El Microscopi Òptic

Pràctiques de Biologia - Batxillerat
El Microscopi Òptic
No veig res!!
Introducció
El tamany de moltes de les estructures biològiques i molts éssers vius estan fora del
poder resolutiu de l’ull humà (0,1 mm) i, per tant, calen una sèrie d’instruments que permetin
visualitzar-los. Un d’aquests instruments és el Microscopi Òptic.
El microscopi, mitjançant dos sistemes de lents, l’ocular i l’objectiu (per aquest motiu
rep el nom de Microscopi Compost), permet visualitzar amb detall estructures de dimensions
realment petites.
En aquesta pràctica aprendreu (o recordareu) la tècnica que cal emprar per realitzar
una bona observació al microscopi i com mesurar aquelles estructures que visualitzeu al
microscopi.
És important que, abans de la realització d’aquesta pràctica, repaseu tots aquells
conceptes teòrics desenvolupats a classe i relacionats amb les tècniques més utilitzades en
citologia.
Objectius de la pràctica
Conèixer les parts principals del microscopi i la seva funció.
Utilitzar correctament la metodologia per emprar el Microscopi.
Efectuar correctament una preparació temporal.
Utilitzar correctament les unitats emprades en microscòpia.
Calcular el tamany real i aparent d’una estructura observada al microscopi.
Material necessari
Microscopi compost
Cobreobjectes
Vidre de rellotge
Gillette
Draps
Portaobjectes
Agulla enmanegada
Pincellet
Patata
Guants
Reactius necessaris
Lugol
Etanol 96º
Pràctiques de Biologia – Batxillerat
 Jordi Basseda - Forpe’02
Aigua destil·lada
El Microscopi Òptic
Pàg 1
Metodologia
1a Part: Parts del microscopi
Ocular
Revòlver
Tub òptic
Objectius
Platina
Braç
Condensador
Macromètric
Diafragma Iris
Portafiltres
Font d’il·luminació
Peu
Micromètric
Pràctiques de Biologia – Batxillerat
 Jordi Basseda - Forpe’02
El Microscopi Òptic
Pàg 2
O Part òptica:
Està constituida per totes aquelles parts per on pasa la llum:
(1) Font d’il·luminació: es troba a la base del microscopi i dirigueix la llum a les lents
del condensador.
(2) Portafiltres: permet la utilització de filtres de colors per resaltar aquelles
estructures de la preparació que han estat tenyides d’un determinat color.
(3) Diafragma Iris: permet regular la quantitat de llum que incidirà sobre la preparació
(4) Condensador: està format per un conjunt de lents que focalitzen la llum a la
preparació (Fig. 1).
(5) Objectius: estan montats en el revòlver. La majoria dels microscopis actuals són
parafocals; es a dir, quan un objecte està enfocat amb un determinat objectiu, al
canviar-se d’objectiu no es perd l’enfocament. Augmenten la imatge de la
preparació un determinat nombre de vegades; com més petit és l’objectiu menys
augments realitza. Normalment el revòlver presenta els objectius següents: 4X,
10X, 40X i 100X (objectiu d’immersió). Els objectius són responsables del poder
resolutiu (la capacitat de diferenciar dos punts molt propers); l’ull humà pot
distingir (resoldre) dos objectes que estiguin separats a una distància de 0,1 mm,
amb l’ajut del microscopi es poden distingir objectes separats en 0,001 mm!!
Cobreobjectes
Portaobjectes
Objectiu per a un
tub òptic de 160
mm
Condensador
Fig. 1
Augment
Llum
Apertura
Numèrica
Gruix màxim
Portaobjectes (mm)
Fig. 2
El poder de resolució d’un objectiu depèn de tres factors:
(a) Apertura Angular: (θ en Fig. 1) és l’angle del conus de llum que entra en la lent
frontal de l’objectiu. El valor òptim de θ és l’angle que produeix un conus de llum
amb un diàmetre que coincideix amb el diàmetre de la lent frontal de l’objectiu.
