Métodos de evaluación de trastornos cognitivos en modelos animales

NEUROFARMACOLOGÍA
Métodos de evaluación de trastornos
cognitivos en modelos animales
F. Navarrete a, J.M. Pérez-Ortiz a, T. Femenía a, M.S. García-Gutiérrez a,
M.E. García-Payá a, C. Leiva-Santana b, J. Manzanares a
MÉTODOS DE EVALUACIÓN DE TRASTORNOS COGNITIVOS EN MODELOS ANIMALES
Resumen. Introducción. El aumento de la prevalencia de la disfunción cognitiva y la demencia, asociado, entre otros factores,
al envejecimiento de la población en los países desarrollados, ha despertado un gran interés por el estudio de la etiopatogénesis del déficit cognitivo y de las posibles dianas farmacológicas para mejorar la función intelectual o frenar la neurodegeneración subyacente en estos síntomas. Desarrollo y conclusiones. Un instrumento esencial a tal fin es la utilización de modelos
animales de las enfermedades humanas que cursan clínicamente con deterioro cognitivo y demencia. En esta revisión analizamos los modelos animales de estos trastornos y las principales pruebas que, mediante la observación de la evolución de la
conducta del animal de experimentación, permiten valorar sus funciones cognitivas y su modificación por los tratamientos experimentales que se quieran ensayar, de cara a su posible aplicación a los pacientes. [REV NEUROL 2008; 47: 137-45]
Palabras clave. Atención. Conducta. Demencia. Deterioro cognitivo. Memoria. Modelos animales.
INTRODUCCIÓN
Disfunción cognitiva en neurología y patología médica
En medicina, los trastornos de las funciones cognitivas se asocian generalmente con las llamadas ‘demencias degenerativas
primarias’, de especial importancia por su alta frecuencia y prevalencia en las poblaciones con un índice de envejecimiento
creciente, típicas de los países desarrollados. Se trata de un grupo heterogéneo de enfermedades caracterizadas por un deterioro mental progresivo que incluye combinaciones variables de
pérdida de memoria, alteraciones del juicio, el cálculo, el lenguaje, la orientación, las habilidades y la conducta, y trastornos
psiquiátricos. Los hallazgos anatomopatológicos de este grupo
de enfermedades consisten en la pérdida de neuronas, localizada preferentemente en la corteza cerebral, junto con cambios
degenerativos de las neuronas supervivientes, inclusiones proteicas y alteración vascular y de la glía. La localización de la
pérdida neuronal y la naturaleza de los cambios degenerativos y
de las inclusiones son los factores que diferencian a las distintas
afecciones [1]. Ejemplos de este grupo de enfermedades degenerativas serían las demencias frontotemporales, la demencia
con cuerpos de Lewy difusos y la enfermedad de Alzheimer. Esta última es el prototipo de enfermedad demenciante neurodegenerativa por excelencia, al ser la más frecuente y la mejor estudiada [2].
Sin embargo, a medida que el interés por el estudio de las
funciones intelectuales ha ido aumentando, se ha comprobado
que existen alteraciones cognitivas en otras enfermedades neurológicas degenerativas cuyas manifestaciones cardinales consisten en un trastorno del movimiento, como las ataxias cerebe-
© 2008, REVISTA DE NEUROLOGÍA
losas, las enfermedades de las motoneuronas o las distrofias
musculares, y que engloban a la enfermedad de Parkinson [3,4],
el temblor esencial [5], la enfermedad de Huntington [6,7], la
parálisis supranuclear progresiva [8], las ataxias hereditarias
[9], la esclerosis lateral amiotrófica [10] y las miopatías [11].
Es de destacar que prácticamente todas las enfermedades
neurológicas adquiridas o secundarias del sistema nervioso, incluidas las traumáticas, vasculares, infecciosas, inflamatorias,
desmielinizantes, tumorales, iatrogénicas, tóxicas, metabólicas
o psiquiátricas, se han asociado con deterioro intelectual o demencia [12]. También algunas enfermedades sistémicas, como
el dolor crónico [13] o las afecciones reumáticas [14] y digestivas [15,16], se han asociado con la disfunción cognitiva. Por lo
tanto, la ubicuidad de la disfunción intelectual en la patología
humana, junto con el hecho de que la alteración cognitiva es
siempre una causa importante de incapacidad para el paciente, y
de estrés y sobrecarga para los familiares, los cuidadores y la sociedad en general, subraya la importancia del problema y la necesidad de profundizar en el conocimiento de las causas, los mecanismos patogénicos y el tratamiento de estos trastornos.
