NEUROFARMACOLOGÍA Métodos de evaluación de trastornos cognitivos en modelos animales F. Navarrete a, J.M. Pérez-Ortiz a, T. Femenía a, M.S. García-Gutiérrez a, M.E. García-Payá a, C. Leiva-Santana b, J. Manzanares a MÉTODOS DE EVALUACIÓN DE TRASTORNOS COGNITIVOS EN MODELOS ANIMALES Resumen. Introducción. El aumento de la prevalencia de la disfunción cognitiva y la demencia, asociado, entre otros factores, al envejecimiento de la población en los países desarrollados, ha despertado un gran interés por el estudio de la etiopatogénesis del déficit cognitivo y de las posibles dianas farmacológicas para mejorar la función intelectual o frenar la neurodegeneración subyacente en estos síntomas. Desarrollo y conclusiones. Un instrumento esencial a tal fin es la utilización de modelos animales de las enfermedades humanas que cursan clínicamente con deterioro cognitivo y demencia. En esta revisión analizamos los modelos animales de estos trastornos y las principales pruebas que, mediante la observación de la evolución de la conducta del animal de experimentación, permiten valorar sus funciones cognitivas y su modificación por los tratamientos experimentales que se quieran ensayar, de cara a su posible aplicación a los pacientes. [REV NEUROL 2008; 47: 137-45] Palabras clave. Atención. Conducta. Demencia. Deterioro cognitivo. Memoria. Modelos animales. INTRODUCCIÓN Disfunción cognitiva en neurología y patología médica En medicina, los trastornos de las funciones cognitivas se asocian generalmente con las llamadas ‘demencias degenerativas primarias’, de especial importancia por su alta frecuencia y prevalencia en las poblaciones con un índice de envejecimiento creciente, típicas de los países desarrollados. Se trata de un grupo heterogéneo de enfermedades caracterizadas por un deterioro mental progresivo que incluye combinaciones variables de pérdida de memoria, alteraciones del juicio, el cálculo, el lenguaje, la orientación, las habilidades y la conducta, y trastornos psiquiátricos. Los hallazgos anatomopatológicos de este grupo de enfermedades consisten en la pérdida de neuronas, localizada preferentemente en la corteza cerebral, junto con cambios degenerativos de las neuronas supervivientes, inclusiones proteicas y alteración vascular y de la glía. La localización de la pérdida neuronal y la naturaleza de los cambios degenerativos y de las inclusiones son los factores que diferencian a las distintas afecciones [1]. Ejemplos de este grupo de enfermedades degenerativas serían las demencias frontotemporales, la demencia con cuerpos de Lewy difusos y la enfermedad de Alzheimer. Esta última es el prototipo de enfermedad demenciante neurodegenerativa por excelencia, al ser la más frecuente y la mejor estudiada [2]. Sin embargo, a medida que el interés por el estudio de las funciones intelectuales ha ido aumentando, se ha comprobado que existen alteraciones cognitivas en otras enfermedades neurológicas degenerativas cuyas manifestaciones cardinales consisten en un trastorno del movimiento, como las ataxias cerebe- © 2008, REVISTA DE NEUROLOGÍA losas, las enfermedades de las motoneuronas o las distrofias musculares, y que engloban a la enfermedad de Parkinson [3,4], el temblor esencial [5], la enfermedad de Huntington [6,7], la parálisis supranuclear progresiva [8], las ataxias hereditarias [9], la esclerosis lateral amiotrófica [10] y las miopatías [11]. Es de destacar que prácticamente todas las enfermedades neurológicas adquiridas o secundarias del sistema nervioso, incluidas las traumáticas, vasculares, infecciosas, inflamatorias, desmielinizantes, tumorales, iatrogénicas, tóxicas, metabólicas o psiquiátricas, se han asociado con deterioro intelectual o demencia [12]. También algunas enfermedades sistémicas, como el dolor crónico [13] o las afecciones reumáticas [14] y digestivas [15,16], se han asociado con la disfunción cognitiva. Por lo tanto, la ubicuidad de la disfunción intelectual en la patología humana, junto con el hecho de que la alteración cognitiva es siempre una causa importante de incapacidad para el paciente, y de estrés y sobrecarga para los familiares, los cuidadores y la sociedad en general, subraya la importancia del problema y la necesidad de profundizar en el conocimiento de las causas, los mecanismos patogénicos y el tratamiento de estos trastornos. Pese al espectacular avance de las técnicas y los conocimientos en neuroimagen, neuroquímica, neurogenética, neuropsicología, neurofisiología y neurofarmacología, la investigación con pacientes presenta importantes limitaciones que hace imprescindibles los estudios experimentales con modelos animales de los distintos tipos de disfunción cognitiva. Hay una gran variedad de modelos animales de deterioro cognitivo, clasificados en función del mecanismo por el que éste se produce, sea selección o manipulación genética, utilización de agentes ambientales durante el desarrollo o la edad adulta, o manipulación farmacológica de la respuesta cognitiva del animal. Aunque los estudios in vitro de tejido cerebral tienen su interés, en el campo de la farmacología cognitiva es necesario utilizar uno o varios modelos animales para determinar la utilidad de un nuevo fármaco y su posología, debido a la complejidad de la función cognitiva, en la que intervienen múltiples estructuras cerebrales interconectadas. El objetivo de esta revisión es describir las principales pruebas de conducta usadas en animales de experimentación para REV NEUROL 2008; 47 (3): 137-145 137 Aceptado tras revisión externa: 30.06.08. a Instituto de Neurociencias de Alicante. Universidad Miguel HernándezCSIC. San Juan de Alicante, Alicante. b Servicio de Neurología. Hospital General de Alicante. Alicante, España. Correspondencia: Dr. Jorge Manzanares. Instituto de Neurociencias de Alicante. Universidad Miguel Hernández-CSIC. Apartado de Correos 18. E-03550 San Juan de Alicante (Alicante). E-mail: [email protected] Los autores manifiestan la inexistencia de posibles conflictos de interés. F. NAVARRETE, ET AL evaluar una serie de trastornos cognitivos, examinando sus fundamentos, sus ventajas e