1 ACTIVIDAD PRÁCTICA AMPLIFICACIÓN DE DNA. Objetivos: Que el alumno conozca y/o realice: Amplificación de DNA. Introducción La Biología Molecular se ha convertido en una poderosa herramienta en muchos campos de las Ciencias Biológicas, Bioquímicas y Médicas. En la actualidad se utiliza ampliamente ya sea en la investigación o el diagnóstico de enfermedades. Esta metodología ha posibilitado los avances en las investigaciones médicas resultando en un mejor diagnóstico y conocimiento de los desarreglos sanguíneos, deficiencias inmunológicas, fibrosis quísticas y el cancer. Ha ayudado, además, en las investigaciones de las enfermedades de los animales, el conocimiento y monitoreo de los recursos naturales, así como en las ciencias taxonómicas, en la Genética evolutiva y del desarrollo, entre otras. Hace 20 años el DNA era una de las macromoléculas más difíciles de analizar y parecía una ardua tarea el comprender la función de tan larga estructura nucleotídica. Sin embargo, la situación hoy es completamente diferente, pues el DNA se ha convertido en la macromolécula más fácil de estudiar. Extracción y purificación del DNA El DNA puede ser fácilmente extraído y purificado de una célula o tejido y, una vez aislado, es mucho más estable que muchas otras macromoléculas: Puede cortarse con una alta precisión y reproducibilidad utilizando enzimas de restricción, permitiendo la escisión de fragmentos específicos de DNA que a su vez, mediante la técnica de clonaje, se puede obtener en cantidades ilimitadas. Utilizando las técnicas de hibridización y los métodos de secuenciación rápida de fragmentos clonados se puede determinar la estructura y organización de una gran parte del genoma de los organismos, de hecho se ha abierto la posibilidad del conocimiento de la secuencia y estructura del genoma humano. La fase inicial, la extracción y purificación del DNA, es muy sencilla y no por eso menos importante. Una buena extracción, no solo en cantidad sino en calidad, favorecen o aseguran la obtención de los resultados esperados y la repetibilidad de los mismos. Casi todos los métodos de extracción de DNA se basan en la lisis enzimática de las células y tejidos por medio de Proteinasa K, la precipitación de las proteínas y restos tisulares en un solvente (usualmente Fenol-Cloroformo) y la colecta de la fase acuosa, donde queda disuelto el DNA, que puede ser precipitado utilizando Etanol absoluto y, disuelto en un buffer apropiado, puede conservarse por mucho tiempo para su estudio. Además, en el mercado existen muchas firmas que producen "Kits" para la extracción y purificación de DNA. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): Este método no es más que la síntesis in vitro de DNA. Es una nueva y potente herramienta que ha causado una revolución en la Biología Molecular. Es tan sensible que una sola molécula de DNA puede ser amplificada y una sola copia de genes pueden ser extraídos de mezclas genómicas complejas y visualizarlas como distintas bandas en geles de agarosa. Puede ser utilizado, además, para efectuar búsquedas y/o secuencia rápido insertos directamente de alicatas de fagot individuales o colonias de bacteria. Adelantos, tales como el uso de una DNA polimerasa termoestable y la automatización del método inventado por Kary Mullis han posibilitado el desarrollo de numerosas y diversas aplicaciones del PCR a través de la comunidad de investigadores. Sin lugar a dudas, un solo protocolo no sería apropiado para todas las situaciones; en consecuencia cada nueva aplicación del PCR requerirá de la optimización. 2 Algunos de los problemas más frecuentemente encontrados incluyen: No-detección de los productos. Presencia de bandas inespecíficas debidas a errores en la inserción de los "primer" o su extensión. La formación de "dímeros de primers" que compiten en la amplificación con los productos deseados. Mutaciones o heterogeneidad debida a errores en la incorporación de bases. Protocolo Estándar de Amplificación por PCR Aunque las condiciones estándares amplifican la mayoría de las secuencias, estas se presentan a continuación principalmente para prever las condiciones iniciales para el diseño de nuevas aplicaciones del PCR. La optimización del PCR puede ser altamente ventajosa para una aplicación dada, especialmente