Quan l’angle θ és molt petit, la resolució és molt pobre. Una de les funcions del
condensador es produir un angle θ ideal del conus de llum.
(b) Índex de refracció: (n) del medi a través del qual la llum va des de la preparació a
la lent frontal de l’objectiu.
(c) Longitud d’ona de la llum: (λ) com més petita és la longitud d’ona de la llum
utilitzada, més gran és el poder resolutiu de l’objectiu. Pot fer-se variar utilitzant
filtres de colors.
Pràctiques de Biologia – Batxillerat
 Jordi Basseda - Forpe’02
El Microscopi Òptic
Pàg 3
El poder de resolució pot determinar-se per l’expressió:
R = λ / [2 x (n x sin (0,5 x θ))]
On:
R = poder de resolució
λ = longitud d’ona de la llum utilitzada
n = índex de refracció del medi entre la lent frontal de l’objectiu i la preparació
θ = apertura angular del conus de llum que uncideix en la lent frontal de l’objectiu
L’expresió [n x sin (0,5 x θ)] és l’apertura numèrica.
Es pot observar que com més gran és l’apertura numèrica més petit és el poder de
resolució i, per tant, millor serà la resolució de l’objectiu (i més car!!).
(6) Ocular: és el conjunt de lents per on es mira. Augmenta la imatge obtinguda per
l’objectiu un determinat nombre de vegades (poden ser 5X, 10X i 15X). El tub
òptic pot ser monocular o binocular (segons admeti un o dos oculars).
O Part mecànica:
(1) Peu: permet mantenir el microscopi en posició vertical.
(2) Braç: lloc per on s’agafa el microscopi per moure’l de localització.
(3) Platina: permet col·locar la preparació a observar. Pot presentar dues pinces de
subjecció de la preparació
(4) Cargol Macromètric: subministra un desplaçament, de la platina o del tub òptic,
per realitzar un enfoc groller.
(5) Cargol Micromètric: per realitzar un enfoc fi, permet efectuar disseccions òptiques.
2na Part: Utilització del Microscopi
Per utilitzar el microscopi heu d’estar familiaritzats amb el seu funcionament. Tingueu
sempre presents les següents precaucions:
(1) Transporteu sempre el microscopi en posició vertical. Utilitzeu una ma per agafarlo pel braç i l’altra ma col·loqueu-la sota del peu del microscopi.
(2) Mai col·loqueu el microscopi aprop dels marges de les taules (poden caure!!).
(3) Mai intenteu netejar les lents del microscopi. Si observeu que estan brutes aviseu
al vostre professor.
(4) Sigueu ordenats i pacients. Cal efectuar totes les operacions amb molta
tranquil·litat i cura. Per una bona observació cal tenir molta paciència!!
(5) Seguiu estrictament la metodologia d’utilització del microscopi.
Pràctiques de Biologia – Batxillerat
 Jordi Basseda - Forpe’02
El Microscopi Òptic
Pàg 4
Metodologia per a l’observació amb el Microscopi
Les operacions que es presenten tot seguit cal que sempre les efectueu en el mateix
ordre!
(1) Col·loqueu el Microscopi sobre la Taula de forma que el seu braç miri cap a
vosaltres.
(2) Treieu la funda del Microscopi i conecteu la font de llum a la xarxa elèctrica.
(3) En el revòlver, ha d’estar col·locat l’objectiu de 4X en l’eix òptic del microscopi;
si no és així, moveu el revòlver fins aconseguir col·locar l’objectiu de 4X en l’eix
òptic del microscopi.
(4) Enceneu la font d’il·luminació.
(5) Ajusteu el diafragma iris fins que la il·luminació sigui la idònia (un excés de llum
pot ocasionar lesions a la retina de l’ull!!).
(6) Si el condensador es pot moure, cal que a l’utilitzar els objectius de 4X i 10X
estigui a uns 5 mm de la preparació; quan utilitzeu l’objectiu de 40X i el de 100X
(immersió!) cal que estigui a uns 2 mm de la preparació.