inconvenientes y su potencial proyección en la clínica. Función cognitiva: atención, aprendizaje y memoria Antes de mostrar las pruebas de conducta que se emplean en la evaluación del deterioro cognitivo, es importante describir una serie de conceptos relacionados con la función intelectual. El sistema de cognición en general se compone de procesos de funcionalidad y de aprendizaje y memoria. Entre los de funcionalidad, se incluyen, por una parte, procesos de ‘preatención’, en los que se realiza el filtrado de la información sensoriomotora para centrar la atención en los elementos más relevantes del entorno [17] y cuya alteración genera una sobrecarga sensorial y una fragmentación cognitiva que podría contribuir a Figura 1. Tipos de memoria y estructuras cerebrales relacionadas. En función de cómo se recibe y almacena la cabe distinguir dos grandes tipos de memoria: la implícita, que no requiere un aprendizaje conscienlas alteraciones que se dan en información, te, y la explícita, producto de un esfuerzo cognitivo consciente. distintos trastornos psicóticos [18], y por otra parte, procesos de ‘atención’, esto es, atención reflexiva, orientación visual, orientación aprendida, vigilancia, habituación y atención selectiva, mantenida o dividida. En los procesos de aprendizaje y memoria se incluyen el aprendizaje asociativo, espacial o no espacial, y la memoria a corto y largo plazo. Se puede definir el concepto de memoria como ‘la retención a largo plazo de representaciones internas dependientes de la experiencia’ [19]. La memoria se puede dividir en dos grandes bloques: memoria implícita (no declarati- Figura 2. Prueba go/no go. Este ensayo tiene lugar en cámaras de conducta operante donde va) y explícita (declarativa) [20,21]. La memo- el animal recibe estímulos go a los que debe responder presionando una palanca, por lo cual reria implícita es la resultante de procesos de cibirá una recompensa, o estímulos no go, frente a los que debe retener su respuesta. aprendizaje no consciente realizados a través de hábitos y habilidades, mediante estimulación o sensibilizarepresentación consciente del suceso o para ejecutar una resción previa, y en los que interviene la musculatura esquelética o puesta motora aprendida. bien respuestas emocionales y de aprendizaje no asociativo. La memoria explícita o declarativa engloba la retención del conoci- En la memoria explícita se incluyen tres categorías diferentes: miento de determinados acontecimientos, lugares o hechos, y memoria inmediata, memoria a corto plazo y memoria a largo en ella toma parte el lóbulo medio temporal del diencéfalo. Esta plazo [20,22]. información se retiene mediante un esfuerzo consciente y a traTodos los aspectos mencionados anteriormente del aprendivés de asociaciones nuevas [21]. La adquisición de la memoria zaje y la memoria se han estudiado a lo largo de los años gracias explícita es un proceso que requiere tres fases: a modelos animales, que han permitido conocer las estructuras – Codificación: captación de detalles sobre los estímulos y el cerebrales que intervienen en su funcionamiento (Fig. 1). entorno para su posterior consolidación (procesamiento de Tipos de modelos animales de trastornos cognitivos la información para almacenarla). – Almacenaje: retención de la información a lo largo del tiempo. Los modelos animales de trastornos cognitivos se han basado ma– Recuperación: utilizar la información retenida para crear una yoritariamente en primates, ratas y ratones, cuyos procesos neu- 138 REV NEUROL 2008; 47 (3): 137-145 EVALUACIÓN DE TRASTORNOS COGNITIVOS ronales son similares a los de la función cognitiva humana. Se pueden distinguir varios tipos de modelos experimentales: – Modelos farmacológicos: permiten la evaluación de fármacos. – Modelos genéticos: basados en animales manipulados genéticamente (transgénicos y knock-out) [23-28]. – Modelos toxicológicos: para determinar la toxicidad de metales pesados, tóxicos y neurotoxinas [29]. Hay modelos animales que simulan síndromes específicos de déficit cognitivo en los cuales el factor desencadenante es el envejecimiento [30-32] o los traumatismos craneoencefálicos [33,34]. Recientemente, se han empleado también otros modelos complementarios que se realizan con animales no mamíferos, como peces cebra (Danio reiro), moscas del vinagre (Drosophila melanogaster) y gusanos (Caenorhabditis elegans), para cribar compuestos potencialmente tóxicos o terapéuticos, y determinar alguna de las bases neuromoleculares de la función cognitiva. PRUEBAS DE CONDUCTA PARA LA EVALUACIÓN DE TRASTORNOS COGNITIVOS EN MODELOS ANIMALES A la hora de abordar el estudio de la función cognitiva utilizando modelos animales debemos tener presentes sus múltiples dimensiones y decidir cuál de ellas deseamos investigar para elegir la prueba específica más apropiada. Evaluación de la atención Preatención Inhibición prepulso. Permite evaluar la capacidad de un individuo para filtrar la información disponible a través de la aplicación de un estímulo de baja intensidad (prepulso) que antecede a un estímulo intenso (pulso). Si a un estímulo alto le precede uno de menor intensidad, la respuesta al segundo estímulo se reduce. En esta prueba se mantiene constantemente un sonido neutro (blanco) con el objetivo de crear un ruido de fondo estable. El estímulo acústico prepulso se aplica entre 4 y 18 dB por encima de este ruido de fondo y precede sistemáticamente al estímulo mayor (pulso) cuya magnitud varía entre 100 y 120 dB y que se aplica durante 60 a 140 ms. El prepulso auditivo inicial inhibe la magnitud de la respuesta de sobresalto posterior ante el pulso, inhibición que se incrementa conforme aumenta la intensidad del prepulso [35]. Atención Orientación y habituación. Para medir la respuesta de orientación visual en ratas y ratones se utiliza una técnica que consiste en colocar un objeto en el campo de visión del animal y evaluar la capacidad que tiene para rastrear el objeto. Una manera de llevar a cabo la prueba es colocar el animal en un área circular donde primero se le deja pasar una fase de habituación de unos dos