en aquellas relacionadas con las pruebas de diagnóstico repetitivo o los procedimientos analíticos que requieren de una ejecución óptima. Protocolo Estándar 1. Poner 100 µl de reacción en un tubo Eppendorf de 0.5 mL, mezclarlo y cubrirlo con 75 µL de aceite mineral: Mezcla: DNA molde (de 105 a 106 moléculas "blanco"*) 20 pMol. de cada primer 20 mM Tris-HCl (pH 8.3, 20oC) 1.5 mM MgCl2 25 mM KCl 0.05% de Tween 20 100 µg/ml de gelatina estéril o seroalbúmina bovina libre de nucleasa 50 µM de cada dNTP 2 Unidades de Taq DNA polimerasa *1 ug de DNA genómico = 3 x 105 Moléculas blanco 10 ug de DNA de Levaduras = 3 x 105 1 ug de DNA de E. coli = 3 x 105 1% de una placa de M-13 = 106 2. Desarrollar de 25 a 35 ciclos de PCR utilizando el siguiente esquema de ToC: Desnaturalización: Annealing: Extensión: 96oC por 15 seg. (Inicialmente se pueden utilizar tiempos mayores) 55oC por 30 seg. 72oC por 1.5 seg. 3. Los ciclos deben terminar con una extensión final de 5 Min. a 72 oC. La reacción se detiene enfriando a 4oC y/o adicionando EDTA 10mM. Factores que afectan el desarrollo del PCR. 1. Concentración de Enzimas: La recomendada oscila, para la Taq DNA polimerasa (Perkin- Elmer Cetus), entre 1Sin embargo los requerimientos de enzimas pueden variar respecto al DNA molde o a los primers. Para optimizar el PCR se recomienda probar concentraciones de enzimas entre 0.5 - 5 Unidades/100ul y chequear los resultados a través de electroforésis en gel. Si la concentración de enzima es muy alta, se producirían y acumularían productos inespecíficos de fondo y, si es muy poca se obtendría una insuficiente cantidad del producto deseado. Nota: Las enzimas (Taq DNA polimerasa) de diferentes proveedores pueden comportarse de manera diferente debido a las distintas formulaciones, condiciones de ensayo y/o definiciones de Unidad. 3 2. dNTPs: Las soluciones almacenadas (Stock) de dNTPs deben ser neutralizadas a pH 7.0 y debe determinarse su concentración espectrofotométricamente. Los Stock primarios deben ser diluidos hasta 10 mM, subdivididos y almacenados a -20oC. Se recomienda para el trabajo una solución que contenga 1mM de cada dNTP. La estabilidad de los dNTPs durante ciclos repetidos es tal que aproximadamente el 50% permanece como dNTP luego de haber transcurridos 50 ciclos. Una concentración entre 20-200 mM de cada uno resulta en un balance óptimo entre el rendimiento, la especificidad y la fidelidad. Los 4 dNTPs deben usarse a concentraciones equivalentes para minimizar los errores de incorporación. Cuando se utilizan bajas concentraciones de dNTP (con relación a las originalmente recomendadas para los PCR que utilizaban el fragmento Klenow 1.5 mM de cada uno) aumentan tanto la especificidad y la fidelidad. Además minimiza los errores de annealing en sitios inespecíficos. Se debe decidir la menor concentración posible de dNTP apropiada para la longitud y la composición 3. Concentración de Magnesio (Mg): Esta puede afectar las siguientes etapas: Annealing de los primer, la temperatura de disociación de las cadenas tanto del DNA molde como de los productos del PCR, la especificidad de los productos, la formación de dímeros de primers y la actividad y fidelidad de la enzima. La enzima (Taq DNA polimerasa) necesita Mg libre suficiente para su unión con el DNA molde, los primers y para la inclusión de los dNTP. De tal modo los PCRs deben contener 0.5-2.5 mM de Mg por encima de la concentración total de dNTP. Nota: La presencia de EDTA u otros agentes quelantes en la solución de primers o en el DNA molde puede afectar el óptimo aparente de Mg. 4. Otros componentes de la reacción: Se recomienda utilizar como buffer para el PCR Tris-HCl de 1050 mM (pH 8.3 - 8.8) cuando se mide a 20oC. El Tris es un buffer iónico dipolar que tiene un pk a de 8.3 a 20oC y un pka de -0.021/oC, de modo que el verdadero pH de 20 mM Tris-HCl (pH 8.3 a 20oC) varía entre 7.8 y 6.8 durante las condiciones tópicas de los ciclos termales. . Se puede adicionar hasta 50 mM de KCl en la mezcla de reacción para facilitar el annealing. Concentraciones superiores a 50mM de KCl ó NaCl a 50mM inhiben la actividad de la Taq polimerasa. . Mientras que el DMSO resulta útil en los PCRs realizados con el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I de E. coli, el 10% de