Pese al espectacular avance de las técnicas y los conocimientos en neuroimagen, neuroquímica, neurogenética, neuropsicología, neurofisiología y neurofarmacología, la investigación con pacientes presenta importantes limitaciones que hace
imprescindibles los estudios experimentales con modelos animales de los distintos tipos de disfunción cognitiva. Hay una
gran variedad de modelos animales de deterioro cognitivo, clasificados en función del mecanismo por el que éste se produce,
sea selección o manipulación genética, utilización de agentes
ambientales durante el desarrollo o la edad adulta, o manipulación farmacológica de la respuesta cognitiva del animal. Aunque los estudios in vitro de tejido cerebral tienen su interés, en
el campo de la farmacología cognitiva es necesario utilizar uno
o varios modelos animales para determinar la utilidad de un
nuevo fármaco y su posología, debido a la complejidad de la
función cognitiva, en la que intervienen múltiples estructuras
cerebrales interconectadas.
El objetivo de esta revisión es describir las principales pruebas de conducta usadas en animales de experimentación para
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Aceptado tras revisión externa: 30.06.08.
a
Instituto de Neurociencias de Alicante. Universidad Miguel HernándezCSIC. San Juan de Alicante, Alicante. b Servicio de Neurología. Hospital
General de Alicante. Alicante, España.
Correspondencia: Dr. Jorge Manzanares. Instituto de Neurociencias de
Alicante. Universidad Miguel Hernández-CSIC. Apartado de Correos 18.
E-03550 San Juan de Alicante (Alicante). E-mail: [email protected]
Los autores manifiestan la inexistencia de posibles conflictos de interés.
F. NAVARRETE, ET AL
evaluar una serie de trastornos cognitivos, examinando
sus fundamentos, sus ventajas
e inconvenientes y su potencial proyección en la clínica.
Función cognitiva: atención,
aprendizaje y memoria
Antes de mostrar las pruebas
de conducta que se emplean
en la evaluación del deterioro
cognitivo, es importante describir una serie de conceptos
relacionados con la función
intelectual. El sistema de cognición en general se compone
de procesos de funcionalidad
y de aprendizaje y memoria.
Entre los de funcionalidad, se
incluyen, por una parte, procesos de ‘preatención’, en los
que se realiza el filtrado de la
información sensoriomotora
para centrar la atención en los
elementos más relevantes del
entorno [17] y cuya alteración
genera una sobrecarga sensorial y una fragmentación cognitiva que podría contribuir a Figura 1. Tipos de memoria y estructuras cerebrales relacionadas. En función de cómo se recibe y almacena la
cabe distinguir dos grandes tipos de memoria: la implícita, que no requiere un aprendizaje conscienlas alteraciones que se dan en información,
te, y la explícita, producto de un esfuerzo cognitivo consciente.
distintos trastornos psicóticos
[18], y por otra parte, procesos de ‘atención’, esto es, atención reflexiva,
orientación visual, orientación aprendida, vigilancia, habituación y atención selectiva, mantenida o dividida.
En los procesos de aprendizaje y memoria
se incluyen el aprendizaje asociativo, espacial
o no espacial, y la memoria a corto y largo plazo. Se puede definir el concepto de memoria
como ‘la retención a largo plazo de representaciones internas dependientes de la experiencia’
[19]. La memoria se puede dividir en dos grandes bloques: memoria implícita (no declarati- Figura 2. Prueba go/no go. Este ensayo tiene lugar en cámaras de conducta operante donde
va) y explícita (declarativa) [20,21]. La memo- el animal recibe estímulos go a los que debe responder presionando una palanca, por lo cual reria implícita es la resultante de procesos de cibirá una recompensa, o estímulos no go, frente a los que debe retener su respuesta.
aprendizaje no consciente realizados a través
de hábitos y habilidades, mediante estimulación o sensibilizarepresentación consciente del suceso o para ejecutar una resción previa, y en los que interviene la musculatura esquelética o
puesta motora aprendida.
bien respuestas emocionales y de aprendizaje no asociativo. La
memoria explícita o declarativa engloba la retención del conoci- En la memoria explícita se incluyen tres categorías diferentes:
miento de determinados acontecimientos, lugares o hechos, y memoria inmediata, memoria a corto plazo y memoria a largo
en ella toma parte el lóbulo medio temporal del diencéfalo. Esta plazo [20,22].
información se retiene mediante un esfuerzo consciente y a traTodos los aspectos mencionados anteriormente del aprendivés de asociaciones nuevas [21]. La adquisición de la memoria zaje y la memoria se han estudiado a lo largo de los años gracias
explícita es un proceso que requiere tres fases:
a modelos animales, que han permitido conocer las estructuras
– Codificación: captación de detalles sobre los estímulos y el cerebrales que intervienen en su funcionamiento (Fig. 1).
entorno para su posterior consolidación (procesamiento de
Tipos de modelos animales de trastornos cognitivos
la información para almacenarla).
– Almacenaje: retención de la información a lo largo del tiempo. Los modelos animales de trastornos cognitivos se han basado ma– Recuperación: utilizar la información retenida para crear una yoritariamente en primates, ratas y ratones, cuyos procesos neu-
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EVALUACIÓN DE TRASTORNOS COGNITIVOS
ronales son similares a los de la función cognitiva humana. Se
pueden distinguir varios tipos de modelos experimentales:
– Modelos farmacológicos: permiten la evaluación de fármacos.
