AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE CEPAS BACTERIANAS

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE CEPAS BACTERIANAS
CON POTENCIAL ANTAGÓNICO PARA EL CONTROL BIOLÓGICO
DE Fusarium oxysporum (SCHLECHT) EN CULTIVOS DE
UCHUVA (Physalis peruviana L.) EN CIÉNEGA, BOYACÁ
(COLOMBIA)
Bióloga. DEISY LISSETH TOLOZA MORENO
Código: 01119733
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
MAESTRÍA EN CIENCIAS-MICROBIOLOGÍA
BOGOTÁ, COLOMBIA
2014
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE CEPAS BACTERIANAS
CON POTENCIAL ANTAGÓNICO PARA EL CONTROL BIOLÓGICO
DE Fusarium oxysporum (SCHLECHT) EN CULTIVOS DE
UCHUVA (Physalis peruviana L.) EN CIÉNEGA, BOYACÁ
(COLOMBIA)
Bióloga. DEISY LISSETH TOLOZA MORENO
Código: 01119733
Trabajo de investigación presentado como requisito para optar al título de
Magister en Ciencias-Microbiología
Director
Ph. D. LUZ MARINA LIZARAZO FORERO
Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia
Codirector
Ph. D. DANIEL URIBE VÉLEZ
Instituto de Biotecnología-Universidad Nacional de Colombia
Línea de investigación:
Microbiología Ambiental
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
MAESTRÍA EN CIENCIAS-MICROBIOLOGÍA
BOGOTÁ, COLOMBIA
2014
A mis padres, por la maravillosa oportunidad
de la vida, y por su inmenso amor
incondicional.
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por hacer de la naturaleza una ciencia aún por explorar.
A mis padres y hermana, que con su comprensión y apoyo incondicional me permitieron
culminar con éxito y con gran satisfacción esta nueva etapa de mi vida.
A la profesora Luz Marina Lizarazo Forero por su colaboración, confianza y aportes, y por
la oportunidad de llevar a cabo este proyecto dentro del Grupo de Investigación Biología
Ambiental.
Al profesor Daniel Uribe Vélez, por cada una de sus orientaciones y sus valiosas
contribuciones a esta investigación, por todo el apoyo, comprensión y el interés mostrado
durante la ejecución de este proyecto.
Al profesor Jorge Orlando Blanco, por su amistad, sus valiosas enseñanzas, el apoyo
moral y la colaboración brindada durante el desarrollo de esta investigación, y por
incentivar en mí el aprecio por la fitopatología.
Al señor Jairo Hernández, representante legal de la Asociación de Productores de
Ciénega-ASOPROCIEN-por el permiso y colaboración para la toma de muestras.
A los productores de uchuva de ASOPROCIEN por permitirme la toma de muestras.
Al Ingeniero Agrónomo Fernando Becerra por su colaboración y acompañamiento en
campo.
Al Departamento de Ciencia, Tecnología e Innovación-Colciencias- y a la Dirección de
Investigaciones de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, por la beca
pasantía de Joven Investigador mediante la cual llevé a cabo las primeras fases de este
proyecto.
A los docentes del Posgrado de la Maestría en Microbiología que me permitieron
continuar con mi formación profesional e investigativa.
A la profesora Martha Fontanilla por todas sus lecciones de vida y cada una de sus
enseñanzas.
A la Doctora Martha Isabel Gómez Álvarez de la Corporación Colombiana de
Investigación Agropecuaria-Corpoica, por facilitarme el producto biológico comercial
empleado en algunas de las etapas de la metodología.
Al Doctor Fernando Rodríguez de la Corporación Colombiana de Investigación
Agropecuaria-Corpoica, por su colaboración en la identificación molecular de algunas
cepas bacterianas.
A los doctores Adriana Bernal de la Universidad de los Andes y Germán Arbeláez de la
Universidad Nacional por la evaluación escrita y oral de la tesis y por sus valiosas
sugerencias y aportes.
A los doctores Gerard Fischer, Jairo Leonardo Cuervo y Germán Arbeláez Torres de la
Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional, y al doctor Pedro Jiménez de la
Universidad Militar Nueva Granada por su colaboración y orientaciones.
A Martha Parada, por estar siempre ahí y por su sincera amistad, y por toda su valiosa
colaboración en el análisis estadístico de los datos.
A Mónica Patiño, por las orientaciones dadas en algunas metodologías planteadas en
este proyecto.
A los integrantes del Laboratorio de Genética Molecular Vegetal de la Corporación
Colombiana de Investigación Agropecuaria-Corpoica, por su gran apoyo y aportes.
A mis grandes amigos, David Hernández, Angela Vianchá, Lorena Albarrán, Gina
Garzón, Jaime Castillo y Estevan López por todo su apoyo moral y físico, y por cada uno
de los momentos llenos de risas que fueron fundamentales para no desfallecer en varios
instantes de la ejecución de este trabajo.
A mis compañeros de la maestría, por el cariño, los momentos de acogimiento y todas
las enseñanzas, en especial a Yara, Melissa, Viviana y Liliana.
A Socorrito Prieto, por todo su apoyo, cariño y amistad, y por tener siempre la palabra
precisa y el consejo adecuado a cada situación.
A las niñas de los laboratorios de la UPTC, quienes siempre me brindaron su
colaboración incondicional.
A todas aquellas personas que de una u otra forma contribuyeron para que este trabajo
terminará con éxito.
Contenido
VII
_______________________________________________________________________________________________________________________________
CONTENIDO
LISTA DE FIGURAS
X
LISTA DE TABLAS
XII
LISTA DE ANEXOS
XIII
LISTA DE ABREVIATURAS
XIV
RESUMEN
XV
INTRODUCCIÓN
1
1.
4
MARCO TEÓRICO
1.1
UCHUVA (Physalis peruviana L.)
4
1.1.1
Ciclo del cultivo y propagación
5
1.1.2
Mercado interno de la uchuva
5
1.1.3
Enfermedades limitantes de la uchuva
6
1.1.4
Hongo fitopatógeno Fusarium oxysporum
6
1.2
CONTROL BIOLÓGICO
9
1.2.1
Rizósfera y Bacterias Promotoras de Crecimiento Vegetal (PGPR)
10
2.
JUSTIFICACIÓN
12
3.
OBJETIVOS
15
3.1
OBJETIVO GENERAL
15
3.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
15
4.
MATERIALES Y MÉTODOS
16
4.1
ÁREA DE ESTUDIO
16
4.2
AISLAMIENTO DE LAS BACTERIAS CON CAPACIDAD ANTAGÓNICA
FRENTE A F. oxysporum ASOCIADAS A LA RIZÓSFERA DE PLANTAS DE
Physalis peruviana
16
4.2.1
Selección de plantas
16
Contenido
VIII
_______________________________________________________________________________________________________________________________
4.2.2
Toma de muestras en campo
17
4.2.3
Aislamiento y caracterización de F. oxysporum
17
4.2.3.1. Pruebas de patogenicidad de aislamientos de F. oxysporum
18
4.2.3.2. Conservación del fitopatógeno
19
4.2.3.3. Análisis estadístico de las pruebas de patogenicidad
19
4.2.4
Aislamiento de rizobacterias antagonistas contra F. oxysporum
20
4.3
SELECCIÓN DE LAS BACTERIAS CON CAPACIDAD ANTAGÓNICA
CONTRA Fusarium oxysporum EN CONDICIONES in vitro
21
4.3.1
Pruebas de antagonismo in vitro
21
4.3.1.1. Prueba de antagonismo in vitro mediante enfrentamiento dual I
21
4.3.1.2. Prueba de antagonismo in vitro mediante enfrentamiento dual II
22
4.3.2
Análisis estadístico de las pruebas de antagonismo in vitro
22
4.3.3
Conservación de los antagonistas bacterianos de F. oxysporum
23
4.4
IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA Y MOLECULAR DE
LAS BACTERIAS CON MAYOR CAPACIDAD ANTAGÓNICA CONTRA
Fusarium oxysporum
23
4.4.1
Caracterización bioquímica de las bacterias con mayor capacidad antagónica
contra Fusarium oxysporum
24
4.4.1.1. Producción de metabolitos secundarios
24
4.4.2
Análisis estadístico de las características bioquímicas de las bacterias
antagónicas
26
4.4.3
Identificación molecular de las bacterias con mayor potencial antagónico contra
F. oxysporum
26
4.5
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTAGÓNICA DE LAS BACTERIAS
SELECCIONADAS CONTRA F. oxysporum BAJO CONDICIONES DE
INVERNADERO EN PLÁNTULAS DE UCHUVA
27
4.5.1
Pruebas de compatibilidad entre las bacterias más antagónicas
27
4.5.2
Pruebas de antagonismos in vivo
27
Contenido
IX
_______________________________________________________________________________________________________________________________
5.
RESULTADOS
29
5.1
FINCAS DE ESTUDIO
5.2
AISLAMIENTO DE LAS BACTERIAS CON CAPACIDAD ANTAGÓNICA
FRENTE A Fusarium oxysporum ASOCIADAS A LA RIZÓSFERA DE
PLANTAS DE Physalis peruviana
29
5.2.1
Aislamiento de morfotipos de F. oxysporum
30
5.2.2
Pruebas de patogenicidad de F. oxysporum
30
5.2.3
Aislamiento de rizobacterias antagonistas contra F. oxysporum
36
5.3
SELECCIÓN DE LAS BACTERIAS CON CAPACIDAD ANTAGÓNICA
CONTRA Fusarium oxysporum EN CONDICIONES in vitro
37
5.4
IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA Y MOLECULAR DE
LAS BACTERIAS CON MAYOR CAPACIDAD ANTAGÓNICA CONTRA
Fusarium oxysporum
42
5.4.1
Caracterización bioquímica de las bacterias con mayor potencial antagónico contra F.
oxysporum
42
5.5
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTAGÓNICA DE LAS BACTERIAS
SELECCIONADAS CONTRA Fusarium oxysporum BAJO CONDICIONES DE
INVERNADERO EN PLÁNTULAS DE UCHUVA
48
6.
DISCUSIÓN
29
54
CONCLUSIONES
63
RECOMENDACIONES
64
BIBLIOGRAFÍA
65
ANEXOS
77
Contenido
X
_______________________________________________________________________________________________________________________________
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Prueba de antagonismo in vitro mediante enfrentamiento dual II.
22
Figura 2. Escala de severidad de la marchitez vascular causada por F. oxysporum en
plántulas de Physalis peruviana.
31
Figura 3. Germinación de las esporas del fitopatógeno F. oxysporum.
32
Figura 4. Incidencia de la enfermedad a través del tiempo de evaluación de los
morfotipos de F. oxysporum inoculados en las plántulas de uchuva.
34
Figura 5. Severidad de la enfermedad a través del tiempo de evaluación de los
morfotipos de F. oxysporum inoculados en las plántulas de uchuva.
36
Figura 6. Inhibición generada por las bacterias endófitas de la raíz y aisladas de suelo
rizosférico de plantas de uchuva sobre el crecimiento micelial de F. oxysporum (Fox17)
empleando la prueba de antagonismo in vitro mediante enfrentamiento dual I.
38
Figura 7. Porcentaje de inhibición del crecimiento micelial de F. oxysporum (Fox17)
originado por las bacterias antagonistas empleando la prueba de antagonismo in vitro
mediante enfrentamiento dual I.
39
Figura 8. Inhibición generada por las bacterias endófitas de la raíz y las aisladas de
suelo rizosférico de plantas de uchuva sobre el crecimiento micelial de F. oxysporum
(Fox17) empleando la prueba de antagonismo in vitro mediante enfrentamiento dual II. 40
Figura 9. Porcentaje de inhibición del crecimiento micelial de F. oxysporum (Fox17)
originado por las bacterias antagonistas empleando la prueba de antagonismo in vitro
mediante enfrentamiento dual II.
41
Figura 10. Correlación de las dos pruebas de antagonismo in vitro mediante
enfrentamiento dual entre las bacterias antagonistas y el morfotipo Fox17 de F.
oxysporum.
42
Figura 11. Producción de ácido 3-indol acético (AIA) por los antagonistas bacterianos de
F. oxysporum.
43
Figura 12. Índice de solubilización de fosfatos por los antagonistas bacterianos de F.
oxysporum.
44
Contenido
XI
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Figura 13. Producción de glucanasas por los antagonistas bacterianos de F. oxysporum.
45
Figura 14. Producción de biosurfactantes por los antagonistas bacterianos de F.
oxysporum.
46
Figura 15. Porcentaje de inhibición del crecimiento de F. oxysporum por producción de
compuestos volátiles orgánicos por los antagonistas bacterianos.
47
Figura 16. Análisis de Componentes Principales (ACP) para el agrupamiento de las
rizobacterias antagonistas del morfotipo Fox17 de F. oxysporum de acuerdo a su similitud
en las características bioquímicas evaluadas.
47
Figura 17. Área Bajo la Curva de Progreso de la Enfermedad (AUDPC) a partir de la
capacidad antagónica in vivo de las rizobacterias contra el morfotipo Fox17 de F.
oxysporum a través del tiempo de evaluación en plántulas de uchuva.
51
Figura 18. Incidencia de la enfermedad a partir de la estimación de la capacidad
antagónica in vivo de las rizobacterias contra el morfotipo Fox17 de F. oxysporum a
través del tiempo de evaluación en plántulas de uchuva.
52
Contenido
XII
_______________________________________________________________________________________________________________________________
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Escala ordinal de severidad de la enfermedad empleada para las pruebas de
patogenicidad.
19
Tabla 2. Características físicas del suelo de las fincas evaluadas.
29
Tabla 3. Aislamiento de morfotipos de F. oxysporum por finca de muestreo.
30
Tabla 4. Porcentaje de germinación de las esporas de los morfotipos de F. oxysporum
evaluados en plántulas de uchuva.
33
Tabla 5. Incidencia y severidad de la enfermedad de los morfotipos de F. oxysporum
inoculados en las plántulas de uchuva al día 35 de evaluación.
35
Tabla 6. Aislamientos bacterianos endófitos de la raíz y asociados a suelo rizosférico en
las tres fincas de estudio.
37
Tabla 7. Incidencia y severidad de la enfermedad en las plántulas de uchuva inoculadas
con las rizobacterias antagonistas del morfotipo Fox17 de F. oxysporum.
50
Contenido
XIII
_______________________________________________________________________________________________________________________________
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Bacterias endófitas de la raíz (ER) y aisladas de suelo rizosférico (SR) con
mayor capacidad antagónica contra Fusarium oxysporum (Fox17) en plantas de uchuva.
77
Anexo 2. Características bioquímicas de las bacterias con mayor capacidad antagónica
contra Fusarium oxysporum (Fox17) en plantas de uchuva.
78
Contenido
XIV
_______________________________________________________________________________________________________________________________
LISTA DE ABREVIATURAS
ACB: Agentes de Control Biológico
AIA: Ácido 3-indol acético
ALB: Agar Luria Bertani
AN: Agar Nutritivo
ASOPROCIEN: Asociación de Productores de Ciénega
ATS. Agar Tripticasa de Soya
AUDPC: Área Bajo la Curva de Progreso de la Enfermedad
BHI: Caldo Brain Heat Infusion
C.Abs: Control Absoluto
C.Pos: Control Positivo
C.PosC: Control Positivo Comercial
CLA: Agar Hoja de Clavel
CLB: Caldo Luria Bertani
NaCl: Solución Salina
PDA: Agar Papa Dextrosa
PGPR: Rizobacterias Promotoras de Crecimiento Vegetal
PI: Período de Incubación
SNA: Agar Spezieller Nährstoffarmer
Resumen y Abstract
XV
_______________________________________________________________________________________________________________________________
RESUMEN
La marchitez vascular causada por el fitopatógeno Fusarium oxysporum, es la
enfermedad más limitante en la producción de uchuva (Physalis peruviana L.). Para su
control, se han utilizado fungicidas en exceso con principios activos recalcitrantes para el
ambiente que dejan trazas en las frutas ocasionando devoluciones de exportación y por
ende, grandes pérdidas económicas. A su vez, se ha aumentado la resistencia del hongo
desarrollando una mayor persistencia en el suelo, por lo que actualmente, se busca el
desarrollo de estrategias efectivas y ecológicamente seguras basadas en una
combinación de prácticas de control entre las que se incluye el uso de agentes
biocontroladores. Con esta investigación se aislaron y caracterizaron bioquímicamente
cepas bacterianas con capacidad antagónica contra F. oxysporum en plantas de uchuva
en Ciénega (Boyacá). Se caracterizaron morfotipos de F. oxysporum aislados de plantas
sintomáticas, los cuales se evaluaron a partir de pruebas de patogenicidad y se
determinó el morfotipo más virulento. Las bacterias fueron aisladas del interior de la raíz
y de suelo rizosférico de plantas seleccionadas aleatoriamente en campo, y su capacidad
antagónica fue evaluada bajo condiciones in vitro usando la técnica de enfrentamiento
dual frente al morfotipo más virulento Fox17 de F. oxysporum, con el fin de seleccionar
las cepas con mayor efecto biocontrolador y caracterizar su capacidad funcional a partir
de la producción de metabolitos secundarios. Se seleccionaron 24 bacterias antagónicas
Gram positivas y Gram negativas de los géneros Bacillus, Enterobacter y Pseudomonas
principalmente, siendo las cepas Bacillus sp. MB015, Pseudomonas sp. MB108 y B.
licheniformis MB109 las más biocontroladoras a nivel in vitro con porcentajes de
inhibición del desarrollo del patógeno de 80.64, 79.94 y 79.33%, respectivamente, de las
cuales Pseudomonas sp. MB108 mostró una alta capacidad de producción de
glucanasas como posible mecanismo de acción para ejercer el antagonismo. En
condiciones in vivo, Ps. fluorescens MB103 y B. megaterium MB112 fueron las cepas con
mayor capacidad antagónica mostrando un 16.67% de incidencia de marchitez vascular,
mientras que E. amnigenus MB009, B. subtilis MB025 y Ps. fluorescens MB103 fueron
las más efectivas en reducción de la severidad de la enfermedad con Áreas Bajo la
Curva de Progreso de la Enfermedad (AUDPs) de 11.84, 10.79 y 7.53, respectivamente.
Con estos resultados, se planteó una alternativa de biocontrol para la marchitez vascular,
a partir de las bacterias con mayor capacidad antagónica contra F. oxysporum, causante
de grandes pérdidas en la producción de la uchuva.
Palabras clave: Antagonismo,
oxysporum, uchuva.
cepas
bacterianas,
control
biológico,
Fusarium
Resumen y Abstract
XVI
_______________________________________________________________________________________________________________________________
ABSTRACT
Vascular wilt caused by Fusarium oxysporum, is the most constraining disease in cape
gooseberry (Physalis peruviana L.) production. For its control, fungicides have been used
at excessive rates, with recalcitrant actives ingredients for the environment, which have
left traces on the fruits causing exports returns and therefore large economic losses. In
turn, the fungus resistance has increased its persistence in the soil, so currently, efforts
are being made to develop effective ecologically safe strategies based on a combination
of control practices, among which the use of biological control agents are included. In this
study, bacterial strains with antagonist activity against F. oxysporum in cape gooseberry
plants from Cienega (Boyaca) were isolated and biochemically characterized.
Morphotypes from F. oxysporum isolation of symptomatic plants were characterized by
pathogenicity test and most virulent morphotype was established. Root endophytic
bacteria and associated rhizospheric soil were isolated from gape gooseberry plants
selected randomly, and their antagonistic capacity was evaluated under conditions in vitro
applying the technique of dual cultivation against the most virulent morphotype Fox17 of
F. oxysporum, with the of aim selecting those strains with the best biocontrol effect and to
characterize their functional capacity of production of secondary metabolites. Twenty-four
Gram positive and Gram negative antagonist bacteria of the Bacillus, Enterobacter and
Pseudomonas genera were mainly selected, being the Bacillus sp. MB015, Pseudomonas
sp. MB108 and B. licheniformis MB109 the most biocontrol strains at an in vitro level with
percentage inhibition of pathogen development of 80.64, 79.94 and 79.33%, respectively.
Among them, Pseudomonas sp. MB108 showed the highest production of glucanase as a
possible mechanism of action to exert the antagonism. In vivo conditions, Ps. fluorescens
MB103 and B. megaterium MB112 strains showed the most antagonistic capacity with a
16.67% of vascular wilt incidence, while E. amnigenus MB009, B. subtilis MB025 y Ps.
fluorescens MB103 were most effectives strains at in reducing the disease severity with
areas under the disease of progress curve (AUDPC) of 11.84, 10.79, 7.53, respectively.