minutos, seguida de la introducción de un pequeño objeto que durante 12 segundos se mueve siguiendo el perímetro del área circular en el campo de visión del ratón. Cada presentación del objeto constituye un ensayo de la prueba y en cada ensayo se mide la respuesta de orientación en intervalos de uno o dos segundos. Se considera que el animal se orienta cuando dirige su cabeza hacia el objeto o bien lo rastrea mientras se encuentra girando. Prueba go/no go. Este ensayo se divide en pruebas go y pruebas no go. La prueba go consiste en la presentación de un estímulo REV NEUROL 2008; 47 (3): 137-145 al animal de experimentación (por ejemplo, luz), ante el cual el animal debe responder y recibirá una recompensa por ello. En el caso de la prueba no go se aplica una determinada señal antes de la señal go (por ejemplo, un tono antes de la luz) y el animal de experimentación tiene que aprender a retener su respuesta para recibir el refuerzo (Fig. 2). La prueba está constituida por tres fases: – Formación: el ratón aprende a realizar una tarea con el objetivo de conseguir un refuerzo y tras esto se le aplica la señal go durante cinco días consecutivos en los que se llevan a cabo 40 pruebas al día. – Prueba go: comienza con la presentación de la señal go y, cuando el ratón responde a dicho estímulo dentro de un determinado período de tiempo (por ejemplo, 60 segundos), se le suministra la recompensa. Es entonces cuando el ratón dispone de un tiempo determinado, 20 segundos, para localizar y consumir la comida. Un fallo en cualquier parte de la prueba supone la interrupción antes de la siguiente prueba go. Cuando el ratón complete con éxito el 85% de las pruebas go durante al menos tres días consecutivos, se introduce en la prueba go/no go. – Prueba go/no go: esta fase dura aproximadamente 10 días, durante los cuales se van intercalando aleatoriamente las pruebas go y no go. Tras la señal no go, el ratón debe aprender a contener su respuesta durante unos 15 segundos para recibir la recompensa. Si el ratón responde antes de tiempo o mientras se está aplicando la señal, se considera fallo y no se le proporciona la recompensa. Si el ratón no logra retrasar su respuesta durante un período determinado (15 segundos), se debe repetir la prueba con un intervalo de tiempo menor (2-10 segundos), con el fin de averiguar si el déficit se debe a una incapacidad para retrasar su respuesta durante un período prolongado o a una incapacidad de aprender la tarea no go. Inhibición latente. Esta prueba permite estudiar la atención selectiva del ratón, así como determinados aspectos del aprendizaje y la memoria. El concepto de inhibición latente hace referencia al retraso que se produce en el condicionamiento a un estímulo cuando ese estímulo ha sido presentado previamente sin ninguna consecuencia [36]. El procedimiento consistiría en tener dos grupos de animales, el primer grupo se coloca en el aparato donde se realiza la prueba y se permite que lo explore durante una hora. El segundo grupo se coloca en el aparato el mismo tiempo pero reciben el estímulo condicionado (por ejemplo, un tono intermitente y/o luces). Al día siguiente, los ratones son examinados en el mismo aparato y el estímulo condicionado precede a un shock eléctrico en las patas (estímulo aversivo). Si el ratón sale de la cámara durante el tono de 8 segundos, se considera respuesta de evitación. Si abandona la cámara tras el tono de 8 segundos y durante la presentación del siguiente tono de 8 segundos y shock eléctrico, la respuesta se registra como escape. Si no abandona la cámara en ninguno de los momentos expuestos anteriormente, se considera que la respuesta es fallida. Con este sistema se consiguen curvas de aprendizaje a lo largo del tiempo en las cuales la evitación, el escape y las respuestas fallidas del ratón pueden seguirse con detalle. Cuando se procede a comparar ambos grupos, se observan claras diferencias entre ellos. La inhibición latente se pone de manifiesto en los ratones que han sido expuestos previamente al estímulo, ya que muestran un retraso en la adquisición de la respuesta condicionada. 139 F. NAVARRETE, ET AL Evaluación del aprendizaje y la memoria Memoria no espacial Prueba de reconocimiento de objetos. Desde que Ennaceur et al [37] introdujeron la prueba de reconocimiento de objetos, se ha ido incrementando su uso como modelo de investigación y poderosa herramienta experimental para valorar los efectos de los fármacos sobre la memoria y los mecanismos neurobiológicos relacionados con el aprendizaje y la memoria [38-45]. Esta prueba se fundamenta en la tendencia natural de los ratones a explorar nuevos objetos y ambientes y compararlos con otros que les son fami- Figura 3. Prueba de reconocimiento de objetos. El experimentador puede estudiar la memoria a corto y largo plazo liares. Al exponer al ratón a modificando el intervalo de tiempo entre la primera exposición a dos objetos idénticos y las siguientes exposiciones, en las que se evalúa el grado de exploración del objeto familiar frente a otro nuevo. una serie de objetos se espera a que éste los explore y se mide el tiempo de exploración, que se define como el pe- to y la memoria en ratas y ratones. La prueba de reconocimienríodo durante el cual el animal olisquea o toca el objeto con las to social se centra en el grado de familiaridad entre dos indivipatas delanteras a una distancia menor o igual a 1 cm. En cada duos. Tal y como se describe en la figura 4, se lleva a cabo en parte de la prueba se cambian los objetos y al inicio se estable- una jaula que tiene una ventana con una malla de alambre [48]. ce el intervalo de tiempo entre la exposición inicial y las si- Junto a la jaula donde se realiza la prueba se coloca otra circular guientes, con lo que se consigue una valoración de la memoria a que, a su vez, está dividida en dos cámaras, cada una de ellas corto y largo plazo. La prueba se realiza en un campo abierto con una ventana con una malla de alambre. La prueba comienza que situamos en una habitación homogéneamente iluminada y con la habituación, situando al ratón en la jaula