– Modelos genéticos: basados en animales manipulados genéticamente (transgénicos y knock-out) [23-28].
– Modelos toxicológicos: para determinar la toxicidad de metales pesados, tóxicos y neurotoxinas [29].
Hay modelos animales que simulan síndromes específicos de déficit cognitivo en los cuales el factor desencadenante es el envejecimiento [30-32] o los traumatismos craneoencefálicos [33,34].
Recientemente, se han empleado también otros modelos complementarios que se realizan con animales no mamíferos, como peces cebra (Danio reiro), moscas del vinagre (Drosophila melanogaster) y gusanos (Caenorhabditis elegans), para cribar compuestos potencialmente tóxicos o terapéuticos, y determinar alguna de las bases neuromoleculares de la función cognitiva.
PRUEBAS DE CONDUCTA PARA
LA EVALUACIÓN DE TRASTORNOS
COGNITIVOS EN MODELOS ANIMALES
A la hora de abordar el estudio de la función cognitiva utilizando modelos animales debemos tener presentes sus múltiples dimensiones y decidir cuál de ellas deseamos investigar para elegir la prueba específica más apropiada.
Evaluación de la atención
Preatención
Inhibición prepulso. Permite evaluar la capacidad de un individuo para filtrar la información disponible a través de la aplicación de un estímulo de baja intensidad (prepulso) que antecede
a un estímulo intenso (pulso). Si a un estímulo alto le precede
uno de menor intensidad, la respuesta al segundo estímulo se reduce. En esta prueba se mantiene constantemente un sonido
neutro (blanco) con el objetivo de crear un ruido de fondo estable. El estímulo acústico prepulso se aplica entre 4 y 18 dB por
encima de este ruido de fondo y precede sistemáticamente al estímulo mayor (pulso) cuya magnitud varía entre 100 y 120 dB y
que se aplica durante 60 a 140 ms. El prepulso auditivo inicial
inhibe la magnitud de la respuesta de sobresalto posterior ante
el pulso, inhibición que se incrementa conforme aumenta la intensidad del prepulso [35].
Atención
Orientación y habituación. Para medir la respuesta de orientación visual en ratas y ratones se utiliza una técnica que consiste
en colocar un objeto en el campo de visión del animal y evaluar
la capacidad que tiene para rastrear el objeto. Una manera de llevar a cabo la prueba es colocar el animal en un área circular donde primero se le deja pasar una fase de habituación de unos dos
minutos, seguida de la introducción de un pequeño objeto que
durante 12 segundos se mueve siguiendo el perímetro del área
circular en el campo de visión del ratón. Cada presentación del
objeto constituye un ensayo de la prueba y en cada ensayo se mide la respuesta de orientación en intervalos de uno o dos segundos. Se considera que el animal se orienta cuando dirige su cabeza hacia el objeto o bien lo rastrea mientras se encuentra girando.
Prueba go/no go. Este ensayo se divide en pruebas go y pruebas
no go. La prueba go consiste en la presentación de un estímulo
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al animal de experimentación (por ejemplo, luz), ante el cual el
animal debe responder y recibirá una recompensa por ello. En el
caso de la prueba no go se aplica una determinada señal antes
de la señal go (por ejemplo, un tono antes de la luz) y el animal
de experimentación tiene que aprender a retener su respuesta
para recibir el refuerzo (Fig. 2).
La prueba está constituida por tres fases:
– Formación: el ratón aprende a realizar una tarea con el objetivo de conseguir un refuerzo y tras esto se le aplica la señal
go durante cinco días consecutivos en los que se llevan a cabo 40 pruebas al día.
– Prueba go: comienza con la presentación de la señal go y,
cuando el ratón responde a dicho estímulo dentro de un determinado período de tiempo (por ejemplo, 60 segundos), se
le suministra la recompensa. Es entonces cuando el ratón
dispone de un tiempo determinado, 20 segundos, para localizar y consumir la comida. Un fallo en cualquier parte de la
prueba supone la interrupción antes de la siguiente prueba
go. Cuando el ratón complete con éxito el 85% de las pruebas go durante al menos tres días consecutivos, se introduce
en la prueba go/no go.
– Prueba go/no go: esta fase dura aproximadamente 10 días,
durante los cuales se van intercalando aleatoriamente las
pruebas go y no go. Tras la señal no go, el ratón debe aprender a contener su respuesta durante unos 15 segundos para
recibir la recompensa. Si el ratón responde antes de tiempo
o mientras se está aplicando la señal, se considera fallo y no
se le proporciona la recompensa. Si el ratón no logra retrasar su respuesta durante un período determinado (15 segundos), se debe repetir la prueba con un intervalo de tiempo
menor (2-10 segundos), con el fin de averiguar si el déficit
se debe a una incapacidad para retrasar su respuesta durante
un período prolongado o a una incapacidad de aprender la
tarea no go.