With these results, a biocontrol strategy for vascular wilt was proposed, from the bacteria
with the most antagonist capacity against F. oxysporum, a fungus that causes great
losses in cape gooseberry production.
Keywords: Antagonism, strains bacteria, biological control, Fusarium oxysporum, cape
gooseberry.
INTRODUCCIÓN
La uchuva (Physalis peruviana L.) ha tomado gran importancia en el país durante la
última década al convertirse en un producto frutícola exótico de exportación, muy
apetecido en los países europeos como Países Bajos y Alemania, ya que se le atribuyen
diferentes propiedades medicinales y también por sus características organolépticas.
Otros destinos de exportación son Canadá, Francia, Brasil, Bélgica, Estados Unidos,
Reino Unido y Suiza (Legiscomex, 2013). Actualmente, se cultivan tres tipos de uchuva
en el mundo, originarias de Colombia, Kenia y Sudáfrica. Colombia se ubica como el
primer productor mundial de uchuva debido a que el fruto presenta una mejor coloración
y un mayor contenido de azúcares, características que la hacen más apetecible en los
mercados internacionales (Fischer, 2005).
El cultivo de la uchuva ha pasado de ser silvestre a producirse en cultivos más
organizados y tecnificados aumentando su área cultivada en el país (Sanabria, 2005),
pasando de 35 hectáreas cosechadas en 1995, 792 ha entre el 2000 y 2004, y 841 ha en
el 2008. La productividad durante este período se incrementó en un 93.9%, pasando de
936 toneladas en 1995 a 15463 en el 2008 (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural,
2009b).
Sin embargo, el cultivo y la postcosecha de la uchuva pueden ser afectadas por diversas
plagas y patógenos como hongos, bacterias y virus causantes de distintas enfermedades
que disminuyen los rendimientos y la calidad del producto final originando pérdidas de
fruta de gran importancia económica, ya que en muchos de los casos se estima que
éstas superan el 40% de la producción total (Bonilla et al., 2009). Entre estas
enfermedades, una de las más importantes por su difícil control es la marchitez vascular
causada por el hongo fitopatógeno Fusarium oxysporum, el cual origina clorosis,
marchitamiento y posterior muerte de la planta. Esta enfermedad, es considerada como
la más limitante del cultivo de uchuva en Colombia, siendo favorecida principalmente por
la siembra continua en un mismo terreno y/o por lotes mal drenados (Zapata et al., 2002).
El control de esta enfermedad así como de otras que se presentan en productos de
interés comercial es de gran importancia para obtener una buena rentabilidad y evitar
pérdidas económicas durante la cosecha (Raaijmakers et al., 2009). Sin embargo, para la
optimización del cultivo de uchuva, se ha requerido el empleo de productos químicos
tanto para el manejo de la fertilización como para el control de problemas fitosanitarios,
los cuales son aplicados en combinación en grandes cantidades. Lo anterior, debido en
parte al desconocimiento de los requerimientos nutricionales de la especie, la no
utilización de análisis de suelos, la falta de un conocimiento de los umbrales económicos
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
2
_______________________________________________________________________________________________________________________________
para el manejo de las poblaciones de plagas y enfermedades y la carencia de asistencia
técnica (Ramírez et al., 2008), lo que ha generado pérdidas del fruto de gran importancia
económica. Se considera que estas pérdidas frecuentemente también son favorecidas
por deficiencias en la detección y diagnóstico acertado de la enfermedad al no soportar
los resultados con análisis de laboratorio, lo que ha conllevado a hacer aplicaciones con
productos químicos que no corresponden y en dosis no establecidas para el cultivo
generando de esta forma, mayor contaminación ambiental y resistencia de los patógenos
(Bonilla et al., 2009).
Estos productos químicos, generan efectos negativos sobre el cultivo como fitotoxicidad,
aumento de patógenos resistentes a los agentes aplicados, contaminación del medio
ambiente (Ramírez et al., 2008), deterioro de la calidad de los suelos, debido en gran
parte a la pérdida de microorganismos nativos y a los desbalances nutricionales por
excesos o déficits en la aplicación de fertilizantes (Azcón and Barea, 1997), y un
incremento progresivo en los costos de producción por gastos adicionales en dichos
insumos. Adicionalmente, existen evidencias de residuos tóxicos en el fruto que afectan
la calidad e inocuidad del mismo ocasionando devoluciones de exportación de la uchuva
(Ramírez et al., 2008).
No obstante, la obtención de cultivos más competitivos y sostenibles y la demanda de
productos de alta calidad y libres de químicos se ha incrementado a nivel mundial, por lo
que durante las últimas décadas, se ha hecho necesaria la implementación de
tecnologías agrícolas efectivas para el control de enfermedades con un bajo impacto
ambiental sobre el ecosistema para cumplir con las exigencias del mercado internacional
de exportación de la uchuva (CCI, 2001). Entre estas, el empleo de productos de origen
biológico es uno de los mecanismos que puede favorecer la sostenibilidad de los
agroecosistemas (CCI, 2001, 2006), buscando de esta forma alternativas de control
biológico basadas en microorganismos asociados a las plantas, que presenten efectos
benéficos y que además actúen como antagonistas de patógenos, por ejemplo, mediante
la producción de aleloquímicos, y como inductores de respuestas fisiológicas de defensa
(Compant et al., 2005; Smith y Mesa, 2012). Asimismo, el uso de biofertilizantes en la
fruticultura garantiza la disponibilidad de nutrientes para la planta y mayor población
microbiana que ayude a la descomposición de la materia orgánica. Entre mayores sean
estos procesos microbianos benéficos en el suelo de un cultivo, mayor será la
productividad del mismo (Azcón and Barea, 1997).
Introducción
3
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Por lo anterior, el desarrollo de este trabajo de investigación ha permitido plantear una
estrategia de control biológico, mediante la evaluación, en condiciones in vitro e in vivo,
de la capacidad antagónica de las bacterias aisladas de la rizósfera de plantas de P.
peruviana, para un control efectivo de la marchitez vascular causada por el hongo
fitopatógeno F. oxysporum. Con la implementación en un futuro, de este sistema de
control se podrá mejorar la calidad del producto para exportación, y de esta forma
optimizar la competitividad del cultivo en el mercado internacional.
1.
1.1
MARCO TEÓRICO
UCHUVA (Physalis peruviana L.)
La uchuva (Physalis peruviana L.) es una planta arbustiva perteneciente a la familia
Solanaceae. El género Physalis, incluye más de 80 especies entre hierbas perennes y
anuales, comestibles y cultivadas, muchas silvestres y poco conocidas. De éstas,
algunas que tienen importancia económica son P. aikekengi, como ornamental y P.
peruviana, la más utilizada por su fruto azucarado. También los frutos de las especies P.
angulata, P. mínima, P. ixocarpa y P. pruinosa son comestibles (Medina, 1991).
P. peruviana es la más conocida de su género, y en Colombia, las plantas cultivadas se
registran como ecotipo Colombia (García et al., 2008). En este ecotipo se observa una
gran variabilidad morfológica entre las plantas, expresión clara de una alta variabilidad
genética. Por esta razón, las características de la fruta y los tiempos de cosecha
presentan una gran heterogeneidad. La planta cultivada alcanza hasta 1.50 m, y es
tutorada por los agricultores para mejorar las características de los frutos y las
condiciones del cultivo, presentándose distintos tipos de manejo dependiendo de la zona
(Fischer, 2000).
La uchuva es originaria en los Andes suramericanos (en la zona andina de Perú, Ecuador
y Colombia). Puede crecer como planta silvestre y semisilvestre, y en Colombia crece en
zonas altas entre los 1500 y 3000 msnm; sin embargo, los mejores cultivos se
encuentran a una altura entre los 1800 y los 2800 msnm, alta luminosidad, con una
temperatura promedio entre 13 y 18 °C, pluviosidad de 1000 a 2000 mm anuales,
humedad relativa de 70 a 80% y brillo solar de 2000 a 2800 horas. Asimismo, requiere de
suelos bien drenados de estructura granular y textura areno-arcillosa, con un pH entre
5.5 y 6.8 y altos contenidos de materia orgánica (Fischer, 2000; Miranda, 2005; Zapata,
2012). Actualmente, esta planta se encuentra en casi todos los altiplanos de los trópicos
y en varias partes de los subtrópicos (Fischer, 2000), y se considera apta para la
protección de terrenos erosionados y como pionera en suelos recientemente formados
debido a su rápido y expansivo crecimiento y a su habilidad de adaptación (Ligarreto et
al., 2005). La planta es susceptible a temperaturas extremas, las muy altas pueden
perjudicar la floración y la fructificación, y las nocturnas inferiores a 10 °C que se
presenten de manera constante, impiden que la planta prospere (Fischer, 2000).
La comercialización de la uchuva ha aumentado actualmente en el exterior por las
diferentes propiedades nutricionales y medicinales que su fruto posee (Ramírez et al.,
Capítulo 1
5
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2008). El fruto es una baya carnosa que mide entre 1.25 y 2.00 cm de diámetro
aproximadamente, con un promedio de 275 semillas, bicarpelar, se caracteriza por ser
semiácido, redondo, amarillo, dulce y pequeño, y se encuentra dentro de un capacho que
lo protege contra insectos, aves, patógenos y condiciones climáticas externas (Mazorra
et al., 2006; García et al., 2008). Presenta además, flores solitarias, pedunculadas, con
corola actinomorfa, gamopétala, de color amarillo. El color de la corola cambia de
amarillo a un amarillo pálido cuando se produce la fecundación (Mazorra et al., 2006).
1.1.1
Ciclo del cultivo y propagación
Principalmente, la uchuva se propaga sexualmente por semilla debido a su alta eficiencia
y bajo costo, para lo cual se requiere el desarrollo de semilleros que permitan su
germinación y su posterior trasplante a campo (Zapata et al., 2002). La producción de
uchuva se presenta durante todo el año, con épocas de mayor oferta entre octubre y
enero, y de menor oferta entre abril y julio, estacionalidad que se relaciona con la
variación de la demanda en los mercados europeos (Fischer, 2005).
En las zonas productoras, el período vegetativo se encuentra entre 6.0 y 7.5 meses,
dependiendo de la altura de la zona. El ciclo productivo inicia a partir del sexto al octavo
mes, contados a partir del semillero, alcanzando un tiempo total desde la propagación
hasta la cosecha de nueve meses y medio con una o dos recolecciones semanales,
hasta que se completa la vida útil del cultivo que es de aproximadamente dos años. En
algunas zonas de Cundinamarca se ha reportado una fase productiva de 18 meses,
mientras que en Boyacá esta fase comprende entre los 12 y 15 meses de producción
(Zapata et al., 2002; Bonilla et al., 2009).
1.1.2
Mercado interno de la uchuva
El Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural señala, para el año 2011, a Boyacá como
el primer departamento productor de uchuva en Colombia, representando el 59.0% de
producción en el mercado nacional con 388 hectáreas de cultivo de las 745 sembradas
en el país, una productividad promedio de 6354 toneladas y un rendimiento por hectárea
de 16376 kilogramos. Los departamentos de Antioquia y Cundinamarca ocupan el
segundo y tercer lugar a nivel nacional con 19.6% y 8.5%, respectivamente. En Boyacá,
el primer municipio productor es Arcabuco con el 30.0% de producción, seguido por
Ramiriquí con el 19.0% y Ciénega con el 18.9% (Ministerio de Agricultura y Desarrollo
Rural, 2012), municipio que para el año 2008 era el mayor productor de uchuva con un
31.2% del total de producción (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, 2009b).
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
6
_______________________________________________________________________________________________________________________________
1.1.3
Enfermedades limitantes de la uchuva
Los cultivos de uchuva pueden ser afectados por una gran diversidad de patógenos de
importancia económica que pueden atacar los diferentes órganos de la planta durante su
ciclo de producción. Las enfermedades más comunes en estos cultivos en las zonas
productoras del país son ocasionadas por hongos, siendo los responsables de las
mayores pérdidas en producción. Los síntomas visibles se localizan principalmente en el
área foliar de la planta y su manejo consiste en la aplicación de fungicidas en
combinación con buenas prácticas agrícolas. Otras enfermedades son ocasionadas por
bacterias que afectan los distintos órganos de la planta en mayor o menor grado, y su
distribución es nacional. También, se presentan enfermedades causadas por virus cuyos
síntomas son expresados en el follaje, los cuales tienen distribución muy localizada,
además de plagas como áfidos, ácaros, mosca blanca, y ataques por nemátodos y
fitoplasmas de forma esporádica (Zapata et al., 2005; Smith, 2012).
Dentro de las enfermedades más limitantes que se presentan en la uchuva, se
encuentran las generadas por hongos fitopatógenos como Alternaria spp., que origina la
enfermedad conocida como mancha foliar, Cercospora spp., mancha gris, Entyloma
australe, carbón de la hoja, Phoma spp., muerte descendente o mal de tierra, Pythium
spp., mal de semilleros, Sclerotinia sclerotiorum, esclerotiniosis o moho blanco, Botrytis
spp., moho gris, y Fusarium oxysporum Schelcht causante de la marchitez vascular
(Blanco, 2000; Smith, 2012), siendo esta última, la enfermedad de mayor impacto
económico y productivo en los cultivos de uchuva debido a que no existe un producto
químico para su control, y es el causante de problemas de desplazamiento de cultivos
por factores fitosanitarios (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, 2009a). Entre las
enfermedades bacterianas se encuentran la mancha grasienta, producida por
Xanthomonas spp., y dormidera o marchitez bacteriana ocasionada por Ralstonia
solanacearum (Zapata et al., 2002).
1.1.4
Hongo fitopatógeno Fusarium oxysporum
La marchitez vascular causada por el hongo Fusarium oxysporum, es la enfermedad más
limitante en el proceso productivo de la uchuva, causando grandes pérdidas económicas
debido a su alto porcentaje de incidencia y severidad (Galindo y Pardo, 2010). F.
oxysporum es un hongo saprófito capaz de sobrevivir y crecer por largos períodos de
tiempo en el material orgánico del suelo (Fravel et al., 2003), es un constituyente normal
en la rizósfera de plantas, aislándose incluso de raíces asintomáticas en diferentes
cultivos (Gordon and Martyn, 1997). Este patógeno presenta estructuras de resistencia
llamadas clamidosporas que germinan produciendo micelio y esporas, las cuales
Capítulo 1
7
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penetran en las raíces a través de heridas ocasionadas por manejo agronómico,
insectos, nemátodos o por las raíces secundarias al emerger (Galindo y Pardo, 2010;
Zapata, 2012). Se dispersa a corta distancia por el agua, botas y herramientas
contaminadas, y a larga distancia principalmente en trasplantes infectados o en el suelo
que viene adherido a ellos (Galindo y Pardo, 2010).
Los primeros síntomas de la enfermedad aparecen como un ligero aclaramiento de las
nervaduras en las hojas jóvenes. Los órganos de la planta infectados por F. oxysporum
pierden turgencia, se vuelven flácidos y de color verde a amarillo verdoso, luego amarillo,
y posteriormente café hasta que mueren. Al hacer cortes en tallos y ramas afectados,
aparecen áreas café como un anillo completo o interrumpido que corresponde a los
tejidos vasculares descoloridos (Galindo y Pardo, 2010; González et al., 2012).
En los haces vasculares de raíces y ramas pueden estar presentes micelio y esporas del
hongo. En ramas jóvenes recién infectadas, el número de vasos xilemáticos formados se
reduce y sus paredes celulares son más delgadas que lo normal. Las toxinas secretadas
en los vasos por el hongo son traslocadas a las hojas causando reducción en la síntesis
de clorofila a lo largo de las nervaduras, y reducción de la fotosíntesis. También alteran la
permeabilidad de la membrana celular y la planta pierde su habilidad para controlar la
salida de agua por transpiración, por lo que se produce en las hojas epinastia,
marchitamiento, necrosis intervenal, pardeamiento y muerte. Frecuentemente, estos
síntomas aparecen solo en un sector de la planta o de las ramas y avanza hasta que el
follaje y las ramas mueren (Galindo y Pardo, 2010; González et al., 2012).
Esta enfermedad se presenta generalmente a partir de los tres meses de edad de cultivo
(Smith, 2012). Sin embargo, se detecta cuando los frutos de las plantas están en un
grado de maduración avanzado e incluso en condiciones normales de almacenamiento,
por lo que F. oxysporum no es limitante del desarrollo y crecimiento de las plantas. La
enfermedad es de importancia económica ya que al atacar a la planta, el fruto maduro
desmejora su calidad en cuanto a presentación y sabor lo que disminuye asimismo, su
comercialización (Ramírez et al., 2008). En el caso de especies vegetales de interés
comercial de la familia Solanaceae, se ha reportado que formas patogénicas de F.
oxysporum son causantes de marchitez vascular en tomate (Sheu and Wang, 2006;
Shanmugam et al., 2011, Ramyabharathi et al., 2012), papa (Daami-Remadi et al., 2006)
y uchuva (Urrea et al., 2011, Jiménez et al., 2012).
En la actualidad no se encuentra registrado ningún producto químico para controlar la
marchitez vascular causada por F. oxysporum, debido a que este fitopatógeno se
encuentra en casi todo tipo de suelo siendo un componente habitual de la microbiota
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
8
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(Fravel et al., 2003), presenta una versatilidad fisiológica que le permite su adaptación a
diversas condiciones medioambientales, además de tener la capacidad de sobrevivir
hasta 30 años en el suelo, debido a las producción de clamidiosporas, estructuras de
resistencia (Díaz et al., 2012), posee la habilidad de colonizar y vivir saprofíticamente en
residuos de cosechas no hospedantes, por lo que el inóculo se mantiene en una
densidad relativamente alta y por un tiempo considerable en los campos de cultivo.
No obstante, la mayoría de los productores utilizan varios ingredientes activos en rotación
o en mezcla para controlar la enfermedad como Captan®, Carbendazim®, Polietoxi
Etanol®, Carboxin® y Thiram® (PERSUAP, 2007; Smith y Mesa, 2012), los cuales son
aplicados directamente a la semilla, o en el caso de Captan también al follaje, sin
embargo, sus efectos carcinogénicos en mamíferos han sido demostrados y su efecto en
seres humanos es controversial (Arce et al., 2010). Adicionalmente, se han empleado
métodos de control cultural mediante la desinfección de herramientas y botas, y
aislamiento de zonas enfermas, empleo de plantas resistentes, desinfección química de
los residuos, entre otras, las cuales no han tenido la eficacia esperada, debido a la
aparición de nuevas variantes del patógeno en el caso de plantas resistentes, generación
de resistencia a los diferentes agroquímicos, y a la contaminación que estos materiales
producen en el ambiente (Ramírez et al., 2008). Actualmente, se ha implementado el uso
de controladores biológicos como Trichoderma harzanium o T. lignorum, que actúan
contra el patógeno principalmente por colonización, competencia por sustrato y nutrientes
y micoparasitismo (Howell, 2003).
El manejo de la marchitez vascular causada por F. oxysporum está basado en el empleo
de prácticas adecuadas, que consisten principalmente en preparar una mezcla del
sustrato (suelo negro, arena y materia orgánica) con posterior solarización. Después de
la siembra de la semilla, es necesario revisar periódicamente el contenido de humedad
del semillero y de no saturarlo con el agua de riego. Asimismo, es recomendable la
inmersión de las semillas en una solución conocida de un biocontrolador de F.
oxysporum antes de la siembra (Blanco, 2000).
De acuerdo a lo anterior, algunos estudios se han enfocado en evaluar alternativas de
control biológico contra F. oxysporum en diversos cultivos, reportando principalmente los
géneros Bacillus, Gliocladium, Paenibacillus, Pseudomonas y Trichoderma como agentes
de control biológico de este patógeno, bajo condiciones tanto in vitro como in vivo (e.g.
Avendaño et al., 2006; Upadhyay and Srivastava, 2008; Shanmugam et al., 2011;
Ramyabharathi et al., 2012; Jha et al., 2013). Con respecto al cultivo de uchuva, Nausa
et al. (2005) además de los anteriores microorganismos, reportan como antagonista al
género Coniothyrium, y Galindo y Pardo (2010) a Gliocladium. En el caso de cepas
bacterianas, Urrea et al. (2011) encontraron que cepas de Pseudomonas fluorescens y
Capítulo 1
9
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Ps. luteola principalmente, y Bacillus brevis aisladas de la rizósfera de plantas de uchuva
inhibieron el crecimiento y esporulación de F. oxysporum, y más recientemente, Zapata
et al. (2012) aislaron de raíces de plantas asintomáticas de uchuva, bacterias epífitas de
los géneros Bacillus y Pseudomonas, siendo Bacillus el que presentó mayor inhibición en
condiciones in vitro del crecimiento del patógeno. Sin embargo, no se han reportado
investigaciones en las que se hayan evaluado los mecanismos de acción que emplean
las bacterias para ejercer control biológico contra este fitopatógeno en uchuva.