DMSO inhibe la actividad de la Taq polimerasa en un 50% y su uso no se recomienda para la mayoría de las aplicaciones de los PCR. . La gelatina o la Seroalbúmina bovina (BSA) (100ug/ml) y los detergentes no iónicos como el Tween 20 o el Laureth 12 (0.05-0.1%) se incluyen para estabilizar la enzima, aunque la mayoría de los protocolos funcionan sin la adición de proteínas. Annealing: La temperatura y el tiempo requerido para el Annealing depende de la composición, longitud y concentración de los primers en la amplificación , una T oC aplicable sería 5oC por debajo de la verdadera temperatura de annealing de los primers; como la Taq DNA polimerasa está activa en un amplio rango de ToC, la extensión de los primers ocurrirá a bajas temperaturas incluyendo en la etapa de Annealing. El rango de actividad de la enzima varía en dos órdenes de magnitud entre 20-85oC. La temperatura de annealing que oscila en el rango de 55 a 72oC generalmente produce buenos los primers. El aumento de la temperatura de annealing aumenta la discriminación contra los primers incorrectamente "acoplados" y reduce la extensión errónea de nucleótidos en el extremo 3' de los primers. Además, las altas temperaturas especialmente en los primeros ciclos ayudan a incrementar la especificidad. Para lograr el máximo de especificidad en el ciclo inicial, la enzima Taq polimerasa puede añadirse luego de ocurrida la primera desnaturalización y durante el Annealing.Bajas temperaturas de extensión conjuntamente con altas concentraciones de dNTP favorecen la extensión errónea de los primers y de nucléotidos mal incorporados. Por esta razón algunos investigadores argumentan que el PCR debe realizarse mejor utilizando primers mas largos y solamente dos temperaturas. Ej: Desde 55-75oC para el Annealing y la extensión y de 94-97oC para la desnaturalización y la separación de las cadenas. 4 Extensión: El tiempo de extensión depende de la longitud y la concentración de la "secuencia blanco" y de la temperatura. Tradicionalmente la extensión se realiza a 72oC puesto que esta temperatura es la cercana al óptimo para la extensión de los primers en el modelo que utiliza al M-13. Los estimados de la incorporación de nucleótidos a 72oC varían de 35 a 100 nucléotidos/segundos en dependencia del buffer, el pH, la concentración de sales y la naturaleza de la muestra de DNA. Se considera un minuto como tiempo suficiente de extensión para producir a 72oC hasta 2 Kb de producto. Sin embargo, tiempos de extensión más largos pueden ayudar en los primeros ciclos si la concentración de sustratos es muy baja y en los últimos ciclos cuando la concentración de productos sobrepasa la concentración de enzimas. Tiempo y Temperatura de desnaturalización: La mayor causa de los fallos de un PCR lo constituyen la desnaturalización incompleta de la muestra y/o los productos del PCR. las condiciones tópicas de desnaturalización son 30 seg. a 95oC o 15 seg. a 97oC, aunque pudieran utilizarse temperaturas mas altas especialmente en muestras con regiones ricas en G+C. La desnaturalización del DNA a la temperatura de separación de las cadenas (Tss) ocurre en pocos segundos, sin embargo, llegar a Tss en el interior del tubo puede tomar algun tiempo. Debe monitorearse la Temperatura dentro de un tubo de reacción utilizando una "sonda termopar de baja masa" . La desnaturalización incompleta permite que el DNA se renaturalice y esto reduce el rendimiento de productos, por otra parte, etapas de desnaturalización que sean muy largas o a muy altas temperaturas llevan a la pérdida innecesaria de la actividad enzimática. El tiempo de vida media de la actividad de la Taq polimerasa es menor de 2 horas a 92.5oC, de 40 min. a 95oC y de 5min. a 97.5oC. Número de Ciclos: Depende principalmente de la concentración inicial de la muestra de DNA cuando se han optimizado el resto de los parámetros. Un error común es ejecutar muchos ciclos. Demasiados ciclos pueden incrementar la cantida y complejidad de los productos inespecíficos de fondo. Por supuesto muy pocos ciclos darían un bajo rendimiento de productos. Tómese la siguiente tabla de Número de Ciclos vs. concentración inicial de muestra como una guía. Número de moléculas de Muestra Número de ciclos 3 x 105 25 - 30 1.5 x 104 30 - 35 103 35 - 40 50 40 - 45