Inhibición latente. Esta prueba permite estudiar la atención selectiva del ratón, así como determinados aspectos del aprendizaje y la memoria. El concepto de inhibición latente hace referencia al retraso que se produce en el condicionamiento a un estímulo cuando ese estímulo ha sido presentado previamente sin
ninguna consecuencia [36]. El procedimiento consistiría en tener
dos grupos de animales, el primer grupo se coloca en el aparato
donde se realiza la prueba y se permite que lo explore durante
una hora. El segundo grupo se coloca en el aparato el mismo
tiempo pero reciben el estímulo condicionado (por ejemplo, un
tono intermitente y/o luces). Al día siguiente, los ratones son
examinados en el mismo aparato y el estímulo condicionado precede a un shock eléctrico en las patas (estímulo aversivo). Si el
ratón sale de la cámara durante el tono de 8 segundos, se considera respuesta de evitación. Si abandona la cámara tras el tono
de 8 segundos y durante la presentación del siguiente tono de 8
segundos y shock eléctrico, la respuesta se registra como escape.
Si no abandona la cámara en ninguno de los momentos expuestos anteriormente, se considera que la respuesta es fallida. Con
este sistema se consiguen curvas de aprendizaje a lo largo del
tiempo en las cuales la evitación, el escape y las respuestas fallidas del ratón pueden seguirse con detalle. Cuando se procede a
comparar ambos grupos, se observan claras diferencias entre
ellos. La inhibición latente se pone de manifiesto en los ratones
que han sido expuestos previamente al estímulo, ya que muestran un retraso en la adquisición de la respuesta condicionada.
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F. NAVARRETE, ET AL
Evaluación del aprendizaje
y la memoria
Memoria no espacial
Prueba de reconocimiento
de objetos. Desde que Ennaceur et al [37] introdujeron la prueba de reconocimiento de objetos, se ha
ido incrementando su uso
como modelo de investigación y poderosa herramienta experimental para valorar los efectos de los fármacos sobre la memoria y
los mecanismos neurobiológicos relacionados con el
aprendizaje y la memoria
[38-45]. Esta prueba se
fundamenta en la tendencia
natural de los ratones a explorar nuevos objetos y
ambientes y compararlos
con otros que les son fami- Figura 3. Prueba de reconocimiento de objetos. El experimentador puede estudiar la memoria a corto y largo plazo
liares. Al exponer al ratón a modificando el intervalo de tiempo entre la primera exposición a dos objetos idénticos y las siguientes exposiciones, en las que se evalúa el grado de exploración del objeto familiar frente a otro nuevo.
una serie de objetos se espera a que éste los explore
y se mide el tiempo de exploración, que se define como el pe- to y la memoria en ratas y ratones. La prueba de reconocimienríodo durante el cual el animal olisquea o toca el objeto con las to social se centra en el grado de familiaridad entre dos indivipatas delanteras a una distancia menor o igual a 1 cm. En cada duos. Tal y como se describe en la figura 4, se lleva a cabo en
parte de la prueba se cambian los objetos y al inicio se estable- una jaula que tiene una ventana con una malla de alambre [48].
ce el intervalo de tiempo entre la exposición inicial y las si- Junto a la jaula donde se realiza la prueba se coloca otra circular
guientes, con lo que se consigue una valoración de la memoria a que, a su vez, está dividida en dos cámaras, cada una de ellas
corto y largo plazo. La prueba se realiza en un campo abierto con una ventana con una malla de alambre. La prueba comienza
que situamos en una habitación homogéneamente iluminada y con la habituación, situando al ratón en la jaula principal durancon objetos que deben ser de similar textura, color y tamaño, te 10 minutos para que se familiarice con el entorno y dejando
vacía la cámara circular. Posteriormente, en uno de los comparpero de distinta forma (Fig. 3).