1.2
CONTROL BIOLÓGICO
El control biológico surge como una alternativa sustitutiva o complementaria a las ya
existentes empleadas para el manejo de enfermedades causadas por diferentes
patógenos en diversas especies de plantas. Se considera como un método importante
para la recuperación del equilibrio de los agroecosistemas y para el aprovechamiento del
potencial antagonista natural de ciertos microorganismos contra patógenos vulnerables
(Avendaño et al., 2006).
Eilenberg et al. (2001) definen el control biológico como un componente del manejo
integrado de enfermedades mediante el uso de organismos vivos con el fin de suprimir la
densidad poblacional o el impacto de un organismo patógeno específico, haciéndolo
menos abundante o menos dañino de lo que pudiera ser. En este contexto,
microorganismos como hongos, bacterias y virus son considerados como Agentes de
Control Biológico- ACB (Kloepper, 1996; Pal and McSpadden, 2006), los cuales reducen
la incidencia y la severidad de las enfermedades (Kloepper and Ryu, 2007).
El antagonismo está dado por la presencia y actividad de organismos que pueden afectar
la densidad de la población, dinámica y actividades metabólicas de los patógenos del
suelo (Raaijmakers et al., 2009). Los mecanismos de antagonismo están relacionados
con el número de especies en contacto y la especificidad de las interacciones, ya sea de
forma directa o indirecta. Las PGPR protegen a las plantas contra los patógenos por
interacciones de antagonismo directo las cuales son producto del contacto físico y/o de
un alto grado de selectividad del patógeno por los mecanismos expresados por el ACB,
como el hiperparasitismo y la predación. Asimismo, por síntesis de metabolitos
secundarios antimicrobianos, enzimas líticas de la pared celular fúngica (Pal and
McSpadden, 2006; Raaijmakers et al., 2009), y por producción de ácido cianhídrico que
suprime el crecimiento de patógenos fúngicos (Persello Cartieaux et al., 2003; Podile and
Kishore, 2007; Shangar, 2013). Entre tanto, el antagonismo indirecto resulta de las
actividades que no involucran contacto del patógeno con el ACB, como la estimulación
de las vías de defensa de la planta por ACBs no patógenos induciendo resistencia
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
10
_______________________________________________________________________________________________________________________________
sistémica, competencia por un nicho ecológico o un substrato mediante producción de
exudados, de sideróforos quelantes del hierro haciéndolo no disponible para el patógeno
(Bloemberg and Lugtenberg, 2001; Haas et al., 2002; Persello Cartieaux et al., 2003; Pal
and McSpadden, 2006; Raaijmakers et al., 2009; Narayanasamy, 2013b), y aumento de
la tolerancia de las plantas a sequías, salinidad y toxicidad por metales (Compant et al.,
2005; Do Vale Barreto et al., 2011).
1.2.1
Rizósfera y Bacterias Promotoras de Crecimiento Vegetal (PGPR)
Hiltner (1904), definió por primera vez el término “rizósfera” como el volumen de suelo
influenciado por la actividad de las raíces de las plantas (Römheld and Neumann, 2006).
Es la zona del suelo influenciada por las secreciones de la raíz, la cual puede contener
cerca de 1011 células microbianas por gramo de raíz (Egamberdieva et al., 2008), y más
de 30000 especies de procariotas (Mendes et al., 2011). Estas secresiones,
principalmente, quimioatrayentes y nutrientes (de Weert et al., 2002), entre los que se
incluyen etileno, azúcares, aminoácidos, ácidos orgánicos, vitaminas, polisacáridos y
enzimas (Garbeva et al., 2004) atraen a los microorganismos hacia el sistema radicular.
También, es considerada como la zona de interacción e infección de los patógenos del
suelo en la que su colonización es el primer paso en la patogénesis, estableciendo una
relación parasítica con la planta (de Weert et al., 2007). Asimismo, es la zona donde la
comunidad rizosférica interactúa con los patógenos del suelo e influencia su infección, de
manera que los microorganismos benéficos para el crecimiento y salud de las plantas
pueden inhibir su crecimiento (Raaijmakers et al.; 2009, Weinert et al., 2011; Berendsen
et al., 2012; Pastor et al., 2012).
Los suelos rizosféricos contienen diversos tipos de microorganismos que pueden generar
efectos benéficos en la productividad de los cultivos entre los que se encuentran
Proteobacterias, principalmente de los géneros Pseudomonas y Burkholderia, Firmicutes
como el género Bacillus, y para el caso de hongos los pertenecientes a los géneros
Trichoderma y Gliocladium, y cepas de Fusarium oxysporum no patogénicas
(Raaijmakers et al., 2009). No obstante, dentro de este grupo de microorganismos
benéficos se encuentran las Rizobacterias Promotoras de Crecimiento Vegetal (PGPR)
que actúan como fitoestimulantes produciendo sustancias bioactivas para incrementar el
crecimiento de las plantas mediante la producción de fitohormonas como el ácido indol
acético, como biofertilizantes mediante la solubilización de fósforo inorgánico, fijación de
nitrógeno, incremento del hierro asimilable a través de sideróforos quelantes de hierro y
la producción de compuestos volátiles que afectan las vías de señalización de las plantas
(Singh et al., 2011). Otro mecanismo, es la inducción de respuestas sistémicas en la
planta con el fin de activar mecanismos de defensa (Pieterse et al., 2003). La resistencia
sistémica inducida (ISR) protege a las plantas de varios fitopatógenos sin requerir la
interacción directa entre el microorganismo que induce resistencia y el patógeno
Capítulo 1
11
_______________________________________________________________________________________________________________________________
(Zehnder et al., 2001). Esta capacidad ha sido observada en un amplio rango de
bacterias, incluyendo endófitas (Hallmann et al., 1997; Compant et al., 2005), las cuales
invaden los tejidos de la raíz, tallo y filoplano (Sturz et al., 2000), y en hongos saprófitos y
micorrízicos arbusculares (Pozo et al., 2002). Además, las PGPR actúan como agentes
de biocontrol protegiendo a las plantas contra el ataque de patógenos mediante diversos
mecanismos de acción (Bloemberg and Lugtenberg, 2001; Weber et al., 2007; Backman
and Sikora, 2008; Harish et al., 2009; Narayanasamy, 2013b; Shangar, 2013).
Los géneros de PGPR más abundantes en la rizósfera y de gran importancia en diversos
cultivos son Pseudomonas y Bacillus, los cuales actúan promoviendo el crecimiento
vegetal, ya que pueden proporcionar a la planta formas solubles de fósforo y de hierro y
promover su crecimiento mediante la producción de fitohormonas como auxinas,
giberelinas, glicolípidos y citoquininas, que estimulan la germinación de las semillas, la
proliferación del sistema radicular y el crecimiento de la parte aérea de la planta
(Garbeva et al., 2004; Lugtenberg and Kamilova, 2009). Asimismo, se conoce la acción
biocontroladora de estas PGPRs frente a un amplio rango de patógenos, en la que su
abundancia y composición dependen de la especie de planta hospedadora (Berg et al.,
2002). El tipo de compuestos liberados por la planta, principalmente, ácidos orgánicos,
azúcares y aminoácidos, determinan en gran parte su interacción con los ACBs (de
Weert et al., 2007; Rudrappa et al., 2008). Entre estos fitopatógenos, uno de gran
importancia económica es F. oxysporum, cuyo control por PGPRs se efectúa a partir de
mecanismos como antagonismo mediante la producción de metabolitos secundarios (ej.
ácido cianhídrico, oomycina, fenazina, pirrolnitrina, pioluteorina, tropolona, iturina A,
surfactina, entre otros), o por la producción de enzimas líticas como las β-1,3glucanasas, así como por estimulación de mecanismos de defensa de la planta (Kloepper
et al., 2004; Compant et al., 2005; van Loon, 2007; Díaz, 2012; Shangar, 2013).
Las interacciones microbianas en la rizósfera generalmente han sido enfocadas hacia la
inhibición del crecimiento y la actividad de un patógeno por microorganismos benéficos.
Sin embargo, los patógenos también emplean una serie de mecanismos para
contrarrestar el antagonismo, entre los que se encuentran la degradación de compuestos
antimicrobianos e interferencia con la regulación y biosíntesis de enzimas y metabolitos
secundarios producidos por los microorganismos antagonistas (Duffy et al., 2003). Esta
degradación de compuestos antimicrobianos ha sido observada en varios aislamientos
de F. oxysporum y su tolerancia al 2, 4- diacetilfloroglucinol (DAPG) producido por
Pseudomonas fluorescens al convertirlo, vía deacetilación, en derivados menos tóxicos,
como monoacetilfloroglucinol y floroglucinol (Schouten et al., 2004), o en el caso de la
producción del ácido fusárico, el cual es una toxina para las plantas y un factor de
patogenicidad de F. oxysporum (Haas and Défago, 2005), que específicamente reprime
la biosíntesis de DAPG (Notz et al., 2002).
2.
JUSTIFICACIÓN
El valor de las exportaciones de las frutas frescas colombianas alcanzó los 48.6 millones
de dólares en el 2012, donde la uchuva es catalogada como la fruta más rentable en las
exportaciones nacionales y para este período fue la más vendida en los mercados
internacionales participando con 29.2 millones de dólares, seguida de la gulupa con
USD12.0 millones, granadilla con USD2.9 millones, pitahaya con USD2.0 millones y
tomate de árbol con USD1.3 millones (Legiscomex, 2013).
En el año 2000, Colombia exportó 1850 toneladas de uchuva fresca por un valor de 7.4
millones de dólares, de las cuales más del 95.0% se destinó a la Unión Europea,
principalmente a Holanda (46.0%), Alemania (26.8%), Gran Bretaña (11.7%) y Francia
(7.2%). Otros destinos de exportación fueron Bélgica y Luxemburgo (5.0%), Suecia
(5.0%), Suiza (3.0%) entre otros países (3.0%) (CCI, 2000). Entre 2005 y 2008, el
volumen exportado de uchuva en fresco se mantuvo constante con un promedio de 6305
toneladas, con entradas por 24.2 millones de dólares en los tres años (Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural, 2009b). Para el 2012, las exportaciones de uchuva
representaron el 60.2% del total de frutas exportadas, presentado un 8.6% más de lo
registrado en el 2011 cuando las exportaciones sumaron 26.9 millones de dólares, siendo
los principales destinos Países Bajos con el 67.9%, seguido de Alemania (24.5%),
Canadá (2.2%) y Francia (1.4%) (Legiscomex, 2013).
Actualmente en el país, el departamento de Boyacá es el mayor productor de uchuva con
388 hectáreas cultivadas, con una productividad promedio de 6354 toneladas y un
rendimiento por hectárea de 16376 kilogramos, que representan el 59.0% de la
producción nacional. Otros departamentos productores de uchuva son Antioquia con 154
ha cultivadas, Cundinamarca con 75 ha, Nariño con 53 ha y Norte de Santander con 31
ha (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, 2012; Agronet, 2013).
Dentro de los costos totales de producción en los cultivos de uchuva, la mano de obra es
el factor de mayor participación (42.8%), seguido del uso de insumos domésticos (17.4%)
y transporte de la cosecha e insumos (13.7%). Los agroquímicos representan el 13.4%
de los costes totales, y dentro de éstos los fertilizantes edáficos y foliares representan el
21.0%, de manera que los plaguicidas, en especial los insecticidas y fungicidas,
representan el 79.0%. Otros factores como el uso del suelo (6.7%), y el pago de
maquinaria, combustible y empaque representan un porcentaje mínimo con respecto al
costo total (Quintero et al., 2004). De esta forma, de acuerdo con el Sistema de
Información de Precios de Insumos y Factores del Ministerio de Agricultura y Desarrollo
Rural (FINAGRO, 2011), para el 2010 el costo total de producción de uchuva en cultivos
Capítulo 2
13
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de menos de una hectárea en el departamento de Boyacá con un ciclo de duración de
dos años, fue de $29.568.554 para el primer año, de los cuales el 28.8% correspondió al
uso de insumos, y dentro de estos, el 1.7% ($490.865) estuvo representado en el uso de
fungicidas, mientras que para el segundo año el costo de producción fue de $24.748.202,
con un 2.2% ($534.583) destinado al empleo de fungicidas.
El cultivo de la uchuva se ha reducido en algunas zonas productoras del país como es el
caso del departamento de Cundinamarca, principalmente por el uso de material de
propagación infectado que no pasa por un proceso previo de certificación lo que ha
llevado a la diseminación de distintas enfermedades, el excesivo uso del suelo sin
prácticas agronómicas que permitan la rotación y que hace que los rendimientos bajen
considerablemente. En consecuencia, el uso excesivo de agroinsumos ha aumentado los
costos de producción, debido a que el cultivo en este departamento, ha sido manejado de
forma similar a los cultivos tradicionales (Bonilla et al., 2009). Todo lo anterior ha
generado un desplazamiento del cultivo hacia otros departamentos como Boyacá, pero
sin tomar las respectivas prevenciones de manejo fitosanitario (Bonilla et al., 2009; Smith
y Mesa, 2012).
Los principales problemas que enfrentan los productores en la etapa de producción de la
uchuva son las enfermedades ocasionadas por el ataque de hongos, bacterias o virus.
Las enfermedades más comunes por su distribución en todas las zonas de producción
del país y las que mayores pérdidas ocasionan son las causadas por hongos y bacterias.
Además de esto, la uchuva es atacada por algunas plagas que tienen distribución en
todas las zonas productoras y afectan el capacho, el fruto y las hojas, ocasionando
pérdidas de hasta la totalidad del cultivo (Zapata et al., 2002).
Entre las enfermedades con mayor importancia, la marchitez vascular cuyo agente
causal es el hongo Fusarium oxysporum, es la de mayor impacto en los cultivos de
uchuva, originando pérdidas hasta del 60% en el departamento de Cundinamarca y entre
el 40 y 50% en el departamento de Boyacá por un posible empleo de semilla infectada
por el patógeno (González y Barrero, 2011). Esta enfermedad afecta seriamente la
sostenibilidad económica y ambiental del cultivo debido a la magnitud de las pérdidas
para los agricultores y comercializadores y al abuso de fungicidas de síntesis química
que se emplean para su control, los cuales contienen principios activos recalcitrantes
para el ambiente que dejan trazas en las frutas, y que pueden llegar a ser tóxicos para el
hombre, lo que genera rechazo por parte de los diferentes mercados internacionales que
son muy exigentes con los niveles de residuos de compuestos xenobióticos en los
productos agrícolas. Además, el uso continuo de químicos para el control de este
microorganismo ha provocado el aumento de la resistencia a muchos de los ingredientes
activos desarrollando una persistencia muy elevada en el suelo (Ramírez et al., 2008;
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
14
_______________________________________________________________________________________________________________________________
González y Barrero, 2011; Zapata, 2012).
Para el desarrollo de esta investigación, se contó con el apoyo de la Asociación de
Productores de Ciénega (ASOPROCIEN), la cual está conformada hace diez años por 48
productores de uchuva que exportan la fruta a diferentes países europeos entre los
cuales Alemania, Francia, Holanda, Bélgica y Rusia son algunos de ellos. En febrero de
2011, ASOPROCIEN se convirtió, a nivel mundial, en la primera asociación exportadora
de uchuva ecotipo Colombia, que en compañía de su aliado comercial CI Andes Export
Company SAS recibió la certificación Fair Trade (Sello de Certificación de Comercio
Justo), otorgada por la empresa Flo-Cert GmBH en Bonn, Alemania (Agroeconómica,
2011). El principal objetivo de la asociación consiste en la búsqueda de nuevos mercados
internacionales mediante la exportación de productos totalmente orgánicos, que
redundará en un aumento de la exportación y en la obtención de mayores dividendos
económicos.
Actualmente, se busca desarrollar y promover estrategias para el manejo integrado de
plagas y enfermedades dentro de un enfoque efectivo y ecológicamente seguro basado
tanto en una combinación de prácticas de control como el uso de agentes
biocontroladores (Ceballos, 2009), por lo que la ejecución de este trabajo de
investigación es de gran importancia ya que por medio del aislamiento y caracterización
de las rizobacterias que actúen como agentes biocontroladores de Fusarium oxysporum
asociadas a cultivos de Physalis peruviana en Boyacá, principal departamento productor
de uchuva en Colombia, se ha planteado una alternativa de biocontrol para este
fitopatógeno, causante de grandes pérdidas económicas en la producción de la uchuva.
Capítulo 3
15
_________________________________________________________________________________________________________________
3.
3.1
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Evaluar la capacidad antagónica de bacterias rizosféricas cultivables de plantas de
uchuva (Physalis peruviana L.) ecotipo Colombia contra Fusarium oxysporum Schlecht
en el municipio de Ciénega (Boyacá-Colombia).
3.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Aislar las bacterias con capacidad antagónica contra F. oxysporum asociadas a la
rizósfera de plantas de P. peruviana.
Seleccionar las bacterias con capacidad antagónica contra F. oxysporum en condiciones
in vitro.
Identificar y caracterizar bioquímica y molecularmente las bacterias con mayor capacidad
antagónica contra F. oxysporum.
Evaluar la capacidad antagónica de las bacterias seleccionadas contra F. oxysporum
bajo condiciones de invernadero en plántulas de uchuva.
4.
4.1
MATERIALES Y MÉTODOS
ÁREA DE ESTUDIO
El municipio de Ciénega se encuentra ubicado en la provincia de Márquez en el
departamento de Boyacá sobre los 2460 msnm, con un clima de piso bioclimático frío y
una temperatura media de 16 °C. Presenta lluvias anuales entre 1000 y 1500 mm con
una distribución de lluvias bimodal, en la que se observan dos períodos lluviosos
marcados, uno entre abril a junio y otro entre octubre y noviembre. La humedad relativa
es alta sobre los 3000 msnm, alcanzando un 90% como valor máximo y un 77% como
valor mínimo (Ciénega nuestro municipio, 2011).
La Asociación de Productores de Ciénega-ASOPROCIEN, está conformada por 48
fincas, que se encuentran ubicadas entre los 2400 y los 2800 msnm. Del total de las
fincas, actualmente 34 son productoras de uchuva, de las cuales, una tiene alrededor de
2500 plantas de uchuva sembradas, cuatro fincas entre 1000 y 1500 plantas, doce entre
500 y 1000 plantas, y diecisiete fincas menos de 500 plantas de uchuva (Becerra, 2011).
4.2
4.2.1
AISLAMIENTO DE LAS BACTERIAS CON CAPACIDAD ANTAGÓNICA
FRENTE A F. oxysporum ASOCIADAS A LA RIZÓSFERA DE PLANTAS
DE Physalis peruviana
Selección de plantas
Se seleccionaron tres fincas de las 34 que actualmente se encuentran en producción de
uchuva dentro de la asociación, teniendo en cuenta aquellas que presentan la mayor
incidencia de marchitez vascular causada por F. oxysporum, de acuerdo a la información
suministrada por los productores de uchuva del área de estudio, la consulta a expertos y
consulta bibliográfica sobre la sintomatología característica de la enfermedad. Las fincas
objeto de estudio para la toma de muestras correspondieron a la finca San Cayetano (05°
23' 50.3" N, 73° 17' 14.2" W), finca La Copa (05° 24' 40.9" N, 73° 18' 5.2" W) y finca
Santa Rosa (05° 23' 50.3" N, 73° 17' 38.9" W).
Capítulo 4
17
_______________________________________________________________________________________________________________________________
4.2.2
Toma de muestras en campo
Se siguió un muestreo aleatorio para la toma de muestras de raíz y suelo rizosférico, de
cinco plantas de uchuva por finca separadas entre sí por 20 m. Se removieron los
agregados de suelo adheridos a las raíces haciendo agitación fuerte de las plantas para
dejar solamente las raíces con suelo rizosférico (suelo firmemente adherido a la raíz).
Cada muestra se almacenó en bolsas herméticas hasta completar 1000 g, y se
mantuvieron en refrigeración desde la colecta y durante el transporte desde los sitios de
estudio hasta su procesamiento, entre 48 a 72 horas posteriores al muestreo, en el
Laboratorio del Grupo de Investigación Biología Ambiental de la Universidad Pedagógica
y Tecnológica de Colombia.