principal durancon objetos que deben ser de similar textura, color y tamaño, te 10 minutos para que se familiarice con el entorno y dejando vacía la cámara circular. Posteriormente, en uno de los comparpero de distinta forma (Fig. 3). En una primera fase de habituación, se coloca el animal en timentos de la cámara circular se coloca un ratón que llamareel campo abierto sin ningún objeto y se deja transcurrir un tiem- mos ‘familiar’, ya que estuvo en contacto previamente durante po variable (10-30 minutos) para que se familiarice con el en- cinco minutos con el ratón experimental (se puede utilizar un torno. A las 24 horas se realiza el entrenamiento, para lo cual se ratón de su misma jaula) y en el otro compartimento se coloca colocan dos objetos idénticos (objetos A) en distinta posición un ratón nuevo, que nunca ha sido expuesto al ratón experimen(posición 1 y posición 2) y se deja el animal en el interior de la tal. La caja circular se gira para enfrentar, por medio de las vencaja durante 5 o 10 minutos, en los que se contabiliza el tiempo tanas de acoplamiento, al ratón de la caja principal con cada uno de exploración (T). En la siguiente fase se deja un objeto A (que de los dos compartimentos en sesiones de cinco minutos. La exllamaremos objeto familiar) y se coloca en la otra posición un periencia se realiza cuatro veces. En las tres primeras el animal objeto nuevo (objeto B). La memoria a corto plazo se mide a la se enfrenta a un ratón familiar y durante el transcurso de estas hora y a las tres horas del entrenamiento, anotando el tiempo de sesiones el ratón se acostumbra a esa exposición y varía su inexploración de los objetos familiar (TA) y nuevo (TB). Transcu- vestigación social (habituación). En la cuarta exposición se gira rridas 24 horas desde el entrenamiento, se mide la memoria a la cámara y se muestra el ratón nuevo (deshabituación). En tolargo plazo, para lo cual se cambia el objeto B por un objeto das las sesiones se mide el tiempo de exploración, definido conuevo (C) y se sigue el mismo procedimiento. El resultado es- mo el tiempo que el animal emplea en acercarse u olisquear la perado es que los ratones sin deterioro cognitivo exploren más ventana de acoplamiento. Los ratones con una función cognitiel objeto nuevo que el familiar. En cambio, para un ratón con al- va no deteriorada pasarán más tiempo olisqueando a los ratones guna alteración en la función cognitiva, el objeto familiar y el nuevos que a los familiares; los que tengan un déficit cognitivo nuevo le parecerán igual de novedosos y no habrá diferencia en- no distinguirán entre los ratones familiares y los nuevos (su tre los tiempos de exploración. tiempo de exploración será similar). Prueba de reconocimiento social. El procedimiento del reconocimiento social lo introdujeron Holloway y Thor [46] y posteriormente fue desarrollado por Robert Dantzer et al [47] para estudiar la regulación neuropeptidérgica sobre el comportamien- 140 Memoria espacial Laberinto acuático de Morris. Una de las pruebas más comúnmente utilizadas por los investigadores para el estudio de la memoria espacial es el laberinto de agua diseñado por Morris REV NEUROL 2008; 47 (3): 137-145 EVALUACIÓN DE TRASTORNOS COGNITIVOS Figura 4. Prueba de reconocimiento social. La exposición repetida del animal a un individuo familiar precede a una última confrontación con un individuo desconocido, momento en el que se evalúa el grado de interacción respecto al que se produjo con anterioridad. Figura 5. Laberinto acuático de Morris. En esta prueba se evalúa el tiempo de latencia que emplea el animal en alcanzar la plataforma sumergida, que representa un estímulo reforzante de escape. Si la plataforma permanece en el mismo lugar, se evalúa la memoria espacial de referencia, y si varía, se analiza la memoria espacial de trabajo. REV NEUROL 2008; 47 (3): 137-145 [49]. La prueba se desarrolla en una piscina circular dividida en cuatro cuadrantes imaginarios (designados como noroeste, suroeste, noreste y sureste) que dispone de una plataforma móvil de escape oculta y parcialmente sumergida. En uno de los cuadrantes se sitúa la plataforma móvil, que debe quedar a una altura de 0,5 cm por debajo del agua. Los puntos de escape se localizarán en siete posiciones diferentes, a igual distancia, fijadas aleatoriamente a través de la prueba, y se deben utilizar los mismos para todos los animales. Alrededor de la piscina se colocan numerosas señales visuales para facilitar la orientación espacial del animal. Las señales luminosas son las más utilizadas en este tipo de laberinto (Fig. 5). En una primera fase de adquisición se introduce al animal con el hocico apuntando hacia las paredes de la piscina para que busque la plataforma durante 60 o 120 segundos. En caso de no que no la encuentre, se le coloca entre 20 y 30 segundos sobre ésta. Se considera que un animal ha encontrado la plataforma cuando permanece en ella 5 o 10 segundos. Después se retira el animal de la plataforma y se le deja descansar cuatro minutos antes de iniciar el siguiente ensayo. Este procedimiento se repite con cada animal hasta 12 entrenamientos consecutivos. La capacidad del animal para localizar eficientemente la plataforma depende de la utilización de las claves que rodean a la piscina (son necesarias al menos dos señales fuera del laberinto para localizar la meta invisible). Esta fase de adquisición o aprendizaje puede durar varios días. Dos días después de finalizar la fase anterior se lleva a cabo una última prueba de retención o ensayo de investigación sin plataforma durante 60 o 100 segundos. Si el animal ha aprendido, nadará más tiempo en el cuadrante meta, es decir, donde previamente estaba situada la plataforma. Las medidas conductuales más utilizadas son la latencia de escape en los ensayos de adquisición (tiempo que transcurre hasta que alcanza la plataforma) y el porcentaje de tiempo en el cuadrante meta durante la prueba final. La adquisición se refleja en las menores latencias de escape a lo largo de los días y el mayor porcentaje de tiempo en el cuadrante meta. 141 F. NAVARRETE, ET AL Laberinto