En una primera fase de habituación, se coloca el animal en timentos de la cámara circular se coloca un ratón que llamareel campo abierto sin ningún objeto y se deja transcurrir un tiem- mos ‘familiar’, ya que estuvo en contacto previamente durante
po variable (10-30 minutos) para que se familiarice con el en- cinco minutos con el ratón experimental (se puede utilizar un
torno. A las 24 horas se realiza el entrenamiento, para lo cual se ratón de su misma jaula) y en el otro compartimento se coloca
colocan dos objetos idénticos (objetos A) en distinta posición un ratón nuevo, que nunca ha sido expuesto al ratón experimen(posición 1 y posición 2) y se deja el animal en el interior de la tal. La caja circular se gira para enfrentar, por medio de las vencaja durante 5 o 10 minutos, en los que se contabiliza el tiempo tanas de acoplamiento, al ratón de la caja principal con cada uno
de exploración (T). En la siguiente fase se deja un objeto A (que de los dos compartimentos en sesiones de cinco minutos. La exllamaremos objeto familiar) y se coloca en la otra posición un periencia se realiza cuatro veces. En las tres primeras el animal
objeto nuevo (objeto B). La memoria a corto plazo se mide a la se enfrenta a un ratón familiar y durante el transcurso de estas
hora y a las tres horas del entrenamiento, anotando el tiempo de sesiones el ratón se acostumbra a esa exposición y varía su inexploración de los objetos familiar (TA) y nuevo (TB). Transcu- vestigación social (habituación). En la cuarta exposición se gira
rridas 24 horas desde el entrenamiento, se mide la memoria a la cámara y se muestra el ratón nuevo (deshabituación). En tolargo plazo, para lo cual se cambia el objeto B por un objeto das las sesiones se mide el tiempo de exploración, definido conuevo (C) y se sigue el mismo procedimiento. El resultado es- mo el tiempo que el animal emplea en acercarse u olisquear la
perado es que los ratones sin deterioro cognitivo exploren más ventana de acoplamiento. Los ratones con una función cognitiel objeto nuevo que el familiar. En cambio, para un ratón con al- va no deteriorada pasarán más tiempo olisqueando a los ratones
guna alteración en la función cognitiva, el objeto familiar y el nuevos que a los familiares; los que tengan un déficit cognitivo
nuevo le parecerán igual de novedosos y no habrá diferencia en- no distinguirán entre los ratones familiares y los nuevos (su
tre los tiempos de exploración.
tiempo de exploración será similar).
Prueba de reconocimiento social. El procedimiento del reconocimiento social lo introdujeron Holloway y Thor [46] y posteriormente fue desarrollado por Robert Dantzer et al [47] para
estudiar la regulación neuropeptidérgica sobre el comportamien-
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Memoria espacial
Laberinto acuático de Morris. Una de las pruebas más comúnmente utilizadas por los investigadores para el estudio de la
memoria espacial es el laberinto de agua diseñado por Morris
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EVALUACIÓN DE TRASTORNOS COGNITIVOS
Figura 4. Prueba de reconocimiento social. La exposición repetida del animal a un individuo familiar
precede a una última confrontación con un individuo desconocido, momento en el que se evalúa el
grado de interacción respecto al que se produjo con anterioridad.
Figura 5. Laberinto acuático de Morris. En esta prueba se evalúa el tiempo de latencia que emplea el
animal en alcanzar la plataforma sumergida, que representa un estímulo reforzante de escape. Si la
plataforma permanece en el mismo lugar, se evalúa la memoria espacial de referencia, y si varía, se
analiza la memoria espacial de trabajo.
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[49]. La prueba se desarrolla en una
piscina circular dividida en cuatro cuadrantes imaginarios (designados como
noroeste, suroeste, noreste y sureste)
que dispone de una plataforma móvil
de escape oculta y parcialmente sumergida. En uno de los cuadrantes se
sitúa la plataforma móvil, que debe
quedar a una altura de 0,5 cm por debajo del agua. Los puntos de escape se
localizarán en siete posiciones diferentes, a igual distancia, fijadas aleatoriamente a través de la prueba, y se
deben utilizar los mismos para todos
los animales. Alrededor de la piscina
se colocan numerosas señales visuales
para facilitar la orientación espacial
del animal. Las señales luminosas son
las más utilizadas en este tipo de laberinto (Fig. 5).
En una primera fase de adquisición se introduce al animal con el hocico apuntando hacia las paredes de la
piscina para que busque la plataforma
durante 60 o 120 segundos. En caso
de no que no la encuentre, se le coloca
entre 20 y 30 segundos sobre ésta. Se
considera que un animal ha encontrado la plataforma cuando permanece
en ella 5 o 10 segundos. Después se
retira el animal de la plataforma y se
le deja descansar cuatro minutos antes
de iniciar el siguiente ensayo. Este
procedimiento se repite con cada animal hasta 12 entrenamientos consecutivos. La capacidad del animal para localizar eficientemente la plataforma
depende de la utilización de las claves
que rodean a la piscina (son necesarias al menos dos señales fuera del laberinto para localizar la meta invisible). Esta fase de adquisición o aprendizaje puede durar varios días. Dos
días después de finalizar la fase anterior se lleva a cabo una última prueba de
retención o ensayo de investigación
sin plataforma durante 60 o 100 segundos. Si el animal ha aprendido,
nadará más tiempo en el cuadrante
meta, es decir, donde previamente estaba situada la plataforma. Las medidas conductuales más utilizadas son la
latencia de escape en los ensayos de
adquisición (tiempo que transcurre
hasta que alcanza la plataforma) y el
porcentaje de tiempo en el cuadrante
meta durante la prueba final. La adquisición se refleja en las menores latencias de escape a lo largo de los días
y el mayor porcentaje de tiempo en el
cuadrante meta.