(7) Utilitzeu el cargol macromètric per moure el conjunt de tub òptic i revòlver del
microscopi cap amunt fins arribar, gairebé, a la màxima alçada.
(8) Col·loqueu la preparació a la platina (sempre amb el cobreobjectes a la part
superior), de forma que la part a observar quedi en línia amb el feix de llum que
penetra per l’apertura de la platina. Utilitzeu les pinces per fixar la preparació.
(9) Mireu per l’ocular* i, utilitzant el cargol macromètric, aneu baixant a poc a poc la
torre del microscopi (conjunt format pel tub òptic i revòlver) fins enfocar la
preparació.
(10) Utilitzant el cargol micromètric, realitzeu l’enfoc fi de la preparació.
(11) Desplaçeu la preparació fins a centrar la part de la preparació que volgueu
visualitzar a major augment (al canviar a un augment superior solament es
visualitza a major augment la part central del camp visual).
(12) Sense tocar per res el cargol macromètric, gireu el revòlver fins col·locar el
següent objectiu i, si es necessari (si l’objectiu que es col·loca és el de 40X),
moveu el condensador i ajusteu la intensitat de llum amb el diafragma iris.
(13) Seguiu l’item 12 per col·locar el següent objectiu (per l’objectiu de 100X la
metòdica a seguir és diferent i s’explicarà en la pràctica que es faci servir)
(14) Un cop finalitzada l’observació, es col.loca l’objectiu de 4X, es puja la torre
del microscopi i es retira la preparació.
(15) Desconnecteu el microscopi de la xarxa elèctrica i tapeu-lo amb la funda.
Augments del Microscopi
Quan s’està utilitzant un determinat objectiu i ocular, els augments als que s’està
observant són:
Augment Total = Augment ocular X augment objectiu
* En l’observació es recomanable mantenir els dos ulls oberts; o bé, anar canviant d’ull per no cansar
excessivament un ull en relació a l’altre.
Pràctiques de Biologia – Batxillerat
 Jordi Basseda - Forpe’02
El Microscopi Òptic
Pàg 5
3a Part: Mesurar el tamany de les estructures visualitzades al Microscopi
O Determinació pel diàmetre del camp visual:
Podeu realitzar una estimació de les estructures observades amb el microscopi
compost si coneixeu la mesura del diàmetre del camp visual, per a cadascun dels objectius, i
el compareu amb l’estructura visualitzada.
™ Col·loqueu un paper mil·limetrat transparent com a preparació i realitzeu
l’observació.
š Mentre esteu observant amb l’objectiu, situeu l’escala del paper mil·limetrat en el
diàmetre del camp visual i estimeu la longitud del camp visual amb aquells
augments.
› Un cop conegut el diàmetre del camp visual amb l’objectiu de 4X (A), podeu
determinar la longitud del camp visual en un altre objectiu (B) per:
Diàmetre (B) = Diàmetre (A) x [Augments totals (A) / Augments totals (B)]
œ Retireu el paper mil·limetrat i realitzeu l’observació de la preparació.
 Per comparació, podreu estimar el tamany de les estructures que visualitzeu (caldrà
situar-les en el diàmetre del camp visual.
ATENCIÓ: els càlculs del diàmetre del camp visual només seran vàlids en el Microscopi
en el que s’han realitzat.
O Determinació del tamany per calcat
… Es realitza mentre s’està efectuant l’observació de l’estructura que es vol mesurar.
š Col·loqueu, movent la preparació, l’estructura a mesurar en el marge del camp
visual (si l’observador es dretà es col·locarà a la dreta; si es esquerrà a l’esquerra).
› L’ull pel que es mira per l’ocular ha d’ésser el contrari de la ma amb la que es
dibuixa.
œ Un company situarà un full en blanc al costat (dret o esquerra, segons amb la ma
que dibuixi l’observador) de la platina i a la mateixa alçada de la platina.