Se tomaron asimismo, muestras de suelo para análisis físicoquímicos seleccionando de
cada cultivo 10 puntos separados entre sí por 10 m. De cada uno, se colectaron 100 g de
suelo a una profundidad entre 0 y 10 cm, los cuales se homogenizaron para conformar
una muestra compuesta de 1000 g.
4.2.3
Aislamiento y caracterización de F. oxysporum
En campo, se realizó un diagnóstico de la sintomatología de marchitez vascular causada
por F. oxysporum en cada una de las tres fincas, con el fin de aislar el patógeno a partir
de plantas sintomáticas. El aislamiento de F. oxysporum se realizó a partir de muestras
tomadas de la base del tallo de seis plantas de uchuva de aproximadamente seis meses
de edad, que presentaron la sintomatología característica de marchitez vascular
(marchitamiento, amarillamiento de hojas, adormecimiento de la planta- Agrios, 2005), a
partir de los cuales se hicieron cortes para observar la presencia de necrosis vascular,
especialmente pardeamiento del xilema.
En laboratorio, se cortaron fragmentos de tallo enfermo, y se desinfectaron en solución
de hipoclorito de sodio al 2.5% por 3 minutos, y luego se lavaron con agua destilada
estéril cuatro veces. Se hicieron cortes transversales de los fragmentos y se realizaron
cortes de aproximadamente 0.5 cm2 de la zona de los haces vasculares (Leslie and
Summerell, 2006). Posteriormente, cada muestra se sembró por triplicado colocando
cinco fragmentos por caja de Petri con medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA), y se
incubaron a 28 ± 2 °C por siete días. Para la identificación de los aislamientos de F.
oxysporum se emplearon las claves taxonómicas de Domsh et al. (1980), Leslie and
Summerell (2006), y se corroboró con la consulta a expertos.
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
18
_______________________________________________________________________________________________________________________________
De cada aislamiento obtenido se hizo la descripción macroscópica y microscópica, y las
colonias características de Fusarium se sembraron por duplicado en distintos medios de
cultivo para la observación de las estructuras reproductivas a partir de las cuales se
identificaron los morfotipos de F. oxysporum. Se sirvieron cajas de Petri de 60 mm con
medio PDA para la observación de la morfología de las colonias, pigmentación y de
microconidias del hongo. Se empleó Agar Hoja de Clavel (CLA) para la observación de
clamidosporas, y Agar Spezieller Nährstoffarmer (SNA) para macroconidias (Leslie and
Summerell, 2006). Las cajas se incubaron a 28 ± 2 °C durante 10 días para el medio
PDA, y por 14 días para los medios CLA y SNA.
4.2.3.1.
Pruebas de patogenicidad de aislamientos de F. oxysporum
Para realizar las pruebas de patogenicidad, los morfotipos identificados como F.
oxysporum se cultivaron en medio PDA y se incubaron a 28 ± 2 °C entre siete y diez
días. Se obtuvo una suspensión de cada aislamiento fúngico en esporulación agregando
10 mL de agua destilada estéril y una gota de Tween 80 para remover las conidias y
posteriormente ajustar la concentración a 1 x 106 conidias.mL-1, utilizando la técnica de
recuento directo con cámara de Neubeauer (modificado de Jiménez et al., 2012).
En condiciones de invernadero se realizaron las pruebas de patogenicidad, mediante un
diseño experimental completamente al azar empleando 16 tratamientos correspondientes
a cada morfotipo de F. oxysporum aislado y al control. Para cada tratamiento se
emplearon 10 réplicas, para un total de 160 unidades muestrales cada una compuesta
por una plántula de uchuva de 60 días de edad. Se hizo inmersión del sistema radicular
sin causar herida en cada suspensión conidial durante 3 minutos. Como control absoluto
se empleó agua destilada estéril. Las plántulas fueron trasplantadas en bolsas de
polietileno con 1500 g de suelo estéril a capacidad de campo, y se cubrieron durante 48
horas para crear una humedad relativa aproximada al 100%. Las variables evaluadas
fueron incidencia de la enfermedad y período de incubación (PI: días transcurridos desde
la inoculación hasta la aparición de los primeros síntomas de la enfermedad).
Se estableció una escala de severidad de la enfermedad (Tabla 1), la cual se evaluó
semanalmente para cada tratamiento. Se hizo una caracterización de los síntomas
típicos de la enfermedad para cada uno de los tratamientos, y al final de la evaluación se
realizó un muestreo destructivo de las plántulas inoculadas con el morfotipo más virulento
haciendo cortes transversales del tallo para observar la presencia de necrosis vascular, y
hacer el reaislamiento del hongo confirmando la infección por el patógeno inoculado, y
cumplir de esta forma, con el cuarto postulado de Koch.
Capítulo 4
19
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Tabla 1. Escala ordinal de severidad de la enfermedad empleada para las pruebas de
patogenicidad.
Escala
0
1
2
3
4
Sintomatología*
Ausencia de enfermedad
Evidencia de síntomas no acentuados (comienzo de epinastia en
peciolo, clorosis leve)
Abscisión de hojas. Epinastia acentuada. Encopamiento de hojas
Marchitamiento medio de la planta. Inclinación del tallo principal
Muerte de la planta
*Modificado de Urrea (2010).
Simultáneamente a las pruebas de patogenicidad, se determinó el porcentaje de
germinación de conidias de cada uno de los morfotipos de Fusarium inoculados, tomando
de la suspensión empleada para la inoculación de las plántulas de uchuva, 20 µL
sembrados en cinco discos (unidad muestral) por caja de Petri con medio PDA. Las cajas
se incubaron a 24 ± 2 °C por 18 horas. Se cuantificaron las conidias germinadas y no
germinadas en 10 campos ópticos de tres unidades muestrales por morfotipo mediante
observación al microscopio. El porcentaje de germinación se determinó de acuerdo a
García et al. (2006) mediante la fórmula:
ó
4.2.3.2.
Conservación del fitopatógeno
Para la conservación de los aislamientos de F. oxysporum, se sembró cada hongo en
medio PDA que contenía discos de papel filtro estéril. Posterior al tiempo de incubación
por 10 días a 28 ± 2° C, se tomaron discos de papel filtro con micelio del hongo y se
llevaron a glicerol al 96% estéril. El cultivo fue almacenado a 4 °C (Blanco, 2013).
4.2.3.3.
Análisis estadístico de las pruebas de patogenicidad
Los datos de severidad e incidencia de la enfermedad se promediaron de acuerdo al
tiempo de inoculación de cada tratamiento, y se calculó el Área Bajo la Curva de
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
20
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Progreso de la Enfermedad (AUDPC) y la incidencia de la enfermedad utilizando el
programa estadístico R versión 2.15.1, Package Agricolae Versión 1.1-2 (Mendiburu,
2012). Asimismo, se realizó un Análisis de Varianza (ANOVA) para evaluar la severidad y
la incidencia luego de cumplir con los supuestos de homoceasticidad y de normalidad de
los datos empleando las pruebas de Levene y de Shapiro-Wilk, respectivamente, y las
medias fueron comparadas empleando la Prueba de Rango Múltiple de Tukey con un
nivel de significancia de p<0.05. Se empleó el programa estadístico R versión 2.15.1.
Como resultado, se seleccionó el morfotipo más virulento de F. oxysporum el cual fue
empleado en las pruebas de antagonismo.
4.2.4
Aislamiento de rizobacterias antagonistas contra F. oxysporum
Se llevó a cabo el método de extensión en placa a partir de diluciones seriadas en
solución salina estéril (NaCl 0.85% p/v) para el aislamiento de las bacterias cultivables
endófitas de raíz y de suelo rizosférico.
Para el aislamiento de bacterias endófitas de la raíz, se procedió de acuerdo a la
metodología de Garrido (2007), la cual consistió en lavar las raíces secundarias con agua
corriente para retirar las partículas de suelo adheridas a éstas, y luego cortarlas en
fragmentos de 0.5 cm2 aproximadamente. Se pesaron los fragmentos de raíz hasta
completar 1 g, y se sumergieron en alcohol etílico al 70% durante 5 minutos.
Posteriormente, se colocaron en una solución de hipoclorito de sodio al 2% por 2
minutos. Se realizaron enjuagues de estos fragmentos en agua destilada estéril para
eliminar los residuos de las soluciones, y se maceraron en mortero con 9 mL de NaCl
(0.85% p/v) para permitir la salida de las bacterias endófitas presentes en las raíces. De
este macerado, se extrajo 1 mL para realizar diluciones seriadas hasta 10-4 en NaCl
(0.85% p/v). De las diluciones 10-2, 10-3 y 10-4, se inocularon 100 µL en medio agar
nutritivo (AN) y agar King B, y luego de someter los tubos a choque térmico a una
temperatura de 80 °C por 10 minutos se inocularon en medio Agar Tripticasa de Soya
(ATS).
De las muestras de suelo rizosférico, se inocularon 100 µL de las diluciones 10-4 y 10-5 en
los medios AN y agar King B, y posteriormente las diluciones se sometieron a choque
térmico a 80 °C por 10 minutos y se inocularon 100 µL en medio ATS.
Las bacterias aisladas tanto de las muestras de raíz y de suelo rizosférico se sembraron
en agar Luria Bertani (ALB) y se incubaron por 48 horas a 28 ± 2 °C para la obtención de
aislamientos puros.
Capítulo 4
21
_______________________________________________________________________________________________________________________________
4.3
4.3.1
SELECCIÓN DE LAS BACTERIAS CON CAPACIDAD ANTAGÓNICA
CONTRA Fusarium oxysporum EN CONDICIONES in vitro
Pruebas de antagonismo in vitro
4.3.1.1.
Prueba de antagonismo in vitro mediante enfrentamiento dual I
Para llevar a cabo la prueba de antagonismo in vitro mediante enfrentamiento dual I, se
emplearon cultivos de 48 horas de crecimiento de las bacterias aisladas de la rizósfera
de uchuva, a partir de las cuales se trazaron dos estrías equidistantes del centro de cajas
de Petri con medio PDA, y se llevaron a incubación por 48 horas a 28 ± 2 °C, con el fin
de que se liberaran al medio los metabolitos bacterianos producidos. Luego, se sembró
un disco de 5 mm de F. oxysporum de cinco días de crecimiento en el centro de las cajas
(Bautista et al., 2007), y se llevaron a incubación por 10 días a temperatura ambiente.
Por cada cepa bacteriana se realizaron las pruebas por triplicado.
Como control absoluto (C.Abs) se empleó agua destilada estéril en substitución de la
bacteria, y como control positivo se utilizó la cepa Pseudomonas fluorescens Pfl 107
facilitada por el Laboratorio de Microbiología Agrícola del Instituto de Biotecnología de la
Universidad Nacional de Colombia. Adicionalmente, se empleó el producto TRICOTEC
WP a base de Trichoderma koningiopsis a una concentración de 1.0 x 107 células.mL-1
como control positivo comercial.
El porcentaje de inhibición de crecimiento micelial para cada tratamiento (Tto) se calculó
considerando el crecimiento del hongo del control absoluto (C.Abs) como 100% y
utilizando la siguiente fórmula (Ceballos, 2009):
Las cepas bacterianas consideradas como antagonistas en la prueba de antagonismo in
vitro mediante enfrentamiento dual I, fueron aquellas que presentaron un porcentaje de
inhibición del crecimiento de F. oxysporum mayor o igual a 30%.
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
22
_______________________________________________________________________________________________________________________________
4.3.1.2.
Prueba de antagonismo in vitro mediante enfrentamiento dual II
Las pruebas de antagonismo in vitro mediante enfrentamiento dual II se realizaron
teniendo en cuenta la metodología propuesta por Montealegre et al. (2003). Para ello, se
colocó un de 5 mm de la zona activa de crecimiento de F. oxysporum en el centro de
cajas de Petri con medio PDA. Posteriormente, se simuló una circunferencia alrededor
del disco fúngico para inocular cada bacteria antagónica resultante de la prueba de
antagonismo in vitro mediante enfrentamiento dual I, sumergiendo la cubierta de una caja
de Petri de 60 mm en cada suspensión bacteriana ajustada a una concentración
aproximada de 1.5 x 108 células.mL-1, a una Densidad Óptica (DO)= 540 nm, y llevándola
al medio de cultivo dejando en el centro el inóculo fúngico (Figura 1). Las cajas fueron
incubadas por 10 días a temperatura ambiente. Las pruebas de antagonismo se
realizaron por triplicado para cada cepa bacteriana.
Figura 1. Prueba de antagonismo in vitro mediante enfrentamiento dual II.
Bacteria antagonista
de F. oxysporum
El crecimiento micelial del hongo se determinó midiendo el diámetro promedio del
crecimiento fúngico (Tto) en comparación con el control absoluto (C.Abs) donde la
suspensión bacteriana fue reemplazada por agua destilada estéril. Se empleó como
control positivo la cepa P. fluorescens Pfl 107, y como control positivo comercial el
producto TRICOTEC WP a una concentración de 1.0 x 107 células.mL-1. Los resultados
fueron expresados en términos de porcentaje de inhibición, empleando la fórmula:
4.3.2
Análisis estadístico de las pruebas de antagonismo in vitro
La capacidad de inhibición de crecimiento de cada cepa bacteriana frente a F. oxysporum
en todas las pruebas de antagonismo se evaluó con un Análisis de Varianza (ANOVA) de
Capítulo 4
23
_______________________________________________________________________________________________________________________________
un factor y la Prueba de Rango Múltiple de Tukey, con un nivel de significancia de
p<0.05. La prueba ANOVA se realizó luego de cumplir con los supuestos de
homoceasticidad mediante la prueba de Levene, y de normalidad de los datos
empleando la prueba de Shapiro-Wilk. Adicionalmente, las dos pruebas de antagonismo
se correlacionaron mediante la Prueba de Correlación de Pearson. Para los análisis, se
empleó el programa estadístico R versión 2.15.1.
4.3.3
Conservación de los antagonistas bacterianos de F. oxysporum
La conservación de las cepas bacterianas antagonistas se realizó por el método
Semistock en papel filtro. Se tomaron dos viales por cada cepa a conservar, y se
adicionaron a cada uno de los discos de papel filtro Whatman N° 4 de 5 mm estériles. Se
realizó un cultivo de cada cepa en caldo Brain Heat Infusion (BHI) con una DO 600, e
incubación a 37 ± 2 °C por 24 horas. Se tomaron 500 µL de cada uno de los cultivos y se
agregaron a los viales previamente preparados realizando una buena homogenización y
se almacenaron a 4 ± 1 °C (Parra et al., 2006). Adicionalmente, se empleó el sistema de
conservación de cepas CRYOBANK para cada morfotipo bacteriano y se almacenaron a
-20 °C.
4.4
IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA Y MOLECULAR
DE LAS BACTERIAS CON MAYOR CAPACIDAD ANTAGÓNICA
CONTRA Fusarium oxysporum
Se hicieron repiques en medios selectivos de las cepas bacterianas con mayor potencial
antagónico contra F. oxysporum, empleando, para las bacterias Gram negativas, agar
McConkey, agar EMB y agar King B. Para los bacilos Gram positivos, se realizó la
técnica de Schaeffer y Fulton para la tinción de endosporas (Rodríguez et al., 2005).
Adicionalmente, se hizo una caracterización bioquímica preliminar de las bacterias
seleccionadas (catalasa, oxidasa, citrato, reducción de nitratos, producción de indol,
movilidad, producción de H2S, producción de CO2, fermentación de glucosa,
descarboxilación y deaminación de la lisina, rojo de metilo, Voges Proskawer), teniendo
en cuenta las características bioquímicas señaladas por Madigan et al. (2006), y se
corroboró su identificación utilizando las pruebas bioquímicas comerciales API 20NE
(para no Enterobacterias-Biomérieux)® y el Sistema BBL Crystal® para la identificación de
bacterias Gram positivas.
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
24
_______________________________________________________________________________________________________________________________
4.4.1
Caracterización bioquímica de las bacterias con mayor capacidad
antagónica contra Fusarium oxysporum
4.4.1.1.
Producción de metabolitos secundarios
Para llevar a cabo el análisis de las características bioquímicas que presentan las
bacterias antagonistas contra F. oxysporum, se tomó como referente el control positivo
Pseudomonas fluorescens Pfl 107 por conocimiento previo de su efectividad en inhibir el
crecimiento de este patógeno. Para ello, cada bacteria antagónica se activó inoculando
un disco de papel filtro impregnado con cada cepa en caldo BHI con incubación a 28 ± 2
°C por 48 horas.

Producción de ácido 3-indol acético (AIA)
La producción de indoles totales se determinó cuantitativamente por colorimetría
utilizando la solución indicadora Salkowski (Gordon and Weber, 1951). Las bacterias
fueron cultivadas por triplicado en caldo Luria Bertani (CLB) suplementado con Ltriptófano a una concentración de 500 μg.mL-1, y se incubaron en oscuridad a 28 ± 2 °C
por 48 horas (Müller and Weiler, 2000). Después de la incubación, se removieron las
células bacterianas del medio de cultivo por centrifugación a 8000 g por 10 min (Fischer
et al., 2007). Se tomó 1 mL del sobrenadante y se mezcló con 4 mL de reactivo de
Salkowski (Patten and Glick, 2002), se llevó a incubación en oscuridad a temperatura
ambiente por 30 min, y se midió la absorbancia en espectrofotómetro a una DO 530. La
concentración de AIA se determinó por comparación con una curva de calibración patrón
elaborada con AIA sintético (Sigma) en concentraciones de 5 a 100 μg.mL-1. Como
control absoluto se empleó CLB más 500 µg.mL-1 de L-triptófano.

Solubilización de fosfatos
La solubilización de fosfatos por las bacterias más antagónicas contra F. oxysporum se
evaluó inoculando 20 µL de cada suspensión bacteriana a concentración de 1.5 x 108
células.mL-1, en cinco discos distribuidos uniformemente en cajas de Petri que contenían
el medio SMRS1 empleando fosfato tricálcico (Ca3(PO4)2) como fuente de fósforo
insoluble (Sundara and Sinha, 1963), con incubación durante siete días a 28 ± 2 °C.
Previamente, a la inoculación en el medio de cultivo, se evaluó la capacidad de las
bacterias de crecer en un medio de cultivo con la misma composición del medio SMRS1
pero sin la fuente de fósforo. Para cada cepa bacteriana, los ensayos se realizaron por
Capítulo 4
25
_______________________________________________________________________________________________________________________________
duplicado. Como control absoluto se utilizó el medio SMRS1. La capacidad de la bacteria
de solubilizar el fósforo presente en el medio se determinó calculando el índice de
solubilización de fosfatos a partir de la fórmula (Kumar and Narula, 1999):
ó

Producción de enzimas líticas
Se evaluó la producción de quitinasas y glucanasas utilizando los medios de cultivo agar
quitina coloidal y agar cebada, respectivamente (Salazar et al., 2006). Previamente a la
inoculación en los medios de cultivo, cada morfotipo bacteriano fue sembrado por
duplicado en medios preparados con los mismos componentes, pero sin quitina coloidal y
sin harina de cebada, con el fin de determinar la capacidad de las bacterias de crecer en
ausencia de la fuente de carbono.
Posteriormente, de cada suspensión bacteriana, a una concentración de 1.5 x 108
células.mL-1, se inocularon 20 µL en cinco discos distribuidos uniformemente en cajas de
Petri con agar quitina coloidal al 2% y agar cebada. Los ensayos se hicieron por
duplicado para cada morfotipo bacteriano, y se llevaron a incubación a 28 ± 2 °C por 72
horas para la producción de glucanasas y por 10 días para la producción de quitinasas.
La capacidad de la bacteria de utilizar la quitina coloidal y la harina de cebada como
fuentes de carbono se observó por la formación de un halo clarificado alrededor de las
colonias. Como control absoluto para los dos ensayos se utilizó agar quitina coloidal y
agar cebada, respectivamente.

Producción de biosurfactantes
La producción de biosurfactantes por las bacterias antagónicas se evaluó por su
actividad lipolítica utilizando como medio de cultivo Agar Tween 80 (Slifkin, 2000). Para
esto, la concentración de células se ajustó a 1.5 x 108 células.mL-1 para cada suspensión
bacteriana, y se inocularon 20 µL de cada una en cinco discos distribuidos
uniformemente por caja de Petri con el medio de cultivo. Posteriormente, las cajas se
llevaron a incubación por 10 días a 28 ± 2 °C. El ensayo se realizó por duplicado para
cada uno de los morfotipos bacterianos. La producción de enzimas lipasas se evaluó por
la formación de halos blancos alrededor de las colonias debido a la degradación de los
lípidos presentes en el medio. Se empleó agar Tween 80 como control absoluto.