141
F. NAVARRETE, ET AL
Laberinto de Barnes. Esta prueba permite estudiar el aprendizaje y la memoria espacial, la memoria de trabajo y de referencia, y la memoria a corto y largo plazo, así como otras tareas
más complejas en ratas y ratones. Fue diseñada por Barnes en
la Universidad de Arizona [50] y consiste en un laberinto seco
donde se utilizan luz y ruido como estímulos aversivos. El refuerzo que recibe el animal es escapar de estos estímulos. El laberinto está constituido por un disco de plástico opaco elevado
del suelo mediante un trípode (Fig. 6). A lo largo del perímetro
del disco se distribuyen 20 agujeros de 5 cm de diámetro y debajo de uno de ellos se coloca un cajón de escape de plástico
opaco. Se pueden situar diversas pistas espaciales alrededor del
cilindro, que permanecerán constantes durante todo el estudio,
y también se pueden colocar debajo de algunos agujeros cajones falsos en los que parece posible introducirse, pero cuyo
espacio disponible es en realidad tan pequeño que impide que
el animal se pueda esconder. Un foco de luz (de unos 150 W) y
un generador de ruido (sobre 80 dB) constituyen los estímulos
aversivos.
El procedimiento comienza con un entrenamiento que consiste en colocar el animal en la caja de escape y dejarlo allí durante un minuto, para continuar un minuto más tarde con las diversas sesiones de exploración. Todas las sesiones empiezan colocando el animal en el centro del laberinto en el interior de una
‘cámara de inicio’, que consiste en un cilindro opaco de unos
10 cm de alto. Al cabo de 10 segundos, se retira la cámara de
inicio, se conectan la luz y el zumbido, y se deja que el animal
explore el laberinto. El estrés producido por estos estímulos inducirá al animal a buscar un espacio cerrado donde esconderse.
La sesión termina cuando el animal encuentra el túnel de escape
o cuando transcurren cinco minutos, momento en el que se le
introduciría manualmente en dicho túnel. Cuando el animal entra en la cámara de escape, los estímulos aversivos cesan y se le
deja en la oscuridad un minuto antes de devolverlo a su jaula. El
túnel de escape está situado siempre debajo del mismo agujero,
que se elige de forma aleatoria para cada animal. La prueba se
realiza durante varios días hasta que en siete u ocho pruebas
consecutivas se produzcan menos de tres errores. Se valoran el
aprendizaje espacial y la memoria midiendo el tiempo que invierte el animal en encontrar el cajón refugio y el número de
errores que comete antes de encontrarlo. Se considerará un
error cada vez que intente introducirse en un agujero que no es
el correcto. Los intentos sucesivos en un mismo agujero equivocado se consideran el mismo error.
Aprendizaje asociativo
Prueba de evitación pasiva. La prueba de evitación pasiva es
una prueba unidireccional que permite estudiar el aprendizaje
adquirido y la memoria. El animal se condiciona con un estímulo aversivo y posteriormente se valora si recuerda esa experiencia. Para llevar a cabo esta prueba se utiliza una caja con dos
compartimentos, uno claro y otro oscuro, separados entre sí por
una puerta corredera. En el compartimento claro hay una luz
potente enfocando directamente al ratón, mientras que en el oscuro hay un circuito cerrado que producirá pequeñas descargas
eléctricas. Se pretende que el ratón aprenda a evitar el compartimento oscuro donde se le aplica la descarga [51].
La prueba comienza con un entrenamiento que consiste en
colocar al ratón en el compartimento iluminado. A los 5 segundos se abre la puerta y se le permite dirigirse al compartimento
oscuro (el ratón tenderá espontáneamente a desplazarse a los
142
Aversión:
luces 150 W
Cajón
refugio
Falso
cajón
Figura 6. Laberinto de Barnes. El animal se sitúa primero en el centro del
aparato en una cámara de inicio y a continuación se le deja que explore
los diversos orificios ante la exposición a estímulos aversivos, como luces y sonidos. Se evalúa el tiempo que emplea en encontrar la salida que
conduce al cajón refugio.
espacios oscuros, pues la luz directa le produce ansiedad). En el
momento en que el ratón entre con las cuatro patas en la cámara oscura se cerrará la puerta y recibirá una descarga eléctrica
de 0,1-0,4 mA durante 2 segundos. Treinta segundos después
de la aplicación de la descarga, se devuelve al ratón a su jaula
hasta el momento de la prueba, que consiste en volver a poner
el ratón en la cámara iluminada y levantar la puerta que separa
las dos cámaras. Durante la prueba no se aplica al animal ninguna descarga y se observa durante 5 minutos, registrando diversos parámetros, entre los que se incluyen el tiempo de latencia hasta que entra en la cámara oscura (como indicador de memoria), el número de veces que cruza de una cámara a otra, el
tiempo total que pasa en cada una de las cámaras y la frecuencia con la que se asoma a la cámara oscura hasta que realmente
entra en ella. El ensayo se puede llevar a cabo a los 30 o 60 minutos del entrenamiento, para evaluar la memoria a corto plazo,
y a las 8 y 24 horas, para valorar la memoria a largo plazo. Es
posible utilizar otras variantes experimentales en las pruebas de
evitación pasiva, como las empleadas en la tarea de evitación
inhibitoria del descenso de la plataforma (step-down inhibitory
avoidance task).
