblaciones humanas •Farmacogenómica: Polimorfismos genéticos asociados a respuesta diferencial a fármacos Detección de mutaciones: Técnicas clásicas •RFLP: Anemia falciforme •PCR específica de alelo: Microorganismos resistentes a drogas (usa la variante Stoeffel de la Taq polimerasa) •ASO (Allele Specific Oligonucleotide Hybridization) PCR en tiempo real •Fluorímetro acoplado al termociclador •Medición fluorescencia directa del tubo de PCR •Varios tipos de marcaje fluorescente del producto de PCR Específico: TAQMAN, Scorpions, etc... Inespecífico: SYBR green Detección de mutaciones: PCR en tiempo real TAQMAN Detección de mutaciones: PCR en tiempo real, Scorpions, Molecular Beacoms Detección de mutaciones: Fluorescent Resonance Energy Transfer (FRET) Transferencia de energía dependiente de la distancia entre dos fluorocromos adyacentes sin emisión de un fotón. El donador y aceptor deben estar muy próximos El espectro de excitación del aceptor debe solapar el espectro de emisión del donador El dipolo de transición del donador y aceptor deben estar en paralelo Detección de mutaciones: Rotura química o enzimática del heterodúplex TCGGC AGCCG TCAGC AGTCG ADN silvestre marcado ADN mutante mezclar, desnaturalizar y renaturalizar Cuatro productos posibles TCGGC AGCCG TCGGC AGTCG TCAGC AGCCG TCAGC AGTCG Añadir un agente modificante específico de cadena simple, pe hidroxilamina (específico de C) Añadir una endonucleasa de cadena simple sin modificación Silvestre sin modificación Heterocigoto Mutante TCAGC AGCCG sin modificación Desnaturalizar, romper con piperidina y separar por gel Detección de mutaciones: Tm melting peak shifting (cambio temperatura desnaturalización) Detección de mutaciones: Reacción en cadena de la ligasa Detección de mutaciones: Microarrays de oligonucleótidos Secuencia de referencia Oligo hibridación perfecta Oligo mutación interna Hibridación ADN individuos silvestres Hibridación individuos mutantes Imagen real después de escáner Detección de mutaciones: Single Strand Conformation Polimorphism (SSCP) Prevención de las enfermedades genéticas Situación Algunas enfermedades genéticas pueden ser tratadas con mayor o menor éxito, sin embargo la mayoría son incurables. El patrón de transmisión de estas enfermedades es predecible en muchos casos Conclusión La prevención es el mejor sistema para manejar las enfermedades genéticas La prevención incluye Chequeo genético (screening) Consejo genético Diagnóstico prenatal Chequeo genético (screening) Detección precoz de homocigotos enfermos: dependiente de test baratos, algún beneficio en el diagnóstico y consejo genético dada la probabilidad de que otros miembros de la familia puedan estar afectados. Ejemplos: fenilcetonuria, homocistinuria, galactosemia, fibrosis quística, hipotiroidismo y anemia falciforme. Detección de heterocigotos portadores: Se aplica a poblaciones con una alta frecuencia de portadores y permite el diagnóstico prenatal y la selección de hijos no enfermos. Ejemplo: Tay-Sach enfermedad incurable común en poblaciones judías (1/20 portadores) Chequeo genético Extracción de sangre total y aislamiento de células mononucleares Extracción de fibroblastos de piel a partir de biopsia Extracción directa de ADN genómico o ARN Análisis de mutaciones o anomalías cromosómicas Inmortalización con virus de Epstein-Barr generación de líneas celulares Consejo genético I ¿Para quién? Parejas con familiares afectados por una enfermedad hereditaria que desean conocer la probabilidad de tener descendencia enferma Parejas pertenecientes a grupos o poblaciones de riesgo Pasos previos Revisar los informes clínicos previos Preparar un pedigrí para determinar el patrón de herencia (autosómicos dominantes, recesivos, ligados al X, anomalías cromosómicas). No puede realizarse consejo genético para enfermedades con origen multifactorial (malformaciones congénitas, arteriosclerosis, enfermedades mentales, etc...) Resultados: Cálculo de probabilidades Opciones reproductivas Consejo genético I I Casos simples: autosómica dominante o recesiva y ligado al X, fáciles de calcular normalmente pueden ser enfermedades muy raras Casos complicados: no se heredan de manera simple y el riesgo de recurrencia se deriva de la frecuencia de la enfermedad entre parientes (riesgo empírico), problemas con la penetrancia, anticipación, mosaicismo de la línea germinal, expresividad variable, fenocopias, infidelidad... Consejo genético I I I Teorema de Bayes Probabilidad previa (PP): antecedentes de la persona Probabilidad condicional (PC): dependientes de la edad, análisis bioquímicos o fenotipo de la descendencia Probabilidad conjunta (PX): PC*PP Probabilidad relativa (PR): PX de estar afectado/ PX de estar afectado+ PX de no estar afectado Aplicación del Teorema de Bayes Un hombre de 50 años de edad cuyo padre murió de Huntington desea conocer la probabilidad de que su hijo desarrolle la enfermedad enfermedad autosómica dominante que aparece entre los 25 y los 55 años de edad Probabilidad Portador No portador Previa ½ ½ Condicional 1/5 1 Conjunta 1/10 ½ Relativa (1/10)/(1/10+1/2)=1/6 Diagnóstico genético prenatal Diagnóstico genético prenatal Indicaciones principales: Edad avanzada de la madre Padres con translocaciones cromosómicas equilibradas Algún hijo previo con anomalías cromosómicas Enfermedad monogénica (pareja portadora de enfermedad hereditaria tipo error innato del metabolismo) con marcadores genéticos disponibles Malformaciones fetales debidas a enfermedades monogénicas que no tienen ningún tipo de marcador genético o bioquímico Diagnóstico genético prenatal Técnicas de diagnóstico prenatal Análisis suero sanguíneo de la madre (alfa fetoproteína) detección de defectos en el tubo neural y aneuploidías Ultrasonografía fetal, detección de anomalías morfológicas Toma de muestras fetales: Células coriónicas (citogenética, marcadores bioquímicos) Amniocentésis (citogenética, marcadores bioquímicos) Biópsia fetal (piel, hígado, etc.) detección de enfermedades hereditarias de la sangre.