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
26
_______________________________________________________________________________________________________________________________

Producción de compuestos volátiles orgánicos
La producción de compuestos volátiles orgánicos por las bacterias con mayor capacidad
antagónica contra F. oxysporum, se evaluó siguiendo la metodología propuesta por
Montealegre et al. (2003). Para ello, se tomaron 100 μL de la suspensión de cada
bacteria antagónica ajustada a una concentración aproximada de 1.5 x 108 células.mL-1 y
se inocularon en el centro de una caja de Petri con medio King B con incubación a 28 ± 2
°C por 24 horas. Previamente, se sembró en medio PDA un disco de 5 mm de F.
oxysporum incubado por cuatro días a 28 ± 2 °C. La evaluación de la producción de
compuestos volátiles se determinó por triplicado colocando una caja con la suspensión
bacteriana frente a otra sembrada con el hongo evitando el contacto entre el antagonista
y el patógeno, y sellándolas para aislar la atmósfera interior y prevenir la pérdida de
volátiles formados. Las cajas fueron incubadas a 28 ± 2 °C por 72 horas. La inhibición del
desarrollo micelial de F. oxysporum por la producción de compuestos volátiles por las
bacterias se evaluó midiendo el diámetro promedio del crecimiento del hongo en
comparación con un control absoluto dado por el crecimiento del patógeno en ausencia
del antagonista.
4.4.2
Análisis estadístico de las características bioquímicas de las
bacterias antagónicas
Se utilizaron diseños unifactoriales completamente al azar para evaluar las
características cuantitativas de las bacterias antagonistas contra F. oxysporum. Las
características bioquímicas se evaluaron mediante un Análisis de Varianza (ANOVA) de
un factor o de una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, luego de validar los
supuestos de homoceasticidad utilizando la prueba de Levene, y de normalidad con la
prueba de Shapiro-Wilk. Asimismo, se realizó un Análisis de Componentes Principales
(ACP) para ver la agrupación de las bacterias por su similitud en las características
bioquímicas. Para la comparación de las medias se empleó la Prueba de Rango Múltiple
de Tukey (p<0.05). Los análisis se realizaron mediante el programa estadístico R versión
2.15.1
4.4.3
Identificación molecular de las bacterias con mayor potencial
antagónico contra F. oxysporum
Las cepas bacterianas con mayor capacidad antagónica frente a F. oxysporum fueron
enviadas para su identificación mediante la amplificación de la región 16s de rRNA
empleando la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR-Polimerase Chain
Capítulo 4
27
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Reaction) al Laboratorio de Microbiología Molecular de la Corporación Colombiana de
Investigación Agropecuaria-Corpoica Tibaitatá y a la Corporación CorpoGen. La región
16S fue amplificada del ADN total y fue secuenciada con los primers universales 27F (5´AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3´), 518F (5´-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3´), 800R
(5´-TACCAGGGTATCTAATCC-3´), y 1492R (5´-GGYTACCTTGTTACGACTT-3´).
Posteriormente, se realizó el análisis taxonómico de las secuencias mediante
comparación con las bases de datos NCBI (National Center for Biotechnology
Information) y RDP (Ribosomal Database Project).
4.5
4.5.1
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTAGÓNICA DE LAS BACTERIAS
SELECCIONADAS CONTRA F. oxysporum BAJO CONDICIONES DE
INVERNADERO EN PLÁNTULAS DE UCHUVA
Pruebas de compatibilidad entre las bacterias más antagónicas
Previamente a los ensayos en invernadero, se realizaron pruebas de compatibilidad con
las bacterias que inhibieron el crecimiento de F. oxysporum en 79.00% o más en
promedio en los dos ensayos de antagonismo in vitro. Se llevó a cabo la prueba de
difusión en agar nutritivo empleando las suspensiones celulares de cada cepa bacteriana
ajustadas a una concentración de 3 x 108 células.mL-1, equivalente al patrón 1 de la
escala de McFarland (Angulo-Cortés et al., 2012). Cada cepa bacteriana se inoculó por
triplicado mediante siembra masiva en el medio de cultivo, y las cepas restantes se
inocularon impregnando discos de papel filtro estériles de 5 mm Whatman N° 4. Las
cajas se llevaron a incubación por 24 horas a 32 ± 2 °C. Las pruebas de compatibilidad
se evaluaron por la formación o no de halo de inhibición entre las cepas.
4.5.2
Pruebas de antagonismos in vivo
La evaluación de las cepas bacterianas con mayor potencial antagónico contra F.
oxysporum bajo condiciones de invernadero, se realizó con las bacterias que presentaron
porcentajes de inhibición del crecimiento del fitopatógeno mayor o igual a 30.00% en las
pruebas de antagonismo in vitro mediante enfrentamiento dual. Asimismo, la capacidad
de control biológico contra F. oxysporum en condiciones in vivo se evaluó empleando en
consorcio las cepas bacterianas con la mayor capacidad antagónica contra el patógeno a
nivel in vitro, y que al evaluarse en laboratorio mediante pruebas de compatibilidad no
mostraron inhibición de crecimiento entre ellas.
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
28
_______________________________________________________________________________________________________________________________
En invernadero, se estableció un diseño experimental completamente al azar con dos
repeticiones en el tiempo empleando 30 tratamientos correspondientes a la inoculación
de las bacterias antagonistas y los controles. Por cada tratamiento se establecieron seis
réplicas, para un total de 180 unidades muestreales compuestas cada una, por una
plántula de uchuva de 30 días de edad aproximadamente. Se hizo inmersión del sistema
radicular de las plántulas de uchuva en cada una de las suspensiones bacterianas las
cuales fueron ajustadas a una concentración de 1 x 108 células.mL-1. Posteriormente, las
plántulas fueron trasplantadas a bolsas de polietileno con 1000 g de suelo previamente
esterilizado e infestado con una suspensión conidial de F. oxysporum en concentración
de 1 x 105 conidias.mL-1. La viabilidad de las esporas de F. oxysporum inoculadas se
evaluó in vitro determinando el porcentaje de germinación de conidias empleando la
misma suspensión conidial utilizada para la infestación del suelo.
Como control absoluto se sustituyó la suspensión bacteriana por agua destilada estéril
sembrando las plántulas de uchuva en suelo no infestado con F. oxysporum, y como
control negativo la raíz de las plántulas fue inmersa en agua destilada estéril y sembrada
en suelo infestado con F. oxysporum. Como control positivo, se empleó la suspensión de
la cepa Ps. fluorescens Pfl 107. Para el caso de los consorcios bacterianos, se
establecieron tres tratamientos (G): G1 y G2: bacterias seleccionadas aleatoriamente del
total de bacterias que inhibieron el crecimiento de F. oxysporum en 79.00% o más en
promedio en las dos pruebas de antagonismo in vitro. G3: bacterias en combinación de
los tratamientos G1 y G2. El efecto de las rizobacterias inoculadas sobre la patogenicidad
de F. oxysporum y el avance de la enfermedad en las plantas se evaluó durante 35 días
en invernadero, regándolas día de por medio manteniéndolas a capacidad de campo. Se
evaluó semanalmente la severidad de la enfermedad empleando la escala de severidad
establecida para las pruebas de patogenicidad, y se estableció la incidencia de la
enfermedad a partir del número de plántulas afectadas.
Se calculó la incidencia de la enfermedad por cada rizobacteria, y con los datos promedio
de severidad se calculó el Área Bajo la Curva de Progreso de la Enfermedad (AUDPC),
empleando el paquete estadístico Package Agricolae Versión 1.1-2 (Mendiburu, 2012).
La incidencia y las AUDPCs se evaluaron mediante un Análisis de Varianza (ANOVA)
luego de cumplir con los supuestos de homoceasticidad mediante la prueba de Levene, y
de normalidad de los datos empleando la prueba de Shapiro-Wilk, y se compararon
empleando la Prueba de Rango Múltiple de Tukey con un nivel de significancia de
p<0.05. Los análisis fueron realizados con el programa estadístico R versión 2.15.1.
5.
5.1
RESULTADOS
FINCAS DE ESTUDIO
El aislamiento de Fusarium oxysporum y las rizobacterias antagónicas se llevó a cabo en
las fincas San Cayetano, La Copa y Santa Rosa, las cuales presentan diferencias en las
características físicas y químicas del suelo. Entre los parámetros físicos, el pH fue
fuertemente ácido para las fincas San Cayetano y La Copa, y moderadamente ácido en
la finca Santa Rosa, mientras que el porcentaje de materia orgánica fue mayor en la finca
San Cayetano con 18.10% y menor en la finca La Copa con 3.02%. En relación a las
características químicas, se observó un mayor contenido de aluminio y menor contenido
de calcio en la finca La Copa, y mayor concentración de fósforo en la finca San Cayetano
(Tabla 2).
Tabla 2. Características físicas del suelo de las fincas evaluadas.
Características físicas
FINCA
San
Cayetano
La Copa
Santa
Rosa
Texturaa
pH
Características químicas
MOb
(%)
Pc
(ppm)
Kd
meq.100 g suelo-cmol.Kg-1
Ale
Caf
Mgg
Nah
CICi
Elementos menores
(ppm)
Fej
Mnk
Cul
Znm
FA
5.10
18.10
71.70
0.60
0.80
5.20
0.44
0.02
7.08
79.60
0.93
0.34
1.91
FArA
4.60
3.02
67.80
0.34
2.60
2.90
0.22
0.02
6.07
60.30
2.99
0.36
1.48
FA
5.60
15.60
54.60
0.66
0.00
10.10
0.76
0.03
11.50
102.00
3.65
1.97
21.20
a. Textura-FA: Franco Arenoso, FArA: Franco Arenoso Arcilloso. b. MO: Materia orgánica. c. P:
Fósforo. d. K: Potasio. e. Al: Aluminio. f. Ca: Calcio. g. Mg: Magnesio. h. Na: Sodio. i. CICE:
Capacidad de Intercambio Catiónico. j. Fe: Hierro. k. Mn: Manganeso. l. Cu: Cobre. m. Zn: Zinc.
5.2
AISLAMIENTO DE LAS BACTERIAS CON CAPACIDAD ANTAGÓNICA
FRENTE A Fusarium oxysporum ASOCIADAS A LA RIZÓSFERA DE
PLANTAS DE Physalis peruviana
El desarrollo de esta actividad consistió en la ejecución de dos fases, que en su orden
consistieron en el aislamiento del morfotipo virulento de F. oxysporum a partir de plantas
sintomáticas de P. peruviana diagnosticadas en campo, y el aislamiento de las bacterias
tanto endófitas de la raíz como las asociadas a suelo rizosférico de los cultivos de
uchuva.
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
30
_______________________________________________________________________________________________________________________________
5.2.1
Aislamiento de morfotipos de F. oxysporum
Para llevar a cabo este estudio, se consideró importante hacer un aislamiento de
morfotipos de F. oxysporum en cada una de las fincas evaluadas con el fin de identificar
el más virulento que podría estar causando la marchitez vascular en uchuva. De esta
forma, a partir de 18 muestras de tallo colectadas de plantas sintomáticas, seis por finca,
se obtuvieron 270 aislamientos fúngicos, de los cuales el 30.00% se aislaron de la finca
San Cayetano, el 40.00% de la finca La Copa y el 30.00% restante de la finca Santa
Rosa. Entre estos, y teniendo en cuenta la descripción morfológica de las colonias del
género Fusarium, los aislamientos se agruparon en 28 morfotipos, y de éstos, quince se
identificaron morfológicamente como F. oxysporum (Tabla 3) de acuerdo a la descripción
macroscópica de las colonias y a la observación de las microconidias, macroconidias y
clamidiosporas a partir de la siembra en los diferentes medios de cultivo (PDA, SNA,
CLA).
Tabla 3. Aislamiento de morfotipos de F. oxysporum por finca de muestreo.
FINCA
San Cayetano
La Copa
Santa Rosa
5.2.2
N°
muestras
6
6
6
Morfotipos del
género Fusarium
10
10
8
Morfotipos de
F. oxysporum
4
8
3
Pruebas de patogenicidad de F. oxysporum
Los quince morfotipos identificados como F. oxysporum fueron evaluados en las pruebas
de patogenicidad, de los cuales, trece manifestaron en las plántulas de uchuva, la
sintomatología correspondiente a marchitez vascular, mostrando, al día 35 después de la
inoculación, las características indicadas en la escala de severidad de la enfermedad
establecida, comenzando desde una marchitez leve, clorosis, epinastia en el peciolo,
pérdida de turgencia, marchitamiento medio, y posterior muerte de la planta (Figura 2).
Capítulo 5
31
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Figura 2. Escala de severidad de la marchitez vascular causada por F. oxysporum en
plántulas de Physalis peruviana.
Escala
Sintomatología
0
Ausencia de enfermedad
1
2
Evidencia de síntomas no
acentuados
(comienzo de epinastia en
peciolo, clorosis leve)
Abscisión de hojas
Epinastia acentuada
Encopamiento de hojas
3
Marchitamiento medio de la
planta
Inclinación del tallo principal
4
Muerte de la planta
Fenotipo
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
32
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Las esporas de los morfotipos de F. oxysporum inoculados (Figura 3) presentaron una
alta capacidad de germinación, con porcentajes superiores al 85.00%. Fox9, Fox12,
Fox19, Fox20, Fox32 y Fox34 presentaron una germinación de esporas del 100.00%. No
obstante, el morfotipo Fox36 registró la menor germinación con el 85.94% (Tabla 4).
Figura 3. Germinación de las esporas del fitopatógeno F. oxysporum. Se muestra en su
orden el proceso de formación del tubo germinal a partir de una espora germinada.
El período de incubación, tiempo en el que se evidenciaron los síntomas en la escala 2
de severidad de la enfermedad, fue de 14 a 21 días para trece de los morfotipos de F.
oxysporum, observando inicialmente una clorosis y marchitez leves, y retraso en el
crecimiento de las plántulas de uchuva con respecto al control. Sin embargo, Fox21 y
Fox34 no mostraron una sintomatología avanzada de fusariosis, la cual no superó la
escala 2 de severidad al día 35, y cuyos síntomas asociados fueron evidenciados solo
hasta el día 28 de evaluación (Tabla 4).
Capítulo 5
33
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Tabla 4. Porcentaje de germinación de las esporas de los morfotipos de F. oxysporum
evaluados en plántulas de uchuva.
Tratamiento
(T)
Fox1
Fox9
Fox12
Fox17
Fox18
Fox19
Fox20
Fox21
Fox27
Fox30
Fox32
Fox34
Fox35
Fox36
Fox39
C.Abs
Finca de
aislamiento
La Copa
La Copa
San Cayetano
San Cayetano
San Cayetano
Santa Rosa
Santa Rosa
San Cayetano
La Copa
La Copa
La Copa
La Copa
Santa Rosa
La Copa
La Copa
-
Porcentaje de
germinación (%)
93.40
100.00
100.00
96.77
97.12
100.00
100.00
96.88
97.58
93.40
100.00
100.00
92.94
85.94
97.96
-
Período de
incubación (días)
14
21
14
14
21
14
14
28
21
21
21
28
21
21
21
0
Los diferentes morfotipos de F. oxysporum presentaron una incidencia de marchitez
vascular igual o mayor al 70.00% al día 35 de evaluación mostrando diferencias
estadísticas significativas (p<0.05) entre ellos (Figura 4, Tabla 5). El 73.33% de los
morfotipos presentaron alta incidencia de la enfermedad con porcentajes entre 90.00 y
100.00% (Figura 4a, b, Tabla 5), mientras que el 26.67% restante presentaron una
incidencia media entre el 70.00 y 80.00% en donde los morfotipos Fox18 y Fox21 fueron
los de menor incidencia siendo los menos virulentos del total de aislamientos fúngicos
(Figura 4c, Tabla 5). No obstante, para efecto de visualizar la incidencia de la
enfermedad mostrada por cada morfotipo fúngico, la Figura 4 muestra en a y b una
incidencia alta, y la Figura 4c una incidencia media de marchitez vascular.
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
34
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Figura 4. Incidencia de la enfermedad a través del tiempo de evaluación de los
morfotipos de F. oxysporum inoculados en las plántulas de uchuva. Morfotipos de F.
oxysporum causantes de incidencia de la enfermedad alta (a, b) y media (c).
Capítulo 5
35
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Tabla 5. Incidencia y severidad de la enfermedad de los morfotipos de F. oxysporum
inoculados en las plántulas de uchuva al día 35 de evaluación. La misma letra indica que
no hubo diferencia significativa (p<0.05) según la prueba de rango múltiple de Tukey.
C.Abs: Control Absoluto.
Tratamiento
(T)
Fox17
Fox30
Fox19
Fox39
Fox12
Fox27
Fox36
Fox20
Fox1
Fox35
Fox32
Fox9
Fox34
Fox18
Fox21
C.Abs
Finca de
aislamiento
Incidencia de la
enfermedad
(%)
San Cayetano
La Copa
Santa Rosa
La Copa
San Cayetano
La Copa
La Copa
Santa Rosa
La Copa
Santa Rosa
La Copa
La Copa
La Copa
San Cayetano
San Cayetano
-
100.00
a
100.00
a
100.00
a
100.00
a
100.00
a
100.00
a
100.00
a
100.00
ab
90.00
ab
90.00
ab
90.00
ab
80.00
ab
80.00
ab
70.00
ab
70.00
b
0.00
a
Nivel de
incidencia de
la enfermedad*
Severidad de la
enfermedad
(AUDPC)
A
A
A
A
A
A
A
A
M
M
M
B
B
B
B
-
40.42
a
36.05
a
35.70
a
35.70
ab
33.25
ab
32.55
abc
29.05
abc
26.25
abc
26.95
abc
26.95
abcd
25.20
ab
32.90
bcd
8.05
abcd
21.00
cd
7.00
d
0.00
a
Nivel de
severidad de la
enfermedad*
A
A
A
A
M
M
M
M
M
M
B
M
B
B
B
-
*Los niveles de incidencia y severidad de la enfermedad corresponden a: alta (A), media (M) y
baja (B). AUDPC: Área Bajo la Curva de Progreso de la Enfermedad.
El Área Bajo la Curva de Progreso de la Enfermedad (AUDPC) fue estadísticamente
diferente (p<0.05) entre los diferentes morfotipos de F. oxysporum durante los 35 días de
evaluación. El 26.67% de los aislados patogénicos presentaron severidad de la
enfermedad alta con valores de AUDPCs entre 35.00 y 41.00, siendo Fox17 el más
virulento con un AUDPC de 40.42, seguido de los morfotipos Fox30, Fox19 y Fox39
(Tabla 5, Figura 5a). Entre tanto, el 46.67% de los morfotipos (Fox12, Fox9, Fox27,
Fox36, Fox1, Fox35 y Fox20) registraron severidad media de la enfermedad con
AUDPCs entre 26.00 - 34.00 (Tabla 5, Figura 5b), mientras que el 26.67% restante
(Fox32, Fox18, Fox34 y Fox21) causaron la severidad de la enfermedad más baja con
AUDPCs de 0.00 - 21.00, siendo Fox34 y Fox21 los que al final del período de evaluación
no registraron síntomas avanzados de marchitez vascular, observando una leve epinastía
en el peciolo y clorosis no acentuada en las plántulas de uchuva (Tabla 1, Figura 5c).
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
36
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Figura 5. Severidad de la enfermedad a través del tiempo de evaluación de los
morfotipos de F. oxysporum inoculados en las plántulas de uchuva. Morfotipos de F.
oxysporum causantes de severidad de la enfermedad alta (a), media (b) y baja (c).
5.2.3
Aislamiento de rizobacterias antagonistas contra F. oxysporum
El número de cepas bacterianas endófitas de la raíz y las aisladas de suelo rizosférico
varió entre las fincas de estudio. Del total de aislamientos, el 39.00% pertenecen a la
finca San Cayetano, el 35.63% a la finca La Copa, y el 25.37% a la finca Santa Rosa. El
mayor recuento de bacterias endófitas de la raíz correspondió a los bacilos Gram
positivos, incluyendo las unidades formadoras de colonia (UFC) aisladas de agar nutritivo
Capítulo 5
37
_______________________________________________________________________________________________________________________________
(AN) y los formadores de endoespora crecidos en agar tripticasa de soya (ATS) luego de
choque térmico, aislando el mayor número de estas bacterias en la finca La Copa (Tabla
6).
Entre tanto, en las muestras de suelo rizosférico predominaron los bacilos Gram
negativos teniendo en cuenta los aislamientos de AN y los del género Pseudomonas
aislados de King B, registrando el mayor recuento bacteriano en la finca La Copa (Tabla
6).