Prueba de evitación activa. Las pruebas de evitación activa requieren varias sesiones de aprendizaje, a diferencia de las de
evitación pasiva, en las que el ratón aprende en una sola sesión,
pero nos permiten examinar funciones cognitivas complejas y
valorar la adquisición y consolidación de la memoria en un mismo animal durante el experimento [52]. La prueba de evitación
activa se puede clasificar en evitación activa de un sentido y evitación activa de dos sentidos. La diferencia radica en que en la
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EVALUACIÓN DE TRASTORNOS COGNITIVOS
prueba de evitación activa de un sentido el ratón siempre recibe
el shock eléctrico en la misma cámara/localización (es unidireccional) [53], mientras que en la de dos sentidos el animal aprende, a través de diferentes pistas, a predecir la descarga eléctrica,
independientemente de la cámara de ensayo (contexto) donde
se produzca (es bidireccional) [54].
La prueba de evitación activa de un sentido se realiza en una
caja con dos compartimentos comunicados entre sí por una puerta e iluminada con luz natural. En un compartimento se coloca
una bombilla y, cuando ésta se enciende, se emite un sonido durante 10 segundos y se abre simultáneamente la puerta para que
el ratón pueda cambiar de compartimento. Al cesar el estímulo
luminoso y sonoro el ratón recibirá una descarga de 0,1 mA durante 20 segundos si no ha cambiado de compartimento, hasta
que escape a la cámara adyacente. Esta prueba, repetida hasta 20
veces al día y con intervalos de 20 segundos, constituye el período de entrenamiento. En cada ensayo se registra el tiempo de
latencia hasta que se produce la respuesta de evitación (escapar
a la otra cámara). Se considera como fallo si esta respuesta no
se produce. Este entrenamiento diario se repite hasta que el ratón alcanza un criterio que refleja aprendizaje. Las curvas de
aprendizaje a lo largo del tiempo revelan adquisición y consolidación de la evitación.
En la prueba de evitación activa de dos sentidos, el ratón
puede recibir la descarga eléctrica en cualquiera de las dos cámaras, dependiendo de su localización actual. El animal debe
resolver un conflicto, ya que la cámara donde recibió la descarga en el ensayo previo se convierte en cámara segura durante la siguiente prueba. Por lo tanto, tiene que aprender a inhibir su tendencia a evitar el compartimento donde acaba de
recibir una descarga y utilizar el estímulo condicionado para
predecir y evitar una nueva descarga [54]. Esta prueba se realiza en una caja con dos compartimentos iluminados con una
bombilla cada uno. Se introduce el ratón en uno de los dos
compartimentos y se le permite explorarlo durante cinco minutos. A continuación se conecta el sistema de sonido y luz
que constituye el estímulo condicionado. Si el animal no cruza a la cámara adyacente tras 8-10 segundos, se le aplica un
shock eléctrico. La luz, el sonido y el shock eléctrico cesan si
el animal cruza a la otra cámara o si transcurren 10 segundos
desde la aplicación del shock eléctrico. Las respuestas se codifican como evitación (el ratón pasa a la cámara adyacente
tras el estímulo condicionado pero antes del shock eléctrico),
escape (el animal cruza a la otra cámara durante el shock eléctrico) o fallo (el ratón no pasa a la cámara adyacente durante
los siguientes 10 segundos tras el shock eléctrico). El período
de aprendizaje consiste en realizar esta prueba al mismo ratón
70 veces durante 70 minutos con intervalos de 30-90 segundos. El análisis de las curvas de aprendizaje nos revela información acerca de la adquisición o pérdida de cada respuesta
(memoria a corto plazo). La repetición de la prueba a las 24
horas del primer ensayo nos permite valorar la memoria a largo
plazo.
Memoria emocional
Condicionamiento aversivo al sabor. El modelo de condicionamiento aversivo al sabor fue descubierto en 1955 por García et
al [55]. Para desarrollar el condicionamiento aversivo al sabor,
el animal debe poder reconocer el estímulo condicionado y llegar a enfermar con la exposición al estímulo no condicionado.
