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INHIBIDORES
• Moléculas que disminuyen la V de reacción enzimática
ƒ Afectan a la cinética de reacción al interferir con:
INHIBICIÓN ENZIMÁTICA
- La formación del complejo ES
- Con su disociación
TEMA 11
- Con ambos procesos a la vez
• Existen varios mecanismos. Veremos los efectos
que producen sobre Enzimas de cinética M-M
TIPOS DE INHIBICIÓN
Inhibiciones reversibles
Inhibiciones irreversibles
1.- INHIBICIÓN COMPETITIVA
2.- INHIBICIÓN NO COMPETITIVA
3.- INHIBICIÓN ACOMPETITIVA Ó INCOMPETITIVA
4.- INHIBICIÓN POR SUSTRATO
• Unión no covalente del I,
no altera la estructura del
E. Al desaparecer, se
recupera la actividad
catalítica
• Unión covalente del
I, altera la estructura
del E de forma
definitiva
•Tipos 1; 2; 3
1
Inhibición Reversible (IR)
La IR puede afectar a Vmax ó Km ó a ambas a la vez
1.- INHIBICIÓN COMPETITIVA.
Si sólo afecta Km
IR Competitiva
• El I compite directamente con un sustrato por un
sitio de fijación enzimático ( centro activo del E)
Si sólo afecta Vmax
IR No-Competitiva
• Se parece al S ( forma y tamaño similares = isóstero)
Si afecta tanto a Km y a Vmax
IR Acompetitiva
IR Mixta
• No es reactivo ( si lo fuera sería un S alternativo
competitivo)
1.- INHIBICIÓN COMPETITIVA.
Modelo General
A. Compitiendo con el sustrato por
el sitio de unión al centro activo
S
Enzima
E +S
ES
E+P
+
S
I
Ki
I
Enzima no activa
Ki ´
EI
+S
No hay
reacción
2
B. Modificando la conformación del centro activo
El grado de inhibición competitiva depende de la
fracción de E que se una al I
de modo que impida la unión del sustrato
K1
E +S
K2
+
K3
E+P
I
S
Ki ´
Ki
Enzima
No hay
reacción
I se une de forma reversible al E y está rápidamente en
equilibrio con ella
EI es catalíticamente inactivo
I
EI
S
Enzima no activa
KI =
• La v de formación EI será igual a la v de descomposición
[E] [I]
en el
KI =
Ki= [I] [E]= Ki´[EI]
KI= Ki´/ Ki
equilibrio
[EI]
• Puede ser superada a >> [S]
• El I competitivo ↑ valor aparente de Km : para
obtener la misma v de reacción se necesita > [S]
α=1+
[I] es la concentración de inhibidor
KI es la cte de disociación para el complejo EI
Km ap es la Km observada en presencia de I
[E] [I]
[EI]
+S
KI es la cte de disociación o cte de
equilibrio de fijación de I a E
Inhibidor competitivo reduce la concentración de
E libre disponible para la unión del sustrato
Ecuación de Michaelis- Menten para reacción
inhibida competitivamente
cte de disociación
• Inhibición mas potente cuanto < KI
Km ap = Km (1 + [I]/KI)
ES
Se deduce como antes (M-M) pero con un término
adicional que representa la fracción de [E]T que une a I
para formar EI
[E]T = [E] + [ES] + [EI]
[I]
KI
V0 =
Vmáx [S]
α Km + [S]
α=1+
resulta
[I]
KI
α Km = Kmap
3
1.- INHIBICIÓN COMPETITIVA.