Tabla 6. Aislamientos bacterianos endófitos de la raíz y asociados a suelo rizosférico en
las tres fincas de estudio.
-1
Endófitas de la raíz (Log UFC g )
Finca
San Cayetano
La Copa
Santa Rosa
King B
Pseudomonas
spp.
4.00
5.87
0.00
ATS
Bacilos Gram (+)
formadores de
espora
4.60
7.28
5.70
AN
Bacilos
Gram (+)
6.14
5.83
5.73
Bacilos
Gram (-)
6.65
6.01
5.83
Cocos
Gram (+)
4.70
0.00
0.00
-1
Suelo rizosférico (Log UFC g )
Finca
San Cayetano
La Copa
Santa Rosa
King B
Pseudomonas
spp.
5.04
5.81
0.00
ATS
Bacilos Gram (+)
formadores de
espora
5.52
6.04
5.64
AN
Bacilos
Gram (+)
6.70
6.59
6.81
Bacilos
Gram (-)
6.39
7.36
6.54
Cocos
Gram (+)
5.85
0.00
0.00
King B: Medio King B, ATS: Medio Agar Tripticasa de Soya, AN: Medio Agar Nutritivo.
5.3
SELECCIÓN DE LAS BACTERIAS CON CAPACIDAD ANTAGÓNICA
CONTRA Fusarium oxysporum EN CONDICIONES in vitro
La selección de las bacterias antagónicas contra F. oxysporum se realizó inicialmente
mediante la prueba de antagonismo in vitro mediante enfrentamiento dual I (Figura 6), a
partir de 117 morfotipos bacterianos obtenidos del total de colonias aisladas (teniendo en
cuenta las descripciones macroscópica y microscópica realizadas) contra el morfotipo
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
38
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Fox17, el cual presentó la mayor incidencia y severidad de marchitez vascular en las
pruebas de patogenicidad realizadas.
Figura 6. Inhibición generada por las bacterias endófitas de la raíz y aisladas de suelo
rizosférico de plantas de uchuva sobre el crecimiento micelial de F. oxysporum (Fox17)
empleando la prueba de antagonismo in vitro mediante enfrentamiento dual I.
De estos morfotipos bacterianos, 24 mostraron capacidad antagónica mayor al 30.00%
contra el fitopatógeno, de los cuales el 54.17% fueron bacilos Gram positivos, y el
45.83% formas bacilares Gram negativas. De estas bacterias antagónicas, el 58.33%
fueron endófitas de la raíz, mientras que de las muestras de suelo rizosférico se aisló el
41.67% restante (Anexo 1). De este modo, la diversidad de las rizobacterias antagónicas
estuvo representada por cuatro géneros, de los cuales Bacillus fue el más predominante
con el 54.17% de los morfotipos, seguido de Enterobacter y Pseudomonas (20.83% cada
uno) y Providencia (4.17%).
Los resultados de esta prueba de antagonismo in vitro mostraron que el 75.00% de las
cepas antagonistas (18 morfotipos) presentaron mayor capacidad de inhibición de F.
Capítulo 5
39
_______________________________________________________________________________________________________________________________
oxysporum con respecto al control positivo comercial a base de Trichoderma koningiopsis
y al control positivo Pseudomonas fluorescens Pfl 107, presentando porcentajes de
inhibición entre 76.58% en E. amnigenus MB097 y 91.45% en Pseudomonas sp. MB108
y B. licheniformis MB109. De estos aislamientos antagonistas, el 29.17% fue
estadísticamente diferente a los dos controles positivos (p<0.05) los cuales presentaron
porcentajes de inhibición de 73.24 y 72.49%, respectivamente (Figura 7, Anexo 1).
Figura 7. Porcentaje de inhibición del crecimiento micelial de F. oxysporum (Fox17)
originado por las bacterias antagonistas empleando la prueba de antagonismo in vitro
mediante enfrentamiento dual I. Las barras representan el error estándar de la media. La
misma letra sobre las barras indica que no hubo diferencia significativa (p<0.05) según la
prueba de rango múltiple de Tukey. C.Abs: Control Absoluto. C.Pos: Control Positivo.
C.PosC: Control Positivo Comercial.
Al realizar una segunda prueba de antagonismo in vitro mediante enfrentamiento dual
entre las bacterias antagonistas y el morfotipo Fox17 (Figura 8), se observó que los
porcentajes de inhibición del crecimiento del patógeno fueron más bajos en relación con
la primera prueba de antagonismo in vitro. Sin embargo, todos los morfotipos bacterianos
presentaron porcentajes de inhibición superiores al 30.00% y menores al 80.00% (Figura
9).
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
40
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Figura 8. Inhibición generada por las bacterias endófitas de la raíz y las aisladas de
suelo rizosférico de plantas de uchuva sobre el crecimiento micelial de F. oxysporum
(Fox17) empleando la prueba de antagonismo in vitro mediante enfrentamiento dual II.
Bacillus sp. MB015 mostró el mayor potencial antagónico con una inhibición del
desarrollo micelial del fitopatógeno de 79.14%, mientras que B. subtilis MB025, E.
amnigenus MB097, Providencia sp. MB106, Ps. fluorecens MB111 y B. megaterium
MB112, presentaron porcentajes de inhibición entre 70.00 y 75.00%. B. subtilis MB003
fue la cepa de menor capacidad antagónica presentando un 34.59% de inhibición. En
general, el 12.50% de las cepas bacterianas mostró una capacidad biocontroladora
estadísticamente diferente (p<0.05) al control positivo comercial T. koningiopsis y al
control positivo Ps. fluorescens Pfl 107, los cuales presentaron porcentajes de inhibición
de 74.81 y 66.17%, respectivamente (Figura 9, Anexo 1).
Capítulo 5
41
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Figura 9. Porcentaje de inhibición del crecimiento micelial de F. oxysporum (Fox17)
originado por las bacterias antagonistas empleando la prueba de antagonismo in vitro
mediante enfrentamiento dual II. Las barras representan el error estándar de la media. La
misma letra sobre las barras indica que no hubo diferencia significativa (p<0.05) según la
prueba de rango múltiple de Tukey. C.Abs: Control Absoluto. C.Pos: Control Positivo.
C.PosC: Control Positivo Comercial.
Las dos pruebas de antagonismo in vitro mediante enfrentamiento dual entre las
bacterias antagonistas y Fox17 presentaron una correlación lineal positiva y significativa
de 0.80 (p<0.05), indicando con ello, que la mayoría de los morfotipos bacterianos que
presentaron un alto porcentaje de inhibición en una de las pruebas de antagonismo dual
también presentó alto porcentaje en la otra prueba, incluyendo tanto el control positivo
Ps. fluorescens Pfl 107 como el control positivo comercial de T. koningiopsis (Figura 10).
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
42
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Figura 10. Correlación de las dos pruebas de antagonismo in vitro mediante
enfrentamiento dual entre las bacterias antagonistas y el morfotipo Fox17 de F.
oxysporum. C.Pos: Control Positivo. C.PosC: Control Positivo Comercial.
5.4
IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA Y MOLECULAR
DE LAS BACTERIAS CON MAYOR CAPACIDAD ANTAGÓNICA
CONTRA Fusarium oxysporum
5.4.1

Caracterización bioquímica de las bacterias con mayor potencial
antagónico contra F. oxysporum
Producción de ácido 3-indol acético (AIA)
La evaluación cualitativa por colorimetría de producción de ácido 3-indol acético (AIA)
sintetizado a partir del triptófano adicionado al medio de cultivo, permitió evidenciar que
las bacterias antagónicas del morfotipo Fox17 de F. oxysporum produjeron AIA en
cantidades estadísticamente diferentes (p<0.05). El 62.50% de las bacterias,
correspondiente a 15 aislamientos, produjo más AIA que el control positivo Ps.
fluorescens Pfl 107. El 33.33% de los morfotipos bacterianos produjo en promedio más
de 50 µg. mL-1 de AIA, el 41.67% entre 3 y 25 µg. mL-1 y el 25.00% restante menos de 1
µg. mL-1. B. megaterium MB112 fue la cepa con mayor producción de esta fitohormona
con 96.07 µg. mL-1 (Figura 11, Anexo 2).
Capítulo 5
43
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Figura 11. Producción de ácido 3-indol acético (AIA) por los antagonistas bacterianos de
F. oxysporum. La misma letra sobre las barras indica que no hubo diferencia significativa
(p<0.05) según la prueba de rango múltiple de Tukey. C.Abs: Control Absoluto. C.Pos:
Control Positivo.

Solubilización de fosfatos
La capacidad de solubilización de fosfatos en condiciones in vitro se presentó en el
45.83% de las bacterias antagónicas (11 de 24 aislamientos), siendo en su mayoría
estadísticamente diferentes (p<0.05). Entre estas bacterias, el índice de solubilización de
fosfatos (IS) fue menor a 1.50, en donde E. amnigenus MB068 obtuvo un IS de 1.45
siendo estadísticamente igual al control positivo Ps. fluorescens Pfl 107, mientras que Ps.
fluorescens MB088 y Ps. fluorescens MB111 registraron la menor capacidad de
solubilización de fosfatos con IS de 1.08 y 1.10, respectivamente (Figura 12, Anexo 2).
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
44
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Figura 12. Índice de solubilización de fosfatos por los antagonistas bacterianos de F.
oxysporum. La misma letra sobre las barras indica que no hubo diferencia significativa
(p<0.05) según la prueba de rango múltiple de Tukey. C.Abs: Control Absoluto. C.Pos:
Control Positivo.

Producción de quitinasas y glucanasas
La producción de quitinasas fue negativa para todas las bacterias antagonistas de F.
oxysporum, mientras que la actividad glucanolítica, evidenciada por la capacidad de las
cepas bacterianas de utilizar la harina de cebada como fuente de carbono se registró en
15 de las 24 rizobacterias antagonistas, que corresponde al 62.50% de las cepas
biocontroladoras de F. oxysporum aisladas, las cuales presentaron en su mayoría
diferencias estadísticas significativas (p<0.05) en el tamaño del halo de clarificación, el
cual osciló en promedio entre 7.80 mm para E. amnigenus MB044 y 1.67 mm para E.
amnigenus MB009 (Figura 13, Anexo 2).
Capítulo 5
45
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Figura 13. Producción de glucanasas por los antagonistas bacterianos de F. oxysporum.
La misma letra sobre las barras indica que no hubo diferencia significativa (p<0.05)
según la prueba de rango múltiple de Tukey. C.Abs: Control Absoluto. C.Pos: Control
Positivo.

Producción de biosurfactantes
La producción de biosurfactantes a partir de la degradación de los lípidos presentes en el
medio por acción de las enzimas lipasas producidas por las bacterias antagonistas fue
observada en el 75.00% de ellas. Solo el 25.00% de las bacterias no mostró tener esta
capacidad. El 54.17% de las cepas antagonistas (13 de 24 aislamientos) produjo más
biosurfactantes con respecto al control positivo Ps. fluorescens Pfl 107, de las cuales el
25.00% mostró diferencias estadísticas significativas (p<0.05), siendo Ps. fluorescens
MB113 la de mayor producción con un tamaño promedio de halo de clarificación de 4.00
mm. B. subtilis MB003, E. amnigenus MB009, B. subtilis MB025, B. subtilis MB055 y Ps.
fluorescens MB103 produjeron menos biosurfactantes siendo estadísticamente similares
(Figura 14, Anexo 2).
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
46
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Figura 14. Producción de biosurfactantes por los antagonistas bacterianos de F.
oxysporum. La misma letra sobre las barras indica que no hubo diferencia significativa
(p<0.05) según la prueba de rango múltiple de Tukey. C.Abs: Control Absoluto. C.Pos:
Control Positivo.

Producción de compuestos volátiles orgánicos
La inhibición del crecimiento de F. oxysporum a partir de la producción de compuestos
volátiles orgánicos (CVOs) por las bacterias antagónicas fue inferior al 20.00% no siendo
diferentes estadísticamente (p<0.05) entre ellas. Entre tanto, el 83.33% de las cepas
bacterianas inhibieron en mayor porcentaje el crecimiento del patógeno con respecto al
control positivo Ps. fluorescens Pfl 107, con variaciones en la inhibición entre 19.82 y
19.59% por las cepas B. subtilis MB055 y Ps. fluorescens MB088, respectivamente, a
4.05% por E. amnigenus MB044 (Figura 15, Anexo 2).
Capítulo 5
47
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Figura 15. Porcentaje de inhibición del crecimiento de F. oxysporum por producción de
compuestos volátiles orgánicos por los antagonistas bacterianos. La misma letra sobre
las barras indica que no hubo diferencia significativa (p<0.05) según la prueba de rango
múltiple de Tukey. C.Abs: Control Absoluto. C.Pos: Control Positivo.
Al agrupar a las bacterias antagonistas por su similitud en cuanto a las características
bioquímicas evaluadas en condiciones in vitro mediante un análisis de componentes
principales (ACP), se evidencia que el 65.80% de la variabilidad es explicada por dos
ejes. Las variables que más aportaron al eje 1 fueron la producción de biosurfactantes, la
solubilización de fosfatos y la producción de ácido 3-indol acético (AIA), mientras que la
producción de glucanasas y compuestos volátiles orgánicos (CVOs) fueron las variables
que más aportaron al eje 2 (Figura 16).
No obstante, a partir de la combinación lineal de las variables con base al ACP, las
rizobacterias se agruparon en cinco clases (cl) diferentes de acuerdo a su similitud en la
caracterización bioquímica, de forma que teniendo en cuenta el eje 2, la clase 1 agrupó al
25.00% de las bacterias antagónicas que, aunque presentaron los menores valores en
las cinco características bioquímicas evaluadas, mostraron una mayor similitud en la
producción de biosurfactantes y de AIA (Figura 16, Anexo 2).
Entre tanto, la clase 2 agrupó al 16.67% de las bacterias con mayor similitud en la
capacidad en la solubilización de fosfatos, mientras que la clase 3 agrupó al 29.17% de
las cepas que produjeron más CVOs y glucanasas. La clase 4 concentró el 12.50% de
las bacterias por su similitud en la solubilización de fosfatos, y la clase 5 estuvo
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
48
_______________________________________________________________________________________________________________________________
representada por el 16.67% de las cepas similares en la producción de biosurfactantes y
de AIA (Figura 16, Anexo 2).
Figura 16. Análisis de Componentes Principales (ACP) para el agrupamiento de las
rizobacterias antagonistas del morfotipo Fox17 de F. oxysporum de acuerdo a su similitud
en las características bioquímicas evaluadas. cl1-5: Clase 1-5.
5.5
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTAGÓNICA DE LAS BACTERIAS
SELECCIONADAS CONTRA Fusarium oxysporum BAJO CONDICIONES
DE INVERNADERO EN PLÁNTULAS DE UCHUVA
La evaluación in vivo de la capacidad antagónica de cada una de las rizobacterias
seleccionadas contra el morfotipo F. oxysporum Fox17 en comparación con el control
positivo Ps. fluorescens Pfl 107 y el control con suelo infestado con Fox17 sin bacteria,
mostró diferencias estadísticas significativas (p<0.05), en donde las cepas bacterianas
mostraron inhibición en menor o mayor grado del desarrollo del patógeno inoculado en el
Capítulo 5
49
_______________________________________________________________________________________________________________________________
suelo (Tabla 7) con Áreas Bajo la Curva de Progreso de la Enfermedad (AUDPCs) entre
0 - 20.00 (Figura 17a), de 20.10 - 28.00 (Figura 17b), de 28.10 - 40.00 (Figura 17c) y de
40.10 - 51.00 (Figura 17d).
Ps. fluorescens MB103, B. subtilis MB025 y E. amnigenus MB009 fueron los morfotipos
con mayor potencial biocontrolador in vivo (AUDPC= 7.53, 10.79, 11.84,
respectivamente), no mostrando al día 35 de evaluación, una sintomatología avanzada
de marchitez vascular en comparación con el control con suelo infestado con Fox17 sin
bacteria y con los demás tratamientos incluido el control positivo (Tabla 7, Figura 17a).
De otra parte, con la inoculación de B. subtilis MB055, E. amnigenus MB068,
Pseudomonas sp. MB108 y B. licheniformis MB109, no se observó una inhibición del
desarrollo del patógeno al final del período de evaluación presentándose una mayor
severidad de la enfermedad en comparación con el control con suelo infestado con
Fox17 (Tabla 7, Figura 17d).
Los consorcios bacterianos establecidos a partir de las cepas que en laboratorio
mostraron los mejores resultados de inhibición del desarrollo micelial de Fox17 (mayor o
igual a 79.00%), fueron menos efectivos que la inoculación de las bacterias antagonistas
por separado, a pesar de que al realizar pruebas de antagonismo in vitro entre ellas,
éstas fueron compatibles entre sí. Es así como G1 (conformado por Bacillus sp. MB015,
E. amnigenus MB068 y Providencia sp. MB106) y G2 (por Pseudomonas sp. MB108 y B.
licheniformis MB109) registraron valores de AUDPCs de 42.00 y 50.40, respectivamente
(Figura 17d), evidenciando, hasta el día 25 para G1 y hasta el día 30 para G2 un mayor
número de plántulas con síntomas de marchitez vascular con respecto al control con
suelo infestado con el patógeno. La inoculación de las cinco rizobacterias (G3) fue más
efectiva que G1 y G2, aunque hacia el día 35 de evaluación, el progreso de la
enfermedad fue avanzado con un AUDPC de 33.08 (Figura 17c).
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
50
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Tabla 7. Incidencia y severidad de la enfermedad en las plántulas de uchuva inoculadas
con las rizobacterias antagonistas del morfotipo Fox17 de F. oxysporum. La misma letra
indica que no hubo diferencia significativa (p<0.05) según la prueba de rango múltiple de
Tukey. C.Abs: Control Absoluto. C.Pos: Control Positivo.
Tratamientos
(T)
MB103
MB112
MB025
MB012
MB032
MB009
MB088
MB097
MB050
MB067
MB031
MB015
G3
MB044
MB104
MB113
MB083
MB051
MB111
G1
MB106
MB068
MB003
MB109
MB055
MB108
G2
C.Abs
C.Pos
C+Fox17
Incidencia de la
enfermedad
(%)
ab
16.67
ab
16.67
ab
25.00
ab
25.00
ab
25.00
ab
33.33
ab
33.33
ab
41.67
ab
41.67
ab
41.67
ab
41.67
ab
50.00
ab
50.00
ab
58.33
ab
58.33
ab
58.33
ab
66.67
ab
66.67
ab
66.67
ab
75.00
ab
83.33
ab
83.33
ab
91.67
ab
91.67
ab
91.67
a
100.00
a
100.00
b
0.00
ab
33.33
a
100.00
Nivel de
Incidencia de la
enfermedad*
B
B
B
B
B
MB
MB
MB
MB
MB
MB
MA
MA
MA
MA
MA
MA
MA
MA
MA
A
A
A
A
A
A
A
MB
A
Severidad de la
enfermedad
(AUDPC)
ij
7.53
efghij
17.79
hij
10.79
ghij
12.83
fghij
15.17
hij
11.84
defghij
21.88
fghij
15.69
fghij
17.50
defghij
22.17
cdefghij
23.71
abcdefghi
29.75
abcdefgh
33.08
cdefghij
24.21
abcdefghi
29.17
abcdefghi
31.27
bcdefghi
25.46
abcdefghi
27.52
abcdefghi
29.17
abcde
42.00
abcdefghi
31.21
abc
47.19
abcdef
38.50
abcd
45.85
a
50.17
ab
49.29
a
50.40
j
0.00
efghij
18.96
abcdefg
36.75
Nivel de
Severidad de la
enfermedad*
B
B
B
B
B
B
MB
B
B
MB
MB
MA
MA
MB
MA
MA
MB
MB
MA
A
MA
A
MA
A
A
A
A
B
MA
*Los niveles de incidencia y severidad de la enfermedad corresponden a: A= Alto, MA= Medio
Alto, MB= Medio Bajo, B= Bajo. AUDPC: Área Bajo la Curva de Progreso de la Enfermedad.
Capítulo 5
51
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Figura 17. Área Bajo la Curva de Progreso de la Enfermedad (AUDPC) a partir de la
capacidad antagónica in vivo de las rizobacterias contra el morfotipo Fox17 de F.
oxysporum a través del tiempo de evaluación en plántulas de uchuva. Severidad de la
enfermedad baja (a), media baja (b), media alta (c) y alta (d).