de Barnes. Esta prueba permite estudiar el aprendizaje y la memoria espacial, la memoria de trabajo y de referencia, y la memoria a corto y largo plazo, así como otras tareas más complejas en ratas y ratones. Fue diseñada por Barnes en la Universidad de Arizona [50] y consiste en un laberinto seco donde se utilizan luz y ruido como estímulos aversivos. El refuerzo que recibe el animal es escapar de estos estímulos. El laberinto está constituido por un disco de plástico opaco elevado del suelo mediante un trípode (Fig. 6). A lo largo del perímetro del disco se distribuyen 20 agujeros de 5 cm de diámetro y debajo de uno de ellos se coloca un cajón de escape de plástico opaco. Se pueden situar diversas pistas espaciales alrededor del cilindro, que permanecerán constantes durante todo el estudio, y también se pueden colocar debajo de algunos agujeros cajones falsos en los que parece posible introducirse, pero cuyo espacio disponible es en realidad tan pequeño que impide que el animal se pueda esconder. Un foco de luz (de unos 150 W) y un generador de ruido (sobre 80 dB) constituyen los estímulos aversivos. El procedimiento comienza con un entrenamiento que consiste en colocar el animal en la caja de escape y dejarlo allí durante un minuto, para continuar un minuto más tarde con las diversas sesiones de exploración. Todas las sesiones empiezan colocando el animal en el centro del laberinto en el interior de una ‘cámara de inicio’, que consiste en un cilindro opaco de unos 10 cm de alto. Al cabo de 10 segundos, se retira la cámara de inicio, se conectan la luz y el zumbido, y se deja que el animal explore el laberinto. El estrés producido por estos estímulos inducirá al animal a buscar un espacio cerrado donde esconderse. La sesión termina cuando el animal encuentra el túnel de escape o cuando transcurren cinco minutos, momento en el que se le introduciría manualmente en dicho túnel. Cuando el animal entra en la cámara de escape, los estímulos aversivos cesan y se le deja en la oscuridad un minuto antes de devolverlo a su jaula. El túnel de escape está situado siempre debajo del mismo agujero, que se elige de forma aleatoria para cada animal. La prueba se realiza durante varios días hasta que en siete u ocho pruebas consecutivas se produzcan menos de tres errores. Se valoran el aprendizaje espacial y la memoria midiendo el tiempo que invierte el animal en encontrar el cajón refugio y el número de errores que comete antes de encontrarlo. Se considerará un error cada vez que intente introducirse en un agujero que no es el correcto. Los intentos sucesivos en un mismo agujero equivocado se consideran el mismo error. Aprendizaje asociativo Prueba de evitación pasiva. La prueba de evitación pasiva es una prueba unidireccional que permite estudiar el aprendizaje adquirido y la memoria. El animal se condiciona con un estímulo aversivo y posteriormente se valora si recuerda esa experiencia. Para llevar a cabo esta prueba se utiliza una caja con dos compartimentos, uno claro y otro oscuro, separados entre sí por una puerta corredera. En el compartimento claro hay una luz potente enfocando directamente al ratón, mientras que en el oscuro hay un circuito cerrado que producirá pequeñas descargas eléctricas. Se pretende que el ratón aprenda a evitar el compartimento oscuro donde se le aplica la descarga [51]. La prueba comienza con un entrenamiento que consiste en colocar al ratón en el compartimento iluminado. A los 5 segundos se abre la puerta y se le permite dirigirse al compartimento oscuro (el ratón tenderá espontáneamente a desplazarse a los 142 Aversión: luces 150 W Cajón refugio Falso cajón Figura 6. Laberinto de Barnes. El animal se sitúa primero en el centro del aparato en una cámara de inicio y a continuación se le deja que explore los diversos orificios ante la exposición a estímulos aversivos, como luces y sonidos. Se evalúa el tiempo que emplea en encontrar la salida que conduce al cajón refugio. espacios oscuros, pues la luz directa le produce ansiedad). En el momento en que el ratón entre con las cuatro patas en la cámara oscura se cerrará la puerta y recibirá una descarga eléctrica de 0,1-0,4 mA durante 2 segundos. Treinta segundos después de la aplicación de la descarga, se devuelve al ratón a su jaula hasta el momento de la prueba, que consiste en volver a poner el ratón en la cámara iluminada y levantar la puerta que separa las dos cámaras. Durante la prueba no se aplica al animal ninguna descarga y se observa durante 5 minutos, registrando diversos parámetros, entre los que se incluyen el tiempo de latencia hasta que entra en la cámara oscura (como indicador de memoria), el número de veces que cruza de una cámara a otra, el tiempo total que pasa en cada una de las cámaras y la frecuencia con la que se asoma a la cámara oscura hasta que realmente entra en ella. El ensayo se puede llevar a cabo a los 30 o 60 minutos del entrenamiento, para evaluar la memoria a corto plazo, y a las 8 y 24 horas, para valorar la memoria a largo plazo. Es posible utilizar otras variantes experimentales en las pruebas de evitación pasiva, como las empleadas en la tarea de evitación inhibitoria del descenso de la plataforma (step-down inhibitory avoidance task). Prueba de evitación activa. Las pruebas de evitación activa requieren varias sesiones de aprendizaje, a diferencia de las de evitación pasiva, en las que el ratón aprende en una sola sesión, pero nos permiten examinar funciones cognitivas complejas y valorar la adquisición y consolidación de la memoria en un mismo animal durante el experimento [52]. La prueba de evitación activa se puede clasificar en evitación activa de un sentido y evitación activa de dos sentidos. La diferencia radica en que en la REV NEUROL 2008; 47 (3): 137-145 EVALUACIÓN DE TRASTORNOS COGNITIVOS prueba de evitación activa de un sentido el ratón siempre recibe el shock eléctrico en la misma cámara/localización (es unidireccional) [53], mientras que en la de dos sentidos el animal aprende, a través de diferentes pistas, a predecir la descarga eléctrica, independientemente de la cámara de