Es importante que se desarrolle esta asociación entre el estímu-
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lo condicionado y el no condicionado para que finalmente,
cuando se presente el estímulo condicionado sólo, el animal lo
evite. La prueba consiste en una primera fase de habituación en
la que se deja al animal durante 24 horas sin comida, restricción
que asegura la ingestión posterior de una cantidad adecuada
que, a su vez, favorecerá la asociación entre el estímulo condicionado y el no condicionado. Pasadas esas 24 horas, se traslada a cada ratón a la jaula de prueba, en el centro de la cual se coloca un pequeño comedero. Su base puede estar aromatizada
con un 1% de vainilla o extracto de almendra y endulzada con
0,25 M de solución de sacarina. A los ratones se les asigna aleatoriamente uno de estos dos aromas. El cuenco de la comida debe pesarse antes y después de la fase de condicionamiento (3060 minutos) para asegurar que el animal ha ingerido una cantidad suficiente. Tras la exposición al estímulo condicionado, se
le inyectan a cada ratón 0,15 M de cloruro de litio o agua estéril
y se le devuelve a su jaula, donde se mantiene 24 horas más con
restricción de comida hasta someterlo a la prueba de retención.
Dicha prueba consiste en colocar dos dispositivos de comida,
uno con el aroma a vainilla y el otro con extracto de almendra
para la libre elección del animal. Se espera que los ratones condicionados a la vainilla prefieran la almendra y los condicionados a la almendra prefieran la vainilla.
Sobresalto potenciado por el miedo. Se trata de una prueba pavloviana de miedo condicionado en la que una respuesta de temor ante un estímulo acústico puede aumentarse cuando éste
se presenta junto con otro estímulo aversivo que genera respuestas de miedo [56,57]. El ensayo se suele llevar a cabo durante cuatro días, comenzando con cinco minutos diarios de
aclimatación en la jaula donde se realizará el experimento. El
primer día, se miden las respuestas de miedo a través de un rango de intensos estímulos acústicos que se aplican durante 40 ms
a diferentes intensidades (100, 105 y 110 dB). Es importante
evaluar al ratón un número limitado de veces para evitar que
una presentación frecuente pueda causar habituación a estos
estímulos. El segundo día se aplican esos mismos estímulos,
pero en la mitad de los ensayos el estímulo acústico de sobresalto se presenta inmediatamente seguido de un tono de 12 kHz
y 70 dB durante 30 segundos (estímulo condicionado), y en la
otra mitad sólo se suministra el estímulo acústico del primer
día. Para calcular la magnitud de la respuesta al estímulo condicionado, la respuesta al estímulo acústico cuando se presenta
aisladamente se resta de la respuesta al estímulo acústico cuando se presenta con el estímulo condicionado, se divide el valor
resultante por el número de respuestas al estímulo acústico
cuando se ha presentado solo y finalmente se multiplica por
100. Los valores positivos indican que el tono aumenta la respuesta de sobresalto inicial; en cambio, los valores negativos
sugieren una reducción en la respuesta cuando se presenta el
estímulo condicionado. El tercer día se aplica el tono (estímulo
condicionado) seguido de un shock eléctrico (estímulo no condicionado) y la asociación entre ambos estímulos se repite diez
veces, con un intervalo entre pruebas de 90 a 180 segundos.
Transcurridas 24 horas, los animales se evalúan del sobresalto
potenciado por el miedo bajo las mismas condiciones utilizadas el segundo día, midiendo la potenciación del sobresalto con
la misma fórmula utilizada en el precondicionamiento. En los
animales que hayan adquirido el sobresalto potenciado por el
miedo, el porcentaje de potenciación debería ser más alto tras
el condicionamiento.
143
F. NAVARRETE, ET AL
CONCLUSIONES
Los modelos animales de trastornos cognitivos desempeñan un
papel clave en la comprensión de las bases neuroquímicas de la
función/disfunción cognitiva. Con su utilización podemos profundizar en las bases fisiopatológicas del deterioro que se produce por el simple hecho de envejecer o el que aparece asociado a diferentes situaciones patológicas, como la enfermedad de
Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, las demencias vasculares, la angiopatía amiloide cerebral, las enfermedades priónicas, la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Huntington, la esquizofrenia y otras enfermedades neurodegenerativas. Además, los modelos animales nos permiten comprobar
la eficacia de nuevos fármacos e identificar posibles dianas terapéuticas.
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METHODS TO EVALUATE COGNITIVE DISORDERS IN ANIMAL MODELS
Summary. Introduction. The increasing prevalence of cognitive dysfunction and dementia associated, among others, to
population aging in developed countries has grown a great interest in the study of the etiopathogenesis of cognitive deficit and
the likely pharmacological targets which improve intellectual function or alter the neurodegeneration underlying these
symptoms. Development and conclusions. An essential tool for that purpose is the use of animal models of human-related
pathologies which clinically develop with cognitive impairment and dementia. In this review we will analyse the animal
models of these disorders and, specially, the main tests that, by means of the observational evolution of the experimental
animal, allow assessing its cognitive functions and its modification by experimental treatments that are wanted to investigate
for its eventual introduction into clinics. [REV NEUROL 2008; 47: 137-45]
Key words. Animal models. Attention. Behaviour. Cognitive impairment. Dementia. Memory.
REV NEUROL 2008; 47 (3): 137-145
145