La incidencia de marchitez vascular en las plántulas de uchuva fue menor para todos los
tratamientos de las bacterias antagónicas de F. oxysporum (p<0.05) en comparación con
el control con suelo infestado con Fox17 sin bacteria (Tabla 7, Figura 18). Las bacterias
con mayor potencial controlador presentaron porcentajes de incidencia al día 35 de
evaluación de 16.67% para Ps. fluorescens MB103 y B. megaterium MB112 (Figura 18a),
y de 33.33% para E. amnigenus MB009 y Ps. fluorescens MB088 (Figura 18b). Otros
morfotipos antagonistas menos efectivos en condiciones de invernadero mostraron una
incidencia media de la enfermedad al final del tiempo de evaluación de 50.00% en
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
52
_______________________________________________________________________________________________________________________________
Bacillus sp. MB015 y G3 (Figura 18c), y una incidencia alta de 100.00% para
Pseudomonas sp. MB108 y G2 (Figura 18d).
Figura 18. Incidencia de la enfermedad a partir de la estimación de la capacidad
antagónica in vivo de las rizobacterias contra el morfotipo Fox17 de F. oxysporum a
través del tiempo de evaluación en plántulas de uchuva. Aislamientos con una incidencia
de la enfermedad baja (a), media baja (b), media alta (c) y alta (d).
Los consorcios bacterianos inoculados en las plántulas de uchuva mostraron una mayor
incidencia de marchitez vascular si se compara con lo observado en las plántulas
inoculadas con las cepas por separado que conformaron estos tratamientos. En este
Capítulo 5
53
_______________________________________________________________________________________________________________________________
sentido, el consorcio G1 mostró una incidencia de la enfermedad del 75.00% al día 35 de
evaluación (Figura 18c), no obstante, entre las cepas que lo conformaron, Bacillus sp.
MB015 presentó una menor incidencia con 50.00% (Figura 18c), mientras que E.
amnigenus MB068 y Providencia sp. MB106 mostraron cada una, una incidencia de
83.33% (Figura 18d).
Entre tanto, el tratamiento G2 mostró una incidencia de la enfermedad del 100.00%
(Figura 18d), similar a la incidencia evidenciada en las plántulas inoculadas con las
bacterias que lo conformaron (Pseudomonas sp. MB108 y B. licheniformis MB109 con
incidencia del 100.00 y 91.67%, respectivamente, Figura 18d). No obstante, el consorcio
G3 mostró la menor incidencia entre los tres establecidos con una incidencia de 50.00%
(Figura 18c). A pesar de ello, de las cinco rizobacterias que lo conformaron (bacterias de
G1 y de G2), solo Bacillus sp. MB015 presentó una incidencia de la enfermedad similar
en comparación con la registrada para este consorcio (Figura 18c).
6.
DISCUSIÓN
La evaluación de la patogenicidad de los morfotipos de Fusarium oxysporum aislados de
plantas sintomáticas de Physalis peruviana, permitió diferenciar claramente la
sintomatología característica de la patología conocida como marchitez vascular, la cual
es comparable con lo observado en campo. De esta forma, en condiciones de
invernadero, los grados de la escala de severidad establecida mostraron cada uno de los
síntomas que evidenciaron el progreso de la enfermedad a través del tiempo de
evaluación. En este sentido, Jiménez et al. (2012), Ortiz (2012) y Enciso-Rodríguez et al.
(2013) evaluaron en uchuva, la sintomatología causada por F. oxysporum mediante
pruebas de patogenicidad describiendo síntomas similares de fusariosis en escalas de
severidad diferentes a la establecida en este estudio.
No obstante, el aislamiento de quince morfotipos de F. oxysporum diferentes entre sí
morfológicamente y por el grado de incidencia y severidad de marchitez vascular que
ocasionaron en las plántulas de uchuva, evidencia una alta variabilidad del patógeno,
enfermedad que en campo es favorecida principalmente por algunas características del
suelo como la presencia de un pH ácido y bajo contenido de materia orgánica (Römheld
and Neumann, 2006), características físicas que a su vez inhiben la competencia de las
bacterias en el suelo (Castro, 1998). Teniendo en cuenta lo anterior, en la finca La Copa
se presentó un bajo porcentaje de materia orgánica pero un buen número de bacterias
aisladas con relación a las otras dos fincas. Estas condiciones mencionadas podrían
explicar la mayor diversidad de morfotipos patogénicos de F. oxysporum encontrada en
esta finca, los cuales mostraron en las pruebas de patogenicidad una alta incidencia y
severidad de marchitez vascular. Al respecto, Gómez (2012), menciona que la
variabilidad de las poblaciones de F. oxysporum, las relaciones filogenéticas y su
evolución se han determinado en función de la patogenicidad, cuya variación temporal
podría estar condicionada por características favorables del suelo y al continuo cambio
de cultivares comerciales utilizados por los productores, lo que ha dado lugar a la
evolución de la diversidad de la población del patógeno, beneficiando a los aislados más
adaptados, es decir, a los más virulentos.
La proporción de bacterias encontradas en esta investigación permitió obtener una visión
general de la comunidad bacteriana cultivable asociada a las plantas de P. peruviana.
Entre las fincas de estudio, San Cayetano presentó la mayor abundancia de rizobacterias
con predominio del género Bacillus, lo que podría estar favorecido por la influencia de
algunas características del suelo como por ejemplo, un pH de 5.10, un contenido de
materia orgánica de 18.10% y una cantidad de fósforo disponible de 71.70 ppm, las
cuales fueron mayores para esta finca con respecto a las otras dos. Esto ya ha sido
reportado anteriormente por Calvo et al. (2008), quienes encontraron un mayor número
Capítulo 6
55
_______________________________________________________________________________________________________________________________
de aislamientos de Bacillus spp. asociados a la rizósfera de cultivos de papa sembrados
en suelos ácidos con pH de 5.80, porcentaje de materia orgánica de 6.60% y cantidad de
fósforo de 20.12 ppm.
La evaluación in vitro de la capacidad antagónica de los morfotipos bacterianos aislados
para actuar como agentes de control biológico contra F. oxysporum asociado al mismo
cultivo, dio como resultado el aislamiento de 24 cepas bacterianas entre endófitas de la
raíz y asociadas a suelo rizosférico. No obstante, el número de aislamientos encontrado
en este trabajo fue mayor al reportado por Urrea et al. (2011), quienes encontraron este
efecto inhibitorio en nueve cepas bacterianas aisladas de la rizósfera de plantas de
uchuva. Si bien, se han aislado rizobacterias antagonistas contra F. oxysporum en
uchuva (Urrea et al., 2011; Zapata et al., 2012), no se ha realizado su caracterización
bioquímica para dilucidar los mecanismos de acción involucrados en el biocontrol, siendo
considerado éste, un aspecto de gran importancia, ya que autores como Bloemberg and
Lugtenberg (2001) y Raaijmakers y colaboradores (2009), mencionan que las bacterias
asociadas a las raíces de las plantas tanto las de vida libre como las endófitas utilizan
diversos mecanismos para promover el crecimiento de las plantas y son agentes
potenciales para el control biológico de agentes fitopatógenos del suelo.
Entre las cepas bacterianas aisladas con potencial antagónico, el 58.33% fueron
endófitas de la raíz en comparación con el 41.67% de las aisladas de suelo rizosférico.
No obstante, a pesar de que la diferencia en la proporción de estos dos grupos
bacterianos no fue destacada, este mayor número de endófitos antagonistas podría estar
relacionado con lo mencionado por Momota y colaboradores (2012), quienes señalan que
en el interior de estructuras vegetales como los tejidos radicales, la disponibilidad de
nutrientes es mayor aunque el número de bacterias es menor. Por otra parte, en el suelo
rizosférico la diversidad y número de bacterias es muy grande dando lugar a que exista
una fuerte competencia por los nutrientes haciendo su disponibilidad limitada, además de
que se presenta un ambiente más inestable que en el interior de la raíz en el que las
bacterias sufren cambios fuertes de pH, temperatura y humedad (Hallmann et al., 1997).
Algunos estudios indican que la capacidad de las bacterias como agentes
biocontroladores es mayor en endófitas comparados con rizobacterias (Sessitsch et al.,
2004), debido posiblemente a que las bacterias endófitas colonizan un nicho ecológico
similar al que colonizan los patógenos por lo que se adaptan mejor que las bacterias
rizosféricas al estar en contacto directo con las células del hospedero (Hallmann et al.,
1997). Es así como la capacidad biocontroladora de bacterias endófitas de la raíz ha sido
evaluada en diversas plantas de interés agrícola que son atacadas por diversos
fitopatógenos (Momota et al., 2012; Soler et al., 2012). Entre estos, algunos trabajos
recientes han evaluado la capacidad biocontroladora de estas bacterias contra formas
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
56
_______________________________________________________________________________________________________________________________
especiales de F. oxysporum, como el de Jha et al. (2013), quienes encontraron este
potencial biocontrolador en Pseudomonas fluorescens y Ps. chlororaphis, responsables
del control de la pudrición de raíz causada por F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici en
tomate, y Bacillus pumilus para el control de F. oxysporum f. sp. pisi en leguminosas y de
F. oxysporum f. sp. vasinfectum en plantas de algodón.
Al realizar las pruebas de antagonismo in vitro se encontró que las mejores cepas con
capacidad de inhibir el desarrollo micelial de F. oxysporum correspondieron a especies
del género Bacillus. Este género es considerado como uno de los colonizadores más
comunes de las plantas (Mahaffee and Kloepper, 1997), que desempeña un papel
importante en el biocontrol de patógenos vasculares (Kloepper and Ryu, 2006; Weber et
al., 2007; Narayanasamy, 2013a), y el cual destina a la síntesis de antibióticos entre el 4–
5% de su genoma (Stein, 2005). Entre estos antibióticos producidos por este
microorganismo, se encuentran lipopéptidos cíclicos de las familias de las surfactinas,
iturinas y fengicinas, que son compuestos antimicrobianos que causan daño en la
membrana celular de los patógenos ocasionando vacuolización (Ongena and Jacques,
2008). En las evaluaciones realizadas in vitro, lo anterior es similar a lo registrado por
Zapata et al. (2012) quienes reportaron, igualmente en uchuva, un mayor potencial
antagónico de cepas del género Bacillus para inhibir el crecimiento de F. oxysporum,
pero al tener en cuenta los ensayos de antagonismo in vivo, una cepa del género
Pseudomonas (Ps. fluorescens MB103) fue la más antagónica siendo este registro
similar al reportado por Urrea et al. (2011), quienes encontraron mayor efecto inhibitorio
de una cepa de Ps. fluorescens contra F. oxysporum aislada de la rizósfera de uchuva.
Profundizando en las características bioquímicas que presentan las bacterias que
podrían influir directamente sobre el crecimiento de la planta o intervenir en la interacción
antagonista-fitopatógeno, la producción de ácido 3-indol acético, la solubilización de
fosfatos y la producción de enzimas líticas, biosurfactantes y compuestos volátiles
orgánicos fueron las características bioquímicas evaluadas en esta investigación que
podrían presentar las cepas bacterianas aisladas.
De esta forma, todas las cepas antagónicas de F. oxysporum produjeron ácido 3-indol
acético (AIA) a diferentes concentraciones, siendo la síntesis de sustancias de regulación
del crecimiento vegetal, una de las características asociadas a rizobacterias tanto epífitas
como endófitas que actúan como Bacterias Promotoras de Crecimiento Vegetal - PGPR
(Suzuki et al., 2003). Además, merece mencionar que se ha estimado que alrededor del
80% de las bacterias asociadas a la rizósfera pueden producir AIA (Patten and Glick,
2002). En este estudio, se destacan las cepas Pseudomonas sp. MB108, Ps. fluorescens
MB111, B. megaterium MB112 y Ps. fluorescens MB113, que produjeron altas
concentraciones de AIA con más de 80 µg.mL-1. Autores como Rives et al. (2009),
Capítulo 6
57
_______________________________________________________________________________________________________________________________
reportaron concentraciones de 45.80 – 56.00 μg.mL-1 de AIA producidas por Ps. putida
aislada de cultivos de arroz, y Hernández et al. (2004), registraron producciones entre
5.30 y 21.50 µg.mL-1 en rizobacterias asociadas al cultivo de maíz de los géneros
Burkholderia y Pseudomonas. Esta alta producción de AIA es atribuida por Badia y
colaboradores (2011) a la liberación de precursores como el triptófano en los exudados
radicales de las plantas que favorecen la síntesis de compuestos indólicos cuando se
establece una interacción fuerte y activa entre la bacteria y la planta.
El efecto de las PGPR en términos de la regulación de crecimiento vegetal desempeña
un papel importante, ya sea por estimulación de la elongación celular de la planta o por
división celular, producto de la síntesis bacteriana de AIA (Patten and Glick, 2002).
También, la producción de AIA es necesaria para una eficiente colonización de la
rizósfera (Zuñiga et al., 2013), y en diversos procesos de fitoestimulación, entre los que
se incluyen la regulación de la quiescencia y germinación de semillas, formación de
raíces, floración, ramificación y maduración de frutos (Patten and Glick, 2002; Idris et al.,
2007; López-Bucio et al., 2007), así como incrementa la resistencia de las plantas a
factores ambientales e induce o suprime la expresión de genes y síntesis de enzimas,
pigmentos y metabolitos (Tsavkelova et al., 2006).
Asimismo, la solubilización de fosfatos inorgánicos como la forma de hacer disponible el
fósforo asimilable por la planta, es otra de las maneras por la que las bacterias pueden
contribuir al crecimiento de las plantas. La mayor capacidad de solubilización de fosfatos
de las bacterias antagonistas se evidenció para el género Bacillus, aunque cuatro de las
cinco cepas aisladas del género Pseudomonas también mostraron esta capacidad,
siendo considerados como los géneros más eficientes dentro de este grupo funcional
(Wani et al., 2007, Patiño, 2010). No obstante, en este estudio también se aislaron otros
géneros solubilizadores como Enterobacter y Providencia. En el suelo, las bacterias
solubilizadoras de fosfato constituyen entre el 1 y 50% del total de la población
bacteriana, con una alta concentración en la rizósfera de las plantas (Khan et al., 2007).
Estas bacterias solubilizan el fosfato a partir de la producción de ácidos orgánicos
especialmente por la oxidación de glucosa a ácido glucónico, mediante la ruta de
oxidación directa, lo que a su vez está relacionado con la acidificación del medio de
cultivo (Naik et al., 2008), tal como se observó a nivel in vitro con todas las cepas
evaluadas sembradas en el medio SMRS1. Estos ácidos orgánicos solubilizan fosfatos a
través de la liberación de protones y por su habilidad para quelar iones de Ca2+, Fe3+ y
Al3+ (Chuang et al., 2007).
E. amnigenus MB068 fue el aislamiento con la mayor capacidad solubilizadora de
fosfatos presentando un índice de solubilización (IS) de 1.45, siendo a su vez una de las
cepas con mayor actividad antifúngica contra F. oxysporum en condiciones in vitro,
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
58
_______________________________________________________________________________________________________________________________
relación que ha sido también observada en algunos estudios que han reportado
rizobacterias solubilizadoras de fosfatos que son antagonistas de patógenos del suelo
como B. subtilis y Ps. fluorescens contra F. oxysporum fs. lycopersici (Khan and Khan,
2002), y Ps. fluorescens contra Botrytis cinerea, Phytium ultimum y Rhizoctonia solani
(Park et al., 2009).
La evaluación de la producción bacteriana de enzimas líticas evidenció que ninguna de
las cepas antagónicas mostró capacidad de producción de quitinasas, aspecto que
podría estar relacionado con el efecto de las condiciones del medio de cultivo, las cuales
desempeñan un papel importante en optimizar o inhibir la producción de esta enzima a
nivel in vitro (Jholapara et al., 2013). Entre estas condiciones, Jholapara et al. (2013),
evaluaron la producción de quitinasas a diferentes temperaturas y encontraron que la
temperatura óptima de incubación para una alta producción de quitinasas por especies
de Bacillus fue de 35 °C, lo que podría haber incidido en el por qué las bacterias
antagonistas, que en su mayoría correspondieron al género Bacillus, no mostraron esta
capacidad a una temperatura de 28 °C.
Entre tanto, más del 50.00% de las rizobacterias antagonistas mostraron capacidad de
producción de glucanasas, siendo éste, otro mecanismo de inhibición de fitopatógenos,
que al igual que las quitinasas, se caracterizan por ser enzimas hidrolíticas relacionadas
con la defensa de las plantas, que al unirse a la pared celular de los hongos, degradan el
β-1,3 glucano y la quitina, respectivamente (Compant et al., 2005; Chandran et al., 2007),
reduciendo así, el crecimiento y la germinación de esporas, y degradando las hifas del
patógeno en estados tardíos de la enfermedad (Chandran et al., 2007). Estudios
recientes han determinado que el efecto de quitinasas y glucanasas bacterianas
desempeña un papel importante en el control de Fusarium en distintos cultivos, como en
el biocontrol de F. oxysporum f. sp. cucumerinum en pepino (Chen et al., 2010), de
Fusarium spp., en jengibre (Shanmugam et al., 2012), y de F. oxysporum f. sp.
lycopersici en tomate por especies de Bacillus (Shanmugam et al., 2011; Ramyabharathi
et al., 2012).
La producción de biosurfactantes es otra de las características bioquímicas que poseen
las bacterias antagonistas para inhibir el crecimiento de patógenos, capacidad observada
en 18 de los antagonistas de F. oxysporum, siendo mayor en la cepa Ps. fluorescens
MB113. Similar a esto, algunos estudios han reportado que la producción de este
metabolito por Ps. fluorescens, podría ser una alternativa para el control de Phytium spp.
en cultivos de trigo (Mazzola et al., 2007), como mecanismo de inducción de resistencia
sistémica en la planta. No obstante, la mayoría de los aislados antagonistas en este
estudio productores de compuestos surfactantes pertenecen al género Bacillus, el cual es
conocido por producir una amplia gama de moléculas biosurfactantes con capacidad de
Capítulo 6
59
_______________________________________________________________________________________________________________________________
inhibir el desarrollo de fitopatógenos (Ongena and Jacques, 2008) mediante la
disminución de la tensión superficial de la membrana celular de las células eucarióticas
ocasionando lisis celular, debido a que estas moléculas pueden intercalarse entre los
componentes estructurales de la membrana plasmática (Kim et al., 2000) o actuar como
toxina para el patógeno (D’aes et al., 2010).
Por otro lado, la producción de compuestos volátiles orgánicos (CVOs) fue mayor para
las cepas B. subtilis MB055 y Ps. fluorescens MB088, aunque los demás morfotipos
antagónicos, con excepción de B. brevis MB083, Ps. fluorescens MB111 y B. megaterium
MB112, también inhibieron el desarrollo miceliar de F. oxysporum por producción de
estos compuestos, si se les compara con el control sin la presencia de bacteria. Esto
evidencia que las rizobacterias produjeron algún compuesto volátil fungistático aunque
para todos los casos, en concentraciones menores a la necesaria para una inhibición
completa del patógeno. Es conocido que estos compuestos intervienen en procesos de
comunicación célula-célula, de promoción de crecimiento e inhibición del desarrollo de
patógenos, además de su habilidad de difundirse a través de soluciones acuosas,
permitiéndoles tener un amplio rango de acción (Kai et al., 2009).
En el caso de los CVOs producidos por bacterias contra fitopatógenos, se ha reportado
que estos inhiben su crecimiento micelial y reducen la esporulación (Kai et al., 2009).
Esta inhibición ha sido observada en el género Pseudomonas (Bastidas, 2010) y en B.
subtilis contra Rhizoctonia solani y Sclerotinia sclerotiorum (Kai et al., 2007; Liu et al.,
2008), y en la especie bacteriana Arthrobacter agilis contra Botrytis cinerea y
Phytophthora cinnamomi (Velásquez-Becerra et al., 2010), que al igual que la cepa B.
subtilis MB055, el ser endófitas podría ser una ventaja preventiva, si se inoculan en una
planta antes de que esta fuera infectada por un fitopatógeno. Asimismo, estos últimos
autores mencionan que la producción de dimetilhexadecilamina es una alternativa al uso
de fungicidas sintéticos como el Captan, usado para el control químico de Fusarium en
uchuva.