ensayo (contexto) donde se produzca (es bidireccional) [54]. La prueba de evitación activa de un sentido se realiza en una caja con dos compartimentos comunicados entre sí por una puerta e iluminada con luz natural. En un compartimento se coloca una bombilla y, cuando ésta se enciende, se emite un sonido durante 10 segundos y se abre simultáneamente la puerta para que el ratón pueda cambiar de compartimento. Al cesar el estímulo luminoso y sonoro el ratón recibirá una descarga de 0,1 mA durante 20 segundos si no ha cambiado de compartimento, hasta que escape a la cámara adyacente. Esta prueba, repetida hasta 20 veces al día y con intervalos de 20 segundos, constituye el período de entrenamiento. En cada ensayo se registra el tiempo de latencia hasta que se produce la respuesta de evitación (escapar a la otra cámara). Se considera como fallo si esta respuesta no se produce. Este entrenamiento diario se repite hasta que el ratón alcanza un criterio que refleja aprendizaje. Las curvas de aprendizaje a lo largo del tiempo revelan adquisición y consolidación de la evitación. En la prueba de evitación activa de dos sentidos, el ratón puede recibir la descarga eléctrica en cualquiera de las dos cámaras, dependiendo de su localización actual. El animal debe resolver un conflicto, ya que la cámara donde recibió la descarga en el ensayo previo se convierte en cámara segura durante la siguiente prueba. Por lo tanto, tiene que aprender a inhibir su tendencia a evitar el compartimento donde acaba de recibir una descarga y utilizar el estímulo condicionado para predecir y evitar una nueva descarga [54]. Esta prueba se realiza en una caja con dos compartimentos iluminados con una bombilla cada uno. Se introduce el ratón en uno de los dos compartimentos y se le permite explorarlo durante cinco minutos. A continuación se conecta el sistema de sonido y luz que constituye el estímulo condicionado. Si el animal no cruza a la cámara adyacente tras 8-10 segundos, se le aplica un shock eléctrico. La luz, el sonido y el shock eléctrico cesan si el animal cruza a la otra cámara o si transcurren 10 segundos desde la aplicación del shock eléctrico. Las respuestas se codifican como evitación (el ratón pasa a la cámara adyacente tras el estímulo condicionado pero antes del shock eléctrico), escape (el animal cruza a la otra cámara durante el shock eléctrico) o fallo (el ratón no pasa a la cámara adyacente durante los siguientes 10 segundos tras el shock eléctrico). El período de aprendizaje consiste en realizar esta prueba al mismo ratón 70 veces durante 70 minutos con intervalos de 30-90 segundos. El análisis de las curvas de aprendizaje nos revela información acerca de la adquisición o pérdida de cada respuesta (memoria a corto plazo). La repetición de la prueba a las 24 horas del primer ensayo nos permite valorar la memoria a largo plazo. Memoria emocional Condicionamiento aversivo al sabor. El modelo de condicionamiento aversivo al sabor fue descubierto en 1955 por García et al [55]. Para desarrollar el condicionamiento aversivo al sabor, el animal debe poder reconocer el estímulo condicionado y llegar a enfermar con la exposición al estímulo no condicionado. Es importante que se desarrolle esta asociación entre el estímu- REV NEUROL 2008; 47 (3): 137-145 lo condicionado y el no condicionado para que finalmente, cuando se presente el estímulo condicionado sólo, el animal lo evite. La prueba consiste en una primera fase de habituación en la que se deja al animal durante 24 horas sin comida, restricción que asegura la ingestión posterior de una cantidad adecuada que, a su vez, favorecerá la asociación entre el estímulo condicionado y el no condicionado. Pasadas esas 24 horas, se traslada a cada ratón a la jaula de prueba, en el centro de la cual se coloca un pequeño comedero. Su base puede estar aromatizada con un 1% de vainilla o extracto de almendra y endulzada con 0,25 M de solución de sacarina. A los ratones se les asigna aleatoriamente uno de estos dos aromas. El cuenco de la comida debe pesarse antes y después de la fase de condicionamiento (3060 minutos) para asegurar que el animal ha ingerido una cantidad suficiente. Tras la exposición al estímulo condicionado, se le inyectan a cada ratón 0,15 M de cloruro de litio o agua estéril y se le devuelve a su jaula, donde se mantiene 24 horas más con restricción de comida hasta someterlo a la prueba de retención. Dicha prueba consiste en colocar dos dispositivos de comida, uno con el aroma a vainilla y el otro con extracto de almendra para la libre elección del animal. Se espera que los ratones condicionados a la vainilla prefieran la almendra y los condicionados a la almendra prefieran la vainilla. Sobresalto potenciado por el miedo. Se trata de una prueba pavloviana de miedo condicionado en la que una respuesta de temor ante un estímulo acústico puede aumentarse cuando éste se presenta junto con otro estímulo aversivo que genera respuestas de miedo [56,57]. El ensayo se suele llevar a cabo durante cuatro días, comenzando con cinco minutos diarios de aclimatación en la jaula donde se realizará el experimento. El primer día, se miden las respuestas de miedo a través de un rango de intensos estímulos acústicos que se aplican durante 40 ms a diferentes intensidades (100, 105 y 110 dB). Es importante evaluar al ratón un número limitado de veces para evitar que una presentación frecuente pueda causar habituación a estos estímulos. El segundo día se aplican esos mismos estímulos, pero en la mitad de los ensayos el estímulo acústico de sobresalto se presenta inmediatamente seguido de un tono de 12 kHz y 70 dB durante 30 segundos (estímulo condicionado), y en la otra mitad sólo se suministra el estímulo acústico del primer día. Para calcular la magnitud de la respuesta al estímulo condicionado, la respuesta al estímulo acústico cuando se presenta aisladamente se resta de la respuesta al estímulo acústico cuando se presenta con el estímulo condicionado, se divide el valor resultante por el número de respuestas al estímulo acústico cuando se ha presentado solo y finalmente se multiplica por 100. Los valores positivos indican que el tono aumenta la respuesta de sobresalto inicial; en cambio, los valores negativos sugieren una reducción en la respuesta cuando se presenta el estímulo condicionado. El tercer día se aplica el tono (estímulo condicionado) seguido de un shock eléctrico (estímulo no condicionado) y la asociación entre ambos estímulos se repite diez veces, con un intervalo entre pruebas de 90 a 180 segundos. Transcurridas 24 horas, los animales se evalúan del sobresalto potenciado por el miedo bajo las mismas condiciones utilizadas el segundo día, midiendo la potenciación del sobresalto con la misma fórmula utilizada en el precondicionamiento. En los animales que hayan adquirido el sobresalto potenciado por el miedo, el porcentaje de potenciación debería ser más alto tras el condicionamiento. 