Reacción de M-M
V0versus [S] en presencia de diferentes concentraciones de I
Valores crecientes de α
9 α , una función de concentración del I y su
afinidad por el E no puede ser < 1
9 Presencia de I hace que [S] parezca menor de lo que es
en realidad. Hace que Km parezca mayor de lo que es
en realidad como consecuencia de que la unión de I y
S al E es mutuamente excluyente
9 El aumento de [S] puede superar al I competitivo
α es el factor por el que [S] debe aumentar
para superar el efecto de la presencia del I
V0 ~ Vmáx para cualquier valor de α
(cualquier concentración del I)
9 El I no afecta el nº de recambio del E
9 Cuando [S] ~ ∞ ;
Gráfico Lineweaver-Burk
KI puede medirse
Vmax= Kcat [ET]
Vmáx [S]
V0 =
1
=
V0
Transformación en doble recíproca
α Km + [S]
α Km
1
Vmáx
[S]
+
1
α= 1 +
Vmáx
[I]
KI
Corresponde a gráfico de ecuación de una recta:
- Pendiente es α Km / Vmáx
- Intersección en el eje 1/[S] es – 1 / α Km
- Intersección en el eje 1/V 0 es 1/Vmáx
4
Ejemplos
-OOC-CH
2-CH2
-COO-
succinatoDH
Succinato
succinatoDH
Malonato
-OOC-CH
2-COO
-OOC-CH=CH-COO-
Fumarato
SIN REACCIÓN
-
Ibuprofeno inhibidor competitivo de la ciclooxigenasa,
interviene en la respuesta inflamatoria
Lehninger. 4ª Ed
Intoxicación por metanol
Estatinas inhiben enzima clave de la biosíntesis de colesterol
2.- INHIBICIÓN NO COMPETITIVA.
ADH
• No existe competitividad entre S y el I
• I no tiene relación estructural con S
ceguera
• I se une al E en sitio diferente al que lo hace el S ( en
un lugar no activo, diferente al centro activo del E)
• I no impide la unión del S. Pudiéndose unir
simultáneamente al E tanto el S como el I
ADH
• I inactiva el E tanto si el S está presente como si no =
distorsiona el sitio activo del E reduciendo su poder
catalítico
5
Inhibidores reversibles
Inhibición no competitiva. Esquema de reacción
K1
2. No competitivos
Se puede unir tanto a la enzima libre como al complejo
enzima-sustrato
E + S
K2
+
I
ES
Enzima
I
I
EI
EI
I
S
K´I
ESI
No hay reacción
I
El I puede unirse al E libre
EIS
E + P
+
I
KI
S
K3
ES
El I puede unirse al complejo ES
E+I
ES + I
EI
ESI
Enzima no activa
Inhibición no competitiva. Esquema de reacción
• Vmáx disminuye en proporción a un factor α = 1 + [I] / K´I
• Km permanece inalterable porque el E se une a S con la
misma afinidad
• K´I es la cte de equilibrio de disociación del complejo
ESI
6
Inhibición no competitiva. Esquema de reacción
Inhibición no competitiva. Esquema de reacción
• Representación de las inversas para obtener la
ecuación de Lineweaver-Burk, se transformará en:
a) Considerando el caso mas sencillo en que KI = K´I
(se disocian a igual velocidad EI y ESI)
• Aplicando las mismas consideraciones que en la Inhib.
Competitiva
[I]
1
1
1+
=
KI
V0
Vmáx
[E]T = [E] + [ES] + [EI] + [ESI]
• Expresión de la Ecuación de M-M como:
V0 =
Vmáx [S]
[I]
[I]
+ 1+
1+
KI
KI
Km
+ [I]
[S]
[I]
α (Km + S)
[I] = 0, Pendiente = Km / Vmáx
- 1 / Km
[S]
[I]
KI
2.- INHIBICIÓN NO COMPETITIVA MIXTA.
b) Considerando el caso en que KI ≠ K´I
(se tendrá que considerar las dos ctes de disociación)
• La Km se verá afectada por α y α´
1 / Vmáx
Vmáx ap
1
KI
• La Vmáx, se modifica, disminuye (la E menos eficiente
con I)
Vmáx ap
KI
[I]
• El punto de corte es el mismo en presencia o ausencia de
I, lo que justifica que no se modifica la Km
Vmáx [S]
Sin I
1+
• La recta corta al eje de las abcisas en su lado negativo
KI
[I] creciente, Pendiente = Km / Vmáx 1 +
1/v
1 / Vmáx 1 +
=
[I]
α=1+
+ Km
Vmáx
α=1+
1/[S]
• Para calcular Vmáx se debe obtener el punto de
corte de la recta al eje 1/V.