 L’observador manté els dos ulls oberts mirant al marge de la platina on es troba el
paper i, mantenint la visió cap a l’infinit, l’observador veurà que es superposa la
imatge de l’observació amb el paper i, aleshores ja pot realitzar la calca (sense
deixar de mirar a l’infinit!!).
ž Un cop efectuat el dibuix es mesura (tamany aparent) i es calcula el tamany real de
l’estructura observada:
Tamany REAL = Tamany Aparent / Augments totals utilitzats
Pràctiques de Biologia – Batxillerat
 Jordi Basseda - Forpe’02
El Microscopi Òptic
Pàg 6
O Utilitzant un ocular micromètric
Es el mètode en que les mesures són més precises.
Donada la variació entre els microscopis cal un calibratge de l’ocular micromètric en
cadascun dels microscopis:
™ Es realitza l’observació, amb l’objectiu de 10X, d’un portaobjectes que porta una
escala calibrada i es fan coincidir les imatges de les dues escales (la del
portaobjectes i la de l’ocular micromètric) de forma que coincideixin els marges
esquerres de les dues escales.
š Observeu a quina marca coincideixen les dues escales i podreu conèixer que mesura
cada divisió de l’ocular micromètric amb l’objectiu utilitzat (Veure Fig. 3 com
exemple)
Portaobjectes
Fig. 3: es presenten per separat les dues escales per a una major comprensió però, en realitat,
coincideixen.
En la Fig. 3a podem veure que 20 espais de l’ocular micromètric són 0,16 mm y que 26 espais
són 0,2 mm. Per tant:
0,16 / 20 = (aprox) 0,20 / 26 = 0,008 mm = 8 µm
Es a dir, amb aquest ocular, cadascun dels espais entre les divisións de l’ocular
micromètric equival a 8 µm.
› Cal repetir els items anteriors per a cadascun dels objectius.
Pràctiques de Biologia – Batxillerat
 Jordi Basseda - Forpe’02
El Microscopi Òptic
Pàg 7
4ta Part: Realitzant una observació
™ Talleu amb la Gillette una patata i rasqueu la superficie de tall amb la gillette.
š Col·loqueu el suc que queda en la Gillette en un vidre de rellotge.
› Col·loqueu una gota d’aigua destil·lada en el vidre de rellotge.
œ Col·loqueu una gota de Lugol en el vidre de rellotge.
 Sacseu suaument el vidre de rellotge.
ž Col·loqueu amb el pincellet una gota del vidre de rellotge sobre un portaobjectes
ben net (si es necessari netejeu-lo amb Etanol 96º).
Ÿ Col·loqueu a sobre de la goteta un cobre objectes evitant la formació de bombolles
d’aire (ajudeu-vos d’una agulla enmanegada) (Fig. 4)
Fig. 4
Realitzeu l’observació i mesureu el tamany real d’alguns grànuls de midó a
diferents objectius (10X i 40X).
Qüestions de la pràctica
(1)
(2)
(3)
(4)
Quines són les funcions dels cargols macromètric i micromètric?
Què és una dissecció òptica?
Com s’evita la formació de bombolles en una preparació temporal?
Quin és el tamany real dels grànuls de midó observats? Efectueu els càlculs i
expreseu el resultat amb las unitats correctes.
Bibliografia
Biologia Experimental. D. Guadilla et al. Vicens Vives. 1973
Prácticas de Biologia. A.Costa Pérez-Herrero. ICE Universidad de Salamanca. 1981
Prácticas de Biologia. J. Cuello et al. Ed. Fontalba. 1978
Manual de Microscopia. M. Locquin et al. Labor. 1985
Biologia General. Antoni Arregui et al. Oikos Tau. 1992
Biology in the Laboratory. D.R. Helms et al. W.H. Freeman. 1998
Life. The Science of Biology. Purves et al. Sinauer Assoc. Inc. i W.H. Freeman.1998
Didàctica de les Ciències Naturals. Biologia. Teresa Tilló. Ed. Universitat de Barcelona 1999
Pràctiques de Biologia – Batxillerat
 Jordi Basseda - Forpe’02
El Microscopi Òptic
Pàg 8