Teniendo en cuenta las diferentes características bioquímicas evaluadas para cada
rizobacteria seleccionada se observó que las mejores cepas bacterianas antagonistas a
nivel in vitro, Pseudomonas sp. MB108 y B. licheniformis MB109, fueron buenas
productoras de ácido 3-indol acético, mostraron una alta capacidad de solubilización de
fosfatos y de producción de glucanasas, mientras que E. amnigenus MB068, además de
ser el mejor solubilizador de fosfatos también fue buen productor de biosurfactantes. No
obstante, la producción de CVOs no fue alta para estas tres cepas bacterianas en
comparación con las demás aisladas. Entre tanto, Bacillus sp. MB015, que inhibió en
buen porcentaje el desarrollo del patógeno bajo condiciones in vitro, no mostró los
mejores resultados en la producción de los metabolitos evaluados, por lo que se deduce
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
60
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que su potencial antagónico podría estar relacionado más con otros mecanismos de
acción no evaluados en este estudio como por ejemplo, la producción de antibióticos.
En relación a lo anterior, autores como Rosas (2007) y Ahmad et al. (2008), señalan que
los antagonistas no tienen un único modo de acción, y la multiplicidad de éstos es una
característica importante para su selección como agentes de control biológico, ya que si
el biocontrolador posee diferentes mecanismos de acción, definidos como la estrategia
que utilizan los microorganismos benéficos contra un patógeno (Liu et al., 2008), como
son su capacidad de colonización de la raíz y de producción de distintos compuestos
antifúngicos (Bouizgarne, 2013), se reducen los riesgos de desarrollo de resistencia en el
fitopatógeno (Ahmad et al., 2008).
Todas las cepas bacterianas seleccionadas in vitro como agentes de control biológico
mostraron inhibición del patógeno a nivel in vivo. Sin embargo, Ps. fluorescens MB103
fue la cepa bacteriana más efectiva en inhibir el desarrollo micelial del patógeno en
condiciones de invernadero, aunque a nivel in vitro presentó un porcentaje de inhibición
menor al obtenido con otros morfotipos como Bacillus sp. MB015, E. amnigenus MB068 y
Pseudomonas sp. MB108, los cuales a nivel in vivo no fueron efectivos en el control de la
marchitez vascular. Al respecto, Raaijmakers et al. (2009) y Narayanasamy (2013b),
señalan que las diferencias en la habilidad de las rizobacterias para controlar patógenos
del suelo están asociadas con la habilidad de mantener la estabilidad de las poblaciones,
en permanecer metabólicamente activas y en la expresión de su actividad antagónica.
La efectividad antagónica a nivel in vivo de Ps. fluorescens MB103, y de otras cepas
como E. amnigenus MB009, B. subtilis MB025 y B. subtilis MB112 en las plántulas de
uchuva podría suponer la producción de otros metabolitos no caracterizados en
laboratorio que dieron lugar a una mayor capacidad de colonización que no fue medida
en este trabajo, ya que de acuerdo a las características bioquímicas evaluadas in vitro,
estas cepas no mostraron ser buenas productoras de biosurfactantes y compuestos
volátiles orgánicos, y solo en E. amnigenus MB009 se evidenció su capacidad para
producir glucanasas.
Estos otros posibles metabolitos producidos por Ps. fluorescens MB103 podrían estar
relacionados con la producción de moléculas quelantes de hierro del tipo sideróforos, que
fueron evidenciados por la emisión de fluorescencia en el medio de cultivo en el que
fueron sembradas inicialmente las rizobacterias. Estudios recientes como el de Chaiharn
et al. (2009), han evaluado el efecto de los sideróforos producidos por cepas bacterianas
para controlar a F. oxysporum en cultivos de arroz, encontrando que sideróforos del tipo
Capítulo 6
61
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hidroxamato producidos por Ps. aureofaciens inhibieron in vitro, el crecimiento del
patógeno.
Asimismo, se podría inferir que otro de los posibles mecanismos empleados por Ps.
fluorescens MB103, y también por E. amnigenus MB009, B. subtilis MB025 y B. subtilis
MB112 a nivel in vivo podría estar relacionado con la producción de antibióticos, los
cuales han sido evaluados en otros estudios para el control de F. oxysporum como el 2-4
diacetilfloroglucinol producido por Ps. fluorescens (Schouten et al., 2004; Narayanasamy,
2013a), fenacina por Ps. chlororaphis (Chin-A-Woeng et al., 1998), bacilomicina y
fengicina por B. amyloliquefaciens (Koumoutsi et al., 2004), e iturina A por B. subtilis
(Ragazzo-Sánchez et al., 2011).
La baja efectividad de Bacillus sp. MB015, E. amnigenus MB068, Pseudomonas sp.
MB108 y B. licheniformis MB109 en inhibir el desarrollo de F. oxysporum a nivel in vivo,
podría relacionarse con una pérdida de la capacidad controladora de las cepas
(Avendaño et al., 2006), o a la incapacidad del inóculo de colonizar la raíz de la planta.
Es así, que con la inoculación de E. amnigenus MB068, Pseudomonas sp. MB108, B.
licheniformis MB109, Fox17 desarrolló una severidad de marchitez vascular significativa
en las plántulas de uchuva entre los 14 y 28 días especialmente, aunque al final de la
evaluación no se observó la sintomatología de la escala 4 de severidad de la
enfermedad. Woeng y colaboradores (2003), señalan que no todos los aislados que
muestran inhibición de un patógeno in vitro proveen un control efectivo de la enfermedad
o colonización de la superficie de la raíz, posiblemente debido a que no todos éstos, son
competentes en la rizósfera, y para los cuales, el grado de colonización requerido para el
biocontrol podría depender del mecanismo usado, ya sea mediante antibiosis o por
resistencia sistémica inducida.
Igualmente, es claro que el modo de acción para inhibir un determinado patógeno en
condiciones in vitro no puede ser extrapolado a ensayos in vivo, ya que los mecanismos
de biocontrol pueden llegar a ser totalmente diferentes por influencia de las condiciones
ambientales (D’aes et al., 2010). Al respecto, Avendaño et al. (2006), sugieren que las
razones para explicar la baja eficiencia de las cepas en invernadero puede ser atribuida a
la pérdida de actividad de las bacterias o a que las condiciones climáticas y la dosis
utilizada en la inoculación no son las más adecuadas para lograr una acción eficaz y
duradera como antagonista durante la evaluación. En este sentido, Shanmugam et al.
(2011) reportaron una reducción de la marchitez vascular causada por F. oxysporum f.sp.
lycopersici, y por consiguiente de la incidencia de la enfermedad en plantas de tomate al
inocular previamente semillas y suelo con B. atrophaeus como antagonista, el cual
ejerció biocontrol sobre el patógeno tanto local como sistémicamente.
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
62
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Por otro lado, los consorcios bacterianos conformados por Bacillus sp. MB015, E.
amnigenus MB068, Providencia sp. MB106, Pseudomonas sp. MB108 y B. licheniformis
MB109, que presentaron la mayor capacidad antagonista in vitro contra F. oxysporum en
las pruebas duales, no potenciaron, en condiciones in vivo, un mayor biocontrol del
fitopatógeno con respecto a la inoculación de las bacterias individualmente, a pesar de
que en las pruebas de compatibilidad realizadas en laboratorio no mostraron
antagonismo entre sí. Por consiguiente, se podría inferir, que esta baja efectividad de los
consorcios puede tener que ver más con una limitación de las cepas en su capacidad de
colonización del sistema radicular, a lo que de Boer (1999) y Hallmann and Berg (2006),
atribuyen a las interacciones negativas que pueden ocurrir entre microorganismos
biocontroladores en inoculaciones múltiples, las cuales pueden afectar su
comportamiento en la colonización de la rizósfera, ya que estos microorganismos que
están ocupando un mismo nicho ecológico y que pueden tener los mismos
requerimientos nutricionales, pueden estar compitiendo por los nutrientes del suelo.
En este mismo sentido cabe mencionar, que los consorcios bacterianos estuvieron
conformados por cepas con mecanismos de acción similares como la producción de
glucanasas, lo que podría también explicar su baja efectividad antagónica contra el
patógeno a nivel in vivo, ya que estarían empleando esta misma estrategia para inhibir el
desarrollo del patógeno. Autores como Xu et al. (2011), mencionan que los altos niveles
de supresión de una enfermedad están dados más por la aplicación de agentes
biocontroladores con mecanismos de acción diferentes, que al uso combinado de
biocontroladores con mecanismos similares.
Por último, como se mencionó anteriormente y como fue observado con esta
investigación, la producción, a nivel in vitro, de metabolitos secundarios que pueden
inhibir el óptimo desarrollo del fitopatógeno, no siempre puede ser efectiva cuando se
dan condiciones in vivo de invernadero o campo, ya sea porque el controlador biológico
no produzca los mismos compuestos antifúngicos o porque no los exprese de igual forma
que en laboratorio para colonizar de esta manera la rizósfera y antagonizar
efectivamente. Por ende, un complemento a este estudio que permita comprobar las
anteriores hipótesis es la evaluación de las rizobacterias aisladas en ensayos más
extensivos en invernadero y posteriormente en campo, así como la identificación de los
metabolitos producidos como en el caso de antibióticos, compuestos orgánicos volátiles o
sideróforos tanto a nivel in vitro como in vivo.
Capítulo 7
63
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CONCLUSIONES
Se presentó una alta variabilidad de Fusarium oxysporum en las fincas evaluadas,
aislando de plantas de uchuva sintomáticas, quince morfotipos morfológicamente
diferentes, que mostraron una incidencia de marchitez vascular igual o mayor al 70.00%,
siendo F. oxysporum Fox17 el más virulento, con una incidencia del 100.00% y la mayor
severidad de la enfermedad con un AUDPC de 40.42.
La mayor diversidad de morfotipos de F. oxysporum se presentó en la finca La Copa,
posiblemente favorecida por características físicas presentes en el suelo como un pH
ácido y bajo contenido de materia orgánica, y químicas como mayor contenido de
aluminio y menor contenido de calcio.
La metodología planteada en este estudio en la que se aislaron antagonistas bacterianos
contra F. oxysporum a partir del mismo patosistema fitopatógeno-uchuva fue exitosa,
obteniendo 24 cepas biocontroladoras entre endófitas de la raíz y asociadas a suelo
rizosférico con diferentes mecanismos de acción que a nivel in vitro mostraron
porcentajes de inhibición del crecimiento micelial del patógeno mayores al 30.00%.
Las cepas bacterianas con mayor capacidad antagónica contra F. oxysporum a nivel
in vitro fueron Bacillus sp. MB015, Enterobacter amnigenus MB068, Providencia sp.
MB106, Pseudomonas sp. MB108 y B. licheniformis MB109, las cuales mostraron
porcentajes de inhibición mayores a 79.00%, caracterizadas por ser buenas productoras
de glucanasas, biosurfactantes y compuestos volátiles orgánicos como mecanismos de
acción para ejercer el antagonismo.
Las características bioquímicas comunes a las bacterias antagonistas fueron la
producción de ácido 3-indol acético para la promoción de crecimiento, y de compuestos
volátiles orgánicos para inhibir el desarrollo de F. oxysporum. Otras, como la
solubilización de fosfatos o la producción de enzimas líticas como glucanasas y
biosurfactantes fueron características solo de algunos de los morfotipos bacterianos.
En condiciones in vivo, Ps. fluorescens MB103 y B. megaterium MB112 fueron las cepas
con mayor capacidad antagónica contra F. oxysporum permitiendo solo un 16.67% de
incidencia de marchitez vascular, mientras que E. amnigenus MB009, B. subtilis MB025
y Ps. fluorescens MB103, mostraron un mayor efecto en la disminución de la severidad
de la enfermedad con valores de 7.53, 10.79, 11.84, respectivamente.
Capítulo 8
64
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RECOMENDACIONES
Identificar los compuestos volátiles orgánicos y sideróforos en las bacterias que
mostraron la capacidad de producirlos, además de los posibles antibióticos que también
podrían estar ejerciendo el antagonismo contra Fusarium oxysporum tanto en
condiciones in vitro como in vivo.
Se propone realizar ensayos in vivo, empleando semillas de uchuva germinadas,
previamente inoculadas con las cepas Pseudomonas fluorescens MB103 y Bacillus
megaterium MB112, con el fin de garantizar un mayor establecimiento y colonización
del antagonista antes de enfrentarse con el patógeno ya presente en el suelo.
Se recomienda realizar evaluaciones de dosis de respuesta a diferentes concentraciones
de inóculo de los aislamientos bacterianos antagónicos, con el fin de tener una mayor
certeza del potencial biocontrolador de las bacterias frente a F. oxysporum en plantas de
uchuva, en posteriores ensayos en campo.
Se sugiere evaluar la inducción de resistencia por parte de las cepas bacterianas
antagónicas como mecanismo de defensa para la planta frente al ataque del patógeno.
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Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
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ANEXOS
Anexo 1. Bacterias endófitas de la raíz (ER) y aisladas de suelo rizosférico (SR) con mayor capacidad antagónica contra
Fusarium oxysporum (Fox17) en plantas de uchuva.
Morfotipos
bacterianos
MB003
MB009
MB012
MB015
MB025
MB031
MB032
MB044
MB050
MB051
MB055
MB067
MB068
MB083
MB088
MB097
MB103
MB104
MB106
MB108
MB109
MB111
MB112
MB113
Control Positivo
Control Positivo Comercial
Control Absoluto*
Muestra
SR
SR
SR
ER
SR
ER
ER
SR
ER
ER
ER
ER
ER
ER
SR
ER
SR
ER
ER
SR
SR
ER
ER
SR
-
Inhibición del crecimiento fúngico (%) in vitro
Enfrentamiento
Enfrentamiento
Promedio pruebas de
dual I
dual II
antagonismo
33.65 (±0.56)
34.59 (±10.02)
34.12
68.03 (±9.08)
65.79 (±0.86)
66.91
87.18 (±2.79)
65.79 (±2.66)
76.48
82.16 (±3.86)
79.14 (±2.03)
80.64
78.44 (±4.64)
72.93 (±1.13)
75.69
79.55 (±2.32)
62.41 (±1.42)
70.98
80.48 (±5.02)
61.66 (±2.46)
71.07
88.85 (±1.12)
67.29 (±3.14)
78.07
84.39 (±1.12)
69.55 (±3.52)
76.97
83.27 (±1.12)
68.61 (±4.00)
75.94
81.41 (±2.32)
65.60 (±1.69)
73.51
53.16 (±3.15)
47.37 (±17.67)
50.27
88.85 (±6.31)
69.79 (±1.42)
79.32
81.04 (±2.23)
63.53 (±5.21)
72.19
38.66 (±2.23)
46.81 (±2.28)
42.64
76.58 (±1.12)
70.30 (±3.40)
73.44
66.54 (±3.35)
52.78 (±4.41)
59.66
90.19 (±1.12)
66.92 (±2.28)
78.55
83.27 (±1.12)
75.00 (±4.31)
79.14
91.45 (±2.32)
68.23 (±5.53)
79.94
91.45 (±0.64)
67.21 (±6.89)
79.33
81.04 (±3.35)
71.05 (±0.33)
75.86
83.27 (±1.12)
71.81 (±4.82)
77.54
58.18 (±1.67)
59.96 (±7.75)
59.07
72.49 (±2.32)
66.17 (±6.86)
69.33
73.79 (±0.79)
74.81 (±1.95)
74.30
87.67 (±1.53)
88.67 (±0.76)
1.59
Identificación
Bacillus subtilis
Enterobacter amnigenus
Bacillus brevis
Bacillus sp.
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Enterobacter amnigenus
Bacillus sp.
Bacillus sp.
Bacillus subtilis
Enterobacter amnigenus
Enterobacter amnigenus
Bacillus brevis
Pseudomonas fluorescens
Enterobacter amnigenus
Pseudomonas fluorescens
Bacillus subtilis
Providencia sp.
Pseudomonas sp.
Bacillus licheniformis
Pseudomonas fluorescens
Bacillus megaterium
Pseudomonas fluorescens
*Corresponde al diámetro promedio del crecimiento de F. oxysporum en cada prueba de antagonismo in vitro mediante enfrentamiento dual.
Antagonismo bacteriano contra Fusarium oxysporum
78
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Anexo 2. Características bioquímicas de las bacterias con mayor capacidad antagónica contra Fusarium oxysporum (Fox17) en
plantas de uchuva.
Morfotipos
bacterianos
Cepas
bacterianas
MB003
MB009
MB012
MB015
MB025
MB031
MB032
MB044
MB050
MB051
MB055
MB067
MB068
MB083
MB088
MB097
MB103
MB104
MB106
MB108
MB109
MB111
MB112
MB113
Control Positivo
Control Absoluto
Bacillus subtilis
Enterobacter amnigenus
Bacillus brevis
Bacillus sp.
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Enterobacter amnigenus
Bacillus sp.
Bacillus sp.
Bacillus subtilis
Enterobacter amnigenus
Enterobacter amnigenus
Bacillus brevis
Pseudomonas fluorescens
Enterobacter amnigenus
Pseudomonas fluorescens
Bacillus subtilis
Providencia sp.
Pseudomonas sp.
Bacillus licheniformis
Pseudomonas fluorescens
Bacillus megaterium
Pseudomonas fluorescens
-
*AIA: Acido 3-Indol Acético
AIA*
Solubilización de
-1
(μg.mL )
fosfatos (IS)
0.70 (±0.15)
0.00 (±0.00)
3.21 (±1.77)
0.00 (±0.00)
0.37 (±0.22)
0.00 (±0.00)
53.75 (±4.22)
1.09 (±0.03)
4.68 (±0.96)
0.00 (±0.00)
0.54 (±3.34)
0.00 (±0.00)
0.93 (±0.06)
0.00 (±0.00)
0.88 (±0.14)
0.00 (±0.00)
0.61 (±0.16)
0.00 (±0.00)
58.39 (±3.35)
0.00 (±0.00)
6.46 (±2.28)
0.00 (±0.00)
25.45 (±3.83)
0.00 (±0.00)
7.37 (±0.30)
1.45 (±0.09)
23.68 (±3.63)
0.00 (±0.00)
12.11 (±4.65)
1.10 (±0.03)
7.75 (±2.79)
1.24 (±0.17)
7.68 (±1.50)
0.00 (±0.00)
3.82 (±0.64)
1.12 (±0.05)
55.95 (±2.89)
1.16 (±0.12)
84.39 (±1.35)
1.31 (±0.19)
67.68 (±3.39)
1.21 (±0.09)
78.51 (±3.05)
1.08 (±0.04)
96.07 (±1.69)
1.12 (±0.03)
84.82 (±1.89)
1.12 (±0.08)
5.58 (±2.70)
1.47 (±0.11)
0.34 (±0.29)
0.00 (±0.00)
Características bioquímicas
Producción de metabolitos secundarios
Glucanasas
Biosurfactantes
Compuestos volátiles
(Halo: mm)
(Halo: mm)
(% inhibición)
2.00 (±0.71)
0.50 (±0.00)
3.59 (±3.11)
1.67 (±0.41)
0.50 (±0.00)
12.16 (±6.45)
4.80 (±0.76)
1.81 (±1.25)
15.32 (±3.33)
6.80 (±1.10)
1.30 (±0.35)
4.50 (±3.47)
0.00 (±0.00)
0.50 (±0.00)
8.11 (±4.87)
7.20 (±0.84)
0.00 (±0.00)
17.34 (±6.49)
5.20 (±0.84)
1.80 (±1.40)
14.86 (±1.79)
7.80 (±0.84)
0.00 (±0.00)
4.05 (±6.52)
0.00 (±0.00)
0.00 (±0.00)
11.04 (±2.17)
7.00 (±1.00)
0.00 (±0.00)
12.16 (±2.03)
5.20 (±1.10)
0.50 (±0.00)
19.82 (±5.75)
5.20 (±1.10)
0.00 (±0.00)
6.53 (±3.33)
5.40 (±0.89)
2.44 (±0.50)
9.68 (±8.34)
0.00 (±0.00)
1.29 (±0.40)
-1.35 (±5.41)
0.00 (±0.00)
0.00 (±0.00)
19.59 (±7.05)
5.70 (±0.76)
1.29 (±0.40)
6.53 (±10.17)
0.00 (±0.00)
0.50 (±0.00)
7.66 (±9.59)
6.90 (±0.55)
1.30 (±0.38)
5.63 (±10.52)
0.00 (±0.00)
2.70 (±0.30)
8.11 (±5.73)
6.10 (±0.65)
0.78 (±0.34)
7.43 (±1.79)
7.80 (±0.91)
1.50 (±0.24)
11.71 (±6.90)
0.00 (±0.00)
2.10 (±1.46)
-7.21 (±2.37)
0.00 (±0.00)
1.50 (±0.53)
-7.77 (±0.48)
0.00 (±0.00)
4.00 (±1.30)
13.06 (±11.11)
0.67 (±0.30)
4.05 (±12.84)
0.00 (±0.00)
0.00 (±0.00)
00.00 (±3.76)