143 F. NAVARRETE, ET AL CONCLUSIONES Los modelos animales de trastornos cognitivos desempeñan un papel clave en la comprensión de las bases neuroquímicas de la función/disfunción cognitiva. Con su utilización podemos profundizar en las bases fisiopatológicas del deterioro que se produce por el simple hecho de envejecer o el que aparece asociado a diferentes situaciones patológicas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, las demencias vasculares, la angiopatía amiloide cerebral, las enfermedades priónicas, la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Huntington, la esquizofrenia y otras enfermedades neurodegenerativas. Además, los modelos animales nos permiten comprobar la eficacia de nuevos fármacos e identificar posibles dianas terapéuticas. BIBLIOGRAFÍA 1. Bird TD, Miller BL. Alzheimer’s disease and other dementias. In Kasper DL, Braunwald E, Fauci AS, Hauser SL, Longo DL, Jameson JL, eds. Harrison’s principles of internal medicine. New York: McGraw-Hill; 2005. p. 2393-406. 2. Sarasa M. Modelos experimentales de la enfermedad de Alzheimer. Rev Neurol 2006; 42: 297-301. 3. Campos-Romo A. Evaluación de alteraciones motoras en modelos animales de enfermedad de Parkinson. Rev Neurol 2008; 46: 167-74. 4. Ostrosky-Solís F. Características neuropsicológicas de la enfermedad de Parkinson. Rev Neurol 2000; 30: 788-96. 5. Benito-Leon J, Louis ED, Bermejo-Pareja F. Elderly-onset essential tremor is associated with dementia. Neurology 2006; 66: 1500-5. 6. García-Ramos R, Del Val-Fernández J, Catalán-Alonso MJ, Barcia-Albacar JA, Matías-Guiu J. Modelos experimentales de la enfermedad de Huntington. Rev Neurol 2007; 45: 437-41. 7. Ward J, Sheppard JM, Shpritz B, Margolis RL, Rosenblatt A, Brandt J. A four-year prospective study of cognitive functioning in Huntington’s disease. J Int Neuropsychol Soc 2006; 12: 445-54. 8. Millar D, Griffiths P, Zermansky AJ, Burn DJ. Characterizing behavioral and cognitive dysexecutive changes in progressive supranuclear palsy. Mov Disord 2006; 21: 199-207. 9. Mantovan MC, Martinuzzi A, Squarzanti F, Bolla A, Silvestri I, Liessi G, et al. Exploring mental status in Friedreich’s ataxia: a combined neuropsychological, behavioral and neuroimaging study. Eur J Neurol 2006; 13: 827-35. 10. García-Moreno JM, Duque P, Izquierdo G. Trastornos neuropsiquiátricos en la esclerosis múltiple. Rev Neurol 2001; 33: 560-67. 11. D’Angelo MG, Bresolin N. Cognitive impairment in neuromuscular disorders. Muscle Nerve 2006; 34: 16-33. 12. Caselli RJ. Other dementias. Continuum 2004; 10: 135-61. 13. Branca B. Neuropsychologic aspects of post-traumatic headache and chronic daily headache. Curr Pain Headache Rep 2006; 10: 54-66. 14. Hanly JG, Fisk JD, McCurdy G, Fougere L, Douglas JA. Neuropsychiatric syndromes in patients with systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. J Rheumatol 2005; 32: 1459-6. 15. Lackner JM, Gudleski GD, Zack MM, Katz LA, Powell C, Krasner S, et al. Measuring health-related quality of life in patients with irritable bowel syndrome: can less be more? Psychosom Med 2006; 68: 312-20. 16. Lackner JM, Lou Coad M, Mertz HR, Wack DS, Katz LA, Krasner SS, et al. Cognitive therapy for irritable bowel syndrome is associated with reduced limbic activity, GI symptoms, and anxiety. Behav Res Ther 2006; 44: 621-38. 17. Posner MI. Attention in cognitive neuroscience. Cambridge: MIT Press; 1995. 18. McGhie A, Chapman J. Disorders of attention and perception in early schizophrenia. Br J Med Psychol 1961; 34: 102. 19. Dudai Y. The neurobiology of memory: concepts, findings, trends. New York: Oxford University Press; 1989. 20. Baddeley AD, Hitch G. The recency effect: implicit learning with explicit retrieval? Mem Cognit 1993; 21: 146-55. 21. Kandel ER, Kupfermann I, Iversen, S. Learning and memory. Principles of neural science. New York: McGraw-Hill; 2000. 22. Haberlandt K, Thomas JG, Lawrence H, Krohn T. Transposition asymmetry in immediate serial recall. Memory 2005; 13: 274-82. 23. Champtiaux N, Changeux JP. Knockout and knockin mice to investigate the role of nicotinic receptors in the central nervous system. Prog Brain Res 2004; 145: 235-51. 24. LaFerla FM, Tinkle BT, Bieberich CJ, Haudenschild CC, Jay G. The Alzheimer’s A beta peptide induces neurodegeneration and apoptotic cell death in transgenic mice. Nat Genet 1995; 9: 21-30. 25. Mangiarini L, Sathasivam K, Seller M, Cozens B, Harper A, Hetherington C, et al. Exon 1 of the HD gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice. Cell 1996; 87: 493-506. 26. Matsui M, Yamada S, Oki T, Manabe T, Taketo MM, Ehlert FJ. Func- 144 tional analysis of muscarinic acetylcholine receptors using knockout mice. Life Sci 2004; 75: 2971-81. 27. Quon D, Wang Y, Catalano R, Scardina JM, Murakami K, Cordell B. Formation of beta-amyloid protein deposits in brains of transgenic mice. Nature 1991; 352: 239-41. 28. Tzavara ET, Bymaster FP, Felder CC, Wade M, Gomeza J, Wess J, et al. Dysregulated hippocampal acetylcholine neurotransmission and impaired cognition in M2, M4 and M2/M4 muscarinic receptor knockout mice. Mol Psychiatry 2003; 8: 673-9. 29. Luquin MR. Modelos experimentales de enfermedad de Parkinson. Rev Neurol 2000; 31: 60-6. 30. Gower AJ, Lamberty Y. The aged mouse as a model of cognitive decline with special emphasis on studies in NMRI mice. Behav Brain Res 1993; 57: 163-73. 31. Ingram DK, Spangler EL, Iijima S, Ikari H, Kuo H, Greig NH, et al. Rodent models of memory dysfunction in Alzheimer’s disease and normal aging: moving beyond the cholinergic hypothesis. Life Sci 1994; 55: 2037-49. 32. Ingram DK, Spangler EL, Iijima S, Kuo H, Bresnahan EL, Greig NH, et al. New pharmacological strategies for cognitive enhancement using a rat model of age-related memory impairment. Ann N Y Acad Sci 1994; 717: 16-32. 33. Fox GB, LeVasseur RA, Faden AI. Behavioral responses of C57BL/6, FVB/N, and 129/SvEMS mouse strains to traumatic brain injury: implications for gene targeting approaches to neurotrauma. J Neurotrauma 1999; 16: 377-89. 34. Sarti C, Pantoni L, Bartolini L, Inzitari D. Cognitive impairment and chronic cerebral hypoperfusion: what can be learned from experimental models. J Neurol Sci 2002; 203-204: 263-6. 35. Hoffman HS, Searle JL. Acoustic variables in the modification of startle reaction in the rat. J Comp Physiol Psychol 1965; 60: 53-8. 36. Lubow RE, De la Casa LG. There is a time and a place for everything: bidirectional modulations of latent inhibition by time-induced context differentiation. Psychol Bull Rev 2005; 12: 806-21. 37. Ennaceur A, Neave N, Aggleton JP. Spontaneous object recognition and object location memory in rats: the effects of lesions in the cingulate cortices, the medial prefrontal cortex, the cingulum bundle and the fornix. Exp Brain Res 1997; 113: 509-19. 38. Baker KB, Kim JJ. Effects of stress and hippocampal NMDA receptor antagonism on recognition memory in rats. Learn Mem 2002; 9: 58-65. 39. Okuda S, Roozendaal B, McGaugh JL. Glucocorticoid effects on object recognition memory require training-associated emotional arousal. Proc Natl Acad Sci U S A 2004; 101: 853-8. 40. Puma C, Bizot JC. Intraseptal infusions of a low dose of AP5, a NMDA receptor antagonist, improves memory in an object recognition task in rats. Neurosci Lett 1998; 248: 183-6. 41. Rampon C, Tang YP, Goodhouse J, Shimizu E, Kyin M, Tsien JZ. Enrichment induces structural changes and recovery from nonspatial memory deficits in CA1 NMDAR1-knockout mice. Nat Neurosci 2000; 3: 238-44. 42. Rosa RM, Flores DG, Appelt HR, Braga AL, Henriques JA, Roesler R. Facilitation of long-term object recognition memory by pretraining administration of diphenyl diselenide in mice. Neurosci Lett 2003; 341: 217-20. 43. Sargolini F, Roullet P, Oliverio A, Mele A. Effects of intra-accumbens focal administrations of glutamate antagonists on object recognition memory in mice. Behav Brain Res 2003; 138: 153-63. 44. Schroder N, O’Dell SJ, Marshall JF. Neurotoxic methamphetamine regimen severely impairs recognition memory in rats. Synapse 2003; 49: 89-96. 45. Tang YP, Shimizu E, Dube GR, Rampon C, Kerchner GA, Zhuo M, et al. Genetic enhancement of learning and memory in mice. Nature 1999; 401: 63-9. 46. Holloway WR Jr, Thor DH. Social memory deficits in adult male rats exposed to cadmium in infancy. Neurotoxicol Teratol 1988; 10: 193-7. 47. Gheusi G, Bluthe RM, Goodall G, Dantzer R. Ethological study of the REV NEUROL 2008; 47 (3): 137-145 EVALUACIÓN DE TRASTORNOS COGNITIVOS effects of tetrahydroaminoacridine (THA) on social recognition in rats. Psychopharmacology (Berl) 1994; 114: 644-50. 48. Choleris E, Gustafsson JA, Korach KS, Muglia LJ, Pfaff DW, Ogawa S. An estrogen-dependent four-gene micronet regulating social recognition: a study with oxytocin and estrogen receptor-alpha and -beta knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100: 6192-7. 49. Morris R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci Methods 1984; 11: 47-60. 50. Barnes CA. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat. J Comp Physiol Psychol 1979; 93: 74-104. 51. Kameyama T, Nabeshima T, Kozawa T. Step-down-type passive avoidance- and escape-learning method. Suitability for experimental amnesia models. J Pharmacol Methods 1986; 16: 39-52. 52. Thomas SA, Palmiter RD. Disruption of the dopamine beta-hydroxylase gene in mice suggests roles for norepinephrine in motor function, learning, and memory. Behav Neurosci 1997; 111: 579-89. 53. Weinberger SB, Koob GF, Martínez JL Jr. Differences in one-way active avoidance learning in mice of three inbred strains. Behav Genet 1992; 22: 177-88. 54. Clincke GH, Wauquier A. Pharmacological protection against hypoxia-induced effects on medium-term memory in a two-way avoidance paradigm. Behav Brain Res 1984; 14: 139-42. 55. García J, Kimeldorf DJ, Koelling RA. Conditioned aversion to saccharin resulting from exposure to gamma radiation. Science 1955; 122: 157-8. 56. Brown JS, Kalish HI, Farber, LE. Conditioned fear as revealed by the magnitude of startle response to an auditory stimulus. Exp Physiol 1951; 41: 317-21. 57. Davis M, Astrachan DI. Conditioned fear and startle magnitude: effects of different footshock or backshock intensities used in training. J Exp Psychol Anim Behav Process 1978; 4: 95-103. METHODS TO EVALUATE COGNITIVE DISORDERS IN ANIMAL MODELS Summary. Introduction. The increasing prevalence of cognitive dysfunction and dementia associated, among others, to population aging in developed countries has grown a great interest in the study of the etiopathogenesis of cognitive deficit and the likely pharmacological targets which improve intellectual function or alter the neurodegeneration underlying these symptoms. Development and conclusions. An essential tool for that purpose is the use of animal models of human-related pathologies which clinically develop with cognitive impairment and dementia. In this review we will analyse the animal models of these disorders and, specially, the main tests that, by means of the observational evolution of the experimental animal, allow assessing its cognitive functions and its modification by experimental treatments that are wanted to investigate for its eventual introduction into clinics. [REV NEUROL 2008; 47: 137-45] Key words. Animal models. Attention. Behaviour. Cognitive impairment. Dementia. Memory. REV NEUROL 2008; 47 (3): 137-145 145