• Al aumentar [I] aumenta el valor de 1 / Vmáx 1 +
ya que es el inverso de Vmáx
[I]
α´ = 1 +
KI
[I]
K´I
• La ecuación de M-M:
[I]
KI
V=
Vmáx [S]
α Km + α´ S
=
Vmáx [S]
α
α´
Km + S
7
2.- INHIBICIÓN NO COMPETITIVA MIXTA.
2.- INHIBICIÓN NO COMPETITIVA MIXTA.
• La ecuación de las inversas en:
Con I
1/V
1
V
=
α Km
1
Vmáx
S
α´
+
Vmáx
1
[I]
1+
K´I
Vmáx
• Representación gráfica daría un conjunto de rectas que
se cortan al lado izdo del eje 1/V
=
α´
[I] creciente
Pendiente = Km / Vmáx
.α
Sin I
Pendiente = Km / Vmáx
Vmáx
1/Vmáx
• Se modifican las Vmáx y las Km
• Se denomina mixta porque se modifican las dos
• Probablemente el I se una a sitios relacionados con la
catálisis (modificandola) y repercusión en la fijación del
S a ese lugar
-
α´
α Km
1/[S]
Se denomina Mixta porque se modifican Vmáx y Km
Si KI< K’I
Lehninger. 4ª Ed
8
3.- INHIBICIÓN ACOMPETITIVA Ó INCOMPETITIVA.
• El I se fija directamente al complejo ES, pero no a la E libre
• La etapa de fijación de I presenta una cte de disociación
K´I
K1
E + S
• Se modifica Km y Vmáx
K2
• Se forma un compuesto terminal ESI
K1
E + S
K2
E + P
K´I
ESI
K3
ES
K3
ES
+
I
E + P
K´I =
+
I
[ES] [I]
[ESI]
ESI
No hay reacción
K´I
[ES] + [I]
Ki= [ES][I]=Ki´[ESI]
K´I
No hay reacción
Km =
[ESI]
[E] [S]
[ES]
[E] = Km [ES]
[S]
Ki´/Ki = KI´
Deducción de la Ecuación M-M
• El I, que no tiene que parecerse al S provoca una
distorsión del sitio activo del E que conduce a una
inactivación del mismo
• Se fija en sitio ≠ de S
• La presencia de I altera tanto la Vmáx y la Km
[ET] = [E] + [ES] + [ESI]
[ET] =
Km [ES]
[S]
[ES][I]
+ [ES] +
[ET] = [ES] Km + 1 + [I]
K´I
[S]
[ES] =
[ET]
Km
[I]
+ 1 +
[S]
K´I
v = K3 . [ES]
Sacando factor común [ES]
K´I
Despejando [ES]
(a)
Sustituyendo en (a)
9
v =
Vmáx
=
Km + 1 + [I]
[S]
K´I
K3 E T
Km + 1 + [I]
[S]
K´I
=
Vmáx . [S]
Km + [S] 1+
[I]
Vmáx . [S]
v =
K´I
α´
1
v
v =
Vmáx . [S]
1
Km + α´ [S]
v
1
v
=
=
=
Expresando en forma de inversos:
Km + α´[S]
Km + α´ [S]
Vmáx . [S]
Km
Vmáx . [S]
+
α´ [S]
Vmáx . [S]
1
1 α´ Km
+
Vmáx Vmáx [S]
La pendiente con I es igual que sin I: Km/Vmáx
Vmáx ap =
Kap =
Vmáx
[I]
1 + K´
I
Km
1 + [I]
K´I
Para las
tres rectas
-1/Km
10
Resumen de los distintos tipos de inhibiciones con
enzimas de comportamiento cinético M-M
Resumen de los distintos tipos de inhibiciones con
enzimas de comportamiento cinético M-M
Tipo de inhibición
Kmap
Ninguna
Vmáx
Competitiva
Vmáx
No competitiva
(mixta)
Vmáx
1 + [I]
K´I
Km . 1 + [I]
KI
=α
1 + [I]
Km
KI
1 + [I]
= α´
K´I
Vmáx
1 + [I]
K´I
Km
1 + [I]
K´I
Incompetitiva
4.- INHIBICIÓN POR SUSTRATO.
Vmáxap
Km
=α
4.- INHIBICIÓN POR SUSTRATO.
• 2 Hipótesis:
Las E pueden inhibirse por [S] altas
Representación de la cinética en forma acampanada
Representación linealizada ó de dobles recíprocos no
dá una línea recta
V
1ª. E puede disponer de 2 lugares de unión para el
mismo S:
- el sitio catalítico y
- el de inhibición
2ª. E adopte 2 configuraciones diferentes reversibles
entre sí. :
1/V
-activa (Ea)
- inactiva (Ei)
[S]
1/[S]
11
4.- INHIBICIÓN POR SUSTRATO.
2ª Hipotesis
El S se une indistintamente a una u a otra forma.
Solo se transformará en P cuando está unido a Ea
Ej: catálisis de la hexoquinasa de cerebro
hexoquinasa
Glucosa-6-fosfato + ADP
P + Ea
Ea
+
<S
Ei
+
>S
EaS
EiS
• Si el E está libre en citoplasma ⇒ inhibida por uno de los
sustratos (G-6-P)
• Si el E está unido a la pared externa de mitocondria ⇒ no
inhibida
• Inhibidores de la DHFR. Antifolatos
INHIBIDORES ENZIMÁTICOS COMO AGENTES
QUIMIOTERAPEUTICOS
•
ATP + Glucosa
ametopterina
METOTREXATO/ AMINOPTERINA
NH2
COOH
N
Como análogos estructurales del S bloquean la acción
enzimática específica
N
H 2N
Ej: Metotrexato (ametopterina), agente anticanceroso.
Inhibidor competitivo
parecido químicamente al dihidrofolato (DHF
CONH
N
R
N
COOH
N
hasta 10000 veces mayor afinidad por la enzima
NH2
OCH3
N
TRIMETOPRIM
DHF reductasa
DHF
THF
H2N
Ác. timidilico (dTMP)
Bacteriostáticos.inhiben la sintesis de
acido folico bacteriano
OCH3
N
OCH3
DNA
OCH3
NH2
TRIMETREXATO
R=H
H2N
CH3
N
R
N
N
OCH3
OCH3
12
INHIBICIÓN REVERSIBLE EN ENZIMAS BISUSTRATO
• E bisustrato, posee 2 sitios de fijación de S distintos
• Mecanismo de inhibición mas complejo
• En E reversibles bisustrato se producen ≠ situaciones
- Inhib. Competitiva
- Inhib. Acompetitiva
- Inhibición no competitiva
a) E, S1 y S2
b) Fijación ordenada.
- S1 y S2 pueden fijarse aleatoriamente ó al azar.
- I para uno de los sustratos (ej. para S2)
+
S1 +
+
I
Solo se une a ES1
S1
ES1
S2
I
+
S2
Inhibición acompetitiva
Inhibición competitiva
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c) forma ordenada
I se puede unir al E directamente ó al complejo ES1
INHIBIDORES IRREVERSIBLES
• Bloquean o destruyen definitivamente el E
+
+
I
S1
• Enlace covalente entre el E y el I irreversible
EI
+
+
S1
• Su disociación es muy lenta ( ligazón muy fuerte)
I
ES1
Inhibición no competitiva
INHIBIDORES IRREVERSIBLES
1º Grupo: Unión al centro activo con bloqueo irreversible
del E
• Clasificación
Ejemplos:
-1º grupo: Unión al centro activo con bloqueo
irreversible del E
• Acetil colinesterasa
• Gases neurotóxicos (sarin ) e insecticidas (malatión)
-2º grupo: Análogos del estado de transición
Acetilcolina
- 3º grupo: Inhibidores suicidas
Cuadro de
estimulación
permanente
Parálisis muscular
Tetania
14
ACh + enzima (Acetilcolinesterasa) ------> Colina +
Acetilcolinesterasa acetilada
2º Grupo. Análogos del estado de transición
• El I debe parecerse al estado de transición del S
Acetilcolinesterasa acetilada + H2O ------> Acetilcolinesterasa
+ ácido acético
O
O2N
O
-
O2N
C
H3C
N+ CH3
O
C
O
Ser CH CH2
H 3C
N+ CH3
O
OH
+
-
O-
O
O2N
O
HO
P
O
C
H3C
F
N+ CH3
Productos
CH3
H3C
N+ CH3
CH3
Ser CH CH2
H3 C
O
Análogo de
estado de transición
H3C
OH
Estado de transición
CH3
O
O2N
Compuestos organofosforados
Sustrato
CH3
O-
O
• Ej: DFP ó DIFP = diisopropil fluorofosfato
- actúan como inhibidores competitivos
CH3
CH
O P O
H3C
CH
CH3
P O
CH
H3 C
CH3
DIFP:
diisopropil
fluorofosfato
CH3
CH
- Actúan sobre enzimas serínicas
(Acetilcolinesterasa)
- Únicamente sobre la Ser activa
- Insecticidas Organofosfóricos:
Parathion, Malathion
- Gases neurotóxicos (sarin)
15
diisopropil fluorofosfato
Inhibición enzimatica irreversible
3º Grupo. Inhibidores suicidas = Inactivadores basados en
el mecanismo de reacción enzimática
• Poco reactivos hasta que se unen al sitio activo del E
Modo de acción de los inhibidores suicidas
E+I
1
EI
2
EI*
3
E’ + I*
• Utilizan el m. de reacción enzimática para inactivar el E
• Papel central en el diseño de nuevos fármacos y
• Pocos efectos secundarios.
Tienen por tanto:
a) la especificidad del inhibidor competitivo y
b) la potencia de los inhibidores irreversibles
1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el sustrato o un
inhibidor competitivo convencional
2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I
en una especie altamente reactiva I*
3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándola
de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.
16
Penicilina (activa)
Ejemplos de inhibidores suicidas(1)
S
R CO NH
- Sistema de la β-lactamasa bacteriana
CH3
CH3
N
O
La utilización masiva de antibióticos b-lactámicos (penicilinas,
sus derivados semisintéticos y cefalosporinas) ha conducido a
la aparición de resistencias a los mismos.
Los microorganismos resistentes a estos antibióticos lo son por
producir una enzima, la b-lactamasa, que inactiva a los antibióticos β-lactámicos.
COO-
β-Lactamasa
R CO NH
O C HN
O-
S
CH3
CH3
COO-
Ác.peniciloico (inactivo)
Muy a menudo los preparados de penicilinas o penicilinas
semisintéticas se formulan añadiendo un inhibidor suicida
de la β -lactamasa, el ácido clavulánico
O
CH2OH
C
N
O
β-Lactamasa
H
O
O
C
O
CH2OH
C
HN
H
COO-
Ác.clavulánico
CH2OH
C
HN
H
- Sistema de la monoamino oxidasa (MAO) cerebral
encargadas de la degradación de ciertos neurotransmisores
O
C
O-
COO-
CH CH2
Ser
O
Ejemplos de inhibidores suicidas(2)
Esta molécula
reacciona con la
serina activa de la
β-lactamasa,
produciendo su
inactivación
La inhibición de la monoamino oxidasa se emplea como
terapéutica de los estados depresivos. Se han
desarrollado muchos inhibidores suicidas de la